Summary
Dit protocol presenteert de synthese van cyclische peptiden via bisalkylering tussen cysteïne en methionine en de gemakkelijke thiol-yne-reactie veroorzaakt door het propargylsulfoniumcentrum.
Abstract
In de afgelopen jaren hebben cyclische peptiden steeds meer aandacht getrokken op het gebied van medicijnontdekking vanwege hun uitstekende biologische activiteiten, en als gevolg daarvan worden ze nu klinisch gebruikt. Het is daarom van cruciaal belang om effectieve strategieën te zoeken voor het synthetiseren van cyclische peptiden om hun toepassing op het gebied van medicijnontdekking te bevorderen. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de efficiënte synthese van cyclische peptiden met behulp van on-resin of intramoleculaire (intermoleculaire) bisalkylering. Met behulp van dit protocol werden lineaire peptiden gesynthetiseerd door gebruik te maken van vaste-fase peptidesynthese met cysteïne (Cys) en methionine (Met) die tegelijkertijd aan de hars werden gekoppeld. Verder werden cyclische peptiden gesynthetiseerd via bisalkylering tussen Met en Cys met behulp van een instelbare tether en een on-tether sulfoniumcentrum. De hele synthetische route kan worden onderverdeeld in drie belangrijke processen: de bescherming van Cys op de hars, de koppeling van de linker en de cyclisering tussen Cys en Met in een trifluorazijnzuur (TFA) splitsingsoplossing. Bovendien, geïnspireerd door de reactiviteit van het sulfoniumcentrum, werd een propargylgroep aan de Met gehecht om thiol-yne-toevoeging te activeren en een cyclisch peptide te vormen. Daarna werden de ruwe peptiden gedroogd en opgelost in acetonitril, gescheiden en vervolgens gezuiverd door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC). Het molecuulgewicht van het cyclische peptide werd bevestigd door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), en de stabiliteit van de cyclische peptidecombinatie met het reductant werd verder bevestigd met behulp van HPLC. Bovendien werd de chemische verschuiving in het cyclische peptide geanalyseerd door 1H nucleaire magnetische resonantie (1H NMR) spectra. Over het algemeen was dit protocol gericht op het vaststellen van een effectieve strategie voor het synthetiseren van cyclische peptiden.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI's)1 spelen een cruciale rol in onderzoek en ontwikkeling van geneesmiddelen. Het construeren van gestabiliseerde peptiden met een vaste conformatie met chemische middelen is een van de belangrijkste methoden voor het ontwikkelen van mimetische motieven van PPI's2. Tot op heden zijn verschillende cyclische peptiden die zich richten op PPI's ontwikkeld voor klinisch gebruik3. De meeste peptiden zijn beperkt tot een α-helix conformatie om de conformationele entropie te verminderen en de metabole stabiliteit, doelbindingsaffiniteit en celpermeabiliteit te verbeteren 4,5. In de afgelopen 2 decennia zijn de zijketens van Cys 6,7, lysine 8,9, tryptofaan10, arginine11 en Met 12,13 in onnatuurlijke aminozuren ingebracht om het peptide in een cyclische conformatie te fixeren. Dergelijke cyclische peptiden kunnen zich richten op een unieke chemische ruimte of speciale plaatsen, waardoor een covalente reactie wordt geactiveerd om eiwit-peptide covalente binding 14,15,16,17 te vormen. In een recent rapport van Yu et al. werd een chloroacetamide verankerd in het domein van peptideliganden, waardoor een covalente conjugatiereactie met een uitstekende eiwitspecificiteitwerd gewaarborgd 18. Bovendien werden elektrofiele kernkoppen, zoals acrylamide en arylsulfonylfluoride (ArSO2F), verder opgenomen in peptiden door Walensky et al.19 om gestabiliseerde peptide covalente remmers te vormen en het antitumoreffect van peptideremmers te verbeteren. Daarom is het erg belangrijk om een extra functionele groep te introduceren om eiwit-peptide liganden covalent te modificeren20. Deze groepen reageren niet alleen met eiwitten aan de zijketen, maar stabiliseren ook de secundaire structuur van het peptide21. De toepassing van covalent gemodificeerde eiwitten geïnduceerd door peptideliganden is echter beperkt vanwege de gecompliceerde synthetische route en de niet-specifieke binding van de chemische groepen22,23. Effectieve strategieën voor de synthese van cyclische peptiden zijn daarom dringend nodig.
Geïnspireerd door de veelzijdige strategieën van cyclische peptiden 2,24,25,26, probeert dit protocol een eenvoudige en efficiënte methode te ontwikkelen voor het stabiliseren van peptiden. Bovendien merkten we op dat de zijketengroep van een stabiel peptide covalent kon reageren met een doeleiwit wanneer het ruimtelijk dicht bij de peptideliganden lag. Het gebrek aan chemisch gemodificeerde Met werd in 2013 door de Deming-groep opgevuld door een nieuwe methode te ontwikkelen voor het produceren van selectief gemodificeerd peptide methionine27. Op basis van deze achtergrond richtten de Shi et al. zich op de ontwikkeling van de ringsluiting van zijketens om een sulfoniumzoutcentrum te vormen. Wanneer het peptide ligand zich combineert met het doeleiwit, reageert de sulfoniumzoutgroep covalent met het ruimtelijk nauwe Cys-eiwit. In de afgelopen jaren hebben de Shi et al. een nieuwe methode ontworpen voor het stabiliseren van cyclisch peptide28. Het sulfoniumzout op het cyclische peptide werd gereduceerd door een reductiemiddel met een sulfhydrylgroep die reversibel werd gereduceerd tot Met. De reactie had echter een lage efficiëntie, wat schadelijk was voor latere biologische toepassingsstudies. In de huidige studie werd een Met-Cys en propargylbromide-Cys ringsluitingsreactie ontworpen, waarbij een enkel sulfoniumzout achterbleef aan de zijketen van het cyclische peptide. Het sulfoniumzout fungeerde als een nieuwe kernkop die covalent reageerde met het eiwit Cys onder ruimtelijke nabijheid. Kortom, een Cys en Met gemuteerd peptide werd gecyclizeerd door intramoleculaire alkylering, wat resulteerde in het genereren van een on-tether sulfoniumcentrum. In dit proces was de vorming van een zijketenbrug van cruciaal belang voor cyclische peptiden. Over het algemeen beschrijft dit protocol een gedetailleerde op sulfonium gebaseerde peptidecyclisatie die wordt bereikt met behulp van eenvoudige reactieomstandigheden en -bewerkingen. Het doel is om een mogelijke methode te ontwikkelen voor verdere brede biologische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de apparatuur
LET OP: Morfoline, N, N-dimethylformamide (DMF), dichloormethaan (DCM), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), TFA, morfoline, piperidine, diethylether en methanol zijn giftig, vluchtig en corrosief. Deze reagentia kunnen het menselijk lichaam schaden door inademing, inname of huidcontact. Gebruik voor alle chemische experimenten beschermende uitrusting, waaronder wegwerphandschoenen, experimentele jassen en beschermende brillen.
- Construeer alle peptidesubstraten op Rink-amide 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) hars door standaard handmatige Fmoc-gebaseerde solid-phase peptide synthesis (SPPS)29, zoals weergegeven in figuur 1.
- Gebruik een van de twee opties voor het construeren van lineaire peptiden: één, synthetiseer het peptide met behulp van condensatiemiddel 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N'-tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HATU) en een reagens van DIPEA; of twee, synthetiseren met behulp van 1-hydroxybenzotriazol (HOBT) en N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) als het amidecondensatiereagens. Selecteer een geschikt protocol voor peptidesynthese volgens de volgorde van het peptide.
- Om een handmatig peptidesyntheseapparaat op te zetten, plaatst u gemodificeerde vacuüm vaste fase extractieapparatuur in een zuurkast en verbindt u deze met een driewegstopkraan. Plaats vervolgens een polypropyleen filterpatroon of glazen reactor op de apparatuur terwijl deze is aangesloten op stikstof (N2) gas.
OPMERKING: Voor het aanpassen van de vacuüm vaste fase extractieapparatuur, verwijdert u de extractiebuis en houdt u het vacuümdichte systeem. - Laad MBHA-hars in de met hars gevulde kolommen en los het op in DMF. Pas de schakelaar van de driewegstopkranen aan voor het opborrelen van N2 en verwijder vervolgens het oplosmiddel in de kolom met behulp van een werkende pomp die is aangesloten op een vacuümsysteem. Bereken de benodigde hoeveelheid aminozuur of condensatiemiddel met behulp van de volgende formule:
Aminozuur (g) en condensatiemiddel (g) = harsschaal (g) × harsbelastingsvermogen (mM/g) × equivalent (5 eq) × molecuulgewicht (g/M)
OPMERKING: Kies de hoeveelheid geladen hars op basis van de lengte van het koppelingspeptide. Meerdere equivalenten (eq) van aminozuren worden gebruikt om vollediger te reageren. Vloeibare oplosmiddelen moeten worden omgezet in volume op basis van dichtheid. De 5 eq laat zien dat de inputhoeveelheid van de berekende verbinding wordt versterkt met een factor vijf.
2. Harsvoorbereiding
OPMERKING: Kies de hoeveelheid geladen hars op basis van de lengte van het koppelingspeptide.
- Weeg 302 mg Rink-amide MBHA-hars (0,331 mM/g geladen) in een kolom (reservoir van 20 ml). Voeg 5-10 ml DCM of DMF toe aan de kolom om de hars onder N2 gedurende 30 minuten te laten borrelen.
- Sluit vervolgens de N2-schakelaar en schakel vervolgens de zuigschakelaar van de vacuümpomp in om het oplosmiddel te verwijderen. Was vervolgens de harsen sequentieel met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) 5x.
3. N-terminal Fmoc-deprotectie
OPMERKING: Deprotectie door morfoline vereist 30 minuten en deprotectie door piperidine duurt 5 minuten.
- Bereid de N-terminale 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) deprotectie-oplossing: bereid een voldoende volume (500 ml) van 20% (v / v) piperidine of 50% (v / v) morfoline in DMF in een glazen container voor Fmoc-groepsdeprotectie.
- Voeg 10 ml van de deprotectieoplossing toe aan de kolom, bel N2 in de oplossing gedurende 30 minuten of 5 minuten 2x en herhaal de deprotectieprocedures 2x.
- Giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) 5x.
- Detecteer de hars als een donkergele kleuroplossing met 5% ninhydrine (Kaiser-test) na elke deprotectie om de afwezigheid van de Fmoc-groep vóór de koppelingsstap te bevestigen. Voeg in detail 1 ml DMF toe aan een kleine hoeveelheid hars en voeg 200 μL 5% ninhydrine toe aan een glazen buis die gedurende 3 minuten bij 130 °C wordt verwarmd om veranderingen in de harskleur te beoordelen.
- Giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) 5x.
4. Koppeling van het lineaire peptide (figuur 2)
OPMERKING: Wanneer de synthetische peptidesequenties twee of meer herhalende eenheden bevatten, kan de koppelingsprocedure direct worden uitgevoerd door het aminozuurtype te selecteren, zoals Fmoc-AA-OH of Fmoc-AAA-OH, enzovoort. Sommige speciale aminozuren met sterische belemmering en peptiden met langere aminozuursequenties zijn nodig om de reactietijd voor koppeling goed te verlengen.
- Neem voor een enkele koppelingsstap de koppeling van Cys-residu als voorbeeld (synthetiseer 300 mg harsschalen). Bereid een mengseloplossing met Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) en HATU (5 eq, 206 mg) of Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) en HOBT (5 eq, 106 mg) in een polypropyleenbuis en los deze op in 3 ml DMF.
- Voeg 173 μL DIPEA (10 eq) of 154 μL DIC (10 eq) toe aan de oplossing van Cys om het aminozuur te activeren. Laat het mengsel 1 min voor activeren. Voeg het mengsel toe aan de kolom met hars en bel het met N2 gedurende 2 uur.
OPMERKING: De specifieke reactietijd die nodig is, moet worden gestandaardiseerd om 5% ninhydrine te detecteren. - Voeg na de koppeling 1 ml DMF toe aan een kleine hoeveelheid hars en voeg 200 μL 5% ninhydrine toe aan een glazen buis die gedurende 3 minuten bij 130 °C wordt verwarmd. Observeer de harsverandering naar kleurloos om de afwezigheid van een vrije aminogroep vóór de deprotectiestap te bevestigen.
- Giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) 5x.
- Voeg 10 ml van de deprotectieoplossing toe aan de kolom, bel met N2 gedurende 30 minuten of 5 minuten 2x, voeg een nieuwe oplossing toe en herhaal de deprotectieprocedures 2x.
- Herhaal de volgende stappen: deprotectie van de Fmoc-groep; detectie van harsdeprotectie; het wassen van de hars; koppeling van het aminozuur; het detecteren van de koppelingsreactie. Herhaal de koppelingsstap totdat alle peptiden zijn gesynthetiseerd.
OPMERKING: Gebruik de Kaiser-test om te controleren of elke stap van deprotectie is voltooid of dat elke stap van de aminozuurkoppeling grondig is. Als alternatief kan een kleine hoeveelheid peptide uit de hars worden gesplitst en door LC-MS worden gecontroleerd op een succesvolle koppeling.
5. Bisalkylering tussen Met en Cys (figuur 3)
- Construeer een lineair peptide met Met en Cys door stap 4.1-4.6 te herhalen. Voeg 10 ml watervrije methanol toe aan de kolom met hars voor dehydratatie en droog met N2 voor het volgende gebruik (herhaal 2x) na lineaire peptidekoppeling.
- Weeg 100 mg van de hars verkregen in de vorige stap in een kolom (reservoir van 20 ml) en was de hars met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) vóór de koppelingsstap.
- Bereid een oplossing voor het verwijderen van de Cys trt(trityl) beschermingsgroep. Bereid een voldoende volume (100 ml) TFA/TIS/DCM (3:5:92) mengsel in een glazen container voor het verwijderen van de beschermstof.
- Voeg 5-10 ml van de oplossing van TFA/TIS/DCM (3:5:92) toe aan de kolom om de beveiligingsgroep gedurende 10 minuten te verwijderen. Herhaal zes keer met N2 borrelend totdat de gele kleur volledig verdwijnt.
- Giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) 5x.
- Bereid een oplossing voor om te reageren met gedeprotecteerde Cys. Bereid een voldoende volume (50 ml) mengseloplossing (DMF) met inbegrip van gediahalogeneerde linker (2 eq) en DIPEA (4 eq) voor reageren met gedeprotecteerde Cys.
- Voeg 5-10 ml van de reactieoplossing toe aan de kolom om te reageren met ontschermde Cys gedurende ten minste 3 uur met N2 borrelen. Droog uit met watervrije methanol en droog met N2 voor het volgende gebruik.
- Giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) 5x.
- Bereid een oplossing voor peptidecyclisatie: bereid een voldoende volume (20 ml) TFA-mengsel (TFA: TIS: H2O = 95: 2.5: 2.5) in een glazen container in de zuurkast voor peptidecyclisatie.
- Voeg 5-10 ml van de TFA-mengseloplossing toe aan de polypropyleenbuis en splits de hars gedurende 3 uur onder de TFA-cocktail.
LET OP: TFA is zeer corrosief en irriterend; het peptidesplitsingsproces moet worden uitgevoerd in een zuurkast. - Voer stap 7.1-7.5 uit om een lineaire peptideoplossing te verkrijgen door middel van omgekeerde fase vloeibare fase zuivering (HPLC). Vriesdroog de oplossing voor het volgende gebruik.
6. Propargylsulfoniumzoutcyclisatie (figuur 4)
- Construeer een lineair peptide met Met en Cys door stap 4.1-4.6 te herhalen. Voeg 10 ml watervrije methanol toe aan de kolom met de hars voor dehydratatie en droog met N2 voor het volgende gebruik (herhaal tweemaal) na lineaire peptidekoppeling.
- Weeg 100 mg van de hars verkregen in de vorige stap in een kolom (reservoir van 20 ml) en was de hars met DCM (5-10 ml) en DMF (5-10 ml) vóór de koppelingsstap.
- Voer stap 7.1-7.5 uit om een lineaire peptideoplossing van HPLC te verkrijgen en vries het monster, zoals vermeld, voor volgend gebruik.
- Bereid een 1% HCOOH waterige oplossing (in volume) en 1,0 mM propargylbromide (5 eq) en voeg toe aan de Met-peptideoplossing (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml MeCN/H2O [1:1, v/v]).
- Schud vervolgens de koppelingsreactie van Met en propargylbromide bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
- Los na de reactie het product op in een polypropyleenbuis in acetonitril en filter het door een membraan van 0,22 μm filter. Zuiver vervolgens de oplossing onmiddellijk door reverse-phase HPLC en vriesdroog het tot poeder voor het volgende gebruik.
- Voeg in de laatste stap het peptide met propargylbromide toe aan een polypropyleenbuis, houd de pH van de reactieoplossing op 8,0 door toevoeging van (NH4)2CO3-oplossing en schud het reactiemengsel gedurende 12 uur op 37 °C. Deze stap verkrijgt het cyclische peptide van propargylsulfoniumzout.
- Verzamel het laatste reactiemengsel: los het op in een polypropyleenbuis in acetonitril en filter het door een filtermembraan van 0,22 μm. Zuiver vervolgens de oplossing onmiddellijk door reverse-phase HPLC en vriesdroog het tot poeder voor het volgende gebruik.
7. Zuivering van cyclische peptiden
- Construeer lineaire peptidesubstraten op Rink-amide MBHA-hars door stappen 4.1-4.6 te herhalen. Voeg 10 ml watervrije methanol toe aan de kolom met hars voor dehydratatie en droog met N2 voor het volgende gebruik (herhaal tweemaal) na lineaire peptidekoppeling.
- Bereid een voldoende volume decolletécocktail (TFA/H2O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) in de zuurkast. Voeg 1-5 ml TFA-mengseloplossing toe aan de polypropyleenbuis en splits de hars gedurende 3 uur onder de TFA-cocktail.
- Droog vervolgens achtereenvolgens de hars onder een stoom van N2 in de kolom. U kunt ook een filterapparaat gebruiken om de hars te filteren en de peptide-oplossing te verzamelen. Voeg vervolgens 20 ml ether toe aan de peptideoplossing om het peptide neer te slaan, centrifugeer bij 3.500 x g gedurende 5 minuten en herhaal tweemaal. Verzamel het ruwe peptideprecipitaat en droog het onder een stroom van N2 voor de volgende stap.
- Los 200 mg ruw peptide op in een polypropyleenbuis in 4 ml acetonitril-wateroplossing en filter het door een filter van 0,22 μm. Breng het peptide over in een HPLC injectieflacon insert. Plaats het inzetstuk in de autosampler van een semi-preparatief omgekeerd fase HPLC-systeem uitgerust met een C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm kolom en een injectielus van 1 ml.
- Zuiver en isoleer het peptide met behulp van een gradiëntprogramma van 5% -95% acetonitril in water met 0,1% TFA gedurende 30 minuten, terwijl de HPLC-spectra worden bewaakt met behulp van UV bij 254 nm. Bevestig het molecuulgewicht van het peptide door LC-MS, verzamel de oplossing van het peptide en vriesdroog het in poeder voor het volgende gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle lineaire peptiden werden gesynthetiseerd op Rink-amide MBHA-hars door standaard handmatige Fmoc vaste-fasesynthese. Een model cyclisch hexapeptide (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) werd geconstrueerd zoals beschreven in figuur 5A. Met name een nieuw on-tether chiraal centrum werd gegenereerd door Met-alkylering, waarbij de twee epimeren van cyclisch peptide (Ia, Ib) werden bevestigd door reverse-phase HPLC. Verder werden de conversie en verhouding van epimeren bepaald met behulp van de integratie van reverse-phase HPLC. Cyclische Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2 peptiden 1-Ia en 1-Ib, gegenereerd uit hexapeptide Ac-WMAAAC-NH2, vertoonden verschillende retentietijden en identieke molecuulgewichten (figuur 5B). Vervolgens werd de tolerantie van het cyclische peptide voor verschillende functionele groepen verder getest, zoals weergegeven in figuur 5C. De lussluitingsefficiëntie van de 10 lineaire peptiden werd geëvalueerd met behulp van een gediahalogeneerde linker, waarbij de resultaten aantonen dat alle peptiden efficiënt de overeenkomstige cyclische peptiden genereerden. Vergeleken met de andere cyclische peptiden produceerde een modelhexacyclisch cyclisch peptide met hoge conversiesnelheden een differentiële verhouding van 1:1 van de epimeren en kon worden gescheiden door HPLC. In sommige gevallen konden de peptide-epimeren echter niet worden gescheiden onder HPLC-omstandigheden, waarschijnlijk omdat het sulfonium chirale centrum van het epimeer niet erg stabiel was en langzaam werd gerasmiseerd tot epimeermengsels. De reactie-efficiëntie van de epimeren (1-Ia) met pyridinrthiolen (PyS) (10 mM) werd vervolgens onderzocht door HPLC. Figuur 5D toont de HPLC-sporen van de tijdsafhankelijke conversie tussen het cyclische peptide (1 mM) en het geconjugeerde product. De sporen tonen duidelijk de tijdsafhankelijke reductie van peptide 1-Ia met PyS in PBS (pH 7,4).
Een andere strategie voor peptideringsluiting was dat eerst een propargylgroep aan Met werd gehecht en vervolgens het gevormde propargylsulfoniumcentrum een thiol-yne-reactie veroorzaakte om een cyclisch peptide te genereren. In deze strategie hadden de ringgrootte en de peptidesequentie geen invloed op de cyclisatiereactie, waarbij het peptide met twee of drie aminozuren alleen als model werd gebruikt om de cirkel te sluiten. De synthetische route van intramoleculaire peptidecyclisatie wordt beschreven in figuur 6A. Daarnaast werd een vereenvoudigd gepropargyleerd Met-modelpeptide geconstrueerd zoals beschreven in figuur 6B. De resultaten toonden aan dat de opbrengst van het modelpeptide MC tot 80% kon zijn wanneer de pH van de reactieoplossing op 8,0 werd ingesteld (MC verwijst naar een model cyclisch peptide dat via deze route wordt gesynthetiseerd; Figuur 6A). Bovendien werd het modelpeptide MC geïsoleerd en gezuiverd door HPLC (figuur 6D) en werd het molecuulgewicht bevestigd door LC-MS (figuur 6C). Zoals te zien is in figuur 6E, werd de chemische verschuiving verder gekenmerkt door 1H NMR en heteronucleaire single quantum coherentie (HSQC). Bovendien werd het dithiothreitol (DTT) toegevoegd om te proberen de sulfoniumring te openen om de stabiliteit van MC te onderzoeken. De resultaten toonden geen toevoeging of ringopening van producten na 24 uur (figuur 6F).
Figuur 1: Diagram van de experimentele opstelling voor een op Fmoc gebaseerd vast fasepeptide voor het synthetiseren van peptiden. De peptidekolom werd op de vastefasereactor geplaatst via driewegstopkranen met stikstof of argon dat door de kolom borrelde tijdens de peptidesynthese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: On-resin intermoleculaire synthetische lineaire CM peptiden. Alle lineaire peptiden werden gesynthetiseerd op Rink-amide MBHA-hars door standaard handmatige Fmoc vaste-fasesynthese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Synthetische routes voor peptidecyclisatie via Cys en Met-bisalkylering. De lineaire peptiden met Met en Cys werden geconstrueerd als gestabiliseerde cyclische peptiden. Eerst werd de trt-beschermde Cys gedeprotected met 3% TFA in DCM. Vervolgens werden een gediahalogeneerde linker (2 eq) en DIPEA (4 eq) toegevoegd om gedurende 3 uur met Cys te reageren. Ten slotte werd de cyclisatie tussen Cys en Met voltooid toen de hars werd gesplitst in een TFA-splitsingsoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Synthetische routes voor peptidecyclisatie via Cys en Met thiol-yne. Eerst werden de lineaire peptiden gezuiverd en gekarakteriseerd door HPLC en LC-MS. De reactie trad op onder de volgende omstandigheden: een oplossing met de verbinding (0,2 mM, 1,0 eq) in 0,2 ml MeCN/H2O (1:1, v/v), 1% HCOOH waterige oplossing (in volume) en propargylbromide (1,0 mM, 5,0 eq) werd geschud bij kamertemperatuur gedurende 12 uur bij een pH van 8,0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Syntheseschema van cyclische peptiden met behulp van bisalkylering tussen Cys en Met. (A) Schematische illustratie van peptidecyclisatie door Cys en Met. (B) Het HPLC- en LC-MS-spectrum van de epimeren (1-Ia en 1-Ib). (C) De functionele residutolerantie van de verschillende peptiden werd getest. D) HPLC-sporen van de tijdsafhankelijke omzetting tussen epimeren (1-Ia; 1 mM) en hun geconjugeerde producten. Dit cijfer is een wijziging van het cijfer gerapporteerd door Wang et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Syntheseschema van cyclische peptiden met behulp van een thiol-yne-type reactie. (A) Gemakkelijke constructie van peptidecyclisatie door de thiol-yne-reactie. MC verwijst naar een model cyclisch peptide gesynthetiseerd door de route. (B) Intramoleculaire peptidecyclisatie van verschillende lineaire peptiden. a = 1 ml waterige oplossing van 1 M (NH4)2CO3 . b = 1% Et3N in 1 ml MeCN/H2O (1:1). Afkortingen: Ahx = 6-aminocaproïnezuur. De opbrengst werd berekend als het percentage van het product bepaald door weging. Conversie vertegenwoordigde de hoeveelheid uitgangsmateriaal die reageerde door HPLC. (C) Het LC-MS spectrum van het MC-cycliclisatiepeptide. (D) Het HPLC-spectrum van het MC-cyclisatiepeptide. (E) 1H NMR en HSQC spectra karakterisering van de MC cyclische peptiden. (F) 1H NMR spectra van de tijdsafhankelijke conversie tussen MC cyclisch peptide en DTT in D2O gedurende 3 h, 6 h, 12 h en 24 h. Dit cijfer is een wijziging van het cijfer gerapporteerd door Hou et al.31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De synthetische benadering die in dit artikel wordt beschreven, biedt een methode voor het synthetiseren van cyclische peptiden met behulp van Cys en Met in de peptidesequentie, waarbij de elementaire lineaire peptiden worden geconstrueerd door gemeenschappelijke vaste-fase peptidesynthesetechnieken. Voor de bisalkylering van cyclische peptiden tussen Cys en Met kan de hele synthetische route worden onderverdeeld in drie belangrijke processen: de bescherming van Cys op de hars, de koppeling van de linker en de cyclisering tussen Cys en Met in een trifluorazijnzuursplitsingsoplossing. Met name de verwijdering van de beschermende groep Cys bleek een cruciale stap te zijn voor de daaropvolgende ringsluitingsreactie. Daarom werd trt-Cys gedeprotecteerd en dit werd gedaan totdat de oplossing geen duidelijke gele kleur had. Verdere studies toonden aan dat cyclische peptiden ontwikkeld door de bisalkylering tussen Cys en Met-methodologie konden worden uitgebreid tot lussluiting in een verscheidenheid aan peptiden, met als voorwaarde dat het peptide de aminozuren Cys en Met bevat. Daarnaast konden de peptidesequentie en linker ook verder worden aangepast volgens het experimentele ontwerp (figuur 5). Het was daarom noodzakelijk om de synthese door LC-MS te monitoren.
Voor cyclische peptiden in de thiol-yne-type reactie, ten eerste, werden lineaire peptiden ook geconstrueerd door gemeenschappelijke vaste-fase peptide synthesetechnieken op hars, met de volgende reacties uitgevoerd in de vloeibare fase oplossing. Ruwe peptiden werden vervolgens uit de hars gesplitst en gezuiverd door reverse-phase HPLC. Een oplossing van peptiden en propargylbromide werd gedurende 12 uur aan de reactie toegevoegd, samen met 0,2 ml MeCN / H2O (1: 1, v / v) en 1% HCOOH waterige oplossing, en de producten werden vervolgens onmiddellijk gezuiverd door reverse-phase HPLC. Verrassend genoeg trad de ringsluitingsreactie op wanneer de pH van de reactieoplossing werd verhoogd tot 8,0. Deze studie heeft een methode ontwikkeld die het peptide beperkt tot een cyclische conformatiestructuur met goede stabiliteit via een thiol-yne-type reactie. Bovendien was het noodzakelijk om het oplosmiddel aan te passen voor de sluiting van de peptidelus omdat de hydrofielheid en hydrofobiciteit van de peptiden anders waren. De pH van het hydrofiele peptide werd bijvoorbeeld aangepast door (NH4) 2CO3 en het hydrofobe peptide werd vervolgens aangepast door een gemengd oplosmiddel (1% Et3N-oplossing in 50% MeCN / H2O; Figuur 6).
In de afgelopen jaren zijn verschillende ligatietechnologieën ontwikkeld voor het synthetiseren van cyclische peptiden, waarbij deze technologieën natuurlijke peptidebindingen en onnatuurlijke backbone-koppelingen genereren32. Er blijven echter uitdagingen bestaan op het gebied van synthetische cyclische peptiden. Ten eerste heeft de aminozuursequentie van het peptide een sterisch effect en kan de efficiëntie van cyclisatie worden beïnvloed door de residuen dicht bij de cyclisatieplaats. Ten tweede is de ruimtelijke structuur van peptiden divers en kan het nodig zijn om de verbindingslocatie zorgvuldig te kiezen tijdens de sluiting van de ring op dezelfde locatie. Ten slotte bevatten peptidesequenties hydrofiele of hydrofobe aminozuren en daarom moet de oplosbaarheid van het reactieoplosmiddel worden overwogen. Daarom moet meer moeite worden gedaan om cyclisatie op de locatie, oplosbaarheid en isomeren te identificeren om cyclische peptidetoepassingen in de farmaceutische industrie verder te ontwikkelen.
In dit onderzoek werd een reeks gemakkelijke macrocyclisatieprotocollen ontworpen met behulp van bisalkylering tussen Cys en Met of via een thiol-yne-type reactie om de uitdagingen van het synthetiseren van cyclische peptiden op te lossen. Gelukkig waren deze reacties gemakkelijk, zeer efficiënt en metaalkatalysatorvrij. Van de ontwikkelde methoden is aangetoond dat ze zowel intermoleculair als intramoleculair presteren en een bevredigende functionele groepstolerantie hebben. Bovendien zijn deze methoden ontwikkeld om restrictieve cyclisatie te introduceren, waardoor de peptideketen meer conformatiegestabiliseerd is, waardoor de affiniteit van het doeleiwit wordt verbeterd en niet-specifieke eiwitbinding wordt verminderd. Bovendien kan door het gebruik van redelijke ontwerpen de selectiviteit van de reactieplaats ook worden verbeterd door een conformatiegestabiliseerd ciliclisatiepeptide te vormen. Over het algemeen genereerde peptideketencyclisatie biologisch actieve verbindingen, wat aangeeft dat cyclische peptiden veelbelovende kandidaat-geneesmiddelen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen financiële steun van het National Key R&D-programma van China (2021YFC2103900); de Natural Science Foundation of China subsidies (21778009, en 21977010); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2022A1515010996 en 2020A1515010521): de Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 en JCYJ20200109140406047); en de Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions grant (2019SHIBS0004). De auteurs erkennen tijdschriftondersteuning van Chemical Science, The Royal Society of Chemistry voor referentie 30 en The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, voor referentie 31.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
| 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
| 2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
| 6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
| Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
| Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
| Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
| Formic acid | Energy | W810042 | |
| High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
| Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
| Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
| Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
| Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
| Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
- Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
- Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
- Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
- Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
- Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
- Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
- Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
- Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
- Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
- Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
- Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
- Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
- Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
- Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
- Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
- Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
- Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
- Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
