Summary
Apresentamos aqui métodos para a preparação de nemática ativa a partir de microtúbulos e motores de cinesina, incluindo a preparação e construção de proteínas e o uso de poços para confinamento nemático ativo.
Abstract
A formação de fases ativas baseadas em biopolímeros tornou-se uma técnica importante para pesquisadores interessados em explorar o campo emergente de cristais líquidos ativos e seus possíveis papéis na biologia celular. Esses novos sistemas consistem em subunidades auto-dirigidas que consomem energia localmente, produzindo um fluido dinâmico fora de equilíbrio. Para formar a fase de cristal líquido ativo descrita neste relatório, componentes proteicos purificados, incluindo biopolímeros e motores moleculares, são combinados, e a fase nemática ativa se forma espontaneamente na presença de trifosfato de adenosina (ATP). Para observar o estado nemático, o material deve ser confinado em uma geometria adequada para microscopia em uma densidade suficientemente alta. Este artigo descreve dois métodos diferentes para a formação de uma fase nemática ativa usando microtúbulos e motores de cinesina: montagem de uma camada ativa bidimensional em uma interface óleo e água e montagem sob uma camada de óleo usando um poço elastomérico. Técnicas para inserir o material ativo em pequenos poços de diferentes formas também são descritas.
Introduction
Os fluidos ativos são compostos de partículas ou elementos movidos a energia que extraem combustível de seu ambiente local. Sob as condições certas, esses elementos ativos móveis podem agir coletivamente para produzir dinâmica de fluidos emergentes em longas escalas de comprimento. Há uma variedade de exemplos de tal comportamento de fase fora de equilíbrio na literatura e fases ativas podem ser encontradas em todo o espectro de sistemas vivos. Alguns exemplos notáveis são colônias de bactérias1, folhas celulares2,3 e o bando ou enxame de organismos 4,5. As fases ativas também têm sido extensivamente estudadas em fases condensadas de filamentos citoesqueléticos, seja como parte da célula6 ou em sistemas sintéticos projetados para fazer uso de componentes biologicamente extraídos 7,8,9. A ordenação cristalina líquida e a formação de defeitos topológicos em sistemas naturais e sintéticos montados a partir de extratos biológicos são de particular interesse para a comunidade de pesquisa. Nos últimos anos, grupos de pesquisa têm examinado tais sistemas, suas propriedades físicas fundamentais e sua relevância para a biologia 2,3,10,11.
Este trabalho enfoca a formação do estado nemático ativo a partir de uma combinação de microtúbulos e proteínas motoras de cinesina. O cristal líquido nemático tradicional é uma fase de equilíbrio da matéria na qual as moléculas constituintes exibem ordenação orientacional. Por exemplo, um fluido constituído por moléculas relativamente rígidas em forma de bastonete pode apresentar tanto a fase nemática quanto, em temperaturas mais elevadas, uma fase fluida isotrópica não orientada12. O primeiro exemplo experimental de uma fase nemática ativa foi desenvolvido por Sanchez et al.13, adaptando um experimento in vitro anterior14 no qual aglomerados de proteínas motoras foram utilizados para produzir um movimento de cisalhamento entre feixes de microtúbulos vizinhos. Quando este sistema de microtúbulos foi confinado a uma camada fina, surgiu a ordenação nemática espontânea. Nos últimos anos, o estado nemático ativo tem sido estudado intensamente por vários grupos de pesquisa experimentais15,16 e teóricos 17,18, com foco em fenômenos como turbulência ativa — estado em que o fluido produz fluxos caóticos autodirigidos19 — e defeitos topológicos móveis. Este trabalho descreve métodos para preparar e formar o estado nemático ativo a partir de microtúbulos e motores de cinesina em diferentes geometrias experimentais. Primeiro, os métodos de preparação para as diferentes soluções de componentes são descritos, seguidos por métodos para formar o nematic ativo usando duas geometrias de câmara de fluxo diferentes. Os resultados típicos de imagem são mostrados. Finalmente, métodos para confinar o nematic ativo em poços e canais são descritos.
Protocol
1. Preparação do material ativo
NOTA: O nematic ativo 2D é montado em um processo de três etapas. Primeiro, duas soluções separadas são preparadas: a) microtúbulos polimerizados e estabilizados e b) MIX (uma solução contendo motores de cinesina). Estes são combinados e a atividade é iniciada após a adição de trifosfato de adenosina (ATP). O material é então confinado em uma geometria adequada, de modo que sua densidade é alta o suficiente para que a ordem nemática surja. Os protocolos estão incluídos para a preparação de todos os componentes necessários e como montar a fase ativa.
- Preparação do cluster de proteínas motoras de cinesina
- Expressar e purificar proteínas motoras K401-BIO recombinantes (motores K401) de Escherichia coli seguindo o protocolo de Edgar C. Young20.
NOTA: As proteínas motoras K401-BIO são diméricas e consistem em duas cabeças conectadas com um caule helicoidal. Os motores foram fornecidos pela Brandeis Biomaterials Facility e utilizados conforme relatado anteriormente16. Para fins de formação de um nemática ativa, as moléculas de cinesina são biotiniladas e, em seguida, conectadas através de uma ligação de estreptavidina para formar aglomerados de cinesina de até quatro motores 13,15,21,22. É útil expressar a cinesina com uma etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP). - Após purificação e incubação de estreptavidina e motores em gelo durante 40 min, congelar rapidamente os motores K401 em azoto líquido em alíquotas de 5 μL a uma concentração final de 0,7 mg/ml e armazenar a -80 °C.
NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. Descongele suavemente a cinesina quando necessário e não volte a congelar. - Preparar clusters de cinesina marcada com biotina (KSA) misturando 24 vol% de 0,7 mg/mL de motores K401, 27 vol% de 0,325 mg/mL de estreptavidina e 3 vol% de 5 mM de ditiotreitol (TDT) (para evitar agregação) a 4 °C em tampão M2B de 46 vol% (80 mM PIPES [ácido 1,4-piperazinediethanesulfônico, pH 6,8], 2 mM MgCl2 e 1 mM EGTA [etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N, N,N′,N′-ácido tetraacético]). Deixe o KSA incubar no gelo por 40 min.
- Expressar e purificar proteínas motoras K401-BIO recombinantes (motores K401) de Escherichia coli seguindo o protocolo de Edgar C. Young20.
- Preparação da solução de microtúbulos
NOTA: Guanosina-5'-[(α,β)-metileno]trifosfato, sal de sódio (GMPCPP) é um análogo lentamente hidrolisável do trifosfato de guanosina (GTP), e os microtúbulos formados na presença de GMPCPP são três vezes mais rígidos que os microtúbulosGTP 23 e mais curtos. O uso de microtúbulos curtos e rígidos é favorável para a formação da fase nemática ativa, pois esses fatores se combinam para promover a ordenação cristalina líquida.- Polimerizar tubulina ciclada não marcada (99%, ver Tabela de Materiais) usando 0,6 mM GMPCPP a uma concentração de tubulina de 6 mg/mL.
NOTA: A tubulina de alta qualidade também pode ser purificada do cérebro bovino ou suíno seguindo protocolos estabelecidos ou obtida de outra fonte confiável, como a Brandeis Biomaterials Facility, onde os materiais podem ser enviados congelados para evitar danos. Para a purificação de tubulina do cérebro bovino, consulte o protocolo publicado de Bate et al.24. Para a purificação da tubulina do cérebro suíno, consulte os protocolos publicados de Castoldi et al.25 e Tayar et al.26. - Em preparação para a polimerização, preparar um banho de calor a 37 °C e pré-arrefecer a centrífuga a 4 °C. Combinar a solução de tubulina não rotulada em tampão M2B (etapa 1.1.3) num tubo de ultracentrífuga de 500 μL com tubulina marcada com rodamina a 4 mol% (ver Tabela de Materiais) para produzir microtúbulos marcados a 4% após a polimerização.
- Verificar a concentração de tubulina usando um ensaio de Bradford27. A concentração total de tubulina no tubo de centrífuga deve ser de 6,5-6,9 mg/mL.
- Incubar a mistura de tubulina no gelo durante 10 min e ultracentrifugar durante 10 min a 352.700 x g a 4 °C. Esta etapa remove a tubulina disfuncional, que estará no pellet.
- Usando uma pipeta, extraia cuidadosamente o sobrenadante contendo tubulina funcional em um tubo de microcentrífuga. Adicionar GMPCPP a uma concentração final de 0,6 mM para induzir a polimerização de tubulina e TDT a uma concentração final de 1 mM para evitar a agregação de proteínas.
- Incubar a mistura em banho-cio a 37 °C durante 30 min e, em seguida, centrifugar novamente durante 10 min a 14.000 x g à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e, em seguida, dilua o pellet com tampão M2B para atingir uma concentração final de microtúbulos de 6 mg/mL.
NOTA: Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante, pelo menos, 4 h antes da utilização. - Para verificar se os microtúbulos polimerizaram com sucesso, diluir 1 μL da solução de microtúbulos 100:1 com tampão M2B e pipeta em uma lâmina de microscópio. Cubra com uma folha de cobertura para imagens usando um microscópio de fluorescência (consulte Tabela de materiais) com uma lente objetiva de 40x.
NOTA: Os comprimentos de onda de excitação e emissão são escolhidos de acordo com a marcação de fluorescência usada nos microtúbulos. Neste protocolo, a marcação de rodamina é usada (ver etapa 1.2.2), de modo que a imagem é realizada usando uma banda de excitação de 515-560 nm e um filtro passa-longo de 590 nm. A Figura 1 mostra um exemplo representativo. - Após a conclusão da polimerização, congelar os microtúbulos como alíquotas de 2 μL em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C (se necessário).
- Polimerizar tubulina ciclada não marcada (99%, ver Tabela de Materiais) usando 0,6 mM GMPCPP a uma concentração de tubulina de 6 mg/mL.
- Preparação de MIX
NOTA: MIX é uma solução aquosa que inclui os clusters de cinesina-estreptavidina (KSA). O MIX preparado deve ser armazenado a -80 °C em alíquotas de 4 μL antes da experiência. Quando o MIX é combinado com ATP e a solução de microtúbulos descrita no passo 1.2 à temperatura ambiente, a atividade é iniciada. O MIX é preparado da seguinteforma 13,19.- Prepare uma solução para prevenir o desbotamento por fluorescência (ANTIFADE) misturando duas soluções antioxidantes. Combine AO1 (250 mM DTT, 65 mM catalase) e AO2 (750 μM catalase, 3 mM de glicose oxidase) numa proporção de volume de 1:1. Inclua 20 mM Trolox, outro antioxidante usado para reduzir os danos causados pela microscopia de fluorescência.
- Preparar o MIX fazendo uma solução de KSA (descrita no passo 1.1.3) que inclua polietilenoglicol (PEG) a 6 % em peso de 20 kDa para induzir o empacotamento dos microtúbulos, 3 vol% de ANTIFADE e 5 vol% de piruvato quinase/desidrogenase láctica (PKLDH) a 70 mg/ml para regeneração de ATP.
2. Criando o nematic ativo
NOTA: A atividade no material é iniciada pela adição de ATP. A rede ativa é preparada fresca para cada experimento, adicionando ATP a uma concentração alta o suficiente para induzir a atividade motora. Para formar uma fase nemática ativa uniforme e totalmente desenvolvida, os microtúbulos devem estar em uma densidade suficientemente alta. Isso pode ser conseguido confinando os microtúbulos entre dois fluidos imiscíveis para formar uma camada nemática ativa bidimensional (2D). Este método foi originalmente desenvolvido na Brandeis University13 e continua a ser uma técnica popular para produzir uma fase nemática ativa, homogénea, de alta qualidade.
- Método da célula de fluxo para formação nemática ativa
- Prepare coberturas hidrofílicas com um revestimento de acrilamida.
- Limpe bem as tampas com água e sabão, etanol e NaOH 0,1 M com enxaguamentos alternados usando água nanopura. Uma vez enxaguados, cubra as folhas de cobertura com uma solução de silano composta por 100 mL de etanol, 1 mL de ácido acético e 500 μL de 3-(trimetoxisilil) propilmetacrilato por 15 min, depois enxaguar com água nanopura.
- Preparar uma solução de acrilamida a partir de 95 ml de água nanopura e 5 ml de acrilamida a 40 % em peso e, em seguida, desgaseificar a solução durante 30 minutos num forno a vácuo.
- Adicionar 35 μL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) para uma concentração final de 2,3 mM e, em seguida, 0,07 g de persulfato de amónio. Deite a solução de acrilamida sobre as tampas enquanto vira para cima e incuba durante a noite à temperatura ambiente.
- Prepare lâminas de microscópio hidrofóbico. Pipetar 100 μL de uma solução repelente de água (ver Tabela de Materiais) numa lâmina de microscópio de vidro limpo e, em seguida, colocar outra lâmina de vidro limpa por cima. Isso garante um revestimento uniforme da solução repelente à água na superfície onde fica por 2 min. Após 2 min, remova a segunda lâmina de vidro e lave bem a primeira lâmina com água nano-pura, depois seque com gás nitrogênio. Limpe suavemente a região onde a fita será colocada (em torno do padrão) com acetona para garantir que a solução repelente à água não impeça a adesão ao vidro.
- Prepare uma mistura de óleo de engenharia que inclua 1,8% (v/v) de 008-FluoroSurfactante (consulte Tabela de Materiais).
- Monte a lâmina de vidro e a tampa com a lâmina de vidro hidrofóbica na parte inferior da célula de fluxo e a tampa hidrofílica deslize como a superfície superior em uma geometria sanduíche usando espaçadores adesivos de dupla face de 40 μm. Coloque os espaçadores separados por 1,5 mm na lâmina do microscópio hidrofóbico. Em seguida, coloque a tampa revestida de acrilamida em cima dos espaçadores com o lado tratado virado para baixo para aderir. Certifique-se de que a adesão esteja completa com a pressão de um objeto contundente.
NOTA: O objetivo é montar uma célula de fluxo com uma interface plana óleo/água no interior (Figura 2A,B). É aqui que a camada ativa se formará. Fitas espaçadoras e filmes alternativos também podem ser usados para produzir uma espessura de célula semelhante. - Depois que a célula de fluxo tiver sido construída, pipete imediatamente a mistura de óleo para a célula de fluxo, preenchendo o espaço fechado.
- Usando uma pipeta, em um frasco separado, misture suavemente 6 μL de material ativo com 3,73 μL de MIX, 1 μL de solução de microtúbulo, 0,6 μL de solução de ATP (a concentração pode ser variada para variar a velocidade do microtúbulo) e 0,67 μL de tampão M2B.
- Pipetar material ativo recém-misturado em uma extremidade aberta da célula de fluxo, os volumes variarão, mas devem exceder o volume da célula de fluxo (aproximadamente 3-6 μL). Algum óleo será deslocado pela solução aquosa à medida que é injetado no canal; isso pode ser absorvido na extremidade oposta do canal de fluxo usando um pequeno pedaço de papel de seda.
- Após o enchimento, sele ambos os lados da célula de fluxo com uma cola epóxi (consulte Tabela de materiais) que endurece quando exposta à luz UV por 20 s.
NOTA: Neste ponto, o material ativo forma uma rede 3D que permanece suspensa na camada de água. - Para confinar a camada ativa entre os dois fluidos imiscíveis em uma camada quase 2D, coloque a célula de fluxo em uma centrífuga de balde oscilante (consulte Tabela de materiais) com a fase aquosa na parte superior e a camada de óleo mais densa embaixo. Centrífuga a 212 x g durante 10 min. Após a conclusão desta etapa, a célula de fluxo pode ser levada a um microscópio de epifluorescência para imagens com uma objetiva de ampliação de 10x ou 20x. A Figura 2C,D mostra imagens típicas antes e depois desta etapa.
- Prepare coberturas hidrofílicas com um revestimento de acrilamida.
- Método invertido para formação de nemática ativa
NOTA: Um método alternativo ao descrito na etapa 2.1 é montar a camada nemática ativa sob uma camada de óleo espessa confinada a um poço PDMS profundo28. Este método produz resultados semelhantes, e é um pouco mais fácil de dominar; no entanto, a qualidade da imagem usando esse método geralmente não é tão boa quanto o método da célula de fluxo.- Preparar o polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando um agente de cura de elastômero e uma base de elastômero (ver Tabela de Materiais). Misture os dois componentes em uma proporção de 1:10 usando uma espátula de metal. Pequenas bolhas aparecem durante a mistura que são difíceis de remover, e a mistura parece leitosa. Para remover essas bolhas, coloque a mistura sob vácuo para desgaseificar por 1 h, após o que o PDMS não curado deve parecer transparente.
NOTA: O PDMS agora está pronto para formar qualquer forma usando um molde, ou pode curar no recipiente e, em seguida, ser cortado ou perfurado no padrão desejado. - Deite o PDMS num molde adequado e deixe durante a noite para curar a 60 °C.
NOTA: Não tratada, a superfície do PDMS curado é hidrofóbica, mas com o tratamento de superfície, pode ser feita hidrofílica. - Para preparar uma superfície PDMS hidrofílica, revestir o PDMS com uma escova de polímero de acrilamida29. Esta etapa também impede que as proteínas grudem na superfície.
- Comece limpando o PDMS por 10 minutos com etanol e isopropanol, depois enxágue bem com água deionizada 3x e seque. Use um limpador de plasma por 5 minutos para limpar o PDMS seco e curado. Este passo torna a superfície mais hidrofílica.
- Em seguida, preparar uma solução de silano (98,5 em peso de etanol, 1 % de ácido acético a peso e 0,5 % em peso de metacrilato de propilo propílico) e imergir o substrato nessa solução por 15 minutos para se preparar para o revestimento da acrilamida. Enxaguar bem o substrato com água desionizada e imergir em solução de acrilamida (solução de acrilamida a 2 m%, solução de acrilamida a 2 mM / bis, TEMED de 2,3 mM e persulfato de amônio a 3 mM).
NOTA: Estes substratos podem ser armazenados à temperatura ambiente cobertos por solução de acrilamida numa placa de Petri de vidro, e devem ser utilizados no prazo de 2 semanas.
- Quando estiver pronto para uso, lave a superfície com água deionizada e seque com nitrogênio para uso imediato. Adicionar a mistura activa (descrita na etapa 2.1.6) aos poços e adicionar imediatamente óleo de silicone por cima a uma espessura de aproximadamente 2 mm.
NOTA: Nesta fase, a mistura ativa será ensanduichada entre o óleo e o revestimento hidrofílico no PDMS, mas ainda será um pouco tridimensional. - Para empurrar o material ainda mais para uma camada 2D, cole o dispositivo PDMS em uma lâmina de vidro, coloque-o em uma centrífuga de balde oscilante e gire por 12 min a 212 x g. O dispositivo precisará ser posicionado de tal forma que o óleo de silicone esteja no topo da camada aquosa. Os resultados representativos são apresentados na Figura 3.
- Preparar o polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando um agente de cura de elastômero e uma base de elastômero (ver Tabela de Materiais). Misture os dois componentes em uma proporção de 1:10 usando uma espátula de metal. Pequenas bolhas aparecem durante a mistura que são difíceis de remover, e a mistura parece leitosa. Para remover essas bolhas, coloque a mistura sob vácuo para desgaseificar por 1 h, após o que o PDMS não curado deve parecer transparente.
3. Preparação de nemática ativa em geometrias confinadas
NOTA: A nemática ativa, como este sistema quase bidimensional, pode ser um desafio para confinar em pequenas geometrias microfluídicas, como poços ou canais. Aqui, um método confiável para confinar o material em diferentes poços PDMS de forma é descrito.
- Primeiro, projete um molde mestre para o PDMS. Isso pode ser conseguido por pilares de impressão 3D em um substrato. Após a impressão 3D do molde mestre de resina, limpar com isopropanol e, em seguida, curar o molde sob uma lâmpada UV por 45 min e no forno a 120 °C por 2 h (Figura 4).
NOTA: A cura sob UV e pós-cura térmica melhora a qualidade da replicação no PDMS, removendo monômeros e resíduos de fotoinibidores da resina30. - Use o molde mestre para criar poços a partir do PDMS. Prepare o PDMS conforme descrito na etapa 2.2.1. Mergulhe o molde mestre em PDMS não curado e cure durante a noite em um forno a 60 °C.
- Após a conclusão da cura do PDMS, remova cuidadosamente o molde mestre e corte o PDMS conforme desejado para trabalhar com os poços (Figura 4). Tratar a superfície do PDMS conforme descrito no passo 2.2.3. Antes do experimento, a superfície pode ser anexada a uma lâmina de vidro com cola epóxi para facilitar a imagem.
- Pipetar 1 μL da mistura activa descrita no passo 2.1.6 para o substrato PDMS e adicionar imediatamente óleo de silicone com viscosidade 100-1000 cSt28 sobre a gota activa da rede. A rede ativa se moverá para o poço; esse processo leva até 60 min (Figura 4). Conforme descrito na etapa 2.2.5, a rede 2D pode ser aprimorada girando o poço PDMS na centrífuga da caçamba oscilante por 12 minutos a 212 x g.
Representative Results
A Figura 1 mostra uma imagem representativa de microtúbulos únicos preparados a partir da tubulina GMPCPP. A imagem mostra microtúbulos curtos de comprimentos semelhantes (com alguma dispersão presente). A diluição suficiente da solução de microtúbulos deve produzir uma imagem de microtúbulos bem separados para verificação do comprimento. Os microtúbulos individuais podem ser difíceis de visualizar devido ao seu pequeno tamanho. O uso de uma câmera de alta sensibilidade projetada para microscopia de fluorescência é melhor para esta aplicação. A Figura 2 e a Figura 3 mostram imagens de microscopia de fluorescência de exemplos de experimentos bem-sucedidos realizados usando o método de células de fluxo (seção 2.1) e o método invertido (seção 2.2), respectivamente. Uma camada nemática ativa bem formada é homogênea em textura, sem áreas de vazio significativas e defeitos topológicos móveis presentes. Note, no entanto, que pode haver alguns pequenos vazios aceitáveis nos núcleos de defeito. Além dos exemplos mostrados na Figura 2 e na Figura 3, três filmes suplementares (Filme 1, Filme 2 e Filme 3) foram incluídos para demonstrar como o nematic ativo deve aparecer em um experimento bem-sucedido. Todos os filmes demonstram o movimento contínuo suave da fase nemática ativa. Nenhuma variação na concentração de microtúbulos é aparente depois que o material atingiu seu estado estacionário. Enquanto ATP suficiente estiver presente no sistema, o material continuará a se mover uniformemente.
Figura 1: Imagem do microscópio de fluorescência dos microtúbulos GMPCPP. Os microtúbulos GMPCPP foram marcados a 4% com tubulina de rodamina e polimerizados por 20 min a 37 °C. A imagem foi realizada à temperatura ambiente. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Nemática de microtúbulos em uma célula de fluxo. (A) Esquema transversal da célula de fluxo, geometria de 1 mm x 18 mm. (B) Esquema de visualização superior da célula de fluxo. (C) Imagem de microscopia de fluorescência demonstrando a aparência típica da solução ativa antes da montagem na interface óleo/água. (D) Imagem de microscopia de fluorescência da fase nemática ativa montada na interface óleo/água dentro da célula de fluxo. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem do microscópio de fluorescência mostrando um nematic ativo preparado pelo método invertido. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diagrama de fluxo ilustrando o método de confinamento nemático ativo em um poço PDMS, incluindo fabricação de molde e tratamento de superfície. Barra de escala na imagem à direita (material ativo confinado) = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Resultado representativo para nemática ativa preparada usando o método da célula de fluxo. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Filme 2: Resultado representativo para nemática ativa preparada pelo método invertido. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Filme 3: Resultado representativo para nemática ativa preparada usando o método invertido confinado a um poço elíptico. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Discussion
Existem alguns pontos ao longo dos protocolos em que o experimentador pode fazer algumas verificações importantes. Antes de encher qualquer um dos dispositivos com material ativo, a microscopia de fluorescência (ver Figura 1) deve ser usada para verificar se os microtúbulos estão polimerizados e, idealmente, ~2-3 μm de comprimento. Se os microtúbulos não forem visíveis ao microscópio, eles podem ter se despolimerizado e o nemático ativo não se formará. Como os microtúbulos individuais são muito pequenos, pode ser um desafio observá-los diretamente através do microscópio. Neste estudo, uma câmera de fluorescência de alta qualidade projetada para aplicações desafiadoras de pouca luz foi usada com o software associado para verificar o crescimento do filamento. Agregados fluorescentes significativos não devem estar presentes nesta fase, pois isso pode indicar despolimerização ou a presença de proteína desnaturada. Também é uma boa ideia fazer uma lâmina de teste de microscópio simples, combinando microtúbulos, MIX e ATP nas mesmas proporções descritas nos protocolos. A atividade deve começar na combinação dos componentes e o material deve parecer semelhante ao mostrado na Figura 2C com feixes presentes e movimentos de filamento perceptíveis visíveis por toda parte.
Ao usar o método da célula de fluxo, o tempo de centrífuga e a orientação da célula de fluxo são importantes para a formação de uma camada ativa uniforme. Esta etapa pode exigir algum ajuste fino, dependendo do tipo de centrífuga usada. A centrifugação da célula de fluxo com o plano ativo orientado perpendicularmente ao plano de rotação fornece os melhores resultados, pois o material pode ser empurrado para a interface do fluido uniformemente. Verifique novamente se a célula de fluxo está cuidadosamente selada antes de centrifugar.
Ao usar o método invertido para produzir nemática ativa confinada, há várias etapas a serem otimizadas. Primeiro, é importante usar um método de impressão 3D que produza estruturas de alta resolução. Paredes laterais irregulares podem fazer com que os microtúbulos se capturem, o que interromperá os fluxos. Os poços não devem ser muito profundos (poços de 150-200 μm de profundidade com uma camada de óleo sobrejacente de 2 mm de espessura foram utilizados neste estudo). Os experimentadores podem precisar ajustar esses parâmetros ligeiramente por tentativa e erro para obter o melhor resultado.
O método das células de fluxo e o método invertido têm sido utilizados por diferentes autores para analisar uma variedade de efeitos que impactam os fluxos ativos, incluindo diferentes óleos12 e estruturas submersas13. A escolha do método depende do objetivo experimental. Usando o método de célula de fluxo, a imagem óptica de cima da camada ativa é mais clara do que para o método invertido devido aos diferentes fluidos sobrejacentes. No método da célula de fluxo, a imagem é realizada através de uma cobertura de vidro e uma fina camada de água, enquanto o método invertido é projetado para ter a camada de óleo no topo. Isso significa que um objetivo de longa distância de trabalho é necessário para o método invertido e a qualidade da imagem é reduzida. As diferenças de qualidade de imagem podem ser observadas comparando-se a Figura 2D (método da célula de fluxo) e a Figura 3 (método invertido) e o Filme 1 e o Filme 2, respectivamente. Uma lente de ampliação menor com uma distância de trabalho maior foi necessária para a Figura 3 do que a utilizada para a Figura 2. Essas desvantagens de imagem para o método invertido podem ser evitadas se um microscópio invertido adequado estiver disponível, combinado com objetivos com uma distância de trabalho apropriada para os substratos da lâmina do microscópio. O vidro mais fino pode ser usado como substrato para permitir o uso de objetivos de distância de trabalho padrão.
Como vantagem, a geometria invertida permite o uso de uma gama mais ampla de viscosidades do óleo, não requer necessariamente centrifugação da caçamba oscilante (se isso não estiver disponível) e a preparação do sistema é relativamente mais fácil uma vez que o molde é preparado. No entanto, para o confinamento em poços usando o método invertido, alguma centrifugação pode ser importante para obter o material em uma camada 2D bem definida.
O método da célula de fluxo tem sido usado recentemente com muito sucesso em experimentos em que uma camada ativa contínua é necessária. Nosso trabalho recente analisou a dinâmica de defeitos topológicos na camada ativa, onde a imagem de alta qualidade e a análise de textura são importantes19. Além disso, o método das células de fluxo tem sido utilizado para investigar os efeitos de microestruturas submersas a óleo sobre os fluxos ativos16 e pilares para reter defeitos nos fluxos ativos31. Este método funciona muito bem para a formação de uma camada ativa contínua, e a qualidade da imagem é excelente. No entanto, a etapa de centrifugação usada para produzir a camada ativa 2D final pode ser difícil de realizar, e as células de fluxo são propensas a vazamentos e bolhas de ar. O método invertido é uma alternativa muito útil com uma alta taxa de sucesso, é fácil de construir e pode ser usado para qualquer padrão de substrato ou geometria, desde que um molde mestre impresso em 3D de alta resolução possa ser criado. Este método também é útil para analisar os efeitos do confinamento geométrico na dinâmica nemática ativa, porque torna os poços de enchimento relativamente simples.
Neste artigo, duas maneiras de formar um nematic ativo a partir de microtúbulos e motores de cinesina são descritos, além de uma técnica para confinar os materiais em poços. O sistema apresentado representa o exemplo mais limpo de uma fase nemática ativa atualmente na literatura e tem sido reproduzido por diversos grupos ao redor do mundo. O significado deste material não reside apenas nas origens biológicas de seus componentes, mas também porque ele abre uma direção inteiramente nova em fluidos ordenados ativos. Ao trabalhar com esse sistema e elucidar suas propriedades fundamentais, os cientistas podem avançar para o design de fases ativas totalmente sintéticas.
Os experimentos focados nos efeitos do confinamento na nemática ativa têm o potencial de responder a questões fundamentais sobre o comportamento dos fluxos ativos e a dinâmica de defeitos topológicos sob confinamento topológico. O método aqui apresentado ajudará na realização de uma variedade de experimentos focados em geometria e sua análise, incluindo microfluídica e mistura ativa.
Disclosures
Alguns materiais utilizados neste trabalho foram fornecidos gratuitamente pela Cytoskeleton Inc. (Denver, EUA).
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o prêmio DMR-1808926 da National Science Foundation (NSF) pelo generoso financiamento. O projeto também foi apoiado pela NSF através do Centro de Excelência em Pesquisa em Ciência e Tecnologia: Centro de Máquinas Celulares e Biomoleculares da Universidade da Califórnia Merced (HRD-1547848) e do Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Bin Liu, da Universidade da Califórnia Merced, pela assistência na impressão 3D do molde, e ao Dr. Jordi Ignes pelo aconselhamento científico durante o desenvolvimento do método experimental invertido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
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