Summary
En selvsamlet peptid-poloxamin nanopartikel (PP-sNp) er udviklet ved hjælp af en mikrofluidisk blandeanordning til at indkapsle og levere in vitro transkriberet messenger RNA. Det beskrevne mRNA/PP-sNp kunne effektivt transfektere dyrkede celler in vitro.
Abstract
In vitro transskriberede messenger RNA (mRNA) vacciner har vist et enormt potentiale i kampen mod coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) pandemi. Effektive og sikre leveringssystemer skal inkluderes i mRNA -vaccinerne på grund af mRNA's skrøbelige egenskaber. Et selvsamlet peptid-poloxamin nanopartikel (PP-sNp) genleveringssystem er specielt designet til lungelevering af nukleinsyrer og viser lovende evner til formidling af vellykket mRNA-transfektion. Her beskrives en forbedret metode til fremstilling af PP-sNp for at uddybe, hvordan PP-sNp indkapsler Metridia luciferase (MetLuc) mRNA og med succes transfekterer dyrkede celler. MetLuc-mRNA opnås ved en in vitro transkriptionsproces fra en lineær DNA-skabelon. En PP-sNp fremstilles ved at blande syntetisk peptid / poloxamin med mRNA-opløsning ved anvendelse af en mikrofluidisk mixer, hvilket muliggør selvmontering af PP-sNp. Ladningen af PP-sNp evalueres efterfølgende ved at måle zetapotentialet. I mellemtiden måles polydispersiteten og den hydrodynamiske størrelse af PP-sNp nanopartikler ved hjælp af dynamisk lysspredning. mRNA /PP-sNp nanopartikler transficeret til dyrkede celler, og supernatanter fra cellekulturen analyseres for luciferaseaktivitet. De repræsentative resultater viser deres kapacitet til in vitro-transfektion . Denne protokol kan kaste lys over udviklingen af næste generations mRNA-vaccineleveringssystemer.
Introduction
Vaccination er blevet udråbt som en af de mest effektive medicinske interventioner til at reducere sygelighed og dødelighed forårsaget af infektionssygdomme1. Betydningen af vacciner er blevet demonstreret siden udbruddet af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19). I modsætning til det traditionelle koncept med injektion af inaktiverede eller levende svækkede patogener koncentrerer state-of-the-art vaccinemetoder, såsom nukleinsyrebaserede vacciner, sig om at bevare målpatogenernes immunstimulerende egenskaber, samtidig med at man undgår de potentielle sikkerhedsproblemer forbundet med den konventionelle hele mikrobielle virus eller i bakteriebaserede vacciner. Både DNA- og RNA-baserede vacciner (dvs. in vitro transskriberet messenger RNA, IVT mRNA) udviser profylaktisk til terapeutisk potentiale mod en række sygdomme, herunder infektionssygdomme og kræft 2,3. I princippet vedrører potentialet i nukleinsyrebaserede vacciner deres produktion, effektivitet og sikkerhed4. Disse vacciner kan fremstilles på en cellefri måde for at muliggøre omkostningseffektiv, skalerbar og hurtig produktion.
En enkelt nukleinsyrebaseret vaccine kan kode for flere antigener, hvilket muliggør målet for adskillige virale varianter eller bakterier med et reduceret antal podninger og styrker immunresponset mod modstandsdygtige patogener 5,6. Desuden kan nukleinsyrebaserede vacciner efterligne den naturlige invasionsproces af virus eller bakteriel infektion, hvilket bringer både B-celle- og T-cellemedierede immunresponser. I modsætning til nogle virus- eller i DNA-baserede vacciner tilbyder IVT mRNA-baserede vacciner en enorm fordel med hensyn til sikkerhed. De kan hurtigt udtrykke det ønskede antigen i cytosolen og er ikke integreret i værtsgenomet, hvilket undgår bekymringer om insertional mutagenese7. IVT-mRNA nedbrydes automatisk efter vellykket translation, så dets proteinekspressionskinetik let kan kontrolleres 8,9. Katalyseret af den alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi har indsats fra virksomheder / institutioner over hele verden gjort det muligt at frigive til markedet af mange typer vacciner. Ivt mRNA-baseret vaccineteknologi viser et stort potentiale og har for første gang demonstreret sin tidligere forventede succes på grund af dens hurtige design og fleksible kapacitet til at tilpasse sig alle målantigener inden for flere måneder. Succesen med IVT mRNA-vacciner mod COVID-19 i kliniske applikationer åbnede ikke kun en ny æra inden for IVT mRNA-vaccineforskning og -udvikling, men akkumulerede også værdifuld erfaring til hurtig udvikling af effektive vacciner til håndtering af udbrud af infektionssygdomme10,11.
På trods af det lovende potentiale for IVT mRNA-vacciner udgør den effektive intracellulære levering af IVT-mRNA til virkningsstedet (dvs. cytoplasma) fortsat en stor hindring12, især for dem, der administreres via luftvejene4. IVT mRNA er i sagens natur et ustabilt molekyle med en ekstremt kort halveringstid (~ 7 h) 13, hvilket gør IVT mRNA meget tilbøjelig til nedbrydning af den allestedsnærværende RNase14. Lymfocytterne i det medfødte immunsystem har tendens til at opsluge det anerkendte IVT-mRNA i tilfælde af in vivo-applikation . Desuden forringer den høje negative ladningstæthed og den store molekylvægt (1 x 104-1 x 106 Da) af IVT mRNA dens effektive gennemtrængning over det anioniske lipiddobbeltlag af cellulære membraner15. Derfor kræves et leveringssystem med visse biofunktionelle materialer for at hæmme nedbrydningen af IVT-mRNA-molekylerne og lette cellulær optagelse16.
Bortset fra nogle få undtagelsestilfælde, hvor nøgen IVT mRNA blev direkte anvendt til in vivo-undersøgelser, anvendes forskellige leveringssystemer til at transportere IVT-mRNA til det terapeutiske virkningssted17,18. Tidligere undersøgelser har vist, at kun få IVT mRNA'er detekteres i cytosol uden hjælp fra et leveringssystem19. Talrige strategier er blevet udviklet til at forbedre RNA-levering med kontinuerlig indsats på området, lige fra protaminkondensation til lipidindkapsling20. Lipidnanopartikler (LNP'er) er de mest klinisk avancerede blandt mRNA-leveringskøretøjerne, hvilket bevises af, at alle de godkendte mRNA COVID-19-vacciner til klinisk brug anvender LNP-baserede leveringssystemer21. LNP'er kan imidlertid ikke formidle effektiv mRNA-transfektion, når formuleringerne leveres via respiratorisk rute22, hvilket bemærkelsesværdigt begrænser anvendelsen af disse formuleringer til at inducere slimhindeimmunrespons eller adressere lungerelaterede sygdomme såsom cystisk fibrose eller α1-antitrypsinmangel. Derfor er det nødvendigt at udvikle et nyt leveringssystem for at lette effektiv levering og transfektion af IVT mRNA i luftvejsrelaterede celler for at løse dette uopfyldte behov.
Det er blevet bekræftet, at peptid-poloxamin selvsamlede nanopartikel (PP-sNp) leveringssystem kan formidle den effektive transfektion af nukleinsyrer i luftvejene hos mus23. PP-sNp anvender en multifunktionel modulær designtilgang, som kan integrere forskellige funktionelle moduler i nanopartiklerne til hurtig screening og optimering23. De syntetiske peptider og elektrisk neutrale amfifile blokcopolymerer (poloxamin) i PP-sNp kan spontant interagere med IVT mRNA for at generere ensartet fordelte nanopartikler med en kompakt struktur og glat overflade23. PP-sNp kan forbedre gentransfektionseffekten af IVT mRNA-molekyler i dyrkede celler og luftvejene hos mus23. Denne undersøgelse beskriver en protokol til generering af PP-sNp indeholdende IVT mRNA, der koder for Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrolleret og hurtig blanding via en mikrofluidisk blandeanordning, der anvender det forskudte sildebensblandingsdesign, anvendes i denne protokol. Proceduren er let at udføre og tillader generering af PP-sNp med mere ensartede størrelser. Det generelle mål med PP-sNp-produktion ved hjælp af den mikrofluidiske mixer er at skabe PP-sNp til mRNA-kompleksdannelse på en velkontrolleret måde, hvilket muliggør effektiv og reproducerbar celletransfektion in vitro. Den nuværende protokol beskriver forberedelse, samling og karakterisering af PP-sNp indeholdende MetLuc-mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transkription af kemisk modificeret mRNA
BEMÆRK: Det er nødvendigt at bruge nukleasefrie rør, reagenser, glasvarer, pipettespidser osv., Fordi RNases er allestedsnærværende i miljøet, såsom laboratorieopløsninger, instrumentoverflader, hår, hud, støv osv. Rengør bænkens overflader og pipetter grundigt inden brug, og brug handsker for at undgå RNase-forurening.
- Udfør linearisering af DNA-skabelonen.
- Syntetisere den åbne læseramme (ORF) af Metridia luciferase (MetLuc) flankeret af en T7 polymerasepromotor, 5 'uoversat region (UTR), 3'UTR og poly (A) haler og klon den i PUC57-vektoren, som udtrykkes i bakterier (se Materialetabel).
BEMÆRK: DNA-skabelonens kodesekvens findes i supplerende fil 1. - Kulturbakterier, lys bakterierne, og oprens plasmid-DNA'et ved den tilsvarende kolonne (se plasmid-DNA-ekstraktionssæt i materialetabellen).
- Udfør en enkelt 50 μL reaktion, der indeholder 2 μL BamHI, 2 μL KpnI (se Materialetabel) og 2 μg plasmid-DNA ved 37 °C i 1 time, og opnå linearisering af DNA-skabelonen.
- Syntetisere den åbne læseramme (ORF) af Metridia luciferase (MetLuc) flankeret af en T7 polymerasepromotor, 5 'uoversat region (UTR), 3'UTR og poly (A) haler og klon den i PUC57-vektoren, som udtrykkes i bakterier (se Materialetabel).
- Udfør in vitro transkription for at generere uncapped-IVT mRNA.
- Udfør mRNA-syntese ved en enkelt 20 μL-reaktion ved hjælp af et T7-transkriptionssæt og pseudouridin (se Materialetabel): 10 μL (0,8-1 μg) lineær DNA-skabelon, 1,5 μL (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP og CTP, 2 μL 10x transkriptionsbuffer, 1 μL T7-enzym og 1 μL nukleasefrit vand (NF-vand). Ovennævnte komponenter blandes grundigt, og der inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
- Fjern skabelonens DNA.
- Der tilsættes 1 μL (1 U) DNase (RNase-fri) efter transskriptionsprocessen, og der inkuberes ved 37 °C i 15 min.
- Udfør uncapped-IVT mRNA-rensning ved hjælp af lithiumchloridudfældning.
- Rens det udækkede IVT-mRNA ved hjælp af lithiumchlorid (se materialetabel) med en arbejdskoncentration på 10 mM. Der tilsættes 50 μL 10 mM lithiumchlorid til 20 μL ikke-indkapslet IVT mRNA-opløsning.
- Bland hele volumen grundigt og afkøl ved -20 °C i 1 time. Saml det ikke-lukkede IVT-mRNA i 12 minutter ved 12.000 x g, som rutinemæssigt producerer 80-120 μg uindkapslet IVT-mRNA fra hver enkelt 20 μL-reaktion.
- Udfør IVT mRNA-capping.
- Udfør IVT mRNA-capping ved hjælp af cap 1-capping-systemet (se Materialetabel). Kort sagt skal du fjerne den sekundære struktur på 50 μg ukappet IVT mRNA ved opvarmning ved 65 ° C i 10 minutter, og derefter forbinde 5'-enden af ikke-lukket IVT-mRNA med cap 1, som fremstilles ved at ændre m7G-hættestrukturen ved hjælp af 2,5 μL s-adenosylmethionin (SAM) (20 mM) og 4 μL 2'-O-methyltransferase (100 U) i en 100 μL reaktion ved 37 ° C i 30-60 min.
- 100 μL af det lukkede IVT-mRNA renses ved hjælp af 250 μL 10 mM lithiumchlorid og fortyndes i 50 μL NF-vand.
- Bestem renheden og molekylstørrelsen af capped-IVT mRNA.
- Mål koncentrationen af capped-IVT mRNA med et UV-synligt spektrofotometer. Ved hjælp af en RNA-markør (se materialetabel) skal du analysere molekylstørrelsen af capped-IVT mRNA i en 1% formaldehyddenaturerende agarosegel indeholdende 18% formaldehyd (spænding er 120 V). Sørg for, at det ikke-lukkede IVT-mRNA og det lukkede IVT-mRNA opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: IVT-mRNA'et blev anset for at have god renhed i et A260 / A280-forhold på 1,8-2,1 og et A260 / A230-forhold på 2,0 eller lidt højere.
- Mål koncentrationen af capped-IVT mRNA med et UV-synligt spektrofotometer. Ved hjælp af en RNA-markør (se materialetabel) skal du analysere molekylstørrelsen af capped-IVT mRNA i en 1% formaldehyddenaturerende agarosegel indeholdende 18% formaldehyd (spænding er 120 V). Sørg for, at det ikke-lukkede IVT-mRNA og det lukkede IVT-mRNA opbevares ved -80 °C.
2. Generering af IVT mRNA / PP-sNp
- Poloxamin 704 (T704) stamopløsning fremstilles ved at opløse T704 (se materialetabel) i NF-vand for at opnå en 10 mg/ml stamopløsning. Den tilberedte opløsning opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: T704 indeholder en X-formet struktur fremstillet af en ethylendiamincentralgruppe bundet til fire kæder af poly (propylenoxid) (PPO) blokke og poly (ethylenoxid) (PEO) blokke24. Molekylvægten (Mw) af T704 er 5500. - Forbered det syntetiske peptid (sPep, se Materialetabel) stamopløsning ved at opløse sPep (sekvens: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRKKKKGACSE
RSMNFCG) i NF-vand for at opnå en 2 mg/ml stamopløsning og opbevares ved 4 °C. - Forbered IVT-mRNA-opløsningen ved at optø IVT-mRNA'et (trin 1) på is og centrifugere kort i 3 s ved 300 x g ved stuetemperatur, inden røret åbnes. Fortynd IVT mRNA-opløsningen til 0,04 μg/ μL med NF-vand.
BEMÆRK: Det anbefales at arbejde i et biosikkerhedsskab, når det er muligt med IVT mRNA. - T704- og sPep-blandingsopløsningen fremstilles ved at fortynde sPep-opløsningen til 0,555 μg/μL og T704-opløsningen til 8 μg/μL med NF-vand. Den blandede opløsning inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur inden yderligere brug.
BEMÆRK: Beregn den krævede sPep-komponent baseret på det ønskede N / P-forhold. N/P-forholdet er det samlede antal nitrogenrester (N) inden for sPep til det samlede antal negativt ladede phosphatgrupper (P) inden for IVT-mRNA'et. Beregn den krævede T704 baseret på vægt / vægt (w / w) forholdet mellem T704 og IVT mRNA. Det er nødvendigt, at N / P-forholdet er 5, og w / w-forholdet er 100. - Forbered IVT mRNA / PP-sNp formuleringen ved at følge nedenstående trin.
- Led IVT mRNA-opløsningen (trin 3) ind i en 1 ml sprøjte, så der ikke er lufthuller eller bobler i sprøjtespidsen. Læg sprøjten i den ene side af patronen ved siden af den roterende blok.
- Fyld en 1 ml sprøjte med T704- og sPep-blandingsopløsningen (trin 4). Fjern eventuelle bobler eller lufthuller ved sprøjtens spids, og sæt sprøjten i pumpens andet indløb (se Materialetabel).
- Indstil pumpen med et flowforhold på 1:1 og en samlet flowhastighed på 4-10 ml/min.
BEMÆRK: En samlet strømningshastighed på 6 ml /min er optimal i de undersøgelser, der præsenteres her. - Anbring et 10 ml RNasefrit konisk rør (se Materialetabel) for at opsamle den blandede IVT-mRNA/PP-sNp-opløsning for enden af blandeanordningens strømningsvej.
- Kør pumpen for at starte blandingen, og sørg for, at parametrene indtastes korrekt. Når pumpen er færdig med at køre i 6 s, opsamles IVT-mRNA/PP-sNp-prøven fra det koniske rør.
BEMÆRK: PP-sNp blev genereret ved hjælp af en mikrofluidisk mixer (supplerende figur 1). Enheden består af en konstant flowpumpe, linkenhed, chip og fast enhed. I blandingsprocessen leverer den konstante flowpumpe, der er forbundet med chippen, væske til chippen i henhold til den forudindstillede strømningshastighed. Den tilsluttede konstantflowpumpe kan tilsluttes flere inputkanaler i chippen med en enkelt udgangskanal. Enhedens komponenter, herunder chippen, blev opnået fra kommercielle kilder og rationelt samlet (se Materialetabel). Parametrene, såsom strømningshastighed og volumen af IVT mRNA-opløsningen og T704-sPep blandet opløsning, kan afvige fra dem, der vises i den aktuelle protokol, hvis der anvendes en anden opsætning og skal optimeres i overensstemmelse hermed.
3. Måling af den hydrodynamiske diameter og polydispersitet af IVT-mRNA /PP-sNp
- En alikvote af IVT mRNA/PP-sNp-opløsningen (trin 2) fortyndes med NF-vand for at opnå et slutvolumen på 1 ml.
- Mål den hydrodynamiske størrelse og polydispersitetsindekset (PDI) ved hjælp af en semi-mikro kuvette25. Tilsæt IVT mRNA / PP-sNp-opløsningen i kuvetten og anbring den i partikelstørrelsesmåleren (se Materialetabel). Opret en standardoperationsprocedure, og klik på Start for at starte dataindsamlingen.
4. Forberedelse af cellerne til transfektion
- Plade humane bronchiale epitelceller (16HBE) og en dendritisk cellelinje (DC2.4) i 96-brøndplader med en densitet på 3,5 x 104 celler / brønd 24 timer før transfektion. Cellerne dyrkes i et dyrkningsmedium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 1% penicillin/streptomycin.
BEMÆRK: Cellerne blev hentet fra en kommerciel kilde (se Materialetabel). - Inkuber cellerne i en inkubator (37 ° C og 5% CO2 -atmosfære) i 24 timer for at sikre, at cellerne er 60% -80% sammenløb før transfektionen.
5. Transfektion af de dyrkede celler
- Efter fjernelse af vækstmediet vaskes de belagte celler med 0,2 ml/brønd 1x PBS.
- Der tilsættes 170 μL serumfrit dyrkningsmedium til hver brønd, der indeholder de belagte cellekulturer.
- Ivt mRNA/PP-sNp-formuleringen indeholdende 0,4 μg MetLuc mRNA (fremstillet i trin 2) tilsættes dråbevis med en mængde på 30 μL/brønd.
- Cellerne inkuberes med IVT mRNA/PP-sNp-formuleringen ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2-beriget atmosfære i 4 timer.
- Transfektionsmediet erstattes med 0,2 ml friskkulturmedium suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 1 % (v/v) penicillin/streptomycin.
BEMÆRK: Det føtale kvægserum blev opvarmet ved 56 °C i 30 minutter for inaktivering. - De transinficerede celler inkuberes ved 37 °C og i en 5 % CO 2-beriget atmosfære i 24 timer, og de supernatanter, der skal påvises, opsamles fra hver brønd.
6. Analyse af celletransfektionseffektivitet ved hjælp af Metridia luciferase (MetLuc) assay
- Assay supernatanten fra hver brønd for MetLuc-aktivitet ved hjælp af coelenterazinsubstrat (se Materialetabel) ved at følge nedenstående trin.
- Forbered en frisk assayopløsning ved at tilsætte 1x PBS til coelenterazinsubstratet (koncentrationen af coelenterazin er 15 mM).
- Vortex coelenterazinopløsningen i 10 s til grundig blanding.
- Der tilsættes 50 μL supernatant (opsamlet i trin 5) til en plade med 96 brønde.
- Mikropladelæseren (se Materialetabel) indstilles med en læsetid på 1.000 ms, før der tilsættes 30 μL coelenterazinopløsning (15 mM) til hvert hul manuelt eller ved automatisk injektion.
- Klik på Start for at måle luminescenssignalet umiddelbart efter tilsætning af coelenterazinopløsningen til supernatanten.
BEMÆRK: Luminescenssignalet måles ved hjælp af en mikropladelæser, og dets aktivitet udtrykkes i relative lysenheder. Værdierne fra PBS-transinficerede brønde vil blive brugt som tomme kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det rekombinante plasmid blev fordøjet for at producere den lineariserede DNA-skabelon (figur 2A). Ved anvendelse af den beskrevne protokol kan T7 in vitro transkriptionssættet producere op til 80-120 μg ubegrænset MetLuc-mRNA pr. 20 μL reaktion og 50-60 μg capped MetLuc-mRNA pr. 100 μL reaktion. Når det analyseres med elektroforese, skal intakt MetLuc-mRNA med høj kvalitet vise et enkelt og klart bånd, som vist i figur 2B. Forurenende stoffer, der indføres i reaktionen fra DNA-skabelonen, kan resultere i RNA-nedbrydning og et lavere udbytte.
PP-sNp indeholdende MetLuc-mRNA (MetLuc-mRNA/PP-sNp) blev fremstillet ved anvendelse af den mikrofluidiske blandingsmetode (figur 1). Tabel 1 viser data om den fysisk-kemiske karakterisering af MetLuc-mRNA/PP-sNp som eksempler. Den hydrodynamiske radius af MetLuc-mRNA /PP-sNp kan betragtes som korrekt, hvis den varierer omkring 70-100 nm. Desuden skal PDI for PP-sNp være konstant og helst være under 0,2, men PDI-værdier op til ca. 0,3 accepteres.
Efter vellykket inkorporering af MetLuc-mRNA i PP-sNp kan formuleringen inkuberes med 16HBE-celler og en dendritisk cellelinje (DC2.4), og transfektionseffektiviteten af MetLuc-mRNA kan indikeres ved luciferaseaktiviteten inden for cellekulturens supernatant 24 timer efter transfektion. Figur 3 er et typisk eksempel på den vellykkede transfektion af MetLuc-mRNA/PP-sNp. Det kan tydeligt ses, at celler transficeret med MetLuc-mRNA / PP-sNp viste signifikant højere ekspression af luciferase sammenlignet med dem, der blev transficeret med kommercielt tilgængelig lipidbaseret transfektionsregent (LP) (se Materialetabel), nøgen MetLuc-mRNA (negativ kontrol), PBS (blank kontrol) eller T704-sPep blandet opløsning (mock control) i 16HBE-celler. MetLuc-mRNA /PP-sNp viste også højere ekspression af luciferase sammenlignet med LP. Dataene tyder på, at PP-sNp-leveringssystemet er vigtigt for at beskytte MetLuc-mRNA mod nedbrydning og for at fremme transfektionseffektiviteten af det eksogene MetLuc-mRNA. Derfor er leveringssystemer som PP-sNp generelt afgørende for IVT mRNA-transfektionsundersøgelser.
Figur 1: Skematisk repræsentation af hele arbejdsgangen for IVT mRNA/PP-sNp. DNA-skabelonen er knyttet til plasmidet ved rekombinant plasmidkonstruktion. Den lineariserede DNA-skabelon samles ved hjælp af restriktionsenzymfordøjelse. In vitro transskriberet mRNA (IVT mRNA) syntetiseres og afgrænses fra den lineariserede DNA-skabelon. T704-sPep-opløsningen indeholder T704 og det syntetiske peptid (sPep), mens IVT mRNA-opløsningen indeholder MetLuc-mRNA. IVT mRNA og T704-sPep blandede opløsninger blandes ved anvendelse af en mikrofluidisk mixer, som danner MetLuc-mRNA / PP-sNp. Dernæst udføres karakteriseringen af MetLuc-mRNA / PP-sNp for at bestemme partikelstørrelsen og polydispersiteten ved hjælp af en Zetasizer. 16HBE-celler transficeret med MetLuc-mRNA/PP-sNp, og luciferaseaktiviteten i supernatanten måles for at evaluere transfektionseffektiviteten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Produktionen af MetLuc-mRNA. (A) DNA-skabelonen indeholder en T7-polymerasepromotor, en 5'utraslateret region (UTR), en åben læseramme (ORF) af MetLuc, en 3'UTR og poly (A) haler. (B) Påvisning af elektroforese. Den hvide pil angiver rekombinant plasmid. Den gule pil angiver PUC57-vektoren. Den røde pil angiver DNA-skabelonen for in vitro-transkriptionen af MetLuc-mRNA. Den grønne pil angiver metluc-mRNA uden låg. Den blå pil angiver metluc-mRNA med låg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Transfektionseffektivitet af MetLuc-mRNA/PP-sNp i 16HBE- og DC2.4-celler. MetLuc-mRNA blev transficeret ved hjælp af PP-sNp i (A) 16HBE-celler og (B) en dendritisk cellelinje (DC2.4). Den endelige koncentration af MetLuc-mRNA var 0,02 μg/μL, koncentrationen af sPep var 0,139 μg/μL, og koncentrationen af T704 var 2 μg/μL i PP-sNp. Kommerciel lipidbaseret transfektionsregent (LP) blev vedtaget som en positiv kontrol. Luciferaseaktiviteten blev målt 24 timer efter transfektion. Den PBS-behandlede prøve blev vedtaget som en blindprøve. T704-sPep blandet løsning blev vedtaget som en mock kontrol. Statistiske forskelle blev analyseret med en Student's t-test (nsp ≥ 0,05, * p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Ivt mRNA | N/P (sPep) | w/w (T704) | Størrelse (nm) | Pdi | Zeta |
| 17,5 ng/μL | 5 | 100 | 85.12 ± 9.40 | 0,20 ± 0,07 | -13.07 ± 0.47 |
Tabel 1: Fysisk-kemiske karakteriseringsdata for MetLuc-mRNA/PP-sNp.
Supplerende figur 1: Opsætningen af det internt forberedte mikrofluidiske udstyr, der anvendes i den aktuelle undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: DNA-skabelonens kodesekvens. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tillader ikke kun omkostningseffektiv og hurtig produktion af IVT mRNA-vaccineformuleringer med definerede egenskaber, men den giver også mulighed for at tilpasse PP-sNp-formuleringen i henhold til specifikke terapeutiske formål, såsom genterapi. For at sikre en vellykket generering af IVT mRNA / PP-sNp foreslås det at være ekstra opmærksom på nogle kritiske trin. Når du arbejder med mRNA, skal du altid huske, at RNase-fri betingelser skal opretholdes gennem hele processen, fordi IVT mRNA er meget følsom med hensyn til nedbrydning af RNase, selvom IVT-mRNA'et er fremstillet med kemisk modifikation. I mellemtiden skal der også sikres et RNase-frit miljø ved opbevaring af formuleringerne. Det anbefales at opbevare IVT mRNA/PP-sNp ved 2-8 °C i op til 1 uge. De præsenterede resultater viser, at nukleasefrit vand er effektivt til succesfuldt at danne PP-sNp med høj transfektionseffektivitet. Andre buffere, såsom PBS, saltvand, OptiMEM osv., Kan anvendes, hvis det ønskes. Det anbefales at udføre in vitro-transfektioner ved hjælp af IVT mRNA / PP-sNp i et OptiMEM-medium for at sikre levedygtigheden af de dyrkede celler. Hvis der vælges en anden buffer i stedet for nukleasefrit vand til fremstilling af formuleringen, er det vigtigt at anvende IVT mRNA med en lav koncentration (under 100 ng / ml); Ellers har nanopartiklerne tendens til at blive udfældet, hvilket igen gør en ugyldig formulering. Årsagen til dette fænomen er den kationiske del i det syntetiske peptid. Derudover kan nanopartiklens stærke positive ladningstæthed destabilisere cellemembranen og dermed inducere signifikant cytotoksicitet. Det blev imidlertid demonstreret i den tidligere undersøgelse, at den positive ladning inden for PP-sNp er afgørende for at formidle effektiv IVT mRNA-cellulær optagelse, endosomflugt og vellykket transfektion23. Som følge heraf er det vigtigt at justere den positive ladning inden for PP-sNp for at finde en delikat balance med hensyn til effektivitet og toksicitet.
Den præsenterede protokol kan anvendes på forskellige PP-sNp-baserede formuleringer med nogle parameterændringer. Til levering af IVT mRNA-baserede vacciner er biofysiske egenskaber såsom partikelstørrelse og polydispersitetsindeks afgørende for transfektionseffektiviteten og immunogeniciteten af de fremstillede nanopartikler26. Partikelstørrelsen af IVT mRNA/PP-sNp i nanometerskalaen muliggør effektiv overførsel på tværs af fysiologiske barrierer og er dermed vigtig for de efterfølgende in vivo-applikationer. Det er blevet rapporteret, at LNP'er i størrelsesområdet 60-150 nm producerer robuste immunresponser hos ikke-menneskelige primater26. På den anden side kunne store nanopartikler (f.eks. 400-1000 nm) ikke overvinde luftvejsslimbarrieren, når de blev anvendt til lungeafgivelse, fordi den gennemsnitlige 3-dimensionelle maskeafstand mellem luftvejsslimnetporer, som afsløret af tidligere undersøgelser, varierer fra ca. 60-300 nm27,28. Hvis den ønskede størrelse eller transfektionseffektivitet ikke opnås, omfatter nogle tip til startfejlfinding justering af mængden af poloxamin eller syntetiske peptidkomponenter, der anvendes. Den tidligere undersøgelse afslørede, at yderligere parametre, såsom mængden af IVT mRNA, der anvendes til transfektion, inkubationstiden og typerne og celletætheden af dyrkede celler, også kunne påvirke transfektionsresultatetsignifikant 23. Da målretningsdelen inden for PP-sNp tillader den specifikke levering af det indkapslede IVT-mRNA i celler, der viser relaterede receptorer, kan udskiftning med alternative målretningsligander desuden være nødvendig, hvis målcellerne transficeret med andre typer snarere end luftvejsrelaterede celler. Samlet set kan protokollen stadig forbedres med mere detaljeret indsigt og yderligere undersøgelse.
I betragtning af at det originale IVT-mRNA / PP-sNp oprindeligt fremstilles ved direkte manuel blanding, spiller operatørens evner en vigtig rolle i styringen af formuleringens kvalitet. Modifikationer i processen med at blande IVT-mRNA'et med komponenterne i PP-sNp kan resultere i store mikropartikler snarere end partikler i nanostørrelse. Det vanskeligste trin er at blande mRNA'et og det syntetiske peptid, hvilket skal gøres på en kontrolleret måde. For at forbedre reproducerbarheden mellem forskellige batcher af IVT mRNA / PP-sNp-formulering blev der vedtaget en mikrofluidisk mixer, fordi screening med lavt volumen, hurtig hastighed og reproducerbarhed er vigtige træk ved anvendelse af den mikrofluidiske metode29. Denne metode viste god reproducerbarhed uden signifikant indvirkning på partikelstørrelsen eller transfektionseffektiviteten observeret blandt forskellige batcher. Dette er et væsentligt kriterium for IVT mRNA-baserede vacciner, der skal anvendes i kliniske applikationer. Især bør den mikrofluidiske mixer ikke overstige det maksimale antal brugere (anbefalet af producenten) og skal ændres mellem formuleringer med forskellige sammensætninger.
Protokollen for IVT mRNA-transkription beskrevet i denne protokol kan teoretisk bruges til at forberede ethvert reporterprotein / antigen af interesse. Metridia luciferase (MetLuc) blev specifikt anvendt i denne undersøgelse, fordi den har unikke fordele. Aktivitetsassayet af MetLuc er let at udføre med høj følsomhed, fordi MetLuc kan producere et intensivt bioluminescerende signal, og det kan udskilles direkte i cellemediet og dermed undgå behovet for cellelyse. Det er vigtigt at bemærke, at MetLuc-ekspression i de dyrkede celler kan påvirkes af mange parametre (f.eks. varierende celletal pr. Brønd og pipetteringsfejl osv.) bortset fra funktionaliteten af selve MetLuc-mRNA'et.
Selvom den nuværende protokol blev etableret til levering af IVT mRNA-vaccinen, kan den også implementeres til vacciner eller terapier, der er baseret på andre typer nukleinsyrer, såsom plasmid-DNA (pDNA). Denne proces kunne tilpasses syntetiske peptid-, nukleinsyre- og poloxaminkomponentændringer til udvikling af særlig PP-sNp til forskellige kliniske indikationer. Faktisk blev genomintegrationen af det eksogene cystisk fibrose transmembrane transduktionsregulator (CFTR) gen i respiratorisk epitelvæv hos CFTR knockout mus med anvendelse af et Sleeping Beauty genetisk modifikationsværktøj leveret af en PP-sNp23 opnået med succes. Med hensyn til terapeutiske anvendelser kan IVT mRNA / PP-sNp-formuleringer anvendes som en aerosol ved anvendelse af specifikke forstøvningsanordninger til helbredelse af lungesygdomme, såsom α1-antitrypsinmangel eller cystisk fibrose30. Det er dog værd at bemærke, at IVT mRNA / PP-sNp-formuleringer til forstøvning bør optimeres og tilpasses, da det aerosoliserede IVT-mRNA kan være ineffektivt på grund af forskydningskraften skabt af forstøveren og den skrøbelige karakter af IVT mRNA30. Desuden er protokollen muligvis skalerbar til større volumener ved hjælp af forskellige mikrofluidiske blandeanordninger, såsom T-junction blandeanordninger og endda impingement jets blandepumper 31,32.
Sammenfattende introducerer protokollen, der er beskrevet her, en reproducerbar metode til formulering af IVT-mRNA i et PP-sNp-leveringssystem samt efterfølgende pålidelig transfektion i dyrkede celler. Den beskrevne metode garanterer en tilgængelig og nem tilgang til fremstilling af IVT mRNA / PP-sNp ved hjælp af en mikrofluidisk mixer. De forberedte formuleringer med små partikelstørrelser og lavt polydispersitetsindeks kan efterfølgende påføres sikkert og effektivt transfekterede dyrkede celler. Denne protokol vil gøre det muligt for det PP-sNp-baserede leveringssystem at blive tilgængeligt for det akademiske samfund til design af nye IVT mRNA-baserede vacciner eller terapier, samtidig med at man undgår alle de nævnte ulemper. Med de fleksible profiler af PP-sNp forventes mange fremtidige anvendelser at blive opnået med PP-sNp til at producere forskellige terapier til behandling af forskellige sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), det store projekt study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) af Kinas Ministerium for Videnskab og Teknologi, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) og Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Forfatterne er taknemmelige for Dr. Xiaoyan Ding for at måle den hydrodynamiske diameter (nm) og polydispersitetsindekset (PDI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
