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Immunology and Infection

पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड एमआरएनए का कुशल अभिकर्मक

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64288
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 3, 1
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, Third Military Medical University, 2Department of Pediatrics, Ludwig-Maximilians University of Munich, 3Department of Pharmacy, Southwest Hospital, Third Military Medical University
* These authors contributed equally

Summary

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए को समाहित करने और वितरित करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस का उपयोग करके एक स्व-इकट्ठे पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) विकसित किया गया है। वर्णित एमआरएनए / पीपी-एसएनपी इन विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक स्थानांतरित कर सकता है।

Abstract

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) टीकों ने कोरोनोवायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी के खिलाफ लड़ने में भारी क्षमता प्रदर्शित की है। एमआरएनए के नाजुक गुणों के कारण एमआरएनए टीकों में कुशल और सुरक्षित वितरण प्रणालियों को शामिल किया जाना चाहिए। एक स्व-इकट्ठे पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) जीन वितरण प्रणाली विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के फुफ्फुसीय वितरण के लिए डिज़ाइन की गई है और सफल एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता में आशाजनक क्षमताओं को प्रदर्शित करती है। यहां, पीपी-एसएनपी तैयार करने के लिए एक बेहतर विधि का वर्णन यह बताने के लिए किया गया है कि पीपी-एसएनपी मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक) एमआरएनए को कैसे समाहित करता है और सफलतापूर्वक सुसंस्कृत कोशिकाओं को स्थानांतरित करता है। मेटलुक-एमआरएनए एक रैखिक डीएनए टेम्पलेट से इन विट्रो प्रतिलेखन प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किया जाता है। पोलोक्सामाइन को माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके एमआरएनए समाधान के साथ मिलाकर उत्पादित किया जाता है, जिससे पीपी-एसएनपी की आत्म-असेंबली की अनुमति मिलती है। पीपी-एसएनपी के चार्ज का मूल्यांकन बाद में जीटा क्षमता को मापकर किया जाता है। इस बीच, पीपी-एसएनपी नैनोकणों के पॉलीडिस्पर्सिटी और हाइड्रोडायनामिक आकार को गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके मापा जाता है। पीपी-एसएनपी नैनोकणों को सुसंस्कृत कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है, और सेल संस्कृति से सतह पर तैरनेवालों को लूसिफेरेज़ गतिविधि के लिए परख किया जाता है। प्रतिनिधि परिणाम इन विट्रो अभिकर्मक के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रोटोकॉल अगली पीढ़ी के एमआरएनए वैक्सीन वितरण प्रणालियों को विकसित करने पर प्रकाश डाल सकता है।

Introduction

संक्रामक रोगों के कारण होने वाली रुग्णता और मृत्यु दर को कम करने के लिए टीकाकरण को सबसे कुशल चिकित्सा हस्तक्षेपों में से एक के रूप में घोषित किया गयाहै। कोरोना वायरस बीमारी 2019 (कोविड-19) के प्रकोप के बाद से टीकों के महत्व को प्रदर्शित किया गया है। निष्क्रिय या जीवित-क्षीण रोगजनकों को इंजेक्शन लगाने की पारंपरिक अवधारणा के विपरीत, अत्याधुनिक वैक्सीन दृष्टिकोण, जैसे न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीके, पारंपरिक संपूर्ण-माइक्रोबियल वायरस से जुड़े संभावित सुरक्षा मुद्दों से बचते हुए लक्ष्य रोगजनकों के प्रतिरक्षा-उत्तेजक गुणों को संरक्षित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं- या बैक्टीरिया-आधारित टीकों में। डीएनए- और आरएनए दोनों (यानी, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए, आईवीटी एमआरएनए) -आधारित टीके संक्रामक रोगों और कैंसर 2,3 सहित विभिन्न बीमारियों के खिलाफ चिकित्सीय क्षमता के लिए रोगनिरोधी प्रदर्शन करते हैं। सिद्धांत रूप में, न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीकों की क्षमता उनके उत्पादन, प्रभावकारिता और सुरक्षा से संबंधितहै 4. इन टीकों को लागत प्रभावी, स्केलेबल और तेजी से उत्पादन की अनुमति देने के लिए सेल-मुक्त तरीके से निर्मित किया जा सकता है।

एक एकल न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीका कई एंटीजन को एन्कोड कर सकता है, जिससे टीकाकरण की कम संख्या के साथ कई वायरल वेरिएंट या बैक्टीरिया के लक्ष्य को सक्षम किया जा सकता है और लचीला रोगजनकों 5,6 के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मजबूत किया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीके वायरस या जीवाणु संक्रमण की प्राकृतिक आक्रमण प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं, जिससे बी सेल- और टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं दोनों आती हैं। कुछ वायरस के विपरीत- या डीएनए-आधारित टीकों में, आईवीटी एमआरएनए-आधारित टीके सुरक्षा के मामले में एक बड़ा लाभ प्रदान करते हैं। वे साइटोसोल में वांछित एंटीजन को तेजी से व्यक्त कर सकते हैं और मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं होते हैं, सम्मिलन उत्परिवर्तन7 के बारे में चिंताओं को दूर करते हैं। सफल अनुवाद के बाद आईवीटी-एमआरएनए स्वचालित रूप से अपमानित हो जाता है, इसलिए इसकी प्रोटीन अभिव्यक्ति कैनेटीक्स को आसानी से 8,9 नियंत्रित किया जा सकता है। सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) महामारी से प्रेरित, दुनिया भर में कंपनियों/संस्थानों के प्रयासों ने कई प्रकार के टीकों के बाजार में रिलीज को सक्षम किया है। आईवीटी एमआरएनए-आधारित वैक्सीन तकनीक बड़ी क्षमता दिखाती है और पहली बार, इसकी तेजी से डिजाइन और कई महीनों के भीतर किसी भी लक्ष्य एंटीजन के अनुकूल होने की लचीली क्षमता के कारण, इसकी पहले से प्रत्याशित सफलता का प्रदर्शन किया है। नैदानिक अनुप्रयोगों में कोविड-19 के खिलाफ आईवीटी एमआरएनए टीकों की सफलता ने न केवल आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन अनुसंधान और विकास के एक नए युग की शुरुआत की, बल्कि संक्रामक रोगों के प्रकोप से निपटने के लिए प्रभावी टीकों के तेजी से विकास के लिए मूल्यवान अनुभव भी संचितकिया।

आईवीटी एमआरएनए टीकों की आशाजनक क्षमता के बावजूद, कार्रवाई की साइट (यानी, साइटोप्लाज्म) के लिए आईवीटी एमआरएनए की कुशल इंट्रासेल्युलर डिलीवरी एक बड़ी बाधा12 पैदा करना जारी रखती है, खासकर वायुमार्ग4 के माध्यम से प्रशासित लोगों के लिए। आईवीटी एमआरएनए स्वाभाविक रूप से एक अत्यंत कम आधा जीवन (~ 7 एच) 13 के साथ एक अस्थिर अणु है, जो आईवीटी एमआरएनए को सर्वव्यापी आरएनएएसई14 द्वारा गिरावट के लिए अत्यधिक प्रवण बनाता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के लिम्फोसाइट्स विवो अनुप्रयोग के मामलों में मान्यता प्राप्त आईवीटी एमआरएनए को घेर लेते हैं। इसके अलावा, आईवीटी एमआरएनए के उच्च नकारात्मक चार्ज घनत्व और बड़े आणविक भार (1 एक्स 104-1 एक्स 106 डीए) सेलुलर झिल्ली15 के आयनिक लिपिड बाइलेयर में इसके प्रभावी पारगम्यता को खराब करते हैं। इसलिए, आईवीटी एमआरएनए अणुओं के क्षरण को रोकने और सेलुलर अपटेक16 की सुविधा के लिए कुछ जैव-कार्यात्मक सामग्रियों के साथ एक वितरण प्रणाली की आवश्यकता होती है।

कुछ असाधारण मामलों के अलावा जिसमें नग्न आईवीटी एमआरएनए का उपयोग सीधे विवो जांच के लिए किया गया था, विभिन्न वितरण प्रणालियों का उपयोग आईवीटी एमआरएनए को कार्रवाई17,18 की चिकित्सीय साइट पर ले जाने के लिए किया जाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डिलीवरी सिस्टम19 की सहायता के बिना साइटोसोल में केवल कुछ आईवीटी एमआरएनए का पता लगाया जाता है। प्रोटामाइन संक्षेपण से लिपिड एनकैप्सुलेशन20 तक क्षेत्र में निरंतर प्रयासों के साथ आरएनए वितरण में सुधार के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं। लिपिड नैनोपार्टिकल्स (एलएनपी) एमआरएनए डिलीवरी वाहनों में सबसे नैदानिक रूप से उन्नत हैं, जैसा कि इस तथ्य से साबित होता है कि नैदानिक उपयोग के लिए सभी अनुमोदित एमआरएनए कोविड -19 टीके एलएनपी-आधारित वितरण प्रणालियोंको नियोजित करते हैं। हालांकि, एलएनपी प्रभावी एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता नहीं कर सकते हैं जब योगों को श्वसन मार्ग22 के माध्यम से वितरित किया जाता है, जो श्लेष्म प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने या फुफ्फुसीय से संबंधित बीमारियों जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस या α1-एंटीट्रिप्सिन की कमी को संबोधित करने में इन योगों के आवेदन को उल्लेखनीय रूप से सीमित करता है। इसलिए, वायुमार्ग से संबंधित कोशिकाओं में आईवीटी एमआरएनए के कुशल वितरण और अभिकर्मक को सुविधाजनक बनाने के लिए एक उपन्यास वितरण प्रणाली विकसित करना इस अपूर्ण आवश्यकता को हल करने के लिए आवश्यक है।

यह पुष्टि की गई है कि पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन स्व-इकट्ठे नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) वितरण प्रणाली चूहों के श्वसन पथ में न्यूक्लिक एसिड के कुशल अभिकर्मक की मध्यस्थता कर सकतीहै 23. पीपी-एसएनपी एक बहुआयामी मॉड्यूलर डिजाइन दृष्टिकोण को गोद लेता है, जो तेजी से स्क्रीनिंग और अनुकूलन23 के लिए नैनोकणों में विभिन्न कार्यात्मक मॉड्यूल को एकीकृत कर सकता है। पीपी-एसएनपी के भीतर सिंथेटिक पेप्टाइड्स और विद्युत रूप से तटस्थ एम्फीफिलिक ब्लॉक कॉपोलिमर (पोलोक्सामाइन) एक कॉम्पैक्ट संरचना और चिकनी सतह23 के साथ समान रूप से वितरित नैनोकणों को उत्पन्न करने के लिए आईवीटी एमआरएनए के साथ अनायास बातचीत कर सकते हैं। पीपी-एसएनपी सुसंस्कृत कोशिकाओं में आईवीटी एमआरएनए अणुओं के जीन अभिकर्मक प्रभाव और चूहों के श्वसन पथ में सुधार कर सकताहै 23. वर्तमान अध्ययन में आईपीटी एमआरएनए युक्त पीपी-एसएनपी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक-एमआरएनए) (चित्रा 1) को एन्कोड करता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस के माध्यम से नियंत्रित और तेजी से मिश्रण, जो कंपित हेरिंगबोन मिश्रण डिजाइन को नियोजित करता है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। प्रक्रिया निष्पादित करना आसान है और अधिक समान आकार के साथ पीपी-एसएनपी की पीढ़ी की अनुमति देता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके पीपी-एसएनपी उत्पादन का सामान्य लक्ष्य एक अच्छी तरह से नियंत्रित तरीके से एमआरएनए जटिलता के लिए पीपी-एसएनपी बनाना है, इस प्रकार इन विट्रो में कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल अभिकर्मक की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल मेटलुक-एमआरएनए युक्त पीपी-एसएनपी की तैयारी, असेंबली और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।

