Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3, 1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מציג את הסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה בין ציסטאין למתיונין ואת תגובת תיול-ין המופעלת על ידי מרכז פרופרגיל סולפוניום.

Abstract

בשנים האחרונות, פפטידים מחזוריים מושכים תשומת לב גוברת בתחום גילוי התרופות בשל פעילותם הביולוגית המצוינת, וכתוצאה מכך הם משמשים כיום קלינית. לכן, חיוני לחפש אסטרטגיות יעילות לסינתזה של פפטידים מחזוריים כדי לקדם את יישומם בתחום גילוי התרופות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לסינתזה יעילה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה תוך-מולקולרית או תוך-מולקולרית (בין-מולקולרית). באמצעות פרוטוקול זה, פפטידים ליניאריים סונתזו על ידי ניצול סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה עם ציסטאין (Cys) ומתיונין (Met) המצומדים בו זמנית על השרף. יתר על כן, פפטידים מחזוריים סונתזו באמצעות ביסלקילציה בין Met ו- Cys באמצעות קשירה הניתנת לכוונון ומרכז סולפוניום על קשירה. ניתן לחלק את כל המסלול הסינתטי לשלושה תהליכים עיקריים: הגנה על Cys על השרף, צימוד המקשר, ומחזוריות בין Cys ו- Met בתמיסת ביקוע חומצה טריפלואורואצטית (TFA). יתר על כן, בהשראת התגובה של מרכז הסולפוניום, קבוצת פרופרגיל הוצמדה למטרופוליטן כדי לגרום לתוספת תיול-ין וליצור פפטיד מחזורי. לאחר מכן, הפפטידים הגולמיים יובשו והתמוססו באצטוניטריל, הופרדו ולאחר מכן טוהרו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). המשקל המולקולרי של הפפטיד המחזורי אושר על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), והיציבות של שילוב הפפטיד המחזורי עם הרדוקטנט אושרה עוד יותר באמצעות HPLC. בנוסף, השינוי הכימי בפפטיד המחזורי נותח על ידי ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית של 1 H (1H NMR). בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לבסס אסטרטגיה יעילה לסינתזה של פפטידים מחזוריים.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs)1 ממלאות תפקיד מרכזי במחקר ובפיתוח תרופות. בניית פפטידים מיוצבים עם קונפורמציה קבועה באמצעים כימיים היא אחת השיטות החשובות ביותר לפיתוח מוטיבים מימטיים של PPIs2. עד כה פותחו מספר פפטידים מחזוריים המכוונים ל-PPIs לשימוש קליני3. רוב הפפטידים מוגבלים לקונפורמציה של סליל α כדי להפחית את האנטרופיה הקונפורמציונית ולשפר את היציבות המטבולית, זיקת קשירת המטרה וחדירות התאים 4,5. בשני העשורים האחרונים, השרשראות הצדדיות של Cys 6,7, ליזין 8,9, טריפטופן 10, ארגינין 11ו-Met 12,13 הוכנסו לחומצות אמינו לא טבעיות כדי לקבע את הפפטיד לקונפורמציה מחזורית. פפטידים מחזוריים כאלה יכולים לכוון למרחב כימי ייחודי או לאתרים מיוחדים, ובכך לעורר תגובה קוולנטית ליצירת קוולנטית חלבונית-פפטידית קוולנטית14,15,16,17. בדו"ח שפורסם לאחרונה על ידי Yu et al., כלורואצטמיד עוגן בתחום של ליגנדות פפטידיות, מה שמבטיח תגובת הצמדה קוולנטית עם ספציפיות מצוינת לחלבון18. יתר על כן, ראשי נפץ אלקטרופיליים, כגון אקרילאמיד ואריל סולפוניל פלואוריד (ArSO2F), שולבו עוד יותר בפפטידים על ידי Walensky et al.19 כדי ליצור מעכבי פפטיד קוולנטיים מיוצבים ולשפר את ההשפעה האנטי-סרטנית של מעכבי פפטידים. לכן, חשוב מאוד להציג קבוצה פונקציונלית נוספת על מנת לשנות באופן קוולנטי ליגנדות חלבון-פפטיד20. קבוצות אלה לא רק מגיבות עם חלבונים בשרשרת הצדדית אלא גם מייצבות את המבנה המשני של הפפטיד21. עם זאת, היישום של חלבונים שעברו שינוי קוולנטי המושרה על ידי ליגנדות פפטידיות מוגבל בשל המסלול הסינתטי המסובך והקשירה הלא ספציפית של הקבוצות הכימיות22,23. אסטרטגיות יעילות לסינתזה של פפטידים מחזוריים נדרשים, אם כן, בדחיפות.

בהשראת האסטרטגיות הרב-גוניות של פפטידים מחזוריים 2,24,25,26, פרוטוקול זה מנסה לפתח שיטה פשוטה ויעילה לייצוב פפטידים. בנוסף, ציינו כי קבוצת השרשרת הצדדית של פפטיד יציב יכולה להגיב באופן קוולנטי עם חלבון מטרה כאשר הוא היה קרוב מרחבית לליגנדות הפפטידיות. את המחסור ב-Met שעבר שינוי כימי מימשה קבוצת דמינג ב-2013 על ידי פיתוח שיטה חדשנית לייצור פפטיד מתיונין27 שעבר שינוי סלקטיבי. בהתבסס על רקע זה, Shi et al. התמקדו בפיתוח סגירת הטבעת של שרשראות צדדיות ליצירת מרכז מלח סולפוניום. כאשר הליגנד הפפטידי משתלב עם חלבון המטרה, קבוצת מלח הסולפוניום מגיבה באופן קוולנטי עם חלבון Cys הקרוב מרחבית. בשנים האחרונות עיצבו בני שי ואחרים שיטה חדשה לייצוב פפטיד מחזורי28. מלח הסולפוניום שעל הפפטיד המחזורי הופחת על ידי חומר מחזר עם קבוצת סולפהידריל שהופחתה באופן הפיך ל-Met. עם זאת, התגובה הייתה בעלת יעילות נמוכה, מה שהזיק למחקרי יישומים ביולוגיים מאוחרים יותר. במחקר הנוכחי תוכננה תגובת סגירה טבעתית של Met-Cys ופרופרגיל ברומיד-Cys, כאשר מלח סולפוניום יחיד נותר על השרשרת הצדדית של הפפטיד המחזורי. מלח הסולפוניום פעל כראש נפץ חדש שהגיב באופן קוולנטי עם החלבון Cys בסמיכות מרחבית. בקצרה, פפטיד שעבר מוטציה ב-Cys ו-Met היה מחזורי על-ידי אלקילציה תוך-מולקולרית, וכתוצאה מכך נוצר מרכז סולפוניום על-קשירה. בתהליך זה, היווצרות גשר שרשרת צדדי הייתה קריטית עבור פפטידים מחזוריים. בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר מחזוריות פפטידית מפורטת מבוססת סולפוניום המושגת באמצעות תנאי תגובה ופעולות פשוטות. המטרה היא לפתח שיטה פוטנציאלית ליישומים ביולוגיים רחבים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ציוד

אזהרה: מורפולין, N,N-דימתילפורמיד (DMF), דיכלורומתאן (DCM), N,N-דיאיזופרופילתילאמין (DIPEA), TFA, מורפולין, פיפרידין, אתר דיאתיל ומתנול הם רעילים, נדיפים וקורוזיביים. ריאגנטים אלה יכולים להזיק לגוף האדם באמצעות שאיפה, בליעה או מגע עם העור. עבור כל הניסויים הכימיים, השתמש בציוד מגן, כולל כפפות חד פעמיות, מעילים ניסיוניים ומשקפי מגן.

  1. בנה את כל מצעי הפפטידים על שרף Rink-amide 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) על-ידי סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS) ידנית סטנדרטית המבוססת על Fmoc29, כפי שמוצג באיור 1.
  2. השתמש באחת משתי האפשרויות לבניית פפטידים ליניאריים: האחת, לסנתז את הפפטיד תוך שימוש בחומר עיבוי 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) ומגיב של DIPEA; או שניים, סינתזה תוך שימוש ב-1-הידרוקסיבנזוטריאזול (HOBT) ו-N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) כמגיב עיבוי אמיד. בחר פרוטוקול מתאים לסינתזת פפטידים בהתאם לרצף הפפטיד.
  3. כדי להקים מכשיר סינתזת פפטידים ידני, הגדר ציוד מיצוי פאזה מוצקה בוואקום מותאם במכסה אדים וחבר אותו עם פקק תלת-כיווני. לאחר מכן, הנח מחסנית מסנן פוליפרופילן או כור זכוכית על הציוד בזמן שהוא מחובר לגז חנקן (N2).
    הערה: לשינוי ציוד מיצוי הפאזה המוצקה בוואקום, הסר את צינור החילוץ ושמור על המערכת האטומה בוואקום.
  4. טען שרף MBHA לתוך העמודות מלאות השרף והמיס אותו ב- DMF. התאם את המתג של הפקקים התלת-כיווניים עבור N2 מבעבע, ולאחר מכן הסר את הממס בעמודה באמצעות משאבת עבודה המחוברת למערכת ואקום. חשב את כמות חומצת האמינו או סוכן העיבוי הנדרשת באמצעות הנוסחה הבאה:
    חומצת אמינו (g) וחומר עיבוי (g) = סולם שרף (g) × כושר העמסת שרף (mM/g) × שווה ערך (5 eq) × משקל מולקולרי (g/M)
    הערה: בחר את כמות השרף הטעון בהתאם לאורך פפטיד הצימוד. מקבילות מרובות (eq) של חומצות אמינו משמשות לתגובה מלאה יותר. ממיסים נוזליים צריכים להיות מומרים לנפח לפי צפיפות. 5 eq מראה כי כמות הקלט של התרכובת המחושבת מוגברת על ידי גורם של חמישה.

2. הכנת שרף

הערה: בחר את כמות השרף הטעון בהתאם לאורך פפטיד הצימוד.

  1. שקלו 302 מ"ג של שרף MBHA מסוג Rink-amide (0.331 מ"מ/גרם טעון) לתוך עמודה (מאגר של 20 מ"ל). הוסף 5-10 מ"ל של DCM או DMF לתוך העמודה כדי לנפח את השרף תחת N2 מבעבע במשך 30 דקות.
  2. לאחר מכן, סגור את מתג N2 ולאחר מכן הפעל את מתג היניקה של משאבת הוואקום כדי להסיר את הממס. לאחר מכן, לשטוף את שרפים ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו DMF (5-10 מ"ל) 5x.

3. הגנת Fmoc מסוף N

הערה: הגנה על ידי מורפולין דורשת 30 דקות, והגנה על ידי פיפרידין אורכת 5 דקות.

  1. הכן את תמיסת ההגנה N-terminal 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc): הכן נפח מספיק (500 מ"ל) של 20% (v/v) פיפרידין או 50% (v/v) מורפולין ב-DMF במיכל זכוכית להגנה על קבוצת Fmoc.
  2. הוסף 10 מ"ל של תמיסת deprotection לעמודה, בועה N2 לתוך הפתרון במשך 30 דקות או 5 דקות 2x, ולחזור על הליכי deprotection 2x.
  3. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  4. זהה את השרף כתמיסת צבע צהוב כהה על ידי 5% ninhydrin (בדיקת קייזר) לאחר כל deprotection כדי לאשר את היעדרה של קבוצת Fmoc לפני שלב הצימוד. בפירוט, הוסף 1 מ"ל של DMF לכמות קטנה של שרף והוסף 200 μL של 5% ninhydrin לצינור זכוכית מחומם ב 130 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי להעריך את השינויים בצבע שרף.
  5. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.

4. צימוד הפפטיד הליניארי (איור 2)

הערה: כאשר רצפי הפפטידים הסינתטיים מכילים שתי יחידות חוזרות או יותר, הליך הצימוד יכול להתבצע ישירות על ידי בחירת סוג חומצת האמינו, כגון Fmoc-AA-OH או Fmoc-AAA-OH, וכן הלאה. כמה חומצות אמינו מיוחדות עם מכשול סטרי ופפטידים עם רצפי חומצות אמינו ארוכים יותר נדרשים כדי להאריך כראוי את זמן התגובה לצימוד.

  1. עבור שלב צימוד יחיד, קח את הצימוד של שאריות Cys כדוגמה (לסנתז 300 מ"ג קשקשים שרף). הכינו תמיסת תערובת הכוללת Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 מ"ג) ו-HATU (5 eq, 206 מ"ג) או Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 מ"ג) ו-HOBT (5 eq, 106 מ"ג) בצינור פוליפרופילן והמיסו ב-3 מ"ל של DMF.
  2. הוסף 173 μL של DIPEA (10 eq) או 154 μL של DIC (10 eq) לתמיסה של Cys כדי להפעיל את חומצת האמינו. נותנים לתערובת לפעול מראש למשך דקה. מוסיפים את התערובת לעמודה עם שרף, ומבעבעים אותה עם N 2 במשך2 שעות.
    הערה: יש לתקנן את זמן התגובה הספציפי הנדרש כדי לזהות 5% נינידרין.
  3. לאחר הצימוד, יש להוסיף 1 מ"ל של DMF לכמות קטנה של שרף ולהוסיף 200 μL של 5% ninhydrin לצינור זכוכית מחומם ב 130 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. שימו לב לשינוי השרף לחסר צבע כדי לאשר את היעדרה של קבוצת אמינו חופשית לפני שלב ההגנה.
  4. מסננים את התמיסה באמצעות משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  5. הוסף 10 מ"ל של תמיסת deprotection לעמודה, בועה עם N2 במשך 30 דקות או 5 דקות 2x, להוסיף תמיסה טרייה, ולחזור על הליכי deprotection 2x.
  6. חזור על השלבים הבאים: הגנה על קבוצת Fmoc; גילוי הגנה על שרף; שטיפת שרף; צימוד חומצת האמינו; זיהוי תגובת הצימוד. חזור על שלב הצימוד עד שכל הפפטידים מסונתזים.
    הערה: השתמש במבחן קייזר כדי לפקח אם כל שלב של הגנה הושלם או אם כל שלב של צימוד חומצות האמינו הוא יסודי. לחלופין, ניתן לבקע כמות קטנה של פפטיד מהשרף ולבדוק על ידי LC-MS לצימוד מוצלח.

5. ביסלקילציה בין מט לסיס (איור 3)

  1. בנה פפטיד ליניארי עם Met ו- Cys על ידי חזרה על שלבים 4.1-4.6. הוסף 10 מ"ל של מתנול נטול מים לעמודה עם שרף לייבוש וייבוש עם N2 לשימוש הבא (חזור על 2x) לאחר צימוד פפטיד ליניארי.
  2. שוקלים 100 מ"ג של שרף המתקבל בשלב הקודם לתוך עמודה (20 מ"ל מאגר) ולשטוף את השרף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) לפני שלב הצימוד.
  3. הכן פתרון להסרת קבוצת ההגנה Cys trt(trityl). הכינו נפח מספיק (100 מ"ל) של תערובת TFA/TIS/DCM (3:5:92) במיכל זכוכית להסרת קבוצת המגן.
  4. הוסף 5-10 מ"ל מהפתרון של TFA/TIS/DCM (3:5:92) לעמודה כדי להסיר את קבוצת ההגנה למשך 10 דקות. חזרו על הפעולה שש פעמים עם N2 מבעבע עד שהצבע הצהוב ייעלם לחלוטין.
  5. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  6. הכן פתרון לתגובה עם Cys לא מוגן. הכן נפח מספיק (50 מ"ל) של תמיסת תערובת (DMF) כולל מקשר די-הלוגני (2 eq) ו- DIPEA (4 eq) לתגובה עם Cys לא מוגן.
  7. הוסף 5-10 מ"ל של תמיסת התגובה לעמודה כדי להגיב עם Cys מוגן לפחות 3 שעות עם N2 מבעבע. יש לייבש עם מתנול נטול מים ולייבש עם N2 לשימוש הבא.
  8. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  9. הכינו תמיסה למחזוריות פפטידים: הכינו נפח מספיק (20 מ"ל) של תערובת TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:2.5) במיכל זכוכית במכסה האדים למחזוריות פפטידים.
  10. מוסיפים 5-10 מ"ל מתמיסת תערובת TFA לצינור הפוליפרופילן ומבקעים את השרף מתחת לקוקטייל TFA למשך 3 שעות.
    זהירות: TFA הוא מאוד קורוזיבי ומרגיז; תהליך המחשוף הפפטידי צריך להתבצע במכסה אדים.
  11. בצע את שלבים 7.1-7.5 כדי לקבל תמיסת פפטיד ליניארית על-ידי טיהור פאזה נוזלית בפאזה הפוכה (HPLC). יש להקפיא-לייבש את התמיסה לשימוש הבא.

6. מחזוריות מלח פרופרגיל סולפוניום (איור 4)

  1. בנה פפטיד ליניארי עם Met ו- Cys על ידי חזרה על שלבים 4.1-4.6. מוסיפים 10 מ"ל של מתנול נטול מים לעמודה עם השרף לייבוש וייבוש עם N2 לשימוש הבא (חוזרים פעמיים) לאחר צימוד פפטיד ליניארי.
  2. שוקלים 100 מ"ג של שרף המתקבל בשלב הקודם לתוך עמודה (20 מ"ל מאגר) ולשטוף את השרף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) לפני שלב הצימוד.
  3. בצע את שלבים 7.1-7.5 כדי להשיג תמיסת פפטיד ליניארית על-ידי HPLC, וייבוש הדגימה בהקפאה, כאמור, לשימוש הבא.
  4. הכינו תמיסה מימית של 1% HCOOH (בנפח) ו-1.0 mM פרופרגיל ברומיד (5 eq) והוסיפו לתמיסת הפפטיד של Met (0.2 mM, 1 eq; 0.2 mL של MeCN/H2O [1:1, v/v]).
  5. לאחר מכן, נערו את תגובת הצימוד של Met ופרופרגיל ברומיד בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
  6. לאחר התגובה, להמיס את המוצר בצינור פוליפרופילן באצטוניטריל ולסנן אותו דרך קרום 0.22 μmfilter. לאחר מכן, טהרו את התמיסה על ידי HPLC בפאזה הפוכה באופן מיידי וייבשו אותה בהקפאה לאבקה לשימוש הבא.
  7. בשלב האחרון, הוסף את הפפטיד עם פרופרגיל ברומיד לצינור פוליפרופילן, שמור על pH תמיסת התגובה ב 8.0 על ידי הוספת (NH4)2CO3 פתרון, ולנער את תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. שלב זה משיג את הפפטיד המחזורי של מלח פרופרגיל סולפוניום.
  8. לאסוף את תערובת התגובה האחרונה: להמיס אותו בצינור פוליפרופילן ב acetonitrile ולסנן אותו דרך קרום מסנן 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, טהרו את התמיסה על ידי HPLC בפאזה הפוכה באופן מיידי וייבשו אותה בהקפאה לאבקה לשימוש הבא.

7. טיהור פפטידים מחזוריים

  1. בנה מצעים פפטידיים ליניאריים על שרף MBHA Rink-amide על ידי חזרה על שלבים 4.1-4.6. מוסיפים 10 מ"ל של מתנול נטול מים לעמודה עם שרף לייבוש וייבוש עם N2 לשימוש הבא (חוזרים פעמיים) לאחר צימוד פפטידי ליניארי.
  2. הכינו נפח מספיק של קוקטייל מחשוף (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) במכסה האדים. מוסיפים 1-5 מ"ל של תמיסת תערובת TFA לצינור הפוליפרופילן ומבקעים את השרף מתחת לקוקטייל TFA למשך 3 שעות.
  3. לאחר מכן, ברצף לייבש את השרף תחת אדים של N2 בעמודה. לחלופין, השתמש בהתקן מסנן כדי לסנן את השרף ולאסוף את תמיסת הפפטיד. לאחר מכן, הוסיפו 20 מ"ל של אתר לתמיסת הפפטידים כדי לזרז את הפפטיד, צנטריפוגה בגודל 3,500 x גרם למשך 5 דקות, וחזרו על הפעולה פעמיים. לאסוף את משקע פפטיד גולמי ולייבש אותו תחת זרם של N2 לשלב הבא.
  4. ממיסים 200 מ"ג של פפטיד גולמי בצינור פוליפרופילן ב-4 מ"ל של תמיסת מים אצטוניטריל ומסננים אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. העבר את הפפטיד לתוך בקבוקון HPLC להוסיף. מקם את התוספת לתוך הדגימה האוטומטית של מערכת HPLC חצי-הכנה לפאזה הפוכה המצוידת ב- C18 5 מיקרומטר, עמוד 4.6 מ"מ x 250 מ"מ ולולאת הזרקה של 1 מ"ל.
  5. לטהר ולבודד את הפפטיד באמצעות תוכנית הדרגתית של 5%-95% אצטוניטריל במים עם 0.1% TFA במשך 30 דקות תוך ניטור ספקטרום HPLC באמצעות UV ב-254 ננומטר. אשרו את המשקל המולקולרי של הפפטיד על ידי LC-MS, אספו את התמיסה של הפפטיד וייבשו אותה בהקפאה לאבקה לשימוש הבא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל הפפטידים הליניאריים סונתזו על שרף MBHA של Rink-amide על ידי סינתזה ידנית סטנדרטית של Fmoc בפאזה מוצקה. מודל הקספפטיד מחזורי (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) נבנה כמתואר באיור 5A. יש לציין כי מרכז כיראלי חדש על קשירה נוצר על ידי אלקילציה של Met, כאשר שני האפימרים של פפטיד מחזורי (Ia, Ib) אושרו על ידי HPLC בפאזה הפוכה. יתר על כן, ההמרה והיחס של אפימרים נקבעו באמצעות שילוב של HPLC בפאזה הפוכה. Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2 פפטידים 1-Ia ו-1-Ib, שנוצרו מהקסאפפטיד Ac-WMAAAC-NH2, הציגו זמני שמירה שונים ומשקלים מולקולריים זהים (איור 5B). לאחר מכן, הסבילות של הפפטיד המחזורי לקבוצות תפקודיות שונות נבדקה עוד יותר, כפי שניתן לראות באיור 5C. יעילות סגירת הלולאה של 10 הפפטידים הליניאריים הוערכה באמצעות מקשר די-הלוגני, כאשר התוצאות הראו כי כל הפפטידים יצרו ביעילות את הפפטידים המחזוריים המתאימים. בהשוואה לפפטידים המחזוריים האחרים, פפטיד מחזורי הקסציקלי מודל עם שיעורי המרה גבוהים הפיק יחס דיפרנציאלי של 1:1 של האפימרים וניתן היה להפריד אותו על ידי HPLC. עם זאת, במקרים מסוימים, לא ניתן היה להפריד את אפימרים פפטידים בתנאי HPLC, ככל הנראה בשל המרכז הכיראלי של הסולפוניום של האפימר שאינו יציב מאוד והופך לאט לאט לתערובות אפימר. יעילות התגובה של האפימרים (1-Ia) עם פירידינרתיולים (PyS) (10 mM) נבדקה לאחר מכן על ידי HPLC. איור 5D מראה את עקבות ה-HPLC של ההמרה תלוית הזמן בין הפפטיד המחזורי (1 mM) לבין המוצר המצומד שלו. העקבות מראים בבירור את ההפחתה תלוית הזמן של פפטיד 1-Ia עם PyS ב- PBS (pH 7.4).

אסטרטגיה נוספת לסגירת טבעות פפטידים הייתה, ראשית, שקבוצת פרופרגיל הוצמדה ל-Met, ואז מרכז הפרופרגיל סולפוניום שנוצר עורר תגובת תיול-ין ליצירת פפטיד מחזורי. באסטרטגיה זו, גודל הטבעת ורצף הפפטידים לא השפיעו על תגובת המחזוריות, כאשר הפפטיד הכיל שתיים או שלוש חומצות אמינו שימש רק כמודל לסגירת הלולאה. המסלול הסינתטי של מחזוריות פפטידים תוך-מולקולרית מתואר באיור 6A. בנוסף, נבנה פפטיד מודל Met מפושט כמתואר באיור 6B. התוצאות הראו כי התשואה של פפטיד המודל MC יכולה להיות עד 80% כאשר תמיסת התגובה pH הוגדרה ל-8.0 (MC מתייחס לפפטיד מחזורי מודל המסונתז על ידי מסלול זה; איור 6A). יתר על כן, פפטיד המודל MC בודד וטוהר על-ידי HPLC (איור 6D), ומשקלו המולקולרי אושר על-ידי LC-MS (איור 6C). כפי שניתן לראות באיור 6E, התזוזה הכימית התאפיינה עוד יותרב-1 H NMR ובקוהרנטיות קוונטית יחידה הטרו-גרעינית (HSQC). בנוסף, ה-dthiothreitol (DTT) נוסף כדי לנסות לפתוח את טבעת הסולפוניום כדי לחקור את היציבות של MC. התוצאות לא הראו תוספת או פתיחת טבעת לאחר 24 שעות (איור 6F).

Figure 1
איור 1: דיאגרמה של מערך הניסוי עבור פפטיד פאזה מוצקה מבוסס Fmoc לסינתזה של פפטידים. עמודת הפפטידים הונחה על כור הפאזה המוצקה באמצעות פקקי תלת-כיווניים עם חנקן או ארגון מבעבעים דרך העמודה במהלך סינתזת פפטידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פפטידי CM ליניאריים סינתטיים בין-מולקולריים על-שרף. כל הפפטידים הליניאריים סונתזו על שרף MBHA של Rink-amide על ידי סינתזה ידנית סטנדרטית של Fmoc בפאזה מוצקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מסלולים סינתטיים למחזוריות פפטידים באמצעות Cys ו-Met bisalkylation. הפפטידים הליניאריים המכילים את Met ו-Cys נבנו כפפטידים מחזוריים מיוצבים. ראשית, ה- Cys המוגן על ידי trt היה מוגן עם 3% TFA ב- DCM. לאחר מכן, נוספו קישור די-הלוגני (2 eq) ו-DIPEA (4 eq) כדי להגיב עם Cys במשך 3 שעות. לבסוף, המחזוריות בין Cys ל-Met הושלמה כאשר השרף נבקע בתמיסת ביקוע TFA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מסלולים סינתטיים למחזוריות פפטידים דרך Cys ו-Met thiol-yne. ראשית, הפפטידים הליניאריים טוהרו ואופיינו על ידי HPLC ו- LC-MS. התגובה התרחשה בתנאים הבאים: תמיסה הכוללת את התרכובת (0.2 mM, 1.0 eq) ב-0.2 מ"ל של MeCN/H2O (1:1, v/v), 1% תמיסה מימית HCOOH (בנפח), ופרופרגיל ברומיד (1.0 mM, 5.0 eq) עברה טלטלה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות ב-pH של 8.0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: סכמת סינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה בין Cys ל-Met. (A) איור סכמטי של מחזוריות פפטידים על ידי Cys ו- Met. (B) ספקטרום ה-HPLC וה-LC-MS של האפימרים (1-Ia ו-1-Ib). (C) נבדקה סבילות השאריות התפקודית של הפפטידים השונים. (D) עקבות HPLC של ההמרה תלוית הזמן בין אפימרים (1-Ia; 1 mM) לבין המוצרים המצומדים שלהם. נתון זה הוא שינוי של זה שדווח על ידי Wang et al.30. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: סכמת סינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות תגובה מסוג תיול-ין. (A) בנייה קלה של מחזוריות פפטידים על ידי תגובת תיול-ין. MC מתייחס למודל פפטיד מחזורי המסונתז על ידי המסלול. (B) מחזוריות פפטידים תוך-מולקולרית של פפטידים ליניאריים שונים. a = 1 מ"ל של 1 M (NH4)2CO3 תמיסה מימית. b = 1% Et3N ב-1 מ"ל של MeCN/H2O (1:1). קיצורים: Ahx = 6-חומצה אמינוקפרואית. התשואה חושבה כאחוז המוצר שנקבע על ידי שקילה. ההמרה ייצגה את כמות חומר המוצא שהגיב על ידי HPLC. (C) ספקטרום LC-MS של פפטיד מחזוריות MC. (D) ספקטרום ה-HPLC של פפטיד מחזוריות MC. (E)אפיון ספקטרום 1 H NMR ו-HSQC של הפפטידים המחזוריים MC. (F) ספקטרוםNMR של 1 H של ההמרה תלוית הזמן בין פפטיד מחזורי MC ל-DTT ב-D2O למשך 3 שעות, 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. נתון זה הוא שינוי של זה שדווח על ידי Hou et al.31. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגישה הסינתטית המתוארת במאמר זה מספקת שיטה לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות Cys ו-Met ברצף הפפטידים, שבו הפפטידים הליניאריים הבסיסיים בנויים על ידי טכניקות נפוצות של סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה. לצורך ביסלקילציה של פפטידים מחזוריים בין Cys ל-Met, ניתן לחלק את כל המסלול הסינתטי לשלושה תהליכים עיקריים: פירוק Cys על השרף, צימוד המקשר והמחזוריות בין Cys ל-Met בתמיסת ביקוע חומצה טריפלואורואצטית. יש לציין כי הסרת קבוצת ההגנה של Cys נמצאה כצעד קריטי לתגובת סגירת הטבעות שלאחר מכן. לכן, trt-Cys היה deprotected, וזה נעשה עד הפתרון לא היה צבע צהוב נראה. מחקרים נוספים הראו כי ניתן להרחיב את הפפטידים המחזוריים שפותחו על ידי הביסלקילציה בין המתודולוגיה Cys ו-Met לסגירת לולאה במגוון פפטידים, כאשר התנאי הוא שהפפטיד מכיל את חומצות האמינו Cys ו-Met. בנוסף, ניתן גם להתאים את רצף הפפטידים והמקשר בהתאם לתכנון הניסוי (איור 5). לכן היה צורך לפקח על הסינתזה על ידי LC-MS.

עבור פפטידים מחזוריים בתגובה מסוג thiol-yne, ראשית, פפטידים ליניאריים נבנו גם על ידי טכניקות סינתזה נפוצות של פפטידים בפאזה מוצקה על שרף, כאשר התגובות הבאות בוצעו בתמיסת הפאזה הנוזלית. פפטידים גולמיים נבקעו לאחר מכן מהשרף וטוהרו על ידי HPLC בפאזה הפוכה. תמיסה של פפטידים ופרופרגיל ברומיד נוספה לתגובה במשך 12 שעות, יחד עם 0.2 מ"ל של MeCN/H2O (1:1, v/v) ו-1% תמיסה מימית של HCOOH, והמוצרים טוהרו מיד על ידי HPLC בפאזה הפוכה. באופן מפתיע, תגובת סגירת הטבעת התרחשה כאשר ה- pH של תמיסת התגובה הוגדל ל -8.0. מחקר זה פיתח שיטה המגבילה את הפפטיד למבנה קונפורמציה מחזורי עם יציבות טובה באמצעות תגובה מסוג תיול-ין. יתר על כן, היה צורך להתאים את הממס לסגירת לולאת הפפטיד בשל ההידרופיליות וההידרופוביות של הפפטידים שונים. לדוגמה, ה-pH של הפפטיד ההידרופילי הותאם על ידי (NH4)2 CO 3, והפפטיד ההידרופובי הותאם לאחר מכן על ידי ממס מעורב (1% Et3 N תמיסת 50% MeCN/H 2O; איור 6).

בשנים האחרונות פותחו טכנולוגיות קשירה שונות לסינתזה של פפטידים מחזוריים, כאשר טכנולוגיות אלו מייצרות קשרים פפטידיים טבעיים וקשרי עמוד שדרה לא טבעיים32. עם זאת, עדיין נותרו אתגרים בתחום הפפטידים המחזוריים הסינתטיים. ראשית, לרצף חומצות האמינו של הפפטיד יש השפעה סטרית, ויעילות הציקליזציה עשויה להיות מושפעת מהשאריות הסמוכות לאתר הציקליזציה. שנית, המבנה המרחבי של פפטידים הוא מגוון, וייתכן שיהיה צורך לבחור בקפידה את אתר החיבור במהלך סגירת הטבעת באותו אתר. לבסוף, רצפי פפטידים מכילים חומצות אמינו הידרופיליות או הידרופוביות, ולכן יש לקחת בחשבון את המסיסות של ממס התגובה. לכן, יש להשקיע מאמץ רב יותר בזיהוי מחזוריות באתר, מסיסות ואיזומרים כדי להמשיך ולפתח יישומי פפטידים מחזוריים בתעשיית התרופות.

במחקר זה, סדרה של פרוטוקולי מקרו-ציקליזציה באמצעות ביסלקילציה בין Cys ל- Met או באמצעות תגובה מסוג thiol-yne תוכננו כדי לפתור את האתגרים של סינתזה של פפטידים מחזוריים. למרבה המזל, תגובות אלה היו קלות, יעילות מאוד ונטולות זרזים מתכתיים. השיטות שפותחו הוכחו כבעלות ביצועים בין-מולקולריים ותוך-מולקולריים ובעלות סובלנות קבוצתית תפקודית מספקת. יתר על כן, שיטות אלה פותחו כדי להציג מחזוריות אילוצים, להבטיח ששרשרת הפפטידים תייצב בצורה קונפורמית יותר, ובכך לשפר את זיקת קשירת חלבון המטרה ולהפחית את קשירת החלבון הלא ספציפי. בנוסף, על ידי שימוש בעיצובים סבירים, ניתן לשפר את הסלקטיביות של אתר התגובה גם על ידי יצירת פפטיד מחזורי מיוצב קונפורמציה. באופן כללי, מחזוריות שרשרת פפטידים יצרה תרכובות פעילות ביולוגית, מה שמצביע על כך שפפטידים מחזוריים הם מועמדים מבטיחים לתרופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מכירים בתמיכה כספית מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2021YFC2103900); מענקי הקרן למדעי הטבע של סין (21778009, ו-21977010); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2022A1515010996 ו- 2020A1515010521): ועדת החדשנות במדע וטכנולוגיה של שנזן, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455, ו- JCYJ20200109140406047); ומענק מכון שנזן-הונג קונג למדעי המוח-שנזן למוסדות מחקר בסיסיים (2019SHIBS0004). המחברים מכירים בתמיכת כתבי העת של מדעי הכימיה , החברה המלכותית לכימיה לעיון 30 וכתב העת לכימיה אורגנית, האגודה האמריקאית לכימיה, לעיון 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography		 SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Tags

כימיה גיליון 187 פפטידים מחזוריים ביסלקילציה/דילקילציה פרופרגיל ברומיד ייצוב ציסטאין מתיונין
בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,… More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter