Summary
자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp)는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 개발 되어 시험관 내 전사된 메신저 RNA를 캡슐화하고 전달합니다. 기술된 mRNA/PP-sNip는 배양된 세포를 시험관내에서 효율적으로 형질감염시킬 수 있었다.
Abstract
시험관 내 전사 메신저 RNA (mRNA) 백신은 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병에 맞서 싸울 수있는 엄청난 잠재력을 보여주었습니다. 효율적이고 안전한 전달 시스템은 mRNA의 깨지기 쉬운 특성으로 인해 mRNA 백신에 포함되어야 한다. 자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp) 유전자 전달 시스템은 핵산의 폐 전달을 위해 특별히 설계되었으며 성공적인 mRNA 트랜스펙션을 매개하는 데 유망한 능력을 표시합니다. 여기서, PP-sNap을 제조하기 위한 개선된 방법이 PP-sNap이 어떻게 메트리디아 루시퍼라제(MetLuc) mRNA를 캡슐화하고 배양된 세포를 성공적으로 형질감염시키는지에 대해 상세히 설명한다. MetLuc-mRNA는 선형 DNA 주형으로부터 시험관내 전사 과정에 의해 수득된다. PP-sNp는 미세 유체 혼합기를 사용하여 합성 펩타이드 / 폴록사민과 mRNA 용액을 혼합하여 PP-sNp의 자체 조립을 가능하게하여 생산됩니다. PP-sNp의 전하는 후속적으로 제타 전위를 측정함으로써 평가된다. 한편, PP-sNp 나노입자의 다분산도 및 유체역학적 크기는 동적 광산란을 이용하여 측정된다. mRNA/PP-sNp 나노입자는 배양된 세포로 형질감염되고, 세포 배양물로부터의 상청액은 루시퍼라제 활성에 대해 분석된다. 대표적인 결과는 시험관내 형질감염에 대한 그들의 능력을 입증한다. 이 프로토콜은 차세대 mRNA 백신 전달 시스템 개발에 빛을 비출 수 있습니다.
Introduction
예방 접종은 전염병으로 인한 이환률 및 사망률을 줄이기위한 가장 효율적인 의료 개입 중 하나로 예고되었습니다1. 백신의 중요성은 2019 년 코로나 바이러스 질병 (COVID-19)이 발병 한 이래로 입증되었습니다. 불활성화 또는 약독화된 병원체를 주입하는 전통적인 개념과는 달리, 핵산 기반 백신과 같은 최첨단 백신 접근법은 기존의 전체 미생물 바이러스 또는 박테리아 기반 백신과 관련된 잠재적 안전성 문제를 피하면서 표적 병원체의 면역 자극 특성을 보존하는 데 집중한다. DNA- 및 RNA (즉, 시험관내 전사된 메신저 RNA, IVT mRNA) 둘 다-기반 백신은 감염성 질환 및 암을 포함하는 다양한 질병에 대한 치료 잠재력에 대한 예방적 잠재력을 나타낸다 2,3. 원칙적으로, 핵산 기반 백신의 잠재력은 그들의 생산, 효능 및 안전성과 관련된다4. 이러한 백신은 비용 효율적이고 확장 가능하며 신속한 생산을 가능하게하기 위해 무세포 방식으로 제조 될 수 있습니다.
단일 핵산 기반 백신은 다중 항원을 인코딩하여 수많은 바이러스 변이체 또는 박테리아의 표적을 접종 횟수를 줄이고 탄력적 인 병원체에 대한 면역 반응을 강화할 수 있습니다 5,6. 게다가, 핵산 기반 백신은 바이러스 또는 박테리아 감염의 자연 침입 과정을 모방하여 B 세포 및 T 세포 매개 면역 반응을 가져올 수 있습니다. 일부 바이러스 또는 DNA 기반 백신과 달리 IVT mRNA 기반 백신은 안전성 측면에서 큰 이점을 제공합니다. 이들은 시토졸에서 원하는 항원을 신속하게 발현할 수 있고 숙주 게놈에 통합되지 않아 삽입 돌연변이유발에 대한 우려를 없애고7. IVT-mRNA는 성공적인 번역 후 자동으로 분해되므로 단백질 발현 동역학을 쉽게 조절할 수 있습니다 8,9. 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 전염병에 의해 촉매 된 전 세계 기업 / 기관의 노력으로 많은 유형의 백신 시장에 출시 될 수있었습니다. IVT mRNA 기반 백신 기술은 큰 잠재력을 보여 주며, 몇 달 내에 모든 표적 항원에 적응할 수있는 신속한 설계와 유연한 능력으로 인해 이전에 예상 된 성공을 처음으로 입증했습니다. 임상 응용 분야에서 COVID-19에 대한 IVT mRNA 백신의 성공은 IVT mRNA 백신 연구 개발의 새로운 시대를 열었을 뿐만 아니라 전염병10,11의 발생을 다루기위한 효과적인 백신의 신속한 개발을위한 귀중한 경험을 축적했습니다.
IVT mRNA 백신의 유망한 잠재성에도 불구하고, 작용 부위(즉, 세포질)로의 IVT mRNA의 효율적인 세포내 전달은 특히 기도(4)를 통해 투여되는 사람들에게 계속해서 주요한 장애물(12)을 제기한다. IVT mRNA는 본질적으로 매우 짧은 반감기 (∼7 h)13을 갖는 불안정한 분자이며, 이는 IVT mRNA가 유비쿼터스 RNase14에 의해 분해되기 매우 쉽다. 선천적 면역계의 림프구는 생체내 적용의 경우에 인식된 IVT mRNA를 삼키는 경향이 있다. 더욱이, IVT mRNA의 높은 음전하 밀도 및 큰 분자량 (1 x 104-1 x 106 Da)은 세포막(15)의 음이온성 지질 이중층을 가로 지르는 그의 효과적인 투과를 손상시킨다. 따라서, IVT mRNA 분자의 분해를 억제하고 세포 흡수(16)를 촉진하기 위해 특정 생체기능성 물질을 갖는 전달 시스템이 요구된다.
네이키드 IVT mRNA가 생체내 조사를 위해 직접 활용된 몇 가지 예외적인 경우와는 별개로, 다양한 전달 시스템이 IVT mRNA를 작용부위 17,18로 운반하는데 사용된다. 이전의 연구들은 단지 몇몇 IVT mRNA들이 전달 시스템(19)의 도움 없이 시토졸에서 검출된다는 것을 밝혀냈다. 프로타민 축합에서 지질 캡슐화(20)에 이르기까지 현장에서 지속적인 노력으로 RNA 전달을 개선하기 위한 수많은 전략이 개발되었다. 지질 나노입자(LNPs)는 mRNA 전달 비히클 중에서 가장 임상적으로 진보된 것으로, 임상적으로 사용하기 위해 승인된 모든 mRNA COVID-19 백신이 LNP 기반 전달 시스템(21)을 사용한다는 사실에 의해 입증되었다. 그러나, LNPs는 제형이 호흡 경로(22)를 통해 전달될 때 효과적인 mRNA 형질감염을 매개할 수 없으며, 이는 점막 면역 반응을 유도하거나 낭포성 섬유증 또는 α1-안티트립신 결핍과 같은 폐 관련 질환을 해결하는 데 이들 제형의 적용을 현저하게 제한한다. 따라서, 이러한 미충족 문제를 해결하기 위해 기도 관련 세포에서 IVT mRNA의 효율적인 전달 및 형질감염을 용이하게 하기 위한 신규한 전달 시스템의 개발이 요구된다.
펩티드-폴록사민 자기조립된 나노입자(PP-sNp) 전달 시스템이 마우스23의 호흡기에서 핵산의 효율적인 형질감염을 매개할 수 있음이 확인되었다. PP-sNp는 다기능 모듈식 설계 접근 방식을 채택하여 다양한 기능 모듈을 나노 입자에 통합하여 신속한 스크리닝 및 최적화(23)를 수행 할 수 있습니다. PP-sNp 내의 합성 펩티드 및 전기적으로 중성인 양친매성 블록 코폴리머(폴록사민)는 IVT mRNA와 자발적으로 상호작용하여 조밀한 구조 및 매끄러운 표면(23)을 갖는 균일하게 분포된 나노입자를 생성할 수 있다. PP-sNip은 마우스(23)의 배양된 세포 및 호흡기에서 IVT mRNA 분자의 유전자 형질감염 효과를 향상시킬 수 있다. 본 연구는 Metridia luciferase (MetLuc-mRNA)를 인코딩하는 IVT mRNA를 함유하는 PP-sNp를 생성하기 위한 프로토콜을 기술한다(도 1). 비틀거리는 헤링본 혼합 설계를 사용하는 미세유체 혼합 장치를 통한 제어 및 신속한 혼합이 이 프로토콜에 활용됩니다. 이 절차는 실행하기 쉽고 더 균일 한 크기의 PP-sNp를 생성 할 수 있습니다. 미세유체 혼합기를 이용한 PP-sNp 생산의 일반적인 목표는 잘 조절된 방식으로 mRNA 복합체화를 위한 PP-sNp를 생성하고, 따라서 시험관내에서 효율적이고 재현 가능한 세포 형질감염을 가능하게 하는 것이다. 본 프로토콜은 MetLuc-mRNA를 함유하는 PP-sNp의 제조, 조립 및 특성화를 기술한다.
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Protocol
1. 화학적으로 변형된 mRNA의 시험관내 전사
참고 : RNases는 실험실 솔루션, 기기 표면, 머리카락, 피부, 먼지 등과 같은 환경에서 유비쿼터스이기 때문에 뉴클레아제가없는 튜브, 시약, 유리 제품, 피펫 팁 등을 사용해야합니다. 사용하기 전에 벤치 표면과 피펫을 철저히 청소하고 RNase 오염을 피하기 위해 장갑을 착용하십시오.
- DNA 주형의 선형화를 수행합니다.
- T7 중합효소 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR), 3'UTR, 및 폴리(A) 꼬리에 의해 측면된 메트리디아 루시퍼라제(MetLuc)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 합성하고, 이를 박테리아에서 발현되는 PUC57 벡터 내로 클로닝한다( 표 참조).
참고: DNA 주형의 코딩 서열은 보충 파일 1에 제공된다. - 박테리아를 배양하고, 박테리아를 용해시키고, 상응하는 컬럼에 의해 플라스미드 DNA를 정제한다( 물질 표의 플라스미드 DNA 추출 키트 참조).
- 2 μL의 BamHI, 2 μL의 KpnI ( 물질의 표 참조) 및 2 μg의 플라스미드 DNA를 포함하는 단일 50 μL 반응을 37°C에서 1시간 동안 수행하고, DNA 주형의 선형화를 달성한다.
- T7 중합효소 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR), 3'UTR, 및 폴리(A) 꼬리에 의해 측면된 메트리디아 루시퍼라제(MetLuc)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 합성하고, 이를 박테리아에서 발현되는 PUC57 벡터 내로 클로닝한다( 표 참조).
- 시험관내 전사를 수행하여 비캡핑된 IVT mRNA를 생성한다.
- T7 전사 키트 및 슈도우리딘을 사용하여 단일 20 μL 반응에 의해 mRNA 합성을 수행한다 ( 물질 표 참조): 10 μL (0.8-1 μg)의 선형화된 DNA 주형, 1.5 μL (150 mM)의 ATP, pseudo-UTP, GTP 및 CTP, 2 μL의 10x 전사 완충액, 1 μL의 T7 효소, 및 1 μL의 뉴클레아제-프리 물(NF-water). 상기 언급된 성분들을 완전히 혼합하고 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 주형 DNA를 제거합니다.
- 전사 과정 후에 1 μL(1 U)의 DNase(RNase-free)를 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 염화리튬 침전을 사용하여 캡핑되지 않은 IVT mRNA 정제를 수행한다.
- 10 mM의 작동 농도로 염화리튬 ( 물질 표 참조)을 사용하여 캡핑되지 않은 IVT mRNA를 정제하십시오. 50 μL의 10 mM 염화리튬을 20 μL의 비캡핑된 IVT mRNA 용액에 첨가한다.
- 전체 부피를 완전히 혼합하고 -20 °C에서 1 시간 동안 차갑게하십시오. 비캡핑된 IVT mRNA를 12,000 x g에서 12분 동안 수집하고, 이는 각각의 단일 20 μL 반응으로부터 80-120 μg의 비캡핑된 IVT mRNA를 일상적으로 생성한다.
- IVT mRNA 캡핑을 수행한다.
- 캡 1 캡핑 시스템을 사용하여 IVT mRNA 캡핑을 수행 한다(표 문헌 참조). 간략하게, 50 μg의 비캡핑된 IVT mRNA의 이차 구조를 65°C에서 10분 동안 가열하여 제거하고, 이어서 비캡핑된 IVT mRNA의 5' 말단을 캡 1과 연결시키고, 이는 2.5 μL의 s-아데노실메티오닌(SAM)(20 mM) 및 4 μL의 2'-O-메틸트랜스퍼라제(100 U)를 사용하여 m7G 캡 구조를 변형시킴으로써 제조되고 100 μL의 2'-O-메틸트랜스퍼라제(100 U)를 30-60분 동안 반응시켰다.
- 250 μL의 10 mM 염화리튬을 사용하여 캡핑된 IVT mRNA의 100 μL를 정제하고, 50 μL의 NF-물에 희석한다.
- 캡핑된 IVT mRNA의 순도 및 분자 크기를 결정한다.
- 캡핑된 IVT mRNA의 농도를 UV-가시 분광광도계로 측정한다. RNA 마커 (표 표 참조)를 사용하여, 18% 포름알데히드를 함유하는 1% 포름알데히드 변성 아가로스 겔에서 캡핑된 IVT mRNA 의 분자 크기를 분석한다(전압은 120 V이다). 비캡핑된 IVT mRNA 및 캡핑된 IVT mRNA가 -80°C에서 저장되도록 보장한다.
참고: IVT mRNA는 1.8-2.1의 A260/A280 비율 및 2.0 또는 약간 더 높은A260/A230 비율에서 양호한 순도를 갖는 것으로 간주되었다.
- 캡핑된 IVT mRNA의 농도를 UV-가시 분광광도계로 측정한다. RNA 마커 (표 표 참조)를 사용하여, 18% 포름알데히드를 함유하는 1% 포름알데히드 변성 아가로스 겔에서 캡핑된 IVT mRNA 의 분자 크기를 분석한다(전압은 120 V이다). 비캡핑된 IVT mRNA 및 캡핑된 IVT mRNA가 -80°C에서 저장되도록 보장한다.
2. IVT mRNA/PP-sNp의 생성
- T704( 물질표 참조)를 NF-water에 가용화하여 폴록사민 704(T704) 원액을 준비하여 10mg/mL 원액을 얻었다. 제조된 용액을 4°C에서 보관한다.
참고: T704는 폴리(프로필렌 옥사이드) (PPO) 블록 및 폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO) 블록(24)의 네 개의 사슬에 결합된 에틸렌디아민 중심기로 이루어진 X자형 구조를 함유한다. T704의 분자량(Mw)은 5500이다. - 합성 펩타이드(sPep, 표 참조) 원액을 sPep를 가용화하여 제조한다(서열: KETWWETWWTEWWTEWKKKKKKRRRRRKKKACSE
RSMNFCG)를 NF-water에 2 mg/mL 원액을 수득하고 4°C에서 저장하였다. - IVT mRNA를 얼음 상에서 해동시키고(단계 1), 튜브를 열기 전에 실온에서 300 x g 에서 3초 동안 바로 원심분리하여 IVT mRNA 용액을 제조하였다. IVT mRNA 용액을 NF-물로 0.04 μg/μL로 희석한다.
참고: 가능하면 IVT mRNA로 생물안전 캐비닛에서 작업하는 것이 좋습니다. - sPep 용액을 0.555 μg/μL로, T704 용액을 NF-물로 8 μg/μL로 희석하여 T704 및 sPep 혼합 용액을 준비합니다. 혼합 용액을 추가 사용 전에 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
참고: 원하는 N/P 비율에 따라 필요한 sPep 구성 요소를 계산합니다. N/P 비는 sPep 내의 질소 잔기(N)의 총 수와 IVT mRNA 내의 음전하를 띤 포스페이트 그룹(P)의 총 수이다. T704와 IVT mRNA 사이의 중량/중량(w/w) 비를 기준으로 필요한 T704를 계산하십시오. N / P 비율은 5이고 w / w 비율은 100이어야합니다. - 아래 단계에 따라 IVT mRNA/PP-sNp 제제를 준비한다.
- IVT mRNA 용액 (단계 3)을 1 mL 주사기에 끌어당겨 주사기 팁에 공극이나 기포가 없도록 한다. 주사기를 카트리지의 한쪽 면에 회전 블록 옆에 로드합니다.
- 1 mL 주사기를 T704 및 sPep 혼합 용액으로 채운다(단계 4). 주사기 팁의 기포 또는 공극을 제거하고 주사기를 펌프의 다른 입구에 넣습니다 ( 재료 표 참조).
- 펌프를 1:1의 유량과 4-10 mL/min의 총 유량으로 설정하십시오.
참고: 6 mL/min의 총 유속은 여기에 제시된 연구에서 최적입니다. - 10 mL RNase-free 원뿔형 튜브 ( 재료 표 참조)를 배치하여 혼합 장치의 유로 끝에 혼합 IVT-mRNA/PP-sNp 용액을 수집합니다.
- 펌프를 실행하여 믹싱을 시작하여 매개변수가 올바르게 입력되었는지 확인합니다. 펌프가 6초 동안 작동을 마친 후 원뿔형 튜브에서 IVT-mRNA/PP-sNp 샘플을 수집합니다.
주: PP-sNp는 미세유체 혼합기를 사용하여 생성되었다(보충 그림 1). 상기 장치는 정수 유동 펌프, 링크 장치, 칩, 및 고정 장치를 포함한다. 혼합 공정에서 칩에 연결된 정수 유량 펌프는 미리 설정된 유량에 따라 칩에 액체를 전달합니다. 연결된 정수 유량 펌프는 단일 출력 채널로 칩의 여러 입력 채널에 연결할 수 있습니다. 칩을 포함한 장치의 구성 요소는 상업적 소스에서 얻어지고 합리적으로 조립되었습니다 ( 재료 표 참조). IVT mRNA 용액 및 T704-sPep 혼합 용액의 유량 및 부피와 같은 파라미터는 일부 다른 설정이 사용되는 경우 현재 프로토콜에 표시된 것과 다를 수 있으며 그에 따라 최적화되어야 합니다.
3. IVT-mRNA/PP-sNp의 유체역학적 직경 및 다분산도 측정
- IVT mRNA/PP-sNp 용액(단계 2)의 분취량을 NF-물로 희석하여 1mL의 최종 부피를 얻는다.
- 세미 마이크로 큐벳(25)을 이용하여 유체역학적 크기 및 다분산 지수(PDI)를 측정한다. IVT mRNA/PP-sNp 용액을 큐벳에 넣고 입자 크기 측정기에 넣습니다( 재료 표 참조). 표준 운영 절차를 설정하고 시작 을 클릭하여 데이터 수집을 시작하십시오.
4. 형질감염용 세포의 제조
- 인간 기관지 상피 세포 (16HBE) 및 수지상 세포주 (DC2.4)를 형질감염 전에 3.5 x 10 4 세포 / 웰24 시간의 밀도로 96 웰 플레이트에 플레이트. 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지에서 세포를 성장시킨다.
주: 세포는 상업적 공급원으로부터 수득되었다( 물질의 표 참조). - 세포를 인큐베이터(37°C 및 5%CO2 분위기)에서 24시간 동안 인큐베이션하여 형질감염 전에 세포가 60%-80% 컨플루언트되도록 한다.
5. 배양된 세포의 형질감염
- 성장 배지를 제거한 후, 플레이팅된 세포를 0.2 mL/웰 1x PBS로 세척한다.
- 170 μL의 무혈청 배지를 플레이팅된 세포 배양물을 함유하는 각 웰에 첨가한다.
- 0.4 μg의 MetLuc mRNA (단계 2에서 제조됨)를 함유하는 IVT mRNA/PP-sNp 제제를 30 μL/웰의 양으로 적가한다.
- 세포를 IVT mRNA/PP-sNp 제형과 함께 37°C에서 4시간 동안 가습된 5%CO2-풍부 분위기에서 인큐베이션한다.
- 형질감염 배지를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청과 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 0.2mL의 신선한 배지로 교체하십시오.
주: 소 태아 혈청을 불활성화를 위해 56°C에서 30분 동안 가열하였다. - 형질감염된 세포를 37°C에서 24시간 동안 5%CO2-농축 분위기에서 인큐베이션하고, 각 웰로부터 검출될 상청액을 수집한다.
6. Metridia luciferase (MetLuc) 분석을 이용한 세포 형질감염 효능 분석
- 아래 단계에 따라 코엘엔테라진 기질( 표 참조)을 사용하여 MetLuc 활성에 대해 각 웰로부터의 상청액을 분석한다.
- 코엘엔테라진 기질에 1x PBS를 첨가하여 신선한 분석 용액을 제조하였다 (코엘엔테라진의 농도는 15 mM이다).
- 철저한 혼합을 위해 10 초 동안 coelenterazine 용액을 소용돌이 치십시오.
- 50 μL의 상청액(단계 5에서 수집됨)을 96-웰 플레이트에 첨가한다.
- 30μL의 코엘엔테라진 용액(15mM)을 각 웰에 수동으로 또는 자동 주입하여 첨가하기 전에 1,000ms의 판독 시간으로 마이크로플레이트 리더( 재료 표 참조)를 설치하십시오.
- 시작을 클릭하여 상청액에 코엘렌테라진 용액을 첨가한 직후에 발광 신호를 측정합니다.
참고: 발광 신호는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되며, 그 활성은 상대 광 단위로 표현됩니다. PBS-형질감염된 웰로부터 수득된 값은 블랭크 대조군으로서 사용될 것이다.
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Representative Results
재조합 플라스미드를 분해하여 선형화된 DNA 주형을 생성하였다(도 2A). 기술된 프로토콜을 사용하여, T7 시험관내 전사 키트는 20 μL 반응 당 최대 80-120 μg의 캡핑되지 않은 MetLuc-mRNA 및 100 μL 반응 당 50-60 μg의 캡핑된 MetLuc-mRNA를 생산할 수 있다. 전기영동으로 분석할 때, 고품질의 무손상 MetLuc-mRNA는 도 2B에 표시된 바와 같이 단일하고 명확한 밴드를 나타내야 한다. DNA 주형으로부터 반응에 도입된 오염물질은 RNA 분해와 더 낮은 수율을 초래할 수 있다.
MetLuc-mRNA(MetLuc-mRNA/PP-sNp)를 포함하는 PP-sNp는 미세유체 혼합 방법을 사용하여 제조하였다(도 1). 표 1 은 MetLuc-mRNA/PP-sNp의 물리화학적 특성화에 대한 데이터를 예로서 나타낸 것이다. MetLuc-mRNA/PP-sNp의 유체역학적 반경은 약 70-100nm 범위인 경우 올바른 것으로 간주될 수 있습니다. 게다가, PP-sNp의 PDI는 일정해야 하고, 바람직하게는 0.2 미만이어야 하지만, 대략 0.3까지의 PDI 값들이 허용된다.
MetLuc-mRNA를 PP-sNp에 성공적으로 혼입시킨 후, 제형은 16HBE 세포 및 수지상 세포주(DC2.4)와 함께 인큐베이션될 수 있고, MetLuc-mRNA의 형질감염 효율은 형질감염 후 24시간 후 세포 배양 상청액 내의 루시퍼라제 활성에 의해 지시될 수 있다. 도 3 은 MetLuc-mRNA/PP-sNp의 성공적인 형질감염의 전형적인 예이다. MetLuc-mRNA/PP-sNp로 형질감염된 세포는 16HBE 세포에서 상업적으로 이용가능한 지질 기반 형질감염 섭정(LP)(표 참조), 네이키드 MetLuc-mRNA(음성 대조군), PBS(빈 대조군) 또는 T704-sPep 혼합 용액(모의 대조군)으로 형질감염된 세포와 비교하여 루시퍼라아제 의 발현이 유의하게 더 높게 나타났음을 분명히 알 수 있다. MetLuc-mRNA/PP-sNp 또한 LP에 비해 루시퍼라아제의 발현이 더 높은 것으로 나타났다. 상기 데이터는 PP-sNp 전달 시스템이 분해로부터 MetLuc-mRNA를 보호하고 외인성 MetLuc-mRNA의 형질감염 효율을 증진시키는 데 중요하다는 것을 시사한다. 따라서, PP-sNip와 같은 전달 시스템은 일반적으로 IVT mRNA 형질감염 연구에 필수적이다.
그림 1: IVT mRNA/PP-sNp의 전체 워크플로우의 개략적 표현. DNA 주형은 재조합 플라스미드 구축에 의해 플라스미드에 연결된다. 선형화된 DNA 주형은 제한 효소 소화를 사용하여 조립된다. 시험관내 전사된 mRNA(IVT mRNA)는 선형화된 DNA 주형으로부터 합성되고 캡핑된다. T704-sPep 용액에는 T704 및 합성 펩티드 (sPep)가 포함되어 있으며, IVT mRNA 용액에는 MetLuc-mRNA가 포함되어 있습니다. IVT mRNA와 T704-sPep 혼합 용액은 MetLuc-mRNA/PP-sNp를 형성하는 미세유체 혼합기를 사용하여 혼합됩니다. 다음으로, MetLuc-mRNA/PP-sNp의 특성화는 Zetasizer를 사용하여 입자 크기 및 다분산도를 결정하기 위해 수행됩니다. 16HBE 세포는 MetLuc-mRNA/PP-sNp로 형질감염되고, 상청액 내의 루시퍼라제 활성은 형질감염 효율을 평가하기 위해 측정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: MetLuc-mRNA의 생산 . (A) DNA 주형은 T7 중합효소 프로모터, 5' 비궤도화 영역(UTR), MetLuc의 오픈 리딩 프레임(ORF), 3'UTR 및 폴리(A) 꼬리를 포함한다. (B) 전기영동 검출. 흰색 화살표는 재조합 플라스미드를 나타낸다. 노란색 화살표는 PUC57 벡터를 나타낸다. 적색 화살표는 MetLuc-mRNA의 시험관내 전사를 위한 DNA 주형을 나타낸다. 녹색 화살표는 뚜껑이 없는 MetLuc-mRNA를 나타냅니다. 파란색 화살표는 캡핑된 MetLuc-mRNA를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 16HBE 및 DC2.4 세포에서 MetLuc-mRNA/PP-sNip의 형질감염 효율. MetLuc-mRNA를 (A) 16HBE 세포 및 (B) 수지상 세포주 (DC2.4)에서 PP-sNip을 사용하여 형질감염시켰다. MetLuc-mRNA의 최종 농도는 0.02 μg/μL, sPep의 농도는 0.139 μg/μL, T704의 농도는 PP-sNp에서 2 μg/μL였다. 루시퍼라제 활성은 형질감염 후 24시간 후에 측정되었다. PBS 처리된 샘플을 블랭크 대조군으로 채택하였다. T704-sPep 혼합 용액을 모의 대조군으로 채택하였다. 통계적 차이는 스튜던트 t-검정으로 분석하였다 (ns p ≥ 0.05, * p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| IVT mRNA | N/P (스펩) | 승 / 월 (T704) | 크기(nm) | PdI | 제타 |
| 17.5 ng/μL | 5 | 100 | 85.12 ± 9.40 | 0.20 ± 0.07 | -13.07 ± 0.47 |
표 1: MetLuc-mRNA/PP-sNp의 물리화학적 특성화 데이터.
보충 그림 1 : 현재 연구에 사용 된 사내에서 준비된 미세 유체 장치의 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: DNA 주형의 코딩 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 기술된 프로토콜은 정의된 특성을 갖는 IVT mRNA 백신 제형의 비용 효율적이고 신속한 생산을 가능하게 할 뿐만 아니라, 유전자 요법과 같은 특정 치료 목적에 따라 PP-sNp 제형을 맞춤화할 수 있는 가능성을 제공한다. IVT mRNA/PP-sNp의 성공적인 생성을 보장하기 위해, 몇 가지 중요한 단계에 각별한 주의를 기울이는 것이 좋습니다. mRNA와 함께 작업할 때, IVT mRNA가 화학적 변형으로 제조되었더라도 IVT mRNA가 RNase에 의한 분해와 관련하여 매우 민감하기 때문에 RNase-free 조건이 프로세스 전반에 걸쳐 유지되어야 한다는 것을 항상 기억해야 한다. 한편, 제형을 저장할 때 RNase가 없는 환경도 보장되어야 한다. IVT mRNA/PP-sNp를 2-8°C에서 최대 1주일 동안 보관하는 것이 좋습니다. 제시된 결과는 뉴클레아제가없는 물이 높은 형질감염 효율로 PP-sNp를 성공적으로 형성하는데 효과적이라는 것을 입증합니다. 다른 완충제, 예컨대 PBS, 식염수, OptiMEM 등이 원하는 경우 사용될 수 있다. 배양된 세포의 생존력을 보장하기 위해 OptiMEM 배지에서 IVT mRNA/PP-sNap을 사용하여 시험관내 형질감염을 수행하는 것이 좋습니다. 제형을 제조하기 위해 뉴클레아제가없는 물이 아닌 다른 완충액을 선택하는 경우, 낮은 농도 (100 ng / mL 이하)의 IVT mRNA를 사용하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 나노입자는 침전되는 경향이 있으며, 이는 차례로 유효하지 않은 제형을 렌더링한다. 이러한 현상의 원인은 합성 펩티드 내의 양이온성 모이어티이다. 추가적으로, 나노입자의 강한 양전하 밀도는 세포막을 불안정하게 할 수 있고, 따라서 상당한 세포독성을 유도할 수 있다. 그러나, PP-sNp 내의 양전하가 효율적인 IVT mRNA 세포 흡수, 엔도솜 탈출, 및 성공적인 형질감염(23)을 매개하는데 필수적이라는 것이 이전 연구에서 입증되었다. 결과적으로, PP-sNp 내에서 양전하를 조정하여 효율과 독성 측면에서 섬세한 균형을 맞추는 것이 중요합니다.
제시된 프로토콜은 일부 파라미터 변화와 함께 다양한 PP-sNp 기반 제형에 적용될 수 있다. IVT mRNA계 백신의 전달을 위해, 입자 크기 및 다분산 지수와 같은 생체물리학적 특성은 제조된 나노입자(26)의 형질감염 효율 및 면역원성에 매우 중요하다. 나노미터 규모의 IVT mRNA/PP-sNp의 입자 크기는 생리학적 장벽을 가로지르는 효율적인 전달을 허용하며, 따라서 후속 생체내 응용에 중요하다. 60-150 nm의 크기 범위의 LNP는 비인간 영장류26에서 강력한 면역 반응을 일으킨다고보고되었습니다. 한편, 대형 나노입자(예를 들어, 400-1000 nm)는 폐 전달을 위해 적용되었을 때 기도 점액 장벽을 극복할 수 없었는데, 이는 이전의 조사에 의해 밝혀진 바와 같이, 기도 점액 메쉬 기공의 평균 3차원 메쉬 간격이 대략 60-300 nm에서27,28 범위이기 때문이다. 원하는 크기 또는 형질감염 효율이 달성되지 않으면, 문제 해결을 시작하기 위한 몇 가지 팁은 사용되는 폴록사민 또는 합성 펩티드 성분의 양을 조정하는 것을 포함한다. 이전의 연구는 형질감염에 사용된 IVT mRNA의 양, 배양 시간, 배양된 세포의 유형 및 세포 밀도와 같은 추가적인 파라미터가 또한 형질감염 결과(23)에 유의하게 영향을 미칠 수 있음을 밝혀냈다. 더욱이, PP-sNp 내의 표적화 모이어티가 캡슐화된 IVT mRNA를 관련 수용체를 표시하는 세포 내로의 특이적 전달을 허용하기 때문에, 표적 세포가 기도 관련 세포가 아닌 다른 유형으로 형질감염되는 경우 대안적인 표적화 리간드로의 대체가 필요할 수 있다. 전반적으로, 프로토콜은 더 자세한 통찰력과 추가 검사를 통해 여전히 개선 될 수 있습니다.
원래의 IVT mRNA/PP-sNp가 직접 수동 혼합에 의해 초기에 제조된다는 것을 고려하면, 조작자의 능력은 제형의 품질을 조절하는데 중요한 역할을 한다. IVT mRNA를 PP-sNp의 성분과 혼합하는 과정에서의 변형은 나노 크기의 입자보다는 큰 미세입자를 초래할 수 있다. 가장 까다로운 단계는 mRNA와 합성 펩타이드를 혼합하는 것이며, 이는 조절된 방식으로 수행되어야 한다. IVT mRNA/PP-sNp 제형의 상이한 배치들 사이의 재현성을 향상시키기 위해, 저용량 스크리닝, 빠른 속도 및 재현성이 마이크로유체 방법(29)을 사용하는 중요한 특징이기 때문에 미세유체 혼합기가 채택되었다. 이 방법은 입자 크기에 큰 영향을 미치지 않고 다른 배치들 사이에서 관찰된 형질감염 효율에 큰 영향을 미치지 않으면서 양호한 재현성을 보여주었다. 이는 IVT mRNA 기반 백신이 임상 적용에 적용되기 위한 필수 기준이다. 특히, 미세 유체 믹서는 최대 사용자 수 (제조업체가 권장)를 초과해서는 안되며 다른 조성의 제형간에 변경해야합니다.
이 프로토콜에 기재된 IVT mRNA 전사의 프로토콜은 이론적으로 관심있는 임의의 리포터 단백질/항원을 제조하는데 사용될 수 있다. Metridia luciferase (MetLuc)는 독특한 장점을 가지고 있기 때문에이 연구에 특별히 적용되었습니다. MetLuc의 활성 분석은 MetLuc이 집중적 인 생체 발광 신호를 생성 할 수 있고 세포 배지로 직접 분비 될 수 있기 때문에 높은 감도로 수행하기 쉽기 때문에 세포 용해의 필요성을 피할 수 있습니다. 배양된 세포에서의 MetLuc 발현은 MetLuc-mRNA 자체의 기능성 이외의 많은 파라미터(예를 들어, 웰당 다양한 세포 수 및 피펫팅 에러 등)에 의해 영향을 받을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
IVT mRNA 백신의 전달을 위한 현재의 프로토콜이 확립되었지만, 플라스미드 DNA(pDNA)와 같은 다른 유형의 핵산에 기초한 백신 또는 치료제를 위해서도 구현될 수 있다. 이러한 과정은 다양한 임상 적응증에 대한 특정 PP-sNp를 개발하기 위한 합성 펩티드, 핵산 및 폴록사민 성분 변화에 적응될 수 있다. 실제로, PP-sNp23에 의해 전달된 슬리핑 뷰티 유전자 변형 도구의 활용과 함께 CFTR 녹아웃 마우스의 호흡 상피 조직에서 외인성 낭포성 섬유증 막횡단 형질도입 조절기 (CFTR) 유전자의 게놈 통합이 성공적으로 달성되었다. 치료 적용과 관련하여, IVT mRNA/PP-sNp 제형은 α1-안티트립신 결핍 또는 낭포성 섬유증(30)과 같은 폐 질환의 치료를 위한 특정 분무 장치를 사용하여 에어로졸로서 사용될 수 있다. 그러나, 에어로졸화된 IVT mRNA가 분무기에 의해 생성된 전단력과 IVT mRNA30의 깨지기 쉬운 특성으로 인해 비효율적일 수 있기 때문에, 분무를 위한 IVT mRNA/PP-sNp 제형은 최적화되고 맞춤화되어야 한다는 점은 주목할 가치가 있다. 더욱이, 프로토콜은 T-접합 혼합 장치 및 심지어 펌프(31,32)를 혼합하는 충돌 제트기와 같은 상이한 미세유체 혼합 장치를 사용하여 더 큰 부피로 확장될 수 있다.
요약하면, 여기에 상술된 프로토콜은 PP-sNp 전달 시스템에서 IVT mRNA를 제형화하는 재현가능한 방법뿐만 아니라 배양된 세포에서의 후속 신뢰할 수 있는 형질감염을 소개한다. 설명 된 방법은 미세 유체 믹서를 사용하여 IVT mRNA / PP-sNp를 생산하는 접근 가능하고 쉬운 접근법을 보장합니다. 작은 입자 크기 및 낮은 다분산 지수를 갖는 제조된 제형은 후속적으로 배양된 세포를 안전하고 효율적으로 형질감염시키기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 PP-sNp 기반 전달 시스템이 언급된 모든 단점을 피하면서 새로운 IVT mRNA 기반 백신 또는 치료제를 설계하기 위한 학계에 제공될 수 있게 할 것이다. PP-sNp의 유연한 프로파일로, PP-sNp를 통해 다양한 질병을 해결할 수 있는 뚜렷한 치료제를 생산하기 위해 향후 수많은 응용이 이루어질 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC, 보조금 번호 82041045 및 82173764), 중국 과학 기술부의 병인 및 전염병 예방 기술 시스템 연구 (2021YFC2302500), 충칭 인재 : 탁월한 젊은 인재 프로젝트 (CQYC202005027) 및 충칭 자연 과학 재단 (cstc2021jcyj-msxmX0136)의 지원을 받았다. 저자들은 유체역학적 직경 (nm)과 다분산 지수 (PDI)를 측정 한 Xiaoyan Ding 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
