Summary
Les méthodes de préparation de la nématique active à partir de microtubules et de moteurs kinésines présentées ici, y compris la préparation et la construction de protéines et l’utilisation de puits pour le confinement nématique actif.
Abstract
La formation de phases actives à base de biopolymères est devenue une technique importante pour les chercheurs intéressés à explorer le domaine émergent des cristaux liquides actifs et leurs rôles possibles en biologie cellulaire. Ces nouveaux systèmes sont constitués de sous-unités autonomes qui consomment de l’énergie localement, produisant un fluide dynamique hors équilibre. Pour former la phase à cristaux liquides actifs décrite dans ce rapport, des composants protéiques purifiés, y compris des biopolymères et des moteurs moléculaires, sont combinés, et la phase nématique active se forme spontanément en présence d’adénosine triphosphate (ATP). Pour observer l’état nématique, le matériau doit être confiné dans une géométrie appropriée pour la microscopie à une densité suffisamment élevée. Cet article décrit deux méthodes différentes pour la formation d’une phase nématique active à l’aide de microtubules et de moteurs kinésines : assemblage d’une couche active bidimensionnelle à l’interface huile-eau et assemblage sous couche d’huile à l’aide d’un puits élastomère. Des techniques pour insérer le matériau actif dans de petits puits de différentes formes sont également décrites.
Introduction
Les fluides actifs sont composés de particules ou d’éléments énergétiques qui puisent le carburant dans leur environnement local. Dans les bonnes conditions, ces éléments actifs mobiles peuvent agir collectivement pour produire une dynamique des fluides émergente sur de longues échelles de longueur. Il existe une variété d’exemples d’un tel comportement de phase hors équilibre dans la littérature et les phases actives peuvent être trouvées dans tout le spectre des systèmes vivants. Quelques exemples notables sont les colonies de bactéries1, les feuillets cellulaires2,3 et le flocage ou l’essaimage d’organismes 4,5. Les phases actives ont également été largement étudiées dans les phases condensées des filaments cytosquelettiques, soit dans le cadre de la cellule6, soit dans des systèmes synthétiques conçus pour utiliser des composants extraits biologiquement 7,8,9. L’ordre cristallin liquide et la formation de défauts topologiques dans les systèmes naturels et synthétiques assemblés à partir d’extraits biologiques présentent un intérêt particulier pour la communauté des chercheurs. Au cours des dernières années, des groupes de recherche ont examiné ces systèmes, leurs propriétés physiques fondamentales et leur pertinence pour la biologie 2,3,10,11.
Cet article se concentre sur la formation de l’état nématique actif à partir d’une combinaison de microtubules et de protéines motrices kinésines. Le cristal liquide nématique traditionnel est une phase d’équilibre de la matière dans laquelle les molécules constitutives présentent un ordre d’orientation. Par exemple, un fluide constitué de molécules relativement rigides en forme de bâtonnets peut présenter à la fois la phase nématique et, à des températures plus élevées, une phase fluide isotrope non orientée12. Le premier exemple expérimental d’une phase nématique active a été développé par Sanchez et al.13, adaptant une expérience in vitro antérieure 14 dans laquelle des grappes de protéines motrices ont été utilisées pour produire un mouvement de cisaillement entre les faisceaux de microtubules voisins. Lorsque ce système de microtubules a été confiné à une couche mince, un ordre nématique spontané a émergé. Au cours des dernières années, l’état nématique actif a été étudié intensivement par plusieurs groupes de recherche expérimentaux 15,16 etthéoriques 17,18, en se concentrant sur des phénomènes tels que la turbulence active – un état dans lequel le fluide produit des écoulements chaotiques auto-entraînés 19 – et les défauts topologiques mobiles. Cet article décrit les méthodes de préparation et de formation de l’état nématique actif à partir de microtubules et de moteurs kinésine dans différentes géométries expérimentales. Tout d’abord, les méthodes de préparation pour les différentes solutions de composants sont décrites, suivies des méthodes de formation de la nématique active en utilisant deux géométries de chambre d’écoulement différentes. Les résultats d’imagerie typiques sont affichés. Enfin, des méthodes de confinage de la nématique active dans des puits et des canaux sont décrites.
Protocol
1. Préparation de la matière active
REMARQUE: La nématique active 2D est assemblée dans un processus en trois étapes. Tout d’abord, deux solutions distinctes sont préparées: a) microtubules polymérisés et stabilisés et b) MIX (une solution contenant des moteurs kinésine). Ceux-ci sont combinés et l’activité est initiée lors de l’ajout d’adénosine triphosphate (ATP). Le matériau est ensuite confiné dans une géométrie appropriée, de sorte que sa densité soit suffisamment élevée pour que l’ordre nématique émerge. Des protocoles sont inclus pour la préparation de tous les composants nécessaires et comment assembler la phase active.
- Préparation de grappes de protéines motrices kinésines
- Exprimer et purifier les protéines motrices recombinantes K401-BIO (moteurs K401) d’Escherichia coli selon le protocole d’Edgar C. Young20.
REMARQUE: Les protéines motrices K401-BIO sont dimères et se composent de deux têtes reliées par une tige hélicoïdale. Les moteurs ont été fournis par l’usine Brandeis Biomaterials et utilisés comme indiqué précédemment16. Dans le but de former une nématique active, les molécules de kinésine sont biotinylées puis connectées via une liaison streptavidine pour former des amas de kinésine allant jusqu’à quatre moteurs 13,15,21,22. Il est utile d’exprimer la kinésine avec une étiquette de protéine fluorescente verte (GFP). - Après purification et incubation de la streptavidine et des moteurs sur glace pendant 40 minutes, congeler les moteurs K401 dans de l’azote liquide dans des aliquotes de 5 μL à une concentration finale de 0,7 mg/mL et les entreposer à -80 °C.
REMARQUE: L’expérience peut être interrompue ici. Décongelez doucement la kinésine au besoin et ne recongelez pas. - Préparer des grappes de kinésine marquée à la biotine (KSA) en mélangeant 24 % en volume de moteurs K401 à 0,7 mg/mL, 27 % en volume de streptavidine à 0,325 mg/mL et 3 % en volume de dithiothréitol (DTT) à 5 mM (pour empêcher l’agrégation) à 4 °C dans un tampon M2B à 46 % en volume (PIPES 80 mM [acide pipérazine dipérazithanesulfonique, pH 6,8], 2 mM MgCl2 et 1 mM EGTA [éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N, Acide N,N′,N′-tétraacétique]). Laissez le RAS incuber sur la glace pendant 40 minutes.
- Exprimer et purifier les protéines motrices recombinantes K401-BIO (moteurs K401) d’Escherichia coli selon le protocole d’Edgar C. Young20.
- Préparation de la solution de microtubules
REMARQUE : Le sel de sodium de guanosine-5'-[(α,β)-méthylène]triphosphate (GMPCPP) est un analogue lentement hydrolysable de la guanosine triphosphate (GTP), et les microtubules formés en présence de GMPCPP sont trois fois plus rigides que les microtubules GTP23 et plus courts. L’utilisation de microtubules courts et rigides est favorable à la formation de la phase nématique active, car ces facteurs se combinent pour favoriser l’ordre cristallin liquide.- Polymériser la tubuline cyclée non marquée (99 %, voir le tableau des matières) en utilisant 0,6 mM de GMPCPP à une concentration de tubuline de 6 mg/mL.
REMARQUE: La tubuline de haute qualité peut également être purifiée à partir du cerveau de bovin ou de porc selon les protocoles établis ou obtenue d’une autre source fiable telle que l’installation Brandeis Biomaterials où les matériaux peuvent être expédiés congelés pour éviter les dommages. Pour la purification de la tubuline à partir du cerveau bovin, veuillez vous référer au protocole publié par Bate et al.24. Pour la purification de la tubuline à partir du cerveau porcin, se référer aux protocoles publiés de Castoldi et al.25 et Tayar et al.26. - En préparation de la polymérisation, préparer un bain de chaleur à 37 °C et prérefroidir la centrifugeuse à 4 °C. Combiner la solution de tubuline non marquée dans un tampon M2B (étape 1.1.3) dans un tube à ultracentrifugeuses de 500 μL avec 4 % molaire de tubuline marquée à la rhodamine (voir le tableau des matériaux) pour produire 4 % de microtubules marqués après polymérisation.
- Vérifier la concentration de tubuline à l’aide d’un test Bradford27. La concentration totale de tubuline dans le tube à centrifuger doit être de 6,5 à 6,9 mg/mL.
- Incuber le mélange de tubuline sur de la glace pendant 10 min et ultracentrifuger pendant 10 min à 352 700 x g à 4 °C. Cette étape élimine la tubuline dysfonctionnelle, qui sera dans la pastille.
- À l’aide d’une pipette, extraire soigneusement le surnageant contenant la tubuline fonctionnelle dans un tube microcentrifugeux. Ajouter GMPCPP à une concentration finale de 0,6 mM pour induire la polymérisation de la tubuline et le DTT à une concentration finale de 1 mM pour empêcher l’agrégation des protéines.
- Incuber le mélange au bain de chaleur à 37 °C pendant 30 min, puis centrifuger à nouveau pendant 10 min à 14 000 x g à température ambiante. Retirer le surnageant, puis diluer la pastille avec un tampon M2B pour atteindre une concentration finale de microtubules de 6 mg/mL.
REMARQUE: Cette solution peut être conservée à température ambiante pendant au moins 4 h avant utilisation. - Pour vérifier que les microtubules ont polymérisé avec succès, diluer 1 μL de la solution de microtubules 100:1 avec un tampon M2B et une pipette sur une lame de microscope. Couvrir avec un couvercle pour l’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir Tableau des matériaux) avec une lentille d’objectif 40x.
REMARQUE: Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont choisies en fonction du marquage de fluorescence utilisé sur les microtubules. Dans ce protocole, le marquage à la rhodamine est utilisé (voir étape 1.2.2), de sorte que l’imagerie est réalisée à l’aide d’une bande d’excitation de 515-560 nm et d’un filtre passe-long de 590 nm. La figure 1 montre un exemple représentatif. - Une fois la polymérisation terminée, congeler les microtubules sous forme d’aliquotes de 2 μL dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C (si nécessaire).
- Polymériser la tubuline cyclée non marquée (99 %, voir le tableau des matières) en utilisant 0,6 mM de GMPCPP à une concentration de tubuline de 6 mg/mL.
- Préparation de MIX
NOTE: MIX est une solution aqueuse qui comprend les grappes kinésine-streptavidine (KSA). Le MÉLANGE préparé doit être conservé à -80 °C dans des aliquotes de 4 μL avant l’expérience. Lorsque MIX est associé à l’ATP et à la solution de microtubules décrite à l’étape 1.2 à température ambiante, l’activité est initiée. MIX est préparé comme suit13,19.- Préparez une solution pour prévenir la décoloration par fluorescence (ANTIFADE) en mélangeant deux solutions antioxydantes. Combiner AO1 (250 mM de DTT, 65 mM de catalase) et AO2 (750 μM de catalase, 3 mM de glucose oxydase) dans un rapport volumique de 1:1. Inclure 20 mM Trolox, un autre antioxydant utilisé pour réduire les dommages causés par la microscopie à fluorescence.
- Préparer le MÉLANGE en fabriquant une solution de KSA (décrite à l’étape 1.1.3) qui comprend 6 % en poids de polyéthylène glycol (PEG) à 20 kDa pour induire le regroupement des microtubules, 3 % en volume d’ANTIFADE et 5 % en volume de pyruvate kinase/déshydrogénase lactique (PKLDH) à 70 mg/mL pour la régénération de l’ATP.
2. Création de la nématique active
NOTE: L’activité dans le matériau est initiée par l’ajout d’ATP. Le réseau actif est préparé frais pour chaque expérience en ajoutant de l’ATP à une concentration suffisamment élevée pour induire une activité motrice. Pour former une phase nématique active uniforme et pleinement développée, les microtubules doivent être à une densité suffisamment élevée. Ceci peut être réalisé en confinant les microtubules entre deux fluides non miscibles pour former une couche nématique active bidimensionnelle (2D). Cette méthode a été développée à l’origine à l’Université Brandeis13 et reste une technique populaire pour produire une phase nématique homogène, de haute qualité et active.
- Méthode de cellule d’écoulement pour la formation nématique active
- Préparer des lamelles hydrophiles avec un revêtement en acrylamide.
- Nettoyez soigneusement les lamelles de couverture avec de l’eau savonneuse, de l’éthanol et 0,1 M de NaOH avec des rinçages alternés à l’eau nanopure. Une fois rincés, enduire les lames de couverture d’une solution de silane composée de 100 mL d’éthanol, 1 mL d’acide acétique et 500 μL de 3-(triméthoxysilyl) propylméthacrylate pendant 15 min, puis rincer à l’eau nanopure.
- Préparer une solution d’acrylamide à partir de 95 mL d’eau nanopure et de 5 mL d’acrylamide à 40 % en poids, puis dégazer la solution pendant 30 min dans une étuve à vide.
- Ajouter 35 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) pour une concentration finale de 2,3 mM, puis 0,07 g de persulfate d’ammonium. Versez la solution d’acrylamide sur les lamelles de couverture face vers le haut et incuber toute la nuit à température ambiante.
- Préparer des lames de microscope hydrophobe. Pipeter 100 μL d’une solution hydrofuge (voir le tableau des matériaux) sur une lame de microscope en verre propre, puis placer une autre lame de verre propre sur le dessus. Cela garantit un revêtement uniforme de la solution hydrofuge sur la surface où elle repose pendant 2 min. Après 2 min, retirez la deuxième lame de verre et rincez soigneusement la première lame avec de l’eau nano-pure, puis séchez-la avec de l’azote gazeux. Nettoyez doucement la région où le ruban sera placé (autour du motif) avec de l’acétone pour vous assurer que la solution hydrofuge n’empêche pas l’adhérence au verre.
- Préparer un mélange d’huile technique contenant du 008-Surfactant 008 à 1,8 % (v/v) (voir le tableau des matériaux).
- Assemblez la lame de verre et la lamelle de couverture avec la lame de verre hydrophobe au bas de la cellule d’écoulement et la glissière de couverture hydrophile comme surface supérieure dans une géométrie sandwich à l’aide d’entretoises adhésives double face de 40 μm. Placez les entretoises à 1,5 mm l’une de l’autre sur la lame de microscope hydrophobe. Placez ensuite la housse recouverte d’acrylamide sur le dessus des entretoises avec le côté traité face vers le bas pour adhérer. Assurez-vous que l’adhérence est complète avec la pression d’un objet contondant.
NOTE: L’objectif est d’assembler une cellule d’écoulement avec une interface huile/eau plate à l’intérieur (Figure 2A, B). C’est là que la couche active se formera. Des bandes et des films d’espacement alternatifs peuvent également être utilisés pour produire une épaisseur de cellule similaire. - Une fois la cellule d’écoulement construite, pipeter immédiatement le mélange d’huile dans la cellule d’écoulement, en remplissant l’espace clos.
- À l’aide d’une pipette, mélanger doucement dans un flacon séparé 6 μL de matière active avec 3,73 μL de MIX, 1 μL de solution de microtubules, 0,6 μL de solution d’ATP (la concentration peut varier pour faire varier la vitesse des microtubules) et 0,67 μL de tampon M2B.
- Pipeter le matériau actif fraîchement mélangé dans une extrémité ouverte de la cellule d’écoulement, les volumes varieront mais devraient dépasser le volume de la cellule d’écoulement (environ 3-6 μL). Une partie de l’huile sera déplacée par la solution aqueuse lorsqu’elle sera injectée dans le canal; Cela peut être évacué à l’extrémité opposée du canal d’écoulement à l’aide d’un petit morceau de papier de soie.
- Après le remplissage, scellez les deux côtés de la cellule d’écoulement avec une colle époxy (voir le tableau des matériaux) qui durcit lorsqu’elle est exposée à la lumière UV pendant 20 s.
REMARQUE: À ce stade, le matériau actif forme un réseau 3D qui reste suspendu dans la couche d’eau. - Pour confiner la couche active entre les deux fluides non miscibles dans une couche quasi-2D, placez la cellule d’écoulement dans une centrifugeuse à godet oscillant (voir Tableau des matériaux) avec la phase aqueuse sur le dessus et la couche d’huile plus dense en dessous. Centrifuger à 212 x g pendant 10 min. Une fois cette étape terminée, la cellule d’écoulement peut être amenée à un microscope à épifluorescence pour l’imagerie avec un objectif de grossissement 10x ou 20x. La figure 2C,D montre des images typiques avant et après cette étape.
- Préparer des lamelles hydrophiles avec un revêtement en acrylamide.
- Méthode inversée pour la formation nématique active
REMARQUE : Une autre méthode que celle décrite à l’étape 2.1 consiste à assembler la couche nématique active sous une couche d’huile épaisse confinée dans un puits PDMS profond28. Cette méthode produit des résultats similaires et est un peu plus facile à maîtriser; Cependant, la qualité d’image à l’aide de cette méthode n’est généralement pas aussi bonne que la méthode de la cellule d’écoulement.- Préparer le polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide d’un agent de durcissement élastomère et d’une base élastomère (voir le tableau des matériaux). Mélanger les deux composants dans un rapport 1:10 à l’aide d’une spatule en métal. De minuscules bulles apparaissent pendant le mélange qui sont difficiles à enlever, et le mélange semble laiteux. Pour éliminer ces bulles, placez le mélange sous vide pour dégazer pendant 1 h, après quoi le PDMS non durci devrait apparaître transparent.
REMARQUE: Le PDMS est maintenant prêt à former n’importe quelle forme à l’aide d’un moule, ou il peut durcir dans le récipient et ensuite être coupé ou poinçonné dans le motif souhaité. - Verser le PDMS dans un moule approprié et laisser durcir toute la nuit à 60 °C.
REMARQUE: Non traitée, la surface du PDMS durci est hydrophobe, mais avec un traitement de surface, elle peut être rendue hydrophile. - Pour préparer une surface PDMS hydrophile, enduire le PDMS d’une brosse polymère acrylamide29. Cette étape empêche également les protéines de coller à la surface.
- Commencez par nettoyer le PDMS pendant 10 minutes avec de l’éthanol et de l’isopropanol, puis rincez abondamment à l’eau désionisée 3x et séchez. Utilisez un nettoyant plasma pendant 5 minutes pour nettoyer le PDMS sec et durci. Cette étape rend la surface plus hydrophile.
- Ensuite, préparez une solution de silane (98,5 % en poids d’éthanol, 1 % en poids d’acide acétique et 0,5 % en poids de méthacrylate de triméthoxysilyle propyle) et immergez le substrat dans cette solution pendant 15 minutes pour préparer le revêtement d’acrylamide. Rincer abondamment le substrat à l’eau désionisée et l’immerger dans une solution d’acrylamide (solution d’acrylamide/bis à 2 % en poids, 2,3 mM MED et 3 mM de persulfate d’ammonium).
REMARQUE: Ces substrats peuvent être conservés à température ambiante recouverts d’une solution d’acrylamide dans une boîte de Petri en verre et doivent être utilisés dans les 2 semaines.
- Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, rincez la surface avec de l’eau désionisée et séchez-la avec de l’azote pour une utilisation immédiate. Ajouter le mélange actif (décrit à l’étape 2.1.6) dans les puits et ajouter immédiatement de l’huile de silicone sur le dessus jusqu’à une épaisseur d’environ 2 mm.
REMARQUE: À ce stade, le mélange actif sera pris en sandwich entre l’huile et le revêtement hydrophile sur le PDMS, mais il sera toujours quelque peu tridimensionnel. - Pour pousser le matériau plus loin dans une couche 2D, collez le dispositif PDMS sur une lame de verre, placez-le dans une centrifugeuse à godet pivotant et faites tourner pendant 12 minutes à 212 x g. Le dispositif devra être positionné de manière à ce que l’huile de silicone se trouve sur le dessus de la couche aqueuse. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 3.
- Préparer le polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide d’un agent de durcissement élastomère et d’une base élastomère (voir le tableau des matériaux). Mélanger les deux composants dans un rapport 1:10 à l’aide d’une spatule en métal. De minuscules bulles apparaissent pendant le mélange qui sont difficiles à enlever, et le mélange semble laiteux. Pour éliminer ces bulles, placez le mélange sous vide pour dégazer pendant 1 h, après quoi le PDMS non durci devrait apparaître transparent.
3. Préparation de la nématique active dans des géométries confinées
REMARQUE: La nématique active telle que ce système quasi-bidimensionnel peut être difficile à confiner dans de petites géométries microfluidiques telles que des puits ou des canaux. Ici, une méthode fiable pour confiner le matériau dans des puits PDMS de différentes formes est décrite.
- Tout d’abord, concevez un moule maître pour le PDMS. Cela peut être réalisé par des piliers d’impression 3D sur un substrat. Après impression 3D du moule maître en résine, nettoyer à l’isopropanol puis durcir le moule sous une lampe UV pendant 45 min et au four à 120 °C pendant 2 h (Figure 4).
REMARQUE: Le durcissement sous UV et post-durcissement thermique améliore la qualité de la réplication dans PDMS en éliminant les monomères et les résidus de photo-inhibiteurs de la résine30. - Utilisez le moule maître pour créer des puits à partir de PDMS. Préparez le PDMS comme décrit à l’étape 2.2.1. Immerger le moule maître dans du PDMS non durci et durcir pendant la nuit dans un four à 60 °C.
- Une fois le durcissement PDMS terminé, retirez soigneusement le moule maître et coupez le PDMS comme vous le souhaitez pour travailler avec les puits (Figure 4). Traitez la surface PDMS comme décrit à l’étape 2.2.3. Avant l’expérience, la surface peut être fixée à une lame de verre avec de la colle époxy pour faciliter l’imagerie.
- Pipeter 1 μL du mélange actif décrit à l’étape 2.1.6 sur le substrat PDMS et ajouter immédiatement de l’huile de silicone avec une viscosité28 de 100-1000 cSt sur la gouttelette active du réseau. Le réseau actif se déplacera dans le puits; ce processus prend jusqu’à 60 min (Figure 4). Comme décrit à l’étape 2.2.5, le réseau 2D peut être amélioré en faisant tourner le puits PDMS dans la centrifugeuse à godet oscillant pendant 12 min à 212 x g.
Representative Results
La figure 1 montre une image représentative de microtubules simples préparés à partir de tubuline GMPCPP. L’image montre de courts microtubules de longueurs similaires (avec une certaine dispersion). Une dilution suffisante de la solution de microtubules devrait produire une image de microtubules bien séparés pour la vérification de la longueur. Les microtubules individuels peuvent être difficiles à imager en raison de leur petite taille. L’utilisation d’une caméra haute sensibilité conçue pour la microscopie à fluorescence est la meilleure pour cette application. La figure 2 et la figure 3 montrent des exemples d’images de microscopie à fluorescence d’expériences réussies réalisées à l’aide de la méthode de la cellule d’écoulement (section 2.1) et de la méthode inversée (section 2.2), respectivement. Une couche nématique active bien formée a une texture homogène, sans zones de vide significatives ni défauts topologiques mobiles. Notez cependant qu’il peut y avoir de petits vides acceptables dans les noyaux défectueux. En plus des exemples présentés à la figure 2 et à la figure 3, trois films supplémentaires (film 1, film 2 et film 3) ont été inclus pour démontrer comment la nématique active devrait apparaître dans une expérience réussie. Tous les films démontrent le mouvement continu et fluide de la phase nématique active. Aucune variation de la concentration en microtubules n’est apparente une fois que le matériau a atteint son état d’équilibre. Tant qu’il y a suffisamment d’ATP dans le système, le matériau continuera à se déplacer uniformément.
Figure 1 : Image au microscope à fluorescence des microtubules GMPCPP. Les microtubules GMPCPP ont été marqués à 4% avec de la tubuline rhodamine et polymérisés pendant 20 min à 37 °C. L’imagerie a été réalisée à température ambiante. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Nématique des microtubules dans une cellule d’écoulement. (A) Schéma en coupe transversale de la cellule d’écoulement, géométrie de 1 mm x 18 mm. (B) Schéma de la vue de dessus de la cellule d’écoulement. (C) Image de microscopie à fluorescence montrant l’aspect typique de la solution active avant son assemblage à l’interface huile/eau. (D) Image par microscopie à fluorescence de la phase nématique active assemblée à l’interface huile/eau à l’intérieur de la cellule d’écoulement. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Image au microscope à fluorescence montrant une nématique active préparée selon la méthode inversée. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Organigramme illustrant la méthode de confinement nématique actif dans un puits PDMS, y compris la fabrication de moules et le traitement de surface. Barre d’échelle sur l’image de droite (matière active confinée) = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film 1 : Résultat représentatif de la nématique active préparée à l’aide de la méthode de la cellule d’écoulement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 2: Résultat représentatif de la nématique active préparée à l’aide de la méthode inversée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 3 : Résultat représentatif de la nématique active préparée selon la méthode inversée confinée à un puits elliptique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Discussion
Il y a quelques points dans les protocoles où l’expérimentateur peut faire des vérifications importantes. Avant de remplir l’un ou l’autre des dispositifs avec un matériau actif, la microscopie à fluorescence (voir Figure 1) doit être utilisée pour vérifier que les microtubules sont polymérisés et idéalement de ~2-3 μm de longueur. Si les microtubules ne sont pas visibles au microscope, ils peuvent s’être dépolymérisés et la nématique active ne se formera pas. Parce que les microtubules individuels sont très petits, il peut être difficile de les observer directement au microscope. Dans cette étude, une caméra à fluorescence de haute qualité conçue pour des applications difficiles à faible luminosité a été utilisée avec le logiciel associé pour vérifier la croissance du filament. Aucun agrégat fluorescent significatif ne doit être présent à ce stade, car cela peut indiquer une dépolymérisation ou la présence de protéines dénaturées. C’est aussi une bonne idée de faire une simple lame de test de microscope en combinant des microtubules, MIX et ATP dans les mêmes proportions que celles décrites dans les protocoles. L’activité devrait commencer lors de la combinaison des composants et le matériau devrait ressembler à celui illustré à la figure 2C avec des faisceaux présents et des mouvements de filament visibles partout.
Lors de l’utilisation de la méthode de la cellule d’écoulement, le temps de centrifugation et l’orientation de la cellule d’écoulement sont importants pour la formation d’une couche active uniforme. Cette étape peut nécessiter quelques ajustements en fonction du type de centrifugeuse utilisé. La centrifugation de la cellule d’écoulement avec le plan actif orienté perpendiculairement au plan de rotation donne les meilleurs résultats car le matériau peut être poussé uniformément sur l’interface du fluide. Vérifiez que la cellule d’écoulement est soigneusement scellée avant de la centrifuger.
Lors de l’utilisation de la méthode inversée pour produire une nématique active confinée, il y a plusieurs étapes à optimiser. Tout d’abord, il est important d’utiliser une méthode d’impression 3D qui produit des structures à haute résolution. Des parois latérales inégales peuvent provoquer la capture des microtubules, ce qui perturbera les écoulements. Les puits ne doivent pas être trop profonds (des puits de 150 à 200 μm de profondeur avec une couche de pétrole sus-jacente de 2 mm d’épaisseur ont été utilisés dans cette étude). Les expérimentateurs peuvent avoir besoin d’ajuster légèrement ces paramètres par essais et erreurs pour obtenir le meilleur résultat.
La méthode des cellules d’écoulement et la méthode inversée ont été utilisées par différents auteurs pour examiner une variété d’effets qui ont un impact sur les flux actifs, y compris différentes huiles12 et structures immergées13. Le choix de la méthode dépend de l’objectif expérimental. En utilisant la méthode de la cellule d’écoulement, l’imagerie optique au-dessus de la couche active est plus claire que pour la méthode inversée en raison des différents fluides sus-jacents. Dans la méthode de la cellule d’écoulement, l’imagerie est réalisée à travers un couvercle en verre et une fine couche d’eau, tandis que la méthode inversée est conçue pour avoir la couche d’huile sur le dessus. Cela signifie qu’un objectif de longue distance de travail est nécessaire pour la méthode inversée et que la qualité de l’image est réduite. Les différences de qualité d’image peuvent être observées en comparant la figure 2D (méthode des cellules d’écoulement) et la figure 3 (méthode inversée), ainsi que les films 1 et 2, respectivement. Une lentille à grossissement plus faible avec une distance de travail plus longue était nécessaire pour la figure 3 que celle utilisée pour la figure 2. Ces inconvénients d’imagerie pour la méthode inversée peuvent être évités si un microscope inversé approprié est disponible, combiné avec des objectifs avec une distance de travail appropriée pour les substrats de lames de microscope. Le verre plus mince peut être utilisé comme substrat pour permettre l’utilisation d’objectifs de distance de travail standard.
Comme avantage, la géométrie inversée permet l’utilisation d’une plus large gamme de viscosités d’huile, ne nécessite pas nécessairement une centrifugation à godet oscillant (si cela n’est pas disponible) et la préparation du système est relativement plus facile une fois le moule préparé. Cependant, pour le confinement dans des puits utilisant la méthode inversée, une certaine centrifugation peut être importante pour amener le matériau dans une couche 2D bien définie.
La méthode des cellules d’écoulement a récemment été utilisée avec beaucoup de succès dans des expériences où une couche active continue est nécessaire. Nos travaux récents ont examiné la dynamique des défauts topologiques dans la couche active, où l’imagerie et l’analyse de texture de haute qualité sont importantes19. En outre, la méthode des cellules d’écoulement a été utilisée pour étudier les effets des microstructures immergées dans le pétrole sur les écoulements actifs16 et les piliers pour piéger les défauts dans les écoulements actifs31. Cette méthode fonctionne très bien pour la formation d’une couche active continue, et la qualité d’image est excellente. Cependant, l’étape de centrifugation utilisée pour produire la couche active 2D finale peut être difficile à réaliser, et les cellules d’écoulement sont sujettes aux fuites et aux bulles d’air. La méthode inversée est une alternative très utile avec un taux de réussite élevé, est facile à construire et peut être utilisée pour n’importe quel motif ou géométrie de substrat à condition qu’un moule maître imprimé en 3D haute résolution puisse être créé. Cette méthode est également utile pour examiner les effets du confinement géométrique sur la dynamique nématique active, car elle rend le remplissage des puits relativement simple.
Dans cet article, deux façons de former une nématique active à partir de microtubules et de moteurs kinésines sont décrites, ainsi qu’une technique pour confiner les matériaux dans des puits. Le système présenté représente l’exemple le plus propre d’une phase nématique active actuellement dans la littérature et a été reproduit par plusieurs groupes à travers le monde. L’importance de ce matériau réside non seulement dans les origines biologiques de ses composants, mais aussi parce qu’il ouvre une toute nouvelle direction dans les fluides ordonnés actifs. En travaillant avec ce système et en élucidant ses propriétés fondamentales, les scientifiques peuvent évoluer vers la conception de phases actives entièrement synthétiques.
Les expériences axées sur les effets du confinement sur la nématique active ont le potentiel de répondre à des questions fondamentales concernant le comportement des flux actifs et la dynamique des défauts topologiques sous confinement topologique. La méthode présentée ici aidera à la réalisation d’une variété d’expériences axées sur la géométrie et à leur analyse, y compris la microfluidique et le mélange actif.
Disclosures
Certains matériaux utilisés dans ce travail ont été fournis gratuitement par Cytoskeleton Inc. (Denver, États-Unis).
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le prix DMR-1808926 de la National Science Foundation (NSF) pour son généreux financement. Le projet a également été soutenu par la NSF par l’intermédiaire du Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines de l’Université de Californie Merced (HRD-1547848) et du Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Nous tenons à remercier le Dr Bin Liu de l’Université de Californie Merced pour son aide dans l’impression 3D du moule, et le Dr Jordi Ignes pour ses conseils scientifiques lors du développement de la méthode expérimentale inversée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
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