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Protocol

1. रासायनिक रूप से संशोधित एमआरएनए के इन विट्रो प्रतिलेखन में

नोट: न्यूक्लियस मुक्त ट्यूबों, अभिकर्मकों, कांच के बने पदार्थ, पिपेट युक्तियों, आदि का उपयोग करना आवश्यक है, क्योंकि आरएनएस पर्यावरण में सर्वव्यापी हैं, जैसे प्रयोगशाला समाधान, उपकरण सतहों, बाल, त्वचा, धूल, आदि। उपयोग करने से पहले बेंच सतहों और पिपेट को अच्छी तरह से साफ करें, और आरएनएएसई संदूषण से बचने के लिए दस्ताने पहनें।

  1. डीएनए टेम्पलेट का रैखिककरण करें।
    1. टी 7 पोलीमरेज़ प्रमोटर, 5 'अनूदित क्षेत्र (यूटीआर), 3'यूटीआर और पॉली (ए) पूंछ द्वारा फ्लैंक किए गए मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक) के खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) को संश्लेषित करें और इसे पीयूसी 57 वेक्टर में क्लोन करें, जिसे बैक्टीरिया में व्यक्त किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: डीएनए टेम्पलेट का कोडिंग अनुक्रम पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है।
    2. संस्कृति बैक्टीरिया, बैक्टीरिया को लाइज करें, और संबंधित कॉलम द्वारा प्लास्मिड डीएनए को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका में प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण किट देखें)।
    3. एक एकल 50 μL प्रतिक्रिया करें जिसमें बामएचआई के 2 μL, केपीएनआई के 2 μL ( सामग्री की तालिका देखें), और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्मिड डीएनए के 2 μg शामिल हैं, और डीएनए टेम्पलेट के रैखिककरण को प्राप्त करें।
  2. अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में प्रदर्शन करें।
    1. टी 7 प्रतिलेखन किट और स्यूडोरिडीन का उपयोग करके एक एकल 20 μL प्रतिक्रिया द्वारा एमआरएनए संश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें): रैखिक डीएनए टेम्पलेट के 10 μL (0.8-1 μg), एटीपी के 1.5 μL (150 mM), छद्म-यूटीपी, जीटीपी और सीटीपी, 10x प्रतिलेखन बफर के 2 μL, T7 एंजाइम के 1 μL, और 1 μL उपर्युक्त घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. टेम्पलेट डीएनए निकालें।
    1. प्रतिलेखन प्रक्रिया के बाद डीएनएएसई (आरएनएएसई-मुक्त) के 1 μL (1 यू) जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. लिथियम क्लोराइड वर्षा का उपयोग करके अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए शुद्धि करें।
    1. 10 एमएम की कामकाजी एकाग्रता के साथ लिथियम क्लोराइड ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए को शुद्ध करें। अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए समाधान के 20 μL में 10 एमएम लिथियम क्लोराइड के 50 μL जोड़ें।
    2. पूरी मात्रा को अच्छी तरह से मिलाएं और 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें। 12,000 एक्स जी पर 12 मिनट के लिए अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए इकट्ठा करें, जो नियमित रूप से प्रत्येक एकल 20 μL प्रतिक्रिया से अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए के 80-120 μg का उत्पादन करता है।
  5. आईवीटी एमआरएनए कैपिंग करें।
    1. कैप 1 कैपिंग सिस्टम का उपयोग करके आईवीटी एमआरएनए कैपिंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। संक्षेप में, 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए के 50 μg की माध्यमिक संरचना को हटा दें, फिर कैप 1 के साथ अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए के 5 'अंत को लिंक करें, जो एस-एडेनोसिलमेथियोनीन (एसएएम) (20 एमएम) के 2.5 μL का उपयोग करके एम 7 जी कैप संरचना को संशोधित करके तैयार किया जाता है और 2'-ओ-ट्रांसमिथेल के 4 μL
    2. 10 एमएम लिथियम क्लोराइड के 250 μL का उपयोग करके कैप्ड आईवीटी एमआरएनए के 100 μL को शुद्ध करें और एनएफ-पानी के 50 μL में पतला करें।
  6. कैप्ड-आईवीटी एमआरएनए की शुद्धता और आणविक आकार निर्धारित करें।
    1. यूवी-दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कैप्ड-आईवीटी एमआरएनए की एकाग्रता को मापें। एक आरएनए मार्कर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), 1% फॉर्मलाडेहाइड विकृत एगरोज़ जेल में कैप्ड-आईवीटी एमआरएनए के आणविक आकार का विश्लेषण करें जिसमें 18% फॉर्मलाडेहाइड (वोल्टेज 120 वी है)। सुनिश्चित करें कि अनकैप्ड-आईवीटी एमआरएनए और कैप्ड-आईवीटी एमआरएनए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत हैं।
      नोट: आईवीटी एमआरएनए को 1.8-2.1 के ए260 / ए280 अनुपात और 2.0 या थोड़ा अधिक के ए260 / ए230 अनुपात में अच्छी शुद्धता माना जाता था।

2. आईवीटी एमआरएनए/पीपी-एसएनपी का सृजन

  1. एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए एनएफ-पानी में टी 704 ( सामग्री की तालिका देखें) को घुलनशील करके पोलोक्सामाइन 704 (टी 704) स्टॉक समाधान तैयार करें। तैयार समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: टी 704 में एक एथिलीनेडियामाइन केंद्रीय समूह से बना एक एक्स-आकार की संरचना होती है जो पॉली (प्रोपलीन ऑक्साइड) (पीपीओ) ब्लॉक और पॉली (एथिलीन ऑक्साइड) (पीईओ) ब्लॉक24 की चार श्रृंखलाओं से बंधी होती है। टी 704 का आणविक भार (मेगावाट) 5500 है।
  2. एसपीईपी को घुलनशील बनाकर सिंथेटिक पेप्टाइड (एसपीईपी, सामग्री की तालिका देखें) स्टॉक समाधान तैयार करें (अनुक्रम: केईटीडब्ल्यूडब्ल्यूडब्ल्यूडब्ल्यूटीईडब्ल्यूडब्ल्यूटीईडब्ल्यूटीईकेकेआरआरकेजीएसईकेजीएसई)
    एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए एनएफ-पानी में आरएसएमएनएफसीजी)।
  3. बर्फ पर आईवीटी एमआरएनए (चरण 1) को पिघलाकर आईवीटी एमआरएनए समाधान तैयार करें और ट्यूब खोलने से पहले कमरे के तापमान पर 300 एक्स जी पर 3 एस के लिए जल्द ही सेंट्रीफ्यूजिंग करें। एनएफ-पानी के साथ आईवीटी एमआरएनए समाधान को 0.04 μg / μL तक पतला करें।
    नोट: आईवीटी एमआरएनए के साथ जब भी संभव हो जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करने की सिफारिश की जाती है।
  4. एनएफ-पानी के साथ 0.555 μg/μL और T704 समाधान को 8 μg/μL में एसपीईपी समाधान को पतला करके T704 और एसपीईपी मिश्रण समाधान तैयार करें। आगे के उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रित समाधान सेते हैं।
    नोट: वांछित एन/पी अनुपात के आधार पर आवश्यक एसपीईपी घटक की गणना करें। पी अनुपात आईपीईपी के भीतर नाइट्रोजन अवशेषों (एन) की कुल संख्या है जो आईवीटी एमआरएनए के भीतर नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए फॉस्फेट समूहों (पी) की कुल संख्या है। टी 704 और आईवीटी एमआरएनए के बीच वजन /वजन (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अनुपात के आधार पर आवश्यक टी 704 की गणना करें। यह आवश्यक है कि एन/पी अनुपात 5 है और डब्ल्यू/डब्ल्यू अनुपात 100 है।
  5. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन तैयार करें।
    1. आईवीटी एमआरएनए समाधान (चरण 3) को 1 एमएल सिरिंज में ड्रा करें, जिससे सिरिंज टिप में कोई हवा अंतराल या बुलबुले सुनिश्चित न हों। घूर्णन ब्लॉक के बगल में कारतूस के एक तरफ सिरिंज लोड करें।
    2. टी 704 और एसपीईपी मिश्रण समाधान (चरण 4) के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें। सिरिंज टिप पर किसी भी बुलबुले या हवा के अंतराल को हटा दें और सिरिंज को पंप के अन्य इनलेट में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. 1: 1 के प्रवाह अनुपात और 4-10 एमएल / मिनट की कुल प्रवाह दर के साथ पंप सेट करें।
      नोट: यहां प्रस्तुत अध्ययनों में 6 एमएल / मिनट की कुल प्रवाह दर इष्टतम है।
    4. मिश्रण डिवाइस के प्रवाह पथ के अंत में मिश्रित आईवीटी-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी समाधान एकत्र करने के लिए 10 एमएल आरएनए-मुक्त शंक्वाकार ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) रखें।
    5. मिश्रण शुरू करने के लिए पंप चलाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि पैरामीटर सही ढंग से इनपुट हैं। पंप 6 एस के लिए चलने के बाद, शंक्वाकार ट्यूब से आईवीटी-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी नमूना एकत्र करें।
      नोट: पीपी-एसएनपी एक माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर (पूरक चित्रा 1) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। डिवाइस में एक निरंतर प्रवाह पंप, लिंक डिवाइस, चिप और फिक्स्ड डिवाइस शामिल हैं। मिश्रण प्रक्रिया में, चिप से जुड़ा निरंतर प्रवाह पंप पूर्व निर्धारित प्रवाह दर के अनुसार चिप को तरल बचाता है। कनेक्टेड निरंतर प्रवाह पंप को एक आउटपुट चैनल के साथ चिप के कई इनपुट चैनलों से जोड़ा जा सकता है। चिप सहित डिवाइस के घटकों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था और तर्कसंगत रूप से इकट्ठा किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। पैरामीटर, जैसे कि प्रवाह दर और आईवीटी एमआरएनए समाधान और टी 704-एसपीईपी मिश्रित समाधान की मात्रा, वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रदर्शित लोगों से भिन्न हो सकती है यदि कुछ अलग सेटअप का उपयोग किया जाता है और तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।

3. हाइड्रोडायनामिक व्यास का मापन और आईवीटी-एमआरएनए /पीपी-एसएनपी की पॉलीडिस्पर्सिटी

  1. 1 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए एनएफ-पानी के साथ आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी समाधान (चरण 2) के एक विभाज्य को पतला करें।
  2. अर्ध-सूक्ष्म क्युवेट25 का उपयोग करके हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) को मापें। क्युवेट में आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी समाधान जोड़ें और इसे कण आकार मीटर में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक मानक संचालन प्रक्रिया सेट करें और डेटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।

4. अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्लेट मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (16एचबीई) और एक डेंड्राइटिक सेल लाइन (डीसी 2.4) अभिकर्मक से पहले 3.5 x 104 कोशिकाओं / 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक एक संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    नोट: कोशिकाओं को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. अभिकर्मक से पहले कोशिकाओं 60% -80% संगम कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 वातावरण) में कोशिकाओं सेते हैं।

5. सुसंस्कृत कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. विकास माध्यम को हटाने के बाद, 0.2 एमएल / अच्छी तरह से 1 एक्स पीबीएस के साथ मढ़वाया कोशिकाओं को धो लें।
  2. मढ़वाया सेल संस्कृतियों युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम के 170 μL जोड़ें।
  3. 30 μL/ अच्छी तरह से की मात्रा के साथ मेटलक एमआरएनए (चरण 2 में तैयार) ड्रॉपवाइज के 0.4 μg युक्त आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन जोड़ें।
  4. पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन के साथ कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए आर्द्र 5% सीओ2-समृद्ध वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. अभिकर्मक माध्यम को 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ताजा संस्कृति माध्यम के 0.2 एमएल के साथ बदलें।
    नोट: भ्रूण गोजातीय सीरम निष्क्रियता के लिए 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया गया था।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं सेते हैं और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 समृद्ध वातावरण में और प्रत्येक कुएं से पता लगाने के लिए सतह पर तैरनेवालों को इकट्ठा करें।

6. मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक) परख का उपयोग करके सेल अभिकर्मक प्रभावकारिता का विश्लेषण

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कोएलेंटेराज़िन सब्सट्रेट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मेटलुक गतिविधि के लिए प्रत्येक कुएं से सतह पर तैरनेवाला परख करें।
    1. कोएलेंटेराज़िन सब्सट्रेट में 1 एक्स पीबीएस जोड़कर एक ताजा परख समाधान तैयार करें (कोएलेंटेराज़िन की एकाग्रता 15 एमएम है)।
    2. पूरी तरह से मिश्रण के लिए 10 एस के लिए कोएलेंटेराज़िन समाधान भंवर।
    3. एक 96 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए सतह पर तैरनेवाला (चरण 5 में एकत्र) के 50 μL जोड़ें।
    4. मैन्युअल रूप से या स्वचालित इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से कोलेंटेराज़िन समाधान (15 एमएम) के 30 μL जोड़ने से पहले 1,000 एमएस पढ़ने के समय के साथ माइक्रोप्लेट रीडर ( सामग्री की तालिका देखें) सेट करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला करने के लिए कोएलेंटेराज़ीन समाधान जोड़ने के तुरंत बाद ल्यूमिनेसेंस सिग्नल को मापने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें ।
      नोट: ल्यूमिनेसेंस सिग्नल को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा जाता है, और इसकी गतिविधि सापेक्ष प्रकाश इकाइयों में व्यक्त की जाती है। पीबीएस-ट्रांसफेक्टेड कुओं से प्राप्त मूल्यों का उपयोग रिक्त नियंत्रण के रूप में किया जाएगा।

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Representative Results

पुनः संयोजक प्लास्मिड रैखिक डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 2 ए) का उत्पादन करने के लिए पच गया था। वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, टी 7 इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट 20 μL प्रतिक्रिया प्रति अनकैप्ड मेटलुक-एमआरएनए के 80-120 μg और 100 μL प्रतिक्रिया प्रति कैप्ड मेटलुक-एमआरएनए के 50-60 μg का उत्पादन कर सकता है। वैद्युतकणसंचलन के साथ विश्लेषण करते समय, उच्च गुणवत्ता के साथ बरकरार मेटलुक-एमआरएनए को एक एकल और स्पष्ट बैंड दिखाना चाहिए, जैसा कि चित्रा 2 बी में प्रदर्शित किया गया है। डीएनए टेम्पलेट से प्रतिक्रिया में पेश किए गए दूषित पदार्थों के परिणामस्वरूप आरएनए गिरावट और कम उपज हो सकती है।

पीपी-एसएनपी जिसमें मेटलुक-एमआरएनए (मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी) माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण विधि (चित्रा 1) का उपयोग करके तैयार किया गया था। तालिका 1 उदाहरण के रूप में मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी के भौतिक रासायनिक लक्षण वर्णन पर डेटा दिखाती है। मेटलुक-एमआरएनए /पीपी-एसएनपी के हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या को सही माना जा सकता है यदि यह लगभग 70-100 एनएम है। इसके अलावा, पीपी-एसएनपी का पीडीआई स्थिर होना चाहिए और अधिमानतः 0.2 से नीचे होना चाहिए, लेकिन लगभग 0.3 तक पीडीआई मान स्वीकार किए जाते हैं।

पीपी-एसएनपी में मेटलुक-एमआरएनए को सफलतापूर्वक शामिल करने के बाद, फॉर्मूलेशन को 16 एचबीई कोशिकाओं और एक डेंड्राइटिक सेल लाइन (डीसी 2.4) के साथ ऊष्मायन किया जा सकता है, और मेटलुक-एमआरएनए की अभिकर्मक दक्षता को सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला 24 घंटे पोस्ट अभिकर्मक के भीतर ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि द्वारा इंगित किया जा सकता है। चित्रा 3 मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी के सफल अभिकर्मक का एक विशिष्ट उदाहरण है। यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी से संक्रमित कोशिकाओं ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिपिड-आधारित अभिकर्मक रीजेंट (एलपी) ( सामग्री की तालिका देखें), नग्न मेटलुक-एमआरएनए (नकारात्मक नियंत्रण), पीबीएस (रिक्त नियंत्रण), या टी 704-एसपीईपी मिश्रित समाधान (मॉक कंट्रोल) से संक्रमित लोगों की तुलना में ल्यूसिफेरेज़ की काफी अधिक अभिव्यक्ति प्रदर्शित की। मेटलुक-एमआरएनए /पीपी-एसएनपी ने भी एलपी की तुलना में ल्यूसिफेरेज़ की उच्च अभिव्यक्ति दिखाई। आंकड़ों से पता चलता है कि पीपी-एसएनपी डिलीवरी सिस्टम मेटलुक-एमआरएनए को गिरावट से बचाने और बहिर्जात मेटलुक-एमआरएनए की अभिकर्मक दक्षता को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, आईपी-एसएनपी जैसे वितरण प्रणाली आमतौर पर आईवीटी एमआरएनए अभिकर्मक अध्ययन के लिए आवश्यक हैं।

Figure 1
चित्रा 1: आईवीटी एमआरएनए /पीपी-एसएनपी के पूरे वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डीएनए टेम्पलेट पुनः संयोजक प्लास्मिड निर्माण द्वारा प्लास्मिड से जुड़ा हुआ है। रैखिक डीएनए टेम्पलेट को प्रतिबंध एंजाइम पाचन का उपयोग करके इकट्ठा किया जाता है। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड एमआरएनए (आईवीटी एमआरएनए) को रैखिक डीएनए टेम्पलेट से संश्लेषित और कैप किया जाता है। टी 704-एसपीईपी समाधान में टी 704 और सिंथेटिक पेप्टाइड (एसपीईपी) होता है, जबकि आईवीटी एमआरएनए समाधान में मेटलुक-एमआरएनए होता है। आईवीटी एमआरएनए और टी 704-एसपीईपी मिश्रित समाधानों को माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके मिलाया जाता है, जो मेटलुक-एमआरएनए / इसके बाद, मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी का लक्षण वर्णन एक ज़ेटासाइज़र का उपयोग करके कण आकार और पॉलीडिस्पर्सिटी निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पीपी-एसएनपी से संक्रमित होते हैं, और अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के भीतर ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि को मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मेटलुक-एमआरएनए का उत्पादन (ए) डीएनए टेम्पलेट में एक टी 7 पोलीमरेज़ प्रमोटर, एक 5'अनस्ट्रास्लाटेड क्षेत्र (यूटीआर), मेटलक का एक खुला रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ), एक 3'यूटीआर और पॉली (ए) पूंछ शामिल हैं। (बी) वैद्युतकणसंचलन का पता लगाना। सफेद तीर पुनः संयोजक प्लास्मिड को इंगित करता है। पीला तीर पीयूसी 57 वेक्टर को इंगित करता है। लाल तीर मेटलुक-एमआरएनए के इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट को इंगित करता है। हरा तीर अनकैप्ड मेटलुक-एमआरएनए को इंगित करता है। नीला तीर कैप्ड मेटलुक-एमआरएनए को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 16 एचबीई और डीसी 2.4 कोशिकाओं में मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी की अभिकर्मक दक्षता। मेटलुक-एमआरएनए को (ए) 16 एचबीई कोशिकाओं और (बी) एक डेंड्राइटिक सेल लाइन (डीसी 2.4) में पीपी-एसएनपी का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट किया गया था। मेटलुक-एमआरएनए की अंतिम सांद्रता 0.02 μg/μL थी, एसपीईपी की 0.139 μg/μL थी, और T704 की पीपी-एसएनपी में 2 μg/μL थी। वाणिज्यिक लिपिड-आधारित अभिकर्मक रीजेंट (एलपी) को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अपनाया गया था। ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि को अभिकर्मक के बाद 24 घंटे मापा गया था। पीबीएस-उपचारित नमूने को रिक्त नियंत्रण के रूप में अपनाया गया था। टी 704-एसपीईपी मिश्रित समाधान को नकली नियंत्रण के रूप में अपनाया गया था। सांख्यिकीय मतभेदों का विश्लेषण एक छात्र के टी-टेस्ट (एनएसपी ≥ 0.05, * पी < 0.05) के साथ किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आईवीटी एमआरएनए एन/पी (एसपीईपी) डब्ल्यू /डब्ल्यू (टी 704) आकार (एनएम) पीडीआई जीटा
17.5 एनजी/μL 5 100 85.12 ± 9.40 0.20 ± 0.07 -13.07 ± 0.47

तालिका 1: मेटलुक-एमआरएनए / पीपी-एसएनपी के भौतिक रासायनिक लक्षण वर्णन डेटा।

पूरक चित्रा 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले इन-हाउस तैयार माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का सेटअप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: डीएनए टेम्पलेट का कोडिंग अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल न केवल परिभाषित गुणों के साथ आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन योगों के लागत प्रभावी और तेजी से उत्पादन की अनुमति देता है, बल्कि यह जीन थेरेपी जैसे विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के अनुसार पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन को अनुकूलित करने की संभावना भी प्रदान करता है। आईवीटी एमआरएनए/पीपी-एसएनपी की सफल पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर अतिरिक्त ध्यान देने का सुझाव दिया जाता है। एमआरएनए के साथ काम करते समय, हमेशा याद रखें कि आरनेस-मुक्त स्थितियों को पूरी प्रक्रिया में बनाए रखा जाना चाहिए क्योंकि आईवीटी एमआरएनए आरएनए द्वारा गिरावट के संबंध में बहुत संवेदनशील है, भले ही आईवीटी एमआरएनए रासायनिक संशोधन के साथ तैयार किया गया हो। इस बीच, योगों को संग्रहीत करते समय एक आरएनएएसई मुक्त वातावरण भी सुनिश्चित किया जाना चाहिए। पीपी-एसएनपी को 1 सप्ताह तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। प्रस्तुत परिणाम दर्शाते हैं कि न्यूक्लियस मुक्त पानी उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ पीपी-एसएनपी को सफलतापूर्वक बनाने में प्रभावी है। अन्य बफर, जैसे कि पीबीएस, खारा, ऑप्टिमेम, आदि का उपयोग वांछित होने पर किया जा सकता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिमेम माध्यम में आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी का उपयोग करके इन विट्रो अभिकर्मकों को करने की सिफारिश की जाती है। यदि फॉर्मूलेशन तैयार करने के लिए न्यूक्लियस मुक्त पानी के बजाय एक और बफर चुना जाता है, तो कम एकाग्रता (100 एनजी / एमएल से नीचे) के साथ आईवीटी एमआरएनए का उपयोग करना महत्वपूर्ण है; अन्यथा, नैनोकणों को अवक्षेपित किया जाता है, जो बदले में, एक अमान्य सूत्रीकरण प्रदान करता है। इस घटना का कारण सिंथेटिक पेप्टाइड के भीतर धनायनिक मॉइटी है। इसके अतिरिक्त, नैनोपार्टिकल का मजबूत सकारात्मक चार्ज घनत्व कोशिका झिल्ली को अस्थिर कर सकता है, इस प्रकार महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी को प्रेरित कर सकता है। हालांकि, पिछले अध्ययन में यह प्रदर्शित किया गया था कि पीपी-एसएनपी के भीतर सकारात्मक चार्ज कुशल आईवीटी एमआरएनए सेलुलर अपटेक, एंडोसोम एस्केप और सफल अभिकर्मक23 की मध्यस्थता में अनिवार्य है। नतीजतन, दक्षता और विषाक्तता के मामले में एक नाजुक संतुलन बनाने के लिए पीपी-एसएनपी के भीतर सकारात्मक चार्ज को समायोजित करना महत्वपूर्ण है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल कुछ पैरामीटर परिवर्तन के साथ विभिन्न पीपी-एसएनपी-आधारित योगों पर लागू किया जा सकता है। आईवीटी एमआरएनए-आधारित टीकों की डिलीवरी के लिए, तैयार नैनोकणों की अभिकर्मक दक्षता और इम्यूनोजेनेसिटी के लिए कण आकार और पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स जैसे बायोफिजिकल गुण महत्वपूर्णहैं। नैनोमीटर पैमाने में आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी का कण आकार शारीरिक बाधाओं में कुशल हस्तांतरण की अनुमति देता है और इस प्रकार, विवो अनुप्रयोगों में बाद के लिए महत्वपूर्ण है। यह बताया गया है कि 60-150 एनएम की आकार सीमा में एलएनपी गैर-मानव प्राइमेट्स26 में मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करते हैं। दूसरी ओर, बड़े आकार के नैनोकणों (जैसे, 400-1000 एनएम) फुफ्फुसीय वितरण के लिए लागू होने पर वायुमार्ग बलगम बाधा को दूर नहीं कर सके क्योंकि, जैसा कि पिछली जांच से पता चला है, वायुमार्ग बलगम जाल छिद्रों की औसत 3-आयामी जाल रिक्ति लगभग 60-300 एनएम27,28 से होती है। यदि वांछित आकार या अभिकर्मक दक्षता प्राप्त नहीं की जाती है, तो समस्या निवारण शुरू करने के लिए कुछ युक्तियों में उपयोग किए जाने वाले पोलोक्सामाइन या सिंथेटिक पेप्टाइड घटकों की मात्रा को समायोजित करना शामिल है। पिछले अध्ययन से पता चला है कि अतिरिक्त पैरामीटर, जैसे अभिकर्मक के लिए उपयोग किए जाने वाले आईवीटी एमआरएनए की मात्रा, इनक्यूबेशन समय, और सुसंस्कृत कोशिकाओं के प्रकार और सेल घनत्व, अभिकर्मक परिणाम23 को भी काफी प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, चूंकि पीपी-एसएनपी के भीतर लक्ष्यीकरण संबंधित रिसेप्टर्स को प्रदर्शित करने वाली कोशिकाओं में एनकैप्सुलेटेड आईवीटी एमआरएनए की विशिष्ट डिलीवरी की अनुमति देता है, वैकल्पिक लक्ष्यीकरण लिगेंड के साथ प्रतिस्थापन आवश्यक हो सकता है यदि लक्ष्य कोशिकाएं वायुमार्ग से संबंधित कोशिकाओं के बजाय अन्य प्रकारों से संक्रमित होती हैं। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल अभी भी अधिक विस्तृत अंतर्दृष्टि और आगे की परीक्षा के साथ सुधार किया जा सकता है।

यह देखते हुए कि मूल आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी शुरू में प्रत्यक्ष मैनुअल मिश्रण द्वारा तैयार किया जाता है, ऑपरेटर की क्षमताएं सूत्रीकरण की गुणवत्ता को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। पीपी-एसएनपी के घटकों के साथ आईवीटी एमआरएनए को मिलाने की प्रक्रिया में संशोधन के परिणामस्वरूप नैनो आकार के कणों के बजाय बड़े सूक्ष्म कण हो सकते हैं। सबसे मुश्किल कदम एमआरएनए और सिंथेटिक पेप्टाइड को मिला रहा है, जिसे नियंत्रित तरीके से किया जाना चाहिए। पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन के विभिन्न बैचों के बीच प्रजनन क्षमता में सुधार करने के लिए, एक माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर को अपनाया गया था क्योंकि कम मात्रा में स्क्रीनिंग, तेज गति और प्रजनन क्षमता माइक्रोफ्लुइडिक विधि29 का उपयोग करने की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं। इस विधि ने अच्छी प्रजनन क्षमता दिखाई, जिसमें कण आकार पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा और न ही विभिन्न बैचों के बीच अभिकर्मक दक्षता देखी गई। नैदानिक अनुप्रयोगों में लागू किए जाने वाले आईवीटी एमआरएनए-आधारित टीकों के लिए यह एक आवश्यक मानदंड है। विशेष रूप से, माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर उपयोगकर्ताओं की अधिकतम संख्या (निर्माता द्वारा अनुशंसित) से अधिक नहीं होना चाहिए और विभिन्न रचनाओं के साथ योगों के बीच बदला जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित आईवीटी एमआरएनए प्रतिलेखन के प्रोटोकॉल का उपयोग सैद्धांतिक रूप से ब्याज के किसी भी रिपोर्टर प्रोटीन / इस अध्ययन में मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक) को विशेष रूप से लागू किया गया था क्योंकि यह अद्वितीय फायदे रखता है। मेटलुक की गतिविधि परख उच्च संवेदनशीलता के साथ प्रदर्शन करना आसान है क्योंकि मेटलक एक गहन बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल का उत्पादन कर सकता है, और इसे सीधे सेल माध्यम में स्रावित किया जा सकता है, इसलिए सेल लिसिस की आवश्यकता से परहेज किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सुसंस्कृत कोशिकाओं में मेटलक अभिव्यक्ति मेटलुक-एमआरएनए की कार्यक्षमता के अलावा कई मापदंडों (जैसे, प्रति अच्छी तरह से अलग-अलग सेल नंबर और पाइपिंग त्रुटियों आदि) से प्रभावित हो सकती है।

यद्यपि वर्तमान प्रोटोकॉल आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन के वितरण के लिए स्थापित किया गया था, लेकिन इसे टीकों या चिकित्सीय के लिए भी लागू किया जा सकता है जो अन्य प्रकार के न्यूक्लिक एसिड, जैसे प्लास्मिड डीएनए (पीडीएनए) पर आधारित हैं। इस प्रक्रिया को विभिन्न नैदानिक संकेतों के लिए विशेष पीपी-एसएनपी विकसित करने के लिए सिंथेटिक पेप्टाइड, न्यूक्लिक एसिड और पोलोक्सामाइन घटक परिवर्तनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। दरअसल, पीपी-एसएनपी23 द्वारा वितरित स्लीपिंग ब्यूटी जेनेटिक मॉडिफिकेशन टूल के उपयोग के साथ सीएफटीआर नॉकआउट चूहों के श्वसन उपकला ऊतक में बहिर्जात सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसडक्शन रेगुलेटर (सीएफटीआर) जीन का जीनोम एकीकरण सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था। चिकित्सीय अनुप्रयोगों के संबंध में, आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी योगों का उपयोग फुफ्फुसीय रोगों के इलाज के लिए विशिष्ट नेबुलाइजेशन उपकरणों का उपयोग करके एयरोसोल के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि α1-एंटीट्रिप्सिन की कमी या सिस्टिक फाइब्रोसिस30। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि नेबुलाइजेशन के लिए आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी योगों को अनुकूलित और अनुकूलित किया जाना चाहिए, क्योंकि एरोसोलाइज्ड आईवीटी एमआरएनए नेबुलाइज़र द्वारा बनाए गए कतरनी बल और आईवीटी एमआरएनए30 की नाजुक प्रकृति के कारण अक्षम हो सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल संभवतः विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण उपकरणों का उपयोग करके बड़ी मात्रा में स्केलेबल है, जैसे कि टी-जंक्शन मिश्रण उपकरण और यहां तक कि इम्पिंगमेंट जेट मिश्रण पंप31,32।

संक्षेप में, यहां विस्तृत प्रोटोकॉल पीपी-एसएनपी वितरण प्रणाली में आईवीटी एमआरएनए तैयार करने की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का परिचय देता है, साथ ही साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं में बाद में विश्वसनीय अभिकर्मक भी। वर्णित विधि माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी के उत्पादन के लिए एक सुलभ और आसान दृष्टिकोण की गारंटी देती है। छोटे कण आकार और कम पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स के साथ तैयार योगों को बाद में सुरक्षित और कुशलतापूर्वक सुसंस्कृत कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल पीपी-एसएनपी-आधारित वितरण प्रणाली को सभी उल्लिखित कमियों से बचते हुए उपन्यास आईवीटी एमआरएनए-आधारित टीके या चिकित्सीय डिजाइन करने के लिए अकादमिक समुदाय के लिए उपलब्ध कराने में सक्षम बनाएगा। पीपी-एसएनपी के लचीले प्रोफाइल के साथ, विभिन्न बीमारियों को संबोधित करने के लिए अलग-अलग चिकित्सीय का उत्पादन करने के लिए पीपी-एसएनपी के साथ कई भविष्य के अनुप्रयोगों को प्राप्त करने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी, ग्रांट नंबर 82041045 और 82173764) द्वारा समर्थित किया गया था, जो चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा रोगजनन और महामारी रोकथाम प्रौद्योगिकी प्रणाली (2021वाईएफसी 2302500) पर अध्ययन की प्रमुख परियोजना, चोंगकिंग प्रतिभा: असाधारण युवा प्रतिभा परियोजना (सीक्यूवाईसी 202005027), और चोंगकिंग के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सीएसटीसी 202020202027) द्वारा समर्थित थी। लेखक हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम) और पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) को मापने के लिए डॉ जियाओयन डिंग के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI Takara 1010
cap 1 capping system Jinan M082
Dendritic cell-line Sigma SCC142
DNA sequence Genescript
Human bronchial epithelial cells Sigma SCC150
KpnI Takara 1068
LP Beyotime C0533
Lithium chloride APEXBio B6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90 Malvern NB007605
Microfluidic chip ZHONGXINQIHENG Standard PDMS chip
Microplate readers ThermoFisher Varioskan lux
NanoDrop One ThermoFisher ND-ONE-W (A30221)
Nuclease-free water ThermoFisher AM9932
OptiMEM Gibco 31985070
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Pseudouridine APE×Bio B7972
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Quanti-Luc InvivoGen Rep-qlc2
RiboRuler High Range RNA Ladder ThermoFisher SM1821
RNase-free conical tube Biosharp BS-100-M
RPMI Medium 1640 ThermoFisher C11875500BT
Syringe pump Chemyx Fusion 101
T7 transcription Kit Jinan E131

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 186 जीन डिलीवरी इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए डिलीवरी सिस्टम पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल
पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में <em>इन विट्रो</em> ट्रांसक्रिप्टेड एमआरएनए का कुशल अभिकर्मक
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Xiao, Q., Liu, Y., Zhang, D., Li,… More

Xiao, Q., Liu, Y., Zhang, D., Li, C., Yang, Q., Lu, D., Zhang, W., Rosenecker, J., Zou, Q., Li, Y., Guan, S. Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles. J. Vis. Exp. (186), e64288, doi:10.3791/64288 (2022).

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