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Chemistry

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3, 1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo presenta la sintesi di peptidi ciclici tramite bisalchilazione tra cisteina e metionina e la facile reazione tiolo-yne innescata dal centro del propargil sulfinfo.

Abstract

Negli ultimi anni, i peptidi ciclici hanno attirato una crescente attenzione nel campo della scoperta di farmaci grazie alle loro eccellenti attività biologiche e, di conseguenza, sono ora utilizzati clinicamente. È quindi fondamentale cercare strategie efficaci per sintetizzare peptidi ciclici per promuovere la loro applicazione nel campo della scoperta di farmaci. Questo articolo riporta un protocollo dettagliato per la sintesi efficiente di peptidi ciclici utilizzando bisalchilazione on-resina o intramolecolare (intermolecolare). Utilizzando questo protocollo, i peptidi lineari sono stati sintetizzati sfruttando la sintesi di peptidi in fase solida con cisteina (Cys) e metionina (Met) accoppiati simultaneamente sulla resina. Inoltre, i peptidi ciclici sono stati sintetizzati tramite bisalchilazione tra Met e Cys utilizzando un cavo sintonizzabile e un centro di solfonio on-tether. L'intero percorso sintetico può essere suddiviso in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l'accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell'acido trifluoroacetico (TFA). Inoltre, ispirato dalla reattività del centro del sulfonio, un gruppo propargilico è stato attaccato al Met per innescare l'aggiunta di tiolo-yne e formare un peptide ciclico. Successivamente, i peptidi grezzi sono stati essiccati e sciolti in acetonitrile, separati e quindi purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il peso molecolare del peptide ciclico è stato confermato dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e la stabilità della combinazione di peptidi ciclici con il riducente è stata ulteriormente confermata utilizzando HPLC. Inoltre, lo spostamento chimico nel peptide ciclico è stato analizzato da spettri di risonanza magnetica nucleare1 H (1H NMR). Nel complesso, questo protocollo mirava a stabilire una strategia efficace per sintetizzare peptidi ciclici.

Introduction

Le interazioni proteina-proteina (PPI)1 svolgono un ruolo fondamentale nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. La costruzione di peptidi stabilizzati con una conformazione fissa con mezzi chimici è uno dei metodi più importanti per lo sviluppo di motivi mimetici di PPI2. Ad oggi, diversi peptidi ciclici che prendono di mira i PPI sono stati sviluppati per uso clinico3. La maggior parte dei peptidi sono vincolati a una conformazione a α-elica per diminuire l'entropia conformazionale e migliorare la stabilità metabolica, l'affinità di legame del bersaglio e la permeabilità cellulare 4,5. Negli ultimi 2 decenni, le catene laterali di Cys 6,7, lisina8,9, triptofano 10, arginina 11 e Met12,13 sono state inserite in amminoacidi innaturali per fissare il peptide in una conformazione ciclica. Tali peptidi ciclici possono colpire uno spazio chimico unico o siti speciali, innescando così una reazione covalente per formare un legame covalente proteina-peptide14,15,16,17. In un recente rapporto di Yu et al., una cloroacetammide è stata ancorata al dominio dei ligandi peptidici, garantendo una reazione di coniugazione covalente con un'eccellente specificità proteica18. Inoltre, testate elettrofile, come l'acrilammide e il fluoruro di arilsulfonile (ArSO2F), sono state ulteriormente incorporate nei peptidi da Walensky et al.19 per formare inibitori covalenti peptidici stabilizzati e migliorare l'effetto antitumorale degli inibitori peptidici. Pertanto, è molto importante introdurre un ulteriore gruppo funzionale per modificare covalentemente i ligandi proteina-peptide20. Questi gruppi non solo reagiscono con le proteine sulla catena laterale, ma stabilizzano anche la struttura secondaria del peptide21. Tuttavia, l'applicazione di proteine modificate covalentemente indotta da ligandi peptidici è limitata a causa della complicata via sintetica e del legame non specifico dei gruppi chimici22,23. Sono quindi urgentemente necessarie strategie efficaci per la sintesi di peptidi ciclici.

Ispirato alle molteplici strategie dei peptidi ciclici 2,24,25,26, questo protocollo tenta di sviluppare un metodo semplice ed efficace per stabilizzare i peptidi. Inoltre, abbiamo notato che il gruppo della catena laterale di un peptide stabile potrebbe reagire covalentemente con una proteina bersaglio quando era spazialmente vicino ai ligandi peptidici. La mancanza di Met chimicamente modificato è stata colmata dal gruppo Deming nel 2013 sviluppando un nuovo metodo per produrre metionina27 peptidica selettivamente modificata. Sulla base di questo background, Shi et al. si sono concentrati sullo sviluppo della chiusura ad anello delle catene laterali per formare un centro di sali di sulfone. Quando il ligando peptidico si combina con la proteina bersaglio, il gruppo salino solfonico reagisce covalentemente con la proteina Cys spazialmente vicina. Negli ultimi anni, Shi et al. hanno progettato un nuovo metodo per stabilizzare il peptide ciclico28. Il sale di solfonio sul peptide ciclico è stato ridotto da un agente riducente con un gruppo sulfidrilico che è stato ridotto reversibilmente a Met. Tuttavia, la reazione ha avuto una bassa efficienza, che è stata dannosa per i successivi studi di applicazione biologica. Nel presente studio, è stata progettata una reazione di chiusura dell'anello Met-Cys e propargyl bromuro-Cys, con un singolo sale di solfonio che rimane sulla catena laterale del peptide ciclico. Il sale di solfonio agiva come una nuova testata che reagiva covalentemente con la proteina Cys nelle vicinanze spaziali. In breve, un peptide mutato Cys e Met è stato ciclizzato mediante alchilazione intramolecolare, con conseguente generazione di un centro di solfonio on-tether. In questo processo, la formazione di un ponte a catena laterale era fondamentale per i peptidi ciclici. Nel complesso, questo protocollo descrive una ciclizzazione dettagliata del peptide a base di solfonio che si ottiene utilizzando semplici condizioni e operazioni di reazione. L'obiettivo è quello di sviluppare un metodo potenziale per ulteriori applicazioni biologiche di ampia portata.

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Protocol

1. Preparazione dell'attrezzatura

ATTENZIONE: Morfolina, N, N-dimetilformammide (DMF), diclorometano (DCM), N, N-diisopropiletilammina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, etere etilico e metanolo sono tossici, volatili e corrosivi. Questi reagenti possono danneggiare il corpo umano attraverso l'inalazione, l'ingestione o il contatto con la pelle. Per tutti gli esperimenti chimici, utilizzare dispositivi di protezione, inclusi guanti monouso, cappotti sperimentali e occhiali protettivi.

  1. Costruire tutti i substrati peptidici sulla resina Rink-amide 4-metilbenzidrilammina (MBHA) mediante sintesi peptidica in fase solida (SPPS)29 manuale standard, come mostrato nella Figura 1.
  2. Utilizzare una delle due opzioni per la costruzione di peptidi lineari: uno, sintetizzare il peptide utilizzando l'agente condensante 2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU) e un reagente di DIPEA; o due, sintetizzare utilizzando 1-idrossibenzotriazolo (HOBT) e N,N'-diisopropilcarbodiimide (DIC) come reagente di condensazione ammidica. Selezionare un protocollo appropriato per la sintesi del peptide in base alla sequenza del peptide.
  3. Per stabilire un dispositivo manuale di sintesi peptidica, installare un'apparecchiatura di estrazione in fase solida sottovuoto modificata in una cappa aspirante e collegarla con un rubinetto a tre vie. Quindi, posizionare una cartuccia filtrante in polipropilene o un reattore di vetro sull'apparecchiatura mentre è collegata al gas di azoto (N2).
    NOTA: Per modificare l'apparecchiatura di estrazione in fase solida sotto vuoto, rimuovere il tubo di estrazione e mantenere il sistema sigillato sottovuoto.
  4. Caricare la resina MBHA nelle colonne riempite di resina e scioglierla in DMF. Regolare l'interruttore dei rubinetti di arresto a tre vie per il gorgogliamento di N2 , quindi rimuovere il solvente nella colonna utilizzando una pompa funzionante collegata a un sistema di vuoto. Calcolare la quantità di aminoacido o agente condensante necessaria utilizzando la seguente formula:
    Amminoacido (g) e agente condensante (g) = scaglie di resina (g) × capacità di carico della resina (mM/g) × equivalente (5 eq) × peso molecolare (g/M)
    NOTA: Scegliere la quantità di resina caricata in base alla lunghezza del peptide di accoppiamento. Più equivalenti (eq) di amminoacidi sono usati per reagire più pienamente. I solventi liquidi devono essere convertiti in volume in base alla densità. Il 5 eq mostra che la quantità di input del composto calcolato è amplificata di un fattore cinque.

2. Preparazione della resina

NOTA: Scegliere la quantità di resina caricata in base alla lunghezza del peptide di accoppiamento.

  1. Pesare 302 mg di resina MBHA Rink-ammide (0,331 mM/g caricati) in una colonna (serbatoio da 20 ml). Aggiungere 5-10 ml di DCM o DMF nella colonna per gonfiare la resina sotto N2 gorgogliando per 30 minuti.
  2. Quindi, chiudere l'interruttore N2 , quindi accendere l'interruttore di aspirazione della pompa per vuoto per rimuovere il solvente. Quindi, lavare le resine in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.

3. Deprotezione Fmoc N-terminale

NOTA: La deprotezione con morfolina richiede 30 minuti e la deprotezione con piperidina richiede 5 minuti.

  1. Preparare la soluzione di deprotezione N-terminale 9-fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc): preparare un volume sufficiente (500 ml) di piperidina al 20% (v/v) o al 50% (v/v) di morfolina in DMF in un contenitore di vetro per la deprotezione del gruppo Fmoc.
  2. Aggiungere 10 ml della soluzione di deprotezione alla colonna, bolla N2 nella soluzione per 30 minuti o 5 minuti 2x e ripetere le procedure di deprotezione 2x.
  3. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
  4. Rilevare la resina come soluzione di colore giallo scuro al 5% di ninidrina (test Kaiser) dopo ogni deprotezione per confermare l'assenza del gruppo Fmoc prima della fase di accoppiamento. In dettaglio, aggiungere 1 mL di DMF a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 μL di ninidrina al 5% in un tubo di vetro riscaldato a 130 °C per 3 minuti per valutare le variazioni del colore della resina.
  5. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.

4. Accoppiamento del peptide lineare (Figura 2)

NOTA: Quando le sequenze peptidiche sintetiche contengono due o più unità ripetute, la procedura di accoppiamento può essere eseguita direttamente selezionando il tipo di amminoacido, come Fmoc-AA-OH o Fmoc-AAA-OH e così via. Alcuni amminoacidi speciali con impedimento sterico e peptidi con sequenze aminoacidiche più lunghe sono necessari per estendere correttamente il tempo di reazione per l'accoppiamento.

  1. Per una singola fase di accoppiamento, prendere come esempio l'accoppiamento del residuo di Cys (sintetizzare scaglie di resina da 300 mg). Preparare una soluzione di miscela comprendente Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HATU (5 eq, 206 mg) o Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HOBT (5 eq, 106 mg) in un tubo di polipropilene e scioglierla in 3 mL di DMF.
  2. Aggiungere 173 μL di DIPEA (10 eq) o 154 μL di DIC (10 eq) alla soluzione di Cys per attivare l'amminoacido. Lasciare che la miscela si pre-attivi per 1 minuto. Aggiungere la miscela alla colonna con resina e bollire con N 2 per2 ore.
    NOTA: Il tempo di reazione specifico richiesto deve essere standardizzato per rilevare il 5% di ninidrina.
  3. Dopo l'accoppiamento, aggiungere 1 mL di DMF a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 μL di ninidrina al 5% in un tubo di vetro riscaldato a 130 °C per 3 minuti. Osservare la resina cambiare in incolore per confermare l'assenza di un gruppo amminico libero prima della fase di deprotezione.
  4. Scolare la soluzione utilizzando una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
  5. Aggiungere 10 ml della soluzione di deprotezione alla colonna, bollire con N2 per 30 minuti o 5 minuti 2x, aggiungere soluzione fresca e ripetere le procedure di deprotezione 2x.
  6. Ripetere i seguenti passaggi: deprotezione del gruppo Fmoc; rilevare la deprotezione della resina; lavare la resina; accoppiamento dell'amminoacido; rilevare la reazione di accoppiamento. Ripetere la fase di accoppiamento fino a quando tutti i peptidi sono sintetizzati.
    NOTA: Utilizzare il test Kaiser per monitorare se ogni fase della deprotezione è completa o se ogni fase dell'accoppiamento degli amminoacidi è completa. In alternativa, una piccola quantità di peptide può essere scissa dalla resina e controllata da LC-MS per un accoppiamento di successo.

5. Bisalchilazione tra Met e Cys (Figura 3)

  1. Costruire un peptide lineare con Met e Cys ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con N2 per l'uso successivo (ripetere 2x) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.
  2. Pesare 100 mg della resina ottenuta nella fase precedente in una colonna (serbatoio da 20 ml) e lavare la resina con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) prima della fase di accoppiamento.
  3. Preparare una soluzione per rimuovere il gruppo protezione Cys trt(tritile). Preparare un volume sufficiente (100 ml) di miscela TFA/TIS/DCM (3:5:92) in un contenitore di vetro per rimuovere il gruppo protectiove.
  4. Aggiungere 5-10 mL della soluzione di TFA/TIS/DCM (3:5:92) alla colonna per rimuovere il gruppo di protezione per 10 minuti. Ripeti sei volte con N2 gorgogliando fino a quando il colore giallo scompare completamente.
  5. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
  6. Preparare una soluzione per reagire con Cys non protetto. Preparare un volume sufficiente (50 ml) di soluzione di miscela (DMF) compreso il linker dialogenato (2 eq) e DIPEA (4 eq) per reagire con Cys deprotetto.
  7. Aggiungere 5-10 mL della soluzione di reazione alla colonna per reagire con Cys deprotetto per almeno 3 ore con gorgogliamento di N2 . Disidratare con metanolo anidro e asciugare con N2 per l'uso successivo.
  8. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
  9. Preparare una soluzione per la ciclizzazione dei peptidi: preparare un volume sufficiente (20 ml) di miscela TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:2.5) in un contenitore di vetro nella cappa aspirante per la ciclizzazione dei peptidi.
  10. Aggiungere 5-10 ml della soluzione di miscela TFA al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail TFA per 3 ore.
    ATTENZIONE: il TFA è altamente corrosivo e irritante; Il processo di scissione del peptide deve essere eseguito in una cappa aspirante.
  11. Eseguire i passaggi 7.1-7.5 per ottenere una soluzione peptidica lineare mediante purificazione in fase liquida in fase inversa (HPLC). Liofilizzare la soluzione per il prossimo utilizzo.

6. Ciclizzazione del sale di propargil solfonio (Figura 4)

  1. Costruire un peptide lineare con Met e Cys ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con la resina per disidratare e asciugare con N2 per l'uso successivo (ripetere due volte) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.
  2. Pesare 100 mg della resina ottenuta nella fase precedente in una colonna (serbatoio da 20 ml) e lavare la resina con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) prima della fase di accoppiamento.
  3. Eseguire i passaggi 7.1-7.5 per ottenere una soluzione peptidica lineare mediante HPLC e liofilizzare il campione, come detto, per il prossimo utilizzo.
  4. Preparare una soluzione acquosa HCOOH all'1% (in volume) e 1,0 mM di bromuro di propargile (5 eq) e aggiungere alla soluzione peptidica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 mL di MeCN/H2O [1:1, v/v]).
  5. Quindi, agitare la reazione di accoppiamento di Met e propargil bromuro a temperatura ambiente per 12 ore.
  6. Dopo la reazione, sciogliere il prodotto in un tubo di polipropilene in acetonitrile e filtrarlo attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.
  7. Nell'ultima fase, aggiungere il peptide con bromuro di propargil in un tubo di polipropilene, mantenere il pH della soluzione di reazione a 8,0 aggiungendo la soluzione di (NH4)2CO3 e agitare la miscela di reazione a 37 °C per 12 ore. Questo passaggio ottiene il peptide ciclico del sale propargil sulfinfo.
  8. Raccogliere l'ultima miscela di reazione: scioglierla in un tubo di polipropilene in acetonitrile e filtrarla attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.

7. Purificazione dei peptidi ciclici

  1. Costruire substrati peptidici lineari su resina MBHA Rink-ammide ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con N2 per l'uso successivo (ripetere due volte) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.
  2. Preparare un volume sufficiente di cocktail di scissione (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) nella cappa aspirante. Aggiungere 1-5 ml di soluzione di miscela TFA al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail TFA per 3 ore.
  3. Quindi, asciugare sequenzialmente la resina sotto un vapore di N2 nella colonna. In alternativa, utilizzare un dispositivo filtrante per filtrare la resina e raccogliere la soluzione peptidica. Quindi, aggiungere 20 ml di etere alla soluzione peptidica per precipitare il peptide, centrifugare a 3.500 x g per 5 minuti e ripetere due volte. Raccogliere il precipitato peptidico grezzo e asciugarlo sotto un flusso di N2 per il passaggio successivo.
  4. Sciogliere 200 mg di peptide grezzo in un tubo di polipropilene in 4 ml di soluzione acetonitrile-acqua e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm. Trasferire il peptide in un inserto di flaconcino HPLC. Inserire l'inserto nell'autocampionatore di un sistema HPLC semi-preparativo a fase inversa dotato di una colonna C18 da 5 μm, 4,6 mm x 250 mm e un circuito di iniezione da 1 ml.
  5. Purificare e isolare il peptide utilizzando un programma gradiente del 5% -95% di acetonitrile in acqua con 0,1% di TFA per 30 minuti mentre si monitorano gli spettri HPLC utilizzando UV a 254 nm. Confermare il peso molecolare del peptide mediante LC-MS, raccogliere la soluzione del peptide e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.

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Representative Results

Tutti i peptidi lineari sono stati sintetizzati su resina Rink-amide MBHA mediante sintesi manuale standard Fmoc in fase solida. Un esapeptide ciclico modello (Ac (ciclo-I)-WMAAAC-NH2) è stato costruito come descritto nella Figura 5A. In particolare, un nuovo centro chirale on-tether è stato generato dall'alchilazione di Met, con i due epimeri del peptide ciclico (Ia, Ib) confermati dall'HPLC in fase inversa. Inoltre, la conversione e il rapporto degli epimeri sono stati determinati utilizzando l'integrazione di HPLC in fase inversa. I peptidi ciclici Ac-(ciclo-I)-WMAAAC-NH2 1-Ia e 1-Ib, generati dall'esapeptide Ac-WMAAAC-NH2, hanno mostrato tempi di ritenzione distinti e pesi molecolari identici (Figura 5B). Successivamente, la tolleranza del peptide ciclico a diversi gruppi funzionali è stata ulteriormente testata, come mostrato nella Figura 5C. L'efficienza di chiusura del circuito dei 10 peptidi lineari è stata valutata utilizzando un linker dialogenato, con i risultati che mostrano che tutti i peptidi hanno generato in modo efficiente i corrispondenti peptidi ciclici. Rispetto agli altri peptidi ciclici, un peptide ciclico esaciclico modello con alti tassi di conversione ha prodotto un rapporto differenziale di 1: 1 degli epimeri e potrebbe essere separato mediante HPLC. Tuttavia, in alcuni casi, gli epimeri peptidici non potevano essere separati in condizioni HPLC, probabilmente a causa del fatto che il centro chirale del solfonio dell'epimero non era molto stabile e veniva lentamente racemizzato in miscele epimeriche. L'efficienza di reazione degli epimeri (1-Ia) con piridinrtioli (PyS) (10 mM) è stata quindi esaminata mediante HPLC. La figura 5D mostra le tracce HPLC della conversione dipendente dal tempo tra il peptide ciclico (1 mM) e il suo prodotto coniugato. Le tracce mostrano chiaramente la riduzione dipendente dal tempo del peptide 1-Ia con PyS in PBS (pH 7.4).

Un'altra strategia per la chiusura dell'anello peptidico era che, in primo luogo, un gruppo propargilico era attaccato a Met, e poi il centro formato propargil sulfonio innescava una reazione tiolo-yne per generare un peptide ciclico. In questa strategia, la dimensione dell'anello e la sequenza peptidica non hanno influenzato la reazione di ciclizzazione, con il peptide contenente due o tre amminoacidi utilizzati solo come modello per chiudere il ciclo. La via sintetica della ciclizzazione intramolecolare dei peptidi è descritta nella Figura 6A. Inoltre, è stato costruito un peptide modello Met propargilata semplificato come descritto nella Figura 6B. I risultati hanno mostrato che la resa del peptide modello MC potrebbe essere fino all'80% quando il pH della soluzione di reazione è stato impostato su 8,0 (MC si riferisce a un peptide ciclico modello sintetizzato per questa via; Figura 6A). Inoltre, il peptide modello MC è stato isolato e purificato mediante HPLC (Figura 6D), e il suo peso molecolare è stato confermato da LC-MS (Figura 6C). Come mostrato nella Figura 6E, lo spostamento chimico è stato ulteriormente caratterizzato da 1H NMR e coerenza quantistica singola eteronucleare (HSQC). Inoltre, il ditiotreitolo (DTT) è stato aggiunto per tentare di aprire l'anello solfonico per esplorare la stabilità di MC. I risultati non hanno mostrato prodotti di aggiunta o apertura dell'anello dopo 24 ore (Figura 6F).

Figure 1
Figura 1: Diagramma della configurazione sperimentale per un peptide in fase solida basato su Fmoc per la sintesi di peptidi. La colonna peptidica è stata posizionata sul reattore in fase solida tramite rubinetti di arresto a tre vie con azoto o argon che gorgogliavano attraverso la colonna durante la sintesi peptidica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Peptidi CM lineari sintetici intermolecolari su resina. Tutti i peptidi lineari sono stati sintetizzati su resina Rink-amide MBHA mediante sintesi manuale standard Fmoc in fase solida. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Vie sintetiche per la ciclizzazione dei peptidi tramite bisalchilazione Cys e Met. I peptidi lineari contenenti Met e Cys sono stati costruiti come peptidi ciclici stabilizzati. In primo luogo, il Cys protetto da trt è stato deprotetto con il 3% di TFA in DCM. Quindi, sono stati aggiunti un linker dialogenato (2 eq) e DIPEA (4 eq) per reagire con Cys per 3 ore. Infine, la ciclizzazione tra Cys e Met è stata completata quando la resina è stata scissa in una soluzione di scissione TFA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Vie sintetiche per la ciclizzazione dei peptidi tramite Cys e Met thiol-yne. In primo luogo, i peptidi lineari sono stati purificati e caratterizzati da HPLC e LC-MS. La reazione si è verificata nelle seguenti condizioni: una soluzione comprendente il composto (0,2 mM, 1,0 eq) in 0,2 mL di MeCN/H2O (1:1, v/v), soluzione acquosa HCOOH all'1% (in volume) e bromuro di propargil (1,0 mM, 5,0 eq) è stata agitata a temperatura ambiente per 12 ore ad un pH di 8,0. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Schema di sintesi di peptidi ciclici mediante bisalchilazione tra Cys e Met. (A) Illustrazione schematica della ciclizzazione peptidica mediante Cys e Met. (B) Lo spettro HPLC e LC-MS degli epimeri (1-Ia e 1-Ib). (C) È stata testata la tolleranza funzionale ai residui dei diversi peptidi. (D) tracce HPLC della conversione dipendente dal tempo tra epimeri (1-Ia; 1 mM) e i loro prodotti coniugati. Questa cifra è una modifica di quella riportata da Wang et al.30. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Schema di sintesi di peptidi ciclici utilizzando una reazione di tipo tiolo-innico. (A) Facile costruzione della ciclizzazione peptidica mediante la reazione tiolo-inca. MC si riferisce a un peptide ciclico modello sintetizzato per la via. (B) Ciclizzazione intramolecolare di diversi peptidi lineari. a = 1 mL di soluzione acquosa di 1 M (NH4)2CO3. b = 1% et3N in 1 mL di MeCN/H2O (1:1). Abbreviazioni: Ahx = acido 6-aminocaproico. La resa è stata calcolata come percentuale del prodotto determinata mediante pesatura. La conversione rappresentava la quantità di materiale di partenza che reagiva con HPLC. (C) Lo spettro LC-MS del peptide di ciclizzazione MC. (D) Lo spettro HPLC del peptide di ciclizzazione MC. (E) Caratterizzazione degli spettri NMR eHSQC 1 H dei peptidi ciclici MC. (F) Spettri NMR 1H della conversione dipendente dal tempo tra peptide ciclico MC e DTT in D2O per 3 ore, 6 ore, 12 ore e 24 ore. Questa cifra è una modifica di quella riportata da Hou et al.31. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

L'approccio sintetico descritto in questo articolo fornisce un metodo per sintetizzare peptidi ciclici utilizzando Cys e Met nella sequenza peptidica, in cui i peptidi lineari di base sono costruiti con tecniche comuni di sintesi peptidica in fase solida. Per la bisalchilazione di peptidi ciclici tra Cys e Met, l'intera via sintetica può essere suddivisa in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l'accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell'acido trifluoroacetico. In particolare, la rimozione del gruppo protettivo di Cys è risultata essere un passo critico per la successiva reazione di chiusura dell'anello. Pertanto, trt-Cys è stato deprotetto, e questo è stato fatto fino a quando la soluzione non ha avuto un colore giallo apparente. Ulteriori studi hanno dimostrato che i peptidi ciclici sviluppati dalla bisalchilazione tra la metodologia Cys e Met potrebbero essere estesi alla chiusura del ciclo in una varietà di peptidi, con la condizione che il peptide contenga gli amminoacidi Cys e Met. Inoltre, la sequenza peptidica e il linker potrebbero anche essere ulteriormente regolati in base al disegno sperimentale (Figura 5). È stato quindi necessario monitorare la sintesi mediante LC-MS.

Per i peptidi ciclici nella reazione di tipo tiolo-inne, in primo luogo, i peptidi lineari sono stati costruiti anche con tecniche comuni di sintesi peptidica in fase solida su resina, con le seguenti reazioni effettuate nella soluzione in fase liquida. I peptidi grezzi sono stati quindi scissi dalla resina e purificati mediante HPLC in fase inversa. Una soluzione di peptidi e bromuro di propargil è stata aggiunta alla reazione per 12 ore, insieme a 0,2 ml di MeCN / H2O (1: 1, v / v) e soluzione acquosa HCOOH all'1%, e i prodotti sono stati quindi purificati immediatamente mediante HPLC in fase inversa. Sorprendentemente, la reazione di chiusura dell'anello si è verificata quando il pH della soluzione di reazione è stato aumentato a 8,0. Questo studio ha sviluppato un metodo che vincola il peptide a una struttura di conformazione ciclica con una buona stabilità attraverso una reazione di tipo tiolo-inne. Inoltre, è stato necessario regolare il solvente per la chiusura dell'ansa peptidica a causa dell'idrofilia e dell'idrofobicità dei peptidi diversi. Ad esempio, il pH del peptide idrofilo è stato regolato da (NH4)2 CO 3, e il peptide idrofobo è stato poi regolato da un solvente misto (soluzione 1% Et3N in 50% MeCN/H 2O; Figura 6).

Negli ultimi anni, sono state sviluppate varie tecnologie di legatura per sintetizzare peptidi ciclici, con queste tecnologie che generano legami peptidici naturali e legami dorsali innaturali32. Tuttavia, le sfide rimangono nel campo dei peptidi ciclici sintetici. In primo luogo, la sequenza aminoacidica del peptide ha un effetto sterico e l'efficienza della ciclizzazione può essere influenzata dai residui vicini al sito di ciclizzazione. In secondo luogo, la struttura spaziale dei peptidi è diversa e potrebbe essere necessario scegliere attentamente il sito di connessione durante la chiusura dell'anello nello stesso sito. Infine, le sequenze peptidiche contengono amminoacidi idrofili o idrofobici e, pertanto, è necessario considerare la solubilità del solvente di reazione. Pertanto, è necessario compiere maggiori sforzi per identificare la ciclizzazione nel sito, la solubilità e gli isomeri per sviluppare ulteriormente le applicazioni dei peptidi ciclici nell'industria farmaceutica.

In questa ricerca, una serie di facili protocolli di macrociclizzazione che utilizzano la bisalchilazione tra Cys e Met o tramite una reazione di tipo tiolo-yne sono stati progettati per risolvere le sfide della sintesi di peptidi ciclici. Fortunatamente, queste reazioni sono state facili, altamente efficienti e prive di catalizzatori metallici. I metodi sviluppati hanno dimostrato di funzionare sia intermolecolarmente che intramolecolarmente e di avere una soddisfacente tolleranza funzionale di gruppo. Inoltre, questi metodi sono stati sviluppati per introdurre la ciclizzazione a vincolo, assicurando che la catena peptidica sia più stabilizzata conformazionale, migliorando così l'affinità di legame delle proteine bersaglio e riducendo il legame proteico non specifico. Inoltre, utilizzando disegni ragionevoli, la selettività del sito di reazione potrebbe anche essere migliorata formando un peptide di ciclizzazione stabilizzato conformazionale. Nel complesso, la ciclizzazione della catena peptidