Les méthodes de préparation de la nématique active à partir de microtubules et de moteurs kinésines présentées ici, y compris la préparation et la construction de protéines et l’utilisation de puits pour le confinement nématique actif.
La formation de phases actives à base de biopolymères est devenue une technique importante pour les chercheurs intéressés à explorer le domaine émergent des cristaux liquides actifs et leurs rôles possibles en biologie cellulaire. Ces nouveaux systèmes sont constitués de sous-unités autonomes qui consomment de l’énergie localement, produisant un fluide dynamique hors équilibre. Pour former la phase à cristaux liquides actifs décrite dans ce rapport, des composants protéiques purifiés, y compris des biopolymères et des moteurs moléculaires, sont combinés, et la phase nématique active se forme spontanément en présence d’adénosine triphosphate (ATP). Pour observer l’état nématique, le matériau doit être confiné dans une géométrie appropriée pour la microscopie à une densité suffisamment élevée. Cet article décrit deux méthodes différentes pour la formation d’une phase nématique active à l’aide de microtubules et de moteurs kinésines : assemblage d’une couche active bidimensionnelle à l’interface huile-eau et assemblage sous couche d’huile à l’aide d’un puits élastomère. Des techniques pour insérer le matériau actif dans de petits puits de différentes formes sont également décrites.
Les fluides actifs sont composés de particules ou d’éléments énergétiques qui puisent le carburant dans leur environnement local. Dans les bonnes conditions, ces éléments actifs mobiles peuvent agir collectivement pour produire une dynamique des fluides émergente sur de longues échelles de longueur. Il existe une variété d’exemples d’un tel comportement de phase hors équilibre dans la littérature et les phases actives peuvent être trouvées dans tout le spectre des systèmes vivants. Quelques exemples notables sont les colonies de bactéries1, les feuillets cellulaires2,3 et le flocage ou l’essaimage d’organismes 4,5. Les phases actives ont également été largement étudiées dans les phases condensées des filaments cytosquelettiques, soit dans le cadre de la cellule6, soit dans des systèmes synthétiques conçus pour utiliser des composants extraits biologiquement 7,8,9. L’ordre cristallin liquide et la formation de défauts topologiques dans les systèmes naturels et synthétiques assemblés à partir d’extraits biologiques présentent un intérêt particulier pour la communauté des chercheurs. Au cours des dernières années, des groupes de recherche ont examiné ces systèmes, leurs propriétés physiques fondamentales et leur pertinence pour la biologie 2,3,10,11.
Cet article se concentre sur la formation de l’état nématique actif à partir d’une combinaison de microtubules et de protéines motrices kinésines. Le cristal liquide nématique traditionnel est une phase d’équilibre de la matière dans laquelle les molécules constitutives présentent un ordre d’orientation. Par exemple, un fluide constitué de molécules relativement rigides en forme de bâtonnets peut présenter à la fois la phase nématique et, à des températures plus élevées, une phase fluide isotrope non orientée12. Le premier exemple expérimental d’une phase nématique active a été développé par Sanchez et al.13, adaptant une expérience in vitro antérieure 14 dans laquelle des grappes de protéines motrices ont été utilisées pour produire un mouvement de cisaillement entre les faisceaux de microtubules voisins. Lorsque ce système de microtubules a été confiné à une couche mince, un ordre nématique spontané a émergé. Au cours des dernières années, l’état nématique actif a été étudié intensivement par plusieurs groupes de recherche expérimentaux 15,16 etthéoriques 17,18, en se concentrant sur des phénomènes tels que la turbulence active – un état dans lequel le fluide produit des écoulements chaotiques auto-entraînés 19 – et les défauts topologiques mobiles. Cet article décrit les méthodes de préparation et de formation de l’état nématique actif à partir de microtubules et de moteurs kinésine dans différentes géométries expérimentales. Tout d’abord, les méthodes de préparation pour les différentes solutions de composants sont décrites, suivies des méthodes de formation de la nématique active en utilisant deux géométries de chambre d’écoulement différentes. Les résultats d’imagerie typiques sont affichés. Enfin, des méthodes de confinage de la nématique active dans des puits et des canaux sont décrites.
Il y a quelques points dans les protocoles où l’expérimentateur peut faire des vérifications importantes. Avant de remplir l’un ou l’autre des dispositifs avec un matériau actif, la microscopie à fluorescence (voir Figure 1) doit être utilisée pour vérifier que les microtubules sont polymérisés et idéalement de ~2-3 μm de longueur. Si les microtubules ne sont pas visibles au microscope, ils peuvent s’être dépolymérisés et la nématique active ne se formera pas. Parce que les microtubules individuels sont très petits, il peut être difficile de les observer directement au microscope. Dans cette étude, une caméra à fluorescence de haute qualité conçue pour des applications difficiles à faible luminosité a été utilisée avec le logiciel associé pour vérifier la croissance du filament. Aucun agrégat fluorescent significatif ne doit être présent à ce stade, car cela peut indiquer une dépolymérisation ou la présence de protéines dénaturées. C’est aussi une bonne idée de faire une simple lame de test de microscope en combinant des microtubules, MIX et ATP dans les mêmes proportions que celles décrites dans les protocoles. L’activité devrait commencer lors de la combinaison des composants et le matériau devrait ressembler à celui illustré à la figure 2C avec des faisceaux présents et des mouvements de filament visibles partout.
Lors de l’utilisation de la méthode de la cellule d’écoulement, le temps de centrifugation et l’orientation de la cellule d’écoulement sont importants pour la formation d’une couche active uniforme. Cette étape peut nécessiter quelques ajustements en fonction du type de centrifugeuse utilisé. La centrifugation de la cellule d’écoulement avec le plan actif orienté perpendiculairement au plan de rotation donne les meilleurs résultats car le matériau peut être poussé uniformément sur l’interface du fluide. Vérifiez que la cellule d’écoulement est soigneusement scellée avant de la centrifuger.
Lors de l’utilisation de la méthode inversée pour produire une nématique active confinée, il y a plusieurs étapes à optimiser. Tout d’abord, il est important d’utiliser une méthode d’impression 3D qui produit des structures à haute résolution. Des parois latérales inégales peuvent provoquer la capture des microtubules, ce qui perturbera les écoulements. Les puits ne doivent pas être trop profonds (des puits de 150 à 200 μm de profondeur avec une couche de pétrole sus-jacente de 2 mm d’épaisseur ont été utilisés dans cette étude). Les expérimentateurs peuvent avoir besoin d’ajuster légèrement ces paramètres par essais et erreurs pour obtenir le meilleur résultat.
La méthode des cellules d’écoulement et la méthode inversée ont été utilisées par différents auteurs pour examiner une variété d’effets qui ont un impact sur les flux actifs, y compris différentes huiles12 et structures immergées13. Le choix de la méthode dépend de l’objectif expérimental. En utilisant la méthode de la cellule d’écoulement, l’imagerie optique au-dessus de la couche active est plus claire que pour la méthode inversée en raison des différents fluides sus-jacents. Dans la méthode de la cellule d’écoulement, l’imagerie est réalisée à travers un couvercle en verre et une fine couche d’eau, tandis que la méthode inversée est conçue pour avoir la couche d’huile sur le dessus. Cela signifie qu’un objectif de longue distance de travail est nécessaire pour la méthode inversée et que la qualité de l’image est réduite. Les différences de qualité d’image peuvent être observées en comparant la figure 2D (méthode des cellules d’écoulement) et la figure 3 (méthode inversée), ainsi que les films 1 et 2, respectivement. Une lentille à grossissement plus faible avec une distance de travail plus longue était nécessaire pour la figure 3 que celle utilisée pour la figure 2. Ces inconvénients d’imagerie pour la méthode inversée peuvent être évités si un microscope inversé approprié est disponible, combiné avec des objectifs avec une distance de travail appropriée pour les substrats de lames de microscope. Le verre plus mince peut être utilisé comme substrat pour permettre l’utilisation d’objectifs de distance de travail standard.
Comme avantage, la géométrie inversée permet l’utilisation d’une plus large gamme de viscosités d’huile, ne nécessite pas nécessairement une centrifugation à godet oscillant (si cela n’est pas disponible) et la préparation du système est relativement plus facile une fois le moule préparé. Cependant, pour le confinement dans des puits utilisant la méthode inversée, une certaine centrifugation peut être importante pour amener le matériau dans une couche 2D bien définie.
La méthode des cellules d’écoulement a récemment été utilisée avec beaucoup de succès dans des expériences où une couche active continue est nécessaire. Nos travaux récents ont examiné la dynamique des défauts topologiques dans la couche active, où l’imagerie et l’analyse de texture de haute qualité sont importantes19. En outre, la méthode des cellules d’écoulement a été utilisée pour étudier les effets des microstructures immergées dans le pétrole sur les écoulements actifs16 et les piliers pour piéger les défauts dans les écoulements actifs31. Cette méthode fonctionne très bien pour la formation d’une couche active continue, et la qualité d’image est excellente. Cependant, l’étape de centrifugation utilisée pour produire la couche active 2D finale peut être difficile à réaliser, et les cellules d’écoulement sont sujettes aux fuites et aux bulles d’air. La méthode inversée est une alternative très utile avec un taux de réussite élevé, est facile à construire et peut être utilisée pour n’importe quel motif ou géométrie de substrat à condition qu’un moule maître imprimé en 3D haute résolution puisse être créé. Cette méthode est également utile pour examiner les effets du confinement géométrique sur la dynamique nématique active, car elle rend le remplissage des puits relativement simple.
Dans cet article, deux façons de former une nématique active à partir de microtubules et de moteurs kinésines sont décrites, ainsi qu’une technique pour confiner les matériaux dans des puits. Le système présenté représente l’exemple le plus propre d’une phase nématique active actuellement dans la littérature et a été reproduit par plusieurs groupes à travers le monde. L’importance de ce matériau réside non seulement dans les origines biologiques de ses composants, mais aussi parce qu’il ouvre une toute nouvelle direction dans les fluides ordonnés actifs. En travaillant avec ce système et en élucidant ses propriétés fondamentales, les scientifiques peuvent évoluer vers la conception de phases actives entièrement synthétiques.
Les expériences axées sur les effets du confinement sur la nématique active ont le potentiel de répondre à des questions fondamentales concernant le comportement des flux actifs et la dynamique des défauts topologiques sous confinement topologique. La méthode présentée ici aidera à la réalisation d’une variété d’expériences axées sur la géométrie et à leur analyse, y compris la microfluidique et le mélange actif.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le prix DMR-1808926 de la National Science Foundation (NSF) pour son généreux financement. Le projet a également été soutenu par la NSF par l’intermédiaire du Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines de l’Université de Californie Merced (HRD-1547848) et du Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Nous tenons à remercier le Dr Bin Liu de l’Université de Californie Merced pour son aide dans l’impression 3D du moule, et le Dr Jordi Ignes pour ses conseils scientifiques lors du développement de la méthode expérimentale inversée.
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |