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Biology

माइक्रोट्यूबुल्स-आधारित सक्रिय नेमैटिक्स बनाना, सीमित करना और निरीक्षण करना

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64287
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Physics, University of California

Summary

यहां प्रस्तुत सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर्स से सक्रिय नेमैटिक्स तैयार करने के तरीके हैं, जिसमें प्रोटीन तैयार करना और निर्माण और सक्रिय नेमेटिक कारावास के लिए कुओं का उपयोग शामिल है।

Abstract

बायोपॉलीमर-आधारित सक्रिय चरणों का गठन सक्रिय तरल क्रिस्टल के उभरते क्षेत्र और सेल जीव विज्ञान में उनकी संभावित भूमिकाओं की खोज में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक बन गया है। इन नवीन प्रणालियों में स्व-संचालित उप-इकाइयाँ शामिल हैं जो स्थानीय रूप से ऊर्जा का उपभोग करती हैं, जो संतुलन से बाहर गतिशील तरल पदार्थ का उत्पादन करती हैं। इस रिपोर्ट में वर्णित सक्रिय तरल क्रिस्टल चरण बनाने के लिए, बायोपॉलिमर और आणविक मोटर्स सहित शुद्ध प्रोटीन घटकों को जोड़ा जाता है, और सक्रिय नेमेटिक चरण अनायास एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की उपस्थिति में बनता है। नेमेटिक अवस्था का निरीक्षण करने के लिए, सामग्री को उच्च पर्याप्त घनत्व पर माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयुक्त ज्यामिति में सीमित किया जाना चाहिए। यह लेख सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर्स का उपयोग करके एक सक्रिय नेमेटिक चरण के गठन के लिए दो अलग-अलग तरीकों का वर्णन करता है: एक तेल और पानी के इंटरफ़ेस पर दो आयामी सक्रिय परत की असेंबली और एक इलास्टोमेरिक कुएं का उपयोग करके एक तेल परत के नीचे असेंबली। विभिन्न आकृतियों के छोटे कुओं में सक्रिय सामग्री डालने की तकनीकों का भी वर्णन किया गया है।

Introduction

सक्रिय तरल पदार्थ ऊर्जा संचालित कणों या तत्वों से बने होते हैं जो अपने स्थानीय वातावरण से ईंधन खींचते हैं। सही परिस्थितियों में, ये मोटिव सक्रिय तत्व लंबी लंबाई-तराजू पर आकस्मिक द्रव गतिशीलता का उत्पादन करने के लिए सामूहिक रूप से कार्य कर सकते हैं। साहित्य में इस तरह के आउट-ऑफ-संतुलन चरण व्यवहार के कई उदाहरण हैं और सक्रिय चरण जीवित प्रणालियों के स्पेक्ट्रम में पाए जा सकते हैं। कुछ उल्लेखनीय उदाहरण बैक्टीरिया1 की कॉलोनियां, सेल शीट 2,3, और जीवों के झुंड या गर्म करने वाले 4,5 हैं। साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स के संघनित चरणों में सक्रिय चरणों का भी बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, या तो सेल6 के हिस्से के रूप में या जैविक रूप से निकाले गए घटकों 7,8,9 का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किए गए सिंथेटिक सिस्टम में। तरल क्रिस्टलीय आदेश और जैविक अर्क से इकट्ठे प्राकृतिक रूप से होने वाले और सिंथेटिक सिस्टम दोनों में टोपोलॉजिकल दोषों का गठन अनुसंधान समुदाय के लिए विशेष रुचि रखता है। हाल के वर्षों में, अनुसंधान समूहों ने ऐसी प्रणालियों, उनके मौलिक भौतिक गुणों और जीव विज्ञान 2,3,10,11 के लिए उनकी प्रासंगिकता की जांच की है।

यह पेपर सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर प्रोटीन के संयोजन से सक्रिय नेमेटिक अवस्था के गठन पर केंद्रित है। पारंपरिक नेमेटिक तरल क्रिस्टल पदार्थ का एक संतुलन चरण है जिसमें घटक अणु अभिविन्यास क्रम प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, अपेक्षाकृत कठोर रॉड जैसे अणुओं से युक्त एक तरल पदार्थ नेमेटिक चरण और उच्च तापमान पर, एक अनओरिएंटेड आइसोट्रोपिक द्रव चरण12 दोनों का प्रदर्शन कर सकता है। एक सक्रिय नेमेटिक चरण का पहला प्रयोगात्मक उदाहरण सांचेज एट अल .13 द्वारा विकसित किया गया था, जो पहले के इन विट्रो प्रयोग14 को अनुकूलित करता था जिसमें मोटर प्रोटीन के समूहों का उपयोग पड़ोसी सूक्ष्मनलिका बंडलों के बीच एक कतरनी गति उत्पन्न करने के लिए किया गया था। जब यह सूक्ष्मनलिका प्रणाली एक पतली परत तक ही सीमित थी, तो सहज नेमेटिक ऑर्डरिंग उभरी। हाल के वर्षों में, सक्रिय न्यूमैटिक स्थिति का कई प्रयोगात्मक15,16 और सैद्धांतिक17,18 शोध समूहों द्वारा गहन अध्ययन किया गया है, जो सक्रिय अशांति जैसी घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करता है - एक ऐसी स्थिति जिसमें तरल पदार्थ स्व-संचालित अराजक प्रवाह पैदा करता है19 - और मोबाइल टोपोलॉजिकल दोष। यह पेपर विभिन्न प्रयोगात्मक ज्यामिति में सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर्स से सक्रिय नेमेटिक स्थिति तैयार करने और बनाने के तरीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, विभिन्न घटक समाधानों के लिए तैयारी के तरीकों का वर्णन किया गया है, इसके बाद दो अलग-अलग प्रवाह कक्ष ज्यामिति का उपयोग करके सक्रिय नेमेटिक बनाने के तरीके हैं। विशिष्ट इमेजिंग परिणाम दिखाए गए हैं। अंत में, कुओं और चैनलों में सक्रिय नेमेटिक को सीमित करने के तरीकों का वर्णन किया गया है।

Protocol

1. सक्रिय सामग्री तैयार करना

नोट: 2 डी सक्रिय नेमेटिक को तीन-चरण यी प्रक्रिया में इकट्ठा किया जाता है। सबसे पहले, दो अलग-अलग समाधान तैयार किए जाते हैं: ए) पॉलीमराइज्ड, स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं और बी) मिक्स (काइन्सिन मोटर्स युक्त एक समाधान)। ये संयुक्त होते हैं और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) जोड़ने पर गतिविधि शुरू की जाती है। सामग्री को तब एक उपयुक्त ज्यामिति में सीमित किया जाता है, जैसे कि इसका घनत्व न्यूमैटिक क्रम के उभरने के लिए पर्याप्त है। प्रोटोकॉल सभी आवश्यक घटकों की तैयारी और सक्रिय चरण को इकट्ठा करने के तरीके के लिए शामिल हैं।

  1. किन्सिन मोटर प्रोटीन क्लस्टर तैयारी
    1. एडगर सी यंग 20 द्वारा प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एस्चेरिचिया कोलाई से पुनः संयोजक के 401-बायो मोटर प्रोटीन (के401 मोटर्स) को व्यक्त और शुद्ध करें।
      नोट: K401-BIO मोटर प्रोटीन डिमेरिक होते हैं और इसमें एक पेचदार डंठल से जुड़े दो सिर होते हैं। मोटर्स को ब्रैंडिस बायोमैटेरियल्स फैसिलिटी द्वारा आपूर्ति की गई थी और पहले की रिपोर्ट के अनुसार उपयोग कियागया था। एक सक्रिय नेमेटिक बनाने के प्रयोजनों के लिए, काइन्सिन अणुओं को बायोटिनाइलेटेड किया जाता है और फिर स्ट्रेप्टाविडिन लिंकेज के माध्यम से जोड़ा जाता है ताकि चार मोटर्स 13,15,21,22 तक के किनेसिन क्लस्टर बनाए जा सकें। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग के साथ काइन्सिन को व्यक्त करना सहायक है।
    2. 40 मिनट के लिए बर्फ पर स्ट्रेप्टाविडिन और मोटर्स के शुद्धिकरण और इनक्यूबेशन के बाद, के 401 मोटर्स को तरल नाइट्रोजन में 0.7 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता पर 5 μL एलिकोट में फ्लैश-फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रयोग को यहां रोका जा सकता है। जरूरत पड़ने पर धीरे से काइन्सिन को पिघलाएं और फिर से फ्रीज न करें।
    3. 0.7 मिलीग्राम/एमएल के401 मोटर्स के 24 वॉल्यूम%, 0.325 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टाविडिन के 27 वॉल्यूम% और 5 एमएम डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के 3 वॉल्यूम% (एकत्रीकरण को रोकने के लिए) को 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाकर बायोटिन-लेबल काइन्सिन (केएसए) β के क्लस्टर तैयारकरें। एन, एन', एन'-टेट्राएसिटिक एसिड)।)। केएसए को 40 मिनट के लिए बर्फ पर सेने दें।
  2. सूक्ष्मनलिका समाधान तैयार करना
    नोट: गुआनोसिन -5'-[(α,β)-मेथिलेनो] ट्राइफॉस्फेट, सोडियम नमक (जीएमपीसीपीपी) गुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) का एक धीरे-धीरे हाइड्रोलाइजेबल एनालॉग है, और जीएमपीसीपी की उपस्थिति में बनने वाले सूक्ष्मनलिकाएं जीटीपी सूक्ष्मनलिकाएं23 और उससे कम की तुलना में तीन गुना कठोर हैं। छोटे, कठोर सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग सक्रिय नेमेटिक चरण के गठन के लिए अनुकूल है क्योंकि ये कारक तरल क्रिस्टलीय आदेश को बढ़ावा देने के लिए गठबंधन करते हैं।
    1. 6 मिलीग्राम / एमएल की ट्यूबुलिन एकाग्रता पर 0.6 एमएम जीएमपीसीपीपी का उपयोग करके बिना लेबल वाले चक्रित ट्यूबुलिन (99%, सामग्री की तालिका देखें) को पॉलीमराइज करें।
      नोट: उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूबुलिन को स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए गोजातीय या पोर्सिन मस्तिष्क से भी शुद्ध किया जा सकता है या ब्रांडिस बायोमैटेरियल्स सुविधा जैसे किसी अन्य विश्वसनीय स्रोत से प्राप्त किया जा सकता है जहां क्षति को रोकने के लिए सामग्री जमे हुए भेजी जा सकती है। गोजातीय मस्तिष्क से ट्यूबुलिन शुद्धिकरण के लिए, कृपया बेट एट अल.24 से प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें। पोर्सिन मस्तिष्क से ट्यूबुलिन शुद्धिकरण के लिए, कैस्टोल्डी एट अल.25 और तायार एट अल.26 से प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें।
    2. पोलीमराइजेशन की तैयारी में, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी स्नान तैयार करें और सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-कूल करें। पोलीमराइजेशन के बाद 4% लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं उत्पन्न करने के लिए 4 मोल% रोडामाइन-लेबल ट्यूबुलिन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ 500 μL अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एम 2 बी बफर (चरण 1.1.3) में अनलेबल ट्यूबुलिन समाधान को मिलाएं।
    3. ब्रैडफोर्ड परख27 का उपयोग करके ट्यूबुलिन एकाग्रता को सत्यापित करें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कुल ट्यूबुलिन एकाग्रता 6.5-6.9 मिलीग्राम / एमएल होनी चाहिए।
    4. ट्यूबुलिन मिश्रण को बर्फ पर 10 मिनट के लिए और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 352,700 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह कदम निष्क्रिय ट्यूबुलिन को हटा देता है, जो गोली में होगा।
    5. पिपेट का उपयोग करके, कार्यात्मक ट्यूबुलिन युक्त सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निकालें। प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने के लिए ट्यूबुलिन पोलीमराइजेशन और डीटीटी को 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता में प्रेरित करने के लिए जीएमपीसीपीपी को 0.6 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    6. मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी स्नान में इनक्यूबेट करें, फिर कमरे के तापमान पर 14,000 x g पर 10 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, फिर 6 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम सूक्ष्मनलिका एकाग्रता तक पहुंचने के लिए एम 2 बी बफर के साथ गोली को पतला करें।
      नोट: इस समाधान को उपयोग से पहले कम से कम 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. यह जांचने के लिए कि सूक्ष्मनलिकाएं सफलतापूर्वक बहुलक हो गई हैं, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एम 2 बी बफर और पिपेट के साथ सूक्ष्मनलिका समाधान 100: 1 के 1 μL को पतला करें। 40x उद्देश्य लेंस के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके इमेजिंग के लिए कवर स्लिप के साथ कवर करें।
      नोट: उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को सूक्ष्मनलिकाएं पर उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति लेबलिंग के अनुसार चुना जाता है। इस प्रोटोकॉल में, रोडामाइन लेबलिंग का उपयोग किया जाता है (चरण 1.2.2 देखें), इसलिए इमेजिंग 515-560 एनएम के उत्तेजना बैंड और 590 एनएम लंबे पास फिल्टर का उपयोग करके की जाती है। चित्र 1 एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है।
    8. पोलीमराइजेशन पूरा होने के बाद, सूक्ष्मनलिकाएं तरल नाइट्रोजन में 2 μL एलिकोट के रूप में ड्रॉप-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस (यदि आवश्यक हो) पर स्टोर करें।
  3. मिक्स की तैयारी
    नोट: मिक्स एक जलीय घोल है जिसमें काइन्सिन-स्ट्रेप्टाविडिन क्लस्टर (केएसए) शामिल हैं। तैयार मिक्स को प्रयोग से पहले 4 μL एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। जब MIX को एटीपी और कमरे के तापमान पर चरण 1.2 में वर्णित सूक्ष्मनलिका समाधान के साथ जोड़ा जाता है, तो गतिविधि शुरू होती है। MIXनिम्नानुसार 13,19 तैयार किया गया है।
    1. दो एंटीऑक्सिडेंट समाधानों को मिलाकर प्रतिदीप्ति लुप्त (एंटीफैड) को रोकने के लिए एक समाधान तैयार करें। एओ 1 (250 एमएम डीटीटी, 65 एमएम कैटालेज) और एओ 2 (750 μM कैटालेज, 3 mM ग्लूकोज ऑक्सीडेज) को 1: 1 वॉल्यूम अनुपात में मिलाएं। 20 एमएम ट्रोलॉक्स शामिल करें, एक और एंटीऑक्सिडेंट जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के कारण होने वाले नुकसान को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है।
    2. केएसए (चरण 1.1.3 में वर्णित) का समाधान बनाकर मिक्स तैयार करें जिसमें एटीपी पुनर्जनन के लिए 70 मिलीग्राम / एमएल पर सूक्ष्मनलिकाएं, 3 वॉल्यूम% एंटीफैड और 5 वॉल्यूम% पाइरूवेट किनेज / लैक्टिक डिहाइड्रोजनेज (पीकेएलडीएच) के बंडलिंग को प्रेरित करने के लिए 6 डब्ल्यूटी% 20 केडीए पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (पीईजी) शामिल हैं।

2. सक्रिय नेमेटिक बनाना

नोट: सामग्री में गतिविधि एटीपी जोड़ द्वारा शुरू की जाती है। सक्रिय नेटवर्क को मोटर गतिविधि को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त एकाग्रता पर एटीपी जोड़कर प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा तैयार किया जाता है। एक समान, पूरी तरह से विकसित सक्रिय नेमेटिक चरण बनाने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं पर्याप्त रूप से उच्च घनत्व पर होनी चाहिए। यह दो-आयामी (2 डी) सक्रिय नेमेटिक परत बनाने के लिए दो अपरिवर्तनीय तरल पदार्थों के बीच सूक्ष्मनलिकाएं को सीमित करके प्राप्त किया जा सकता है। यह विधि मूल रूप से ब्रैंडिस विश्वविद्यालय13 में विकसित की गई थी और एक सजातीय, उच्च गुणवत्ता, सक्रिय नेमेटिक चरण के उत्पादन के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बनी हुई है।

  1. सक्रिय नेमेटिक गठन के लिए प्रवाह सेल विधि
    1. एक्रिलामाइड कोटिंग के साथ हाइड्रोफिलिक कवरलिप तैयार करें।
      1. नैनोप्योर पानी का उपयोग करके वैकल्पिक कुल्ला के साथ साबुन के पानी, इथेनॉल और 0.1 एम एनएओएच के साथ कवरलिप्स को अच्छी तरह से साफ करें। एक बार धोने के बाद, कवरलिप्स को 100 एमएल इथेनॉल, 1 एमएल एसिटिक एसिड और 500 लीटर 3-(ट्राइमेथॉक्सिसिल) प्रोपाइलमेथैक्रिलेट से बने सिलेन घोल के साथ 15 मिनट के लिए कोट करें, फिर नैनोप्योर पानी से धो लें।
      2. नैनोप्योर पानी के 95 एमएल और 40 डब्ल्यूटी% एक्रिलामाइड के 5 एमएल से एक्रिलामाइड समाधान तैयार करें, फिर वैक्यूम ओवन में 30 मिनट के लिए घोल को डीगैस करें।
      3. 2.3 mM अंतिम सांद्रता के लिए टेट्रामेथाइलेथिलीनडायमाइन (TEMED) का 35 μL जोड़ें और फिर 0.07 ग्राम अमोनियम परसल्फेट जोड़ें। एक्रिलामाइड घोल को कवरलिप्स पर डालें, जबकि कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. हाइड्रोफोबिक माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पानी विकर्षक घोल ( सामग्री की तालिका देखें) के पिपेट 100 μL, फिर शीर्ष पर एक और साफ ग्लास स्लाइड रखें। यह सतह पर पानी विकर्षक समाधान की एक समान परत सुनिश्चित करता है जहां यह 2 मिनट के लिए बैठता है। 2 मिनट के बाद, दूसरी ग्लास स्लाइड को हटा दें और पहली स्लाइड को नैनो-शुद्ध पानी से अच्छी तरह से धो लें, फिर नाइट्रोजन गैस से सुखाएं। धीरे से उस क्षेत्र को साफ करें जहां टेप को एसीटोन के साथ रखा जाएगा (पैटर्न के आसपास) यह सुनिश्चित करने के लिए कि पानी विकर्षक समाधान ग्लास के आसंजन को नहीं रोकता है।
    3. इंजीनियर तेल का एक मिश्रण तैयार करें जिसमें 1.8% (v/v) 008-फ्लोरोसर्फेक्टेंट शामिल है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. ग्लास स्लाइड को इकट्ठा करें और फ्लो सेल के तल पर हाइड्रोफोबिक ग्लास स्लाइड के साथ कवरस्लिप को इकट्ठा करें और हाइड्रोफिलिक कवर स्लिप को 40 μm डबल-साइडेड चिपकने वाले स्पेसर्स का उपयोग करके सैंडविच ज्यामिति में ऊपरी सतह के रूप में फिसलता है। हाइड्रोफोबिक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्पेसर्स को 1.5 मिमी अलग रखें। फिर एक्रिलामाइड लेपित कवरस्लिप को स्पेसर्स के शीर्ष पर रखें, जिसमें इलाज किए गए साइड का पालन करने के लिए नीचे रखा जाए। सुनिश्चित करें कि आसंजन एक कुंद वस्तु से दबाव के साथ पूरा हो।
      नोट: लक्ष्य अंदर एक सपाट तेल / पानी इंटरफ़ेस के साथ एक प्रवाह सेल को इकट्ठा करना है (चित्रा 2 ए, बी)। यह वह जगह है जहां सक्रिय परत बनेगी। वैकल्पिक स्पेसर टेप और फिल्मों का उपयोग एक समान सेल मोटाई का उत्पादन करने के लिए भी किया जा सकता है।
    5. प्रवाह सेल का निर्माण होने के बाद, तुरंत तेल मिश्रण को प्रवाह सेल में डालें, संलग्न स्थान को भरें।
    6. एक पिपेट का उपयोग करके, एक अलग शीशी में 6 μL सक्रिय सामग्री को 3.73 μL MIX के साथ, 1 μL सूक्ष्मनलिका समाधान, 0.6 μL एटीपी समाधान (एकाग्रता सूक्ष्मनलिका वेग को अलग करने के लिए भिन्न किया जा सकता है), और M2B बफर के 0.67 μL के साथ धीरे-धीरे मिलाएं।
    7. प्रवाह सेल के एक खुले छोर में पिपेट ताजा मिश्रित सक्रिय सामग्री, वॉल्यूम अलग-अलग होंगे लेकिन प्रवाह सेल (लगभग 3-6 μL) की मात्रा से अधिक होना चाहिए। कुछ तेल जलीय घोल द्वारा विस्थापित हो जाएगा क्योंकि इसे चैनल में इंजेक्ट किया जाता है; यह टिशू पेपर के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग करके प्रवाह चैनल के विपरीत छोर पर दुष्ट हो सकता है।
    8. भरने के बाद, प्रवाह सेल के दोनों किनारों को एक एपॉक्सी गोंद के साथ सील करें ( सामग्री की तालिका देखें) जो 20 सेकंड के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में आने पर कठोर हो जाता है।
      नोट: इस बिंदु पर, सक्रिय सामग्री एक 3 डी नेटवर्क बनाती है जो पानी की परत में निलंबित रहती है।
    9. अर्ध-2 डी परत में दो अपरिवर्तनीय तरल पदार्थों के बीच सक्रिय परत को सीमित करने के लिए, प्रवाह कोशिका को एक झूलती बाल्टी सेंट्रीफ्यूज (सामग्री की तालिका देखें) में रखें, जिसमें शीर्ष पर जलीय चरण और नीचे सघन तेल परत हो। 10 मिनट के लिए 212 x g पर सेंट्रीफ्यूज। इस चरण के पूरा होने के बाद, प्रवाह सेल को 10x या 20x आवर्धन उद्देश्य के साथ इमेजिंग के लिए एक एपि-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर ले जाया जा सकता है। चित्रा 2 सी, डी इस चरण से पहले और बाद में विशिष्ट छवियां दिखाता है।
  2. सक्रिय नेमेटिक गठन के लिए उल्टी विधि
    नोट: चरण 2.1 में वर्णित एक वैकल्पिक विधि एक गहरी पीडीएमएस वेल28 तक सीमित मोटी तेल परत के नीचे सक्रिय नेमेटिक परत को इकट्ठा करना है। यह विधि समान परिणाम उत्पन्न करती है, और मास्टर करने के लिए कुछ आसान है; हालांकि, इस विधि का उपयोग करके छवि की गुणवत्ता आमतौर पर प्रवाह सेल विधि के रूप में अच्छी नहीं होती है।
    1. एक इलास्टोमर इलाज एजेंट और एक इलास्टोमेर बेस का उपयोग करके पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। धातु स्पैटुला का उपयोग करके दो घटकों को 1: 10 अनुपात में मिलाएं। मिश्रण के दौरान छोटे बुलबुले दिखाई देते हैं जिन्हें हटाना मुश्किल होता है, और मिश्रण दूधिया दिखाई देता है। इन बुलबुले को हटाने के लिए, मिश्रण को वैक्यूम के नीचे 1 घंटे के लिए डेगैस में रखें, जिसके बाद ठीक न किए गए पीडीएमएस पारदर्शी दिखाई देने चाहिए।
      नोट: पीडीएमएस अब मोल्ड का उपयोग करके किसी भी आकार को बनाने के लिए तैयार है, या यह कंटेनर में ठीक हो सकता है और फिर वांछित पैटर्न में काटा या मुक्का किया जा सकता है।
    2. पीडीएमएस को एक उपयुक्त मोल्ड में डालें और 60 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करने के लिए रात भर छोड़ दें।
      नोट: अनुपचारित, ठीक किए गए पीडीएमएस की सतह हाइड्रोफोबिक है, लेकिन सतह उपचार के साथ, इसे हाइड्रोफिलिक बनाया जा सकता है।
    3. हाइड्रोफिलिक पीडीएमएस सतह तैयार करने के लिए, पीडीएमएस को एक्रिलामाइड बहुलक ब्रश29 के साथ कोट करें। यह कदम प्रोटीन को सतह पर चिपकने से भी रोकता है।
      1. इथेनॉल और आइसोप्रोपेनॉल दोनों के साथ 10 मिनट के लिए पीडीएमएस को साफ करके शुरू करें, फिर 3 गुना और सूखने के लिए विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें। सूखे, ठीक किए गए पीडीएमएस को साफ करने के लिए 5 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करें। यह कदम सतह को अधिक हाइड्रोफिलिक बनाता है।
      2. इसके बाद, एक सिलेन समाधान (98.5 डब्ल्यूटी% इथेनॉल, 1 डब्ल्यूटी% एसिटिक एसिड, और 0.5 डब्ल्यूटी% ट्राइमेथॉक्सिसिल प्रोपिल मेथैक्रिलेट) तैयार करें और एक्रिलामाइड कोटिंग की तैयारी के लिए उस घोल में सब्सट्रेट को 15 मिनट के लिए डुबोएं। सब्सट्रेट को विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह से धो लें और एक्रिलामाइड समाधान (2 डब्ल्यूटी% एक्रिलामाइड / बीआईएस समाधान, 2.3 एमएम टीईएमईडी, और 3 एमएम अमोनियम परसल्फेट) में डुबोएं।
        नोट: इन सब्सट्रेट्स को ग्लास पेट्री डिश में एक्रिलामाइड समाधान में कवर किए गए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है, और 2 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए।
    4. उपयोग के लिए तैयार होने पर, सतह को विआयनीकृत पानी से धो लें और तत्काल उपयोग के लिए नाइट्रोजन के साथ सुखाएं। कुओं में सक्रिय मिश्रण (चरण 2.1.6 में वर्णित) जोड़ें और तुरंत लगभग 2 मिमी की मोटाई के लिए शीर्ष पर सिलिकॉन तेल जोड़ें।
      नोट: इस स्तर पर, सक्रिय मिश्रण को पीडीएमएस पर तेल और हाइड्रोफिलिक कोटिंग के बीच सैंडविच किया जाएगा, लेकिन यह अभी भी कुछ तीन आयामी होगा।
    5. सामग्री को 2 डी परत में आगे धकेलने के लिए, पीडीएमएस डिवाइस को ग्लास स्लाइड पर गोंद करें, इसे स्विंगिंग बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में रखें और 212 x g पर 12 मिनट के लिए घुमाएं। डिवाइस को इस तरह से तैनात करने की आवश्यकता होगी कि सिलिकॉन तेल जलीय परत के शीर्ष पर हो। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिखाए गए हैं।

3. सीमित ज्यामिति में सक्रिय नेमैटिक्स तैयार करना

नोट: इस अर्ध-दो-आयामी प्रणाली जैसे सक्रिय नेमैटिक्स कुओं या चैनलों जैसे छोटे माइक्रोफ्लुइडिक ज्यामिति में सीमित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। यहां, सामग्री को विभिन्न आकार के पीडीएमएस कुओं में सीमित करने के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन किया गया है।

  1. सबसे पहले, पीडीएमएस के लिए एक मास्टर मोल्ड डिजाइन करें। यह एक सब्सट्रेट पर 3 डी प्रिंटिंग स्तंभों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। राल मास्टर मोल्ड को 3 डी प्रिंट करने के बाद, आइसोप्रोपेनॉल के साथ साफ करें और फिर 45 मिनट के लिए यूवी लैंप के नीचे और ओवन में 2 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड को ठीक करें (चित्रा 4)।
    नोट: यूवी और थर्मल पोस्ट-क्यूरिंग के तहत इलाज राल30 से मोनोमर्स और फोटो अवरोधक अवशेषों को हटाकर पीडीएमएस में प्रतिकृति की गुणवत्ता में सुधार करता है।
  2. पीडीएमएस से कुएं बनाने के लिए मास्टर मोल्ड का उपयोग करें। चरण 2.2.1 में वर्णित पीडीएमएस तैयार करें। मास्टर मोल्ड को ठीक किए गए पीडीएमएस में डुबोएं और 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रात भर इलाज करें।
  3. पीडीएमएस इलाज पूरा होने के बाद, मास्टर मोल्ड को सावधानीपूर्वक हटा दें और कुओं के साथ काम करने के लिए वांछित पीडीएमएस को काट लें (चित्रा 4)। चरण 2.2.3 में वर्णित पीडीएमएस सतह का इलाज करें। प्रयोग से पहले, इमेजिंग को आसान बनाने के लिए सतह को एपॉक्सी गोंद के साथ ग्लास स्लाइड से जोड़ा जा सकता है।
  4. पीडीएमएस सब्सट्रेट पर चरण 2.1.6 में वर्णित सक्रिय मिश्रण का पिपेट 1 μL और तुरंत सक्रिय नेटवर्क बूंद के शीर्ष पर 100-1000 cSt चिपचिपाहट28 के साथ सिलिकॉन तेल जोड़ें। सक्रिय नेटवर्क कुएं में चला जाएगा; इस प्रक्रिया में 60 मिनट तक का समय लगता है (चित्रा 4)। जैसा कि चरण 2.2.5 में वर्णित है, 2 डी नेटवर्क को 212 x g पर 12 मिनट के लिए स्विंगिंग बकेट सेंट्रीफ्यूज में पीडीएमएस को अच्छी तरह से घुमाकर बढ़ाया जा सकता है।

Representative Results

चित्रा 1 जीएमपीसीपीपी ट्यूबुलिन से तैयार एकल सूक्ष्मनलिकाएं की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। छवि समान लंबाई के छोटे सूक्ष्मनलिकाएं दर्शाती है (कुछ फैलाव मौजूद है)। सूक्ष्मनलिका समाधान के पर्याप्त कमजोर पड़ने से लंबाई सत्यापन के लिए अच्छी तरह से अलग सूक्ष्मनलिकाएं की छवि का उत्पादन करना चाहिए। व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं उनके छोटे आकार के कारण छवि बनाने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती हैं। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए डिज़ाइन किए गए उच्च संवेदनशीलता कैमरे का उपयोग इस आवेदन के लिए सबसे अच्छा है। चित्रा 2 और चित्रा 3 क्रमशः प्रवाह सेल विधि (खंड 2.1) और उलटा विधि (खंड 2.2) का उपयोग करके किए गए सफल प्रयोगों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का उदाहरण दिखाते हैं। एक अच्छी तरह से गठित सक्रिय नेमेटिक परत बनावट में सजातीय है, जिसमें कोई महत्वपूर्ण शून्य क्षेत्र और मोबाइल टोपोलॉजिकल दोष मौजूद नहीं हैं। हालांकि ध्यान दें कि दोष कोर में कुछ स्वीकार्य छोटी रिक्तियां हो सकती हैं। चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाए गए उदाहरणों के अलावा, तीन पूरक फिल्मों (मूवी 1, मूवी 2 और मूवी 3) को यह प्रदर्शित करने के लिए शामिल किया गया है कि एक सफल प्रयोग में सक्रिय नेमेटिक कैसे दिखाई देना चाहिए। सभी फिल्में सक्रिय नेमेटिक चरण की चिकनी निरंतर गति को प्रदर्शित करती हैं। सामग्री के स्थिर अवस्था में पहुंचने के बाद सूक्ष्मनलिका एकाग्रता में कोई भिन्नता स्पष्ट नहीं होती है। जब तक सिस्टम में पर्याप्त एटीपी मौजूद है, तब तक सामग्री समान रूप से चलती रहेगी।

Figure 1
चित्रा 1: जीएमपीसीपीपी सूक्ष्मनलिकाएं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवि। जीएमपीसीपीपी सूक्ष्मनलिकाएं रोडामाइन ट्यूबुलिन के साथ 4% पर लेबल की गई थीं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए बहुलकीकृत थीं। इमेजिंग कमरे के तापमान पर किया गया था। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रवाह सेल में सूक्ष्मनलिकाएं नेमैटिक्स। (ए) प्रवाह सेल के क्रॉस अनुभागीय योजनाबद्ध, 1 मिमी x 18 मिमी ज्यामिति। (बी) प्रवाह सेल का शीर्ष दृश्य योजनाबद्ध। (सी) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवि तेल / पानी इंटरफ़ेस पर असेंबली से पहले सक्रिय समाधान की विशिष्ट उपस्थिति का प्रदर्शन करती है। (डी) प्रवाह सेल के अंदर तेल / पानी इंटरफ़ेस पर इकट्ठे सक्रिय नेमेटिक चरण की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप छवि उल्टे विधि का उपयोग करके तैयार एक सक्रिय नेमैटिक दिखाती है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रवाह आरेख एक पीडीएमएस कुएं में सक्रिय नेमेटिक कारावास के लिए विधि को दर्शाता है, जिसमें मोल्ड निर्माण और सतह उपचार शामिल हैं। दाईं छवि पर स्केल पट्टी (सीमित सक्रिय सामग्री) = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1: प्रवाह सेल विधि का उपयोग करके तैयार सक्रिय नेमेटिक के लिए प्रतिनिधि परिणाम। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: उल्टे विधि का उपयोग करके तैयार किए गए सक्रिय नेमेटिक के लिए प्रतिनिधि परिणाम। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 3: एक अंडाकार कुएं तक सीमित उल्टे विधि का उपयोग करके तैयार किए गए सक्रिय नेमेटिक के लिए प्रतिनिधि परिणाम। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल में कुछ बिंदु हैं जिन पर प्रयोगकर्ता कुछ महत्वपूर्ण जांच कर सकता है। सक्रिय सामग्री के साथ किसी भी उपकरण को भरने से पहले, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ( चित्रा 1 देखें) का उपयोग यह जांचने के लिए किया जाना चाहिए कि सूक्ष्मनलिकाएं बहुलक हैं और आदर्श रूप से ~ 2-3 μm लंबाई में हैं। यदि सूक्ष्मनलिकाएं माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई नहीं देती हैं, तो वे डिपोलीमराइज्ड हो सकते हैं और सक्रिय नेमेटिक नहीं बनेंगे। क्योंकि व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं बहुत छोटी होती हैं, इसलिए माइक्रोस्कोप के माध्यम से उन्हें सीधे निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस अध्ययन में, चुनौतीपूर्ण कम रोशनी वाले अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए एक उच्च गुणवत्ता वाले फ्लोरेसेंस कैमरा का उपयोग फिलामेंट विकास को सत्यापित करने के लिए संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ किया गया था। इस स्तर पर महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट समुच्चय मौजूद नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह डिपोलीमराइजेशन या विकृत प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत दे सकता है। प्रोटोकॉल में वर्णित अनुपात में सूक्ष्मनलिकाएं, मिक्स और एटीपी को जोड़कर एक सरल माइक्रोस्कोप परीक्षण स्लाइड बनाना भी एक अच्छा विचार है। गतिविधि घटकों के संयोजन पर शुरू होनी चाहिए और सामग्री को चित्रा 2 सी में दिखाए गए बंडलों के समान दिखाई देना चाहिए जिसमें बंडल मौजूद हैं और ध्यान देने योग्य फिलामेंट आंदोलन पूरे समय दिखाई देते हैं।

प्रवाह सेल विधि का उपयोग करते समय, प्रवाह सेल का सेंट्रीफ्यूज समय और अभिविन्यास एक समान सक्रिय परत के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस चरण में उपयोग किए गए सेंट्रीफ्यूज प्रकार के आधार पर कुछ ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता हो सकती है। घूर्णन के तल के लंबवत सक्रिय विमान उन्मुख के साथ प्रवाह सेल को सेंट्रीफ्यूज करना सबसे अच्छे परिणाम देता है क्योंकि सामग्री को समान रूप से द्रव इंटरफ़ेस पर धकेला जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजिंग से पहले फ्लो सेल को सावधानीपूर्वक सील किया गया है, इसकी दोबारा जांच करें।

सीमित सक्रिय नेमैटिक्स का उत्पादन करने के लिए उल्टे विधि का उपयोग करते समय अनुकूलन के लिए कई चरण हैं। सबसे पहले, 3 डी प्रिंटिंग विधि का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का उत्पादन करता है। असमान साइड की दीवारें सूक्ष्मनलिकाएं पकड़ने का कारण बन सकती हैं, जो प्रवाह को बाधित करेगी। कुओं को बहुत गहरा नहीं होना चाहिए (इस अध्ययन में 2 मिमी मोटी तेल परत के साथ 150-200 किमी गहरे कुओं का उपयोग किया गया था)। प्रयोगकर्ताओं को सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए परीक्षण और त्रुटि द्वारा इन मापदंडों को थोड़ा समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

प्रवाह सेल विधि और उल्टे विधि का उपयोग विभिन्न लेखकों द्वारा विभिन्न प्रकार के प्रभावों को देखने के लिए किया गया है जो सक्रिय प्रवाह को प्रभावित करते हैं, जिसमें विभिन्न तेल12 और पनडुब्बी संरचनाएं13 शामिल हैं। विधि का चुनाव प्रयोगात्मक उद्देश्य पर निर्भर करता है। प्रवाह सेल विधि का उपयोग करते हुए, सक्रिय परत के ऊपर से ऑप्टिकल इमेजिंग अलग-अलग तरल पदार्थों के कारण उल्टे विधि की तुलना में स्पष्ट है। फ्लो सेल विधि में, इमेजिंग एक ग्लास कवर स्लिप और पानी की एक पतली परत के माध्यम से की जाती है, जबकि उल्टे विधि को शीर्ष पर तेल की परत रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसका मतलब है कि उल्टे विधि के लिए एक लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य की आवश्यकता होती है, और छवि की गुणवत्ता कम हो जाती है। छवि गुणवत्ता अंतर क्रमशः चित्रा 2 डी (प्रवाह सेल विधि) और चित्रा 3 (उल्टे विधि), और मूवी 1 और मूवी 2 की तुलना करके देखा जा सकता है। चित्र 2 की तुलना में चित्र 3 के लिए लंबी कार्य दूरी के साथ कम आवर्धन लेंस की आवश्यकता थी। उल्टे विधि के लिए इन इमेजिंग नुकसान से बचा जा सकता है यदि एक उपयुक्त उलटा माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, माइक्रोस्कोप स्लाइड सब्सट्रेट्स के लिए उपयुक्त कार्य दूरी के साथ उद्देश्यों के साथ संयुक्त है। पतले ग्लास का उपयोग मानक कामकाजी दूरी उद्देश्यों के उपयोग की अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जा सकता है।

एक लाभ के रूप में, उल्टे ज्यामिति तेल चिपचिपाहट की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग की अनुमति देती है, जरूरी नहीं कि झूलने वाली बाल्टी सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता हो (यदि यह उपलब्ध नहीं है), और मोल्ड तैयार होने के बाद सिस्टम की तैयारी अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, उल्टे विधि का उपयोग करके कुओं में कारावास के लिए, सामग्री को अच्छी तरह से परिभाषित 2 डी परत में लाने के लिए कुछ सेंट्रीफ्यूजेशन महत्वपूर्ण हो सकते हैं।

प्रवाह सेल विधि का उपयोग हाल ही में प्रयोगों में बहुत सफलतापूर्वक किया गया है जहां एक निरंतर सक्रिय परत की आवश्यकता होती है। हमारे हाल के काम ने सक्रिय परत में टोपोलॉजिकल दोषों की गतिशीलता को देखा है, जहां उच्च गुणवत्ता इमेजिंग और बनावटविश्लेषण महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, प्रवाह सेल विधि का उपयोग सक्रिय प्रवाह16 और स्तंभों पर तेल-पनडुब्बी माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रभावों की जांच करने के लिए किया गया है ताकि सक्रिय प्रवाह31 में दोषों को फंसाया जा सके। यह विधि एक निरंतर सक्रिय परत के गठन के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करती है, और छवि की गुणवत्ता उत्कृष्ट है। हालांकि, अंतिम 2 डी सक्रिय परत का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को पूरा करना मुश्किल हो सकता है, और प्रवाह कोशिकाओं को लीक और हवा के बुलबुले का खतरा होता है। उल्टे विधि उच्च सफलता दर के साथ एक बहुत ही उपयोगी विकल्प है, निर्माण में आसान है, और किसी भी सब्सट्रेट पैटर्न या ज्यामिति के लिए उपयोग किया जा सकता है बशर्ते एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी मुद्रित मास्टर मोल्ड बनाया जा सके। यह विधि सक्रिय नेमेटिक गतिशीलता पर ज्यामितीय कारावास के प्रभावों को देखने के लिए भी उपयोगी है क्योंकि यह कुओं को भरने को अपेक्षाकृत सरल बनाता है।

इस पेपर में, सूक्ष्मनलिकाएं और किन्सिन मोटर्स से एक सक्रिय नेमेटिक बनाने के दो तरीकों का वर्णन किया गया है, साथ ही कुओं में सामग्री को सीमित करने की एक तकनीक भी है। प्रस्तुत प्रणाली वर्तमान में साहित्य में एक सक्रिय नेमैटिक चरण का सबसे साफ उदाहरण का प्रतिनिधित्व करती है और दुनिया भर के कई समूहों द्वारा पुन: प्रस्तुत की गई है। इस सामग्री का महत्व न केवल इसके घटकों की जैविक उत्पत्ति में निहित है, बल्कि इसलिए भी कि यह सक्रिय आदेशित तरल पदार्थों में एक पूरी तरह से नई दिशा खोलता है। इस प्रणाली के साथ काम करके और इसके मौलिक गुणों को स्पष्ट करके, वैज्ञानिक पूरी तरह से सिंथेटिक सक्रिय चरणों के डिजाइन की ओर बढ़ सकते हैं।

सक्रिय नेमैटिक्स पर कारावास के प्रभावों पर केंद्रित प्रयोगों में टोपोलॉजिकल कारावास के तहत सक्रिय प्रवाह और टोपोलॉजिकल दोष गतिशीलता के व्यवहार के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने की क्षमता है। यहां प्रस्तुत विधि विभिन्न प्रकार के ज्यामिति-केंद्रित प्रयोगों और उनके विश्लेषण के प्रदर्शन में सहायता करेगी, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक्स और सक्रिय मिश्रण शामिल हैं।

Disclosures

इस काम में उपयोग की जाने वाली कुछ सामग्री साइटोस्केलेटन इंक (डेनवर, यूएसए) द्वारा नि: शुल्क प्रदान की गई थी।

Acknowledgments

लेखक उदार वित्त पोषण के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) पुरस्कार डीएमआर -1808926 को स्वीकार करना चाहते हैं। इस परियोजना को एनएसएफ द्वारा विज्ञान और प्रौद्योगिकी में अनुसंधान उत्कृष्टता केंद्र के माध्यम से भी समर्थित किया गया था: कैलिफोर्निया मर्सेड विश्वविद्यालय में सेलुलर और बायोमोलेक्यूलर मशीनों के लिए केंद्र (एचआरडी -1547848) और ब्रांडिस बायोमैटेरियल्स सुविधा सामग्री अनुसंधान विज्ञान और इंजीनियरिंग केंद्र (डीएमआर -2011486)। हम मोल्ड को 3 डी प्रिंटिंग में सहायता के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ बिन लियू को धन्यवाद देना चाहते हैं, और उल्टे प्रयोगात्मक विधि के विकास के दौरान वैज्ञानिक सलाह के लिए डॉ जोर्डी इग्नेस।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 kD PEG (polyethylene glycol)) Sigma Aldrich 1419109 Depletion agent
CAS Number: 125061-88-3
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514-50ML CAS Number: 2530-85-0
3D printer & Resin Phrozen Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin
40% Acrylamide Solution BIO-RAD 1610140 CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1
Acetic Acid Fisher CAS Number: 64-19-7
Acetone Sigma Aldrich CAS Number: 67-64-1
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) Grace Bio-Labs 620001 SecureSeal
Ammonium Persulfate Sigma Aldrich A3678 CAS Number: 7727-54-0
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) Aquapel Glass Treatment hydrophobic glass treatment
ATP (Adenosine triphosphate) Sigma Aldrich A1852 CAS Number: 34369-07-8
Beakers VWR
Catalase Sigma Aldrich C9322 CAS Number: "9001-05-2"
Desiccator Bel-art
Digital CMOS camera Hamamatsu ORCA - Flash4.0 LT+
DTT (Dithiothreitol) Sigma Aldrich D9779 CAS Number: "3483-12-3"
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) Sigma Aldrich MFCD00004291 CAS Number: 67-42-5
Ethanol Sigma Aldrich CAS Number: 64-17-5
Fluorescence microscope Leica DM 2500P
Glass Coverslips VWR 48368-040
Glass Slides VWR 16004-430
Glucose Sigma Aldrich G7021 CAS Number: 50-99-7
Glucose Oxidase Sigma Aldrich 345386 CAS Number: 9001-37-0
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) Jena Bioscience NU-405S CAS Number: 14997-54-7
HFE7500 Oil 3M
Hot Plate Fisher Scientific Thermix hot plate model 100M
Isopropyl Alcohol VWR
KCl (potassium chloride) Sigma Aldrich P5405 CAS Number: 7447-40-7
Methanol Sigma Aldrich CAS Number: 67-56-1
MgCl2 (Magnesium Chloride) Sigma Aldrich 208337 CAS Number: 7786-30-3
Microcentrifuge tubes Eppendorf - Thermo Fisher 1.5 mL
Nanopure water purifier Sartorius arium mini
NaOH (Sodium hydroxide) Sigma Aldrich SX0603 CAS Number: 1310-73-2
Petri Dishes VWR
PH Meter Thermo Scientist Orion 3 STAR
Phosphoenol-pyruvate (PEP) Sigma Aldrich MFCD00044476 CAS Number: 4265-07-0
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) Sigma Aldrich CAS Number: 5625-37-6
Pipettes (0.2 - 1000 µl) VWR
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 2594628
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) Sigma Aldrich CAS Number: 63148-52-7
Streptavidin Thermofisher S888
Swinging Bucket Centrifuge Thermo Scientist Sorvall legend RT+
Sylgard 184 Elastomer base World Precision Instruments SYLG184
Sylgard 184 Elastomer Curing agent World Precision Instruments SYLG184
Table top centrifuge Eppendorf MiniSpin Plus
TEMED (Tetramethylethylenediamine) BIO-RAD 1610800 CAS Number: 110-18-9
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) Sigma Aldrich MFCD00006846 CAS Number: 53188-07-1
Tubulin Cytoskeleton T240-B
Tubulin (Rhodamine labeled) Cytoskeleton TL590M-A
Ultracentrifuge Beckman Optima Max-TL
UV Light RapidFix
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) RapidFix
Water Bath Thelco
Whatman Filter paper Sigma Aldrich WHA1001325

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References

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जीव विज्ञान अंक 191
माइक्रोट्यूबुल्स-आधारित सक्रिय नेमैटिक्स बनाना, सीमित करना और निरीक्षण करना
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Memarian, F. L., Khaladj, D. A., Hammar, D., Hirst, L. S. Forming, Confining, and Observing Microtubule-Based Active Nematics. J. Vis. Exp. (191), e64287, doi:10.3791/64287 (2023).

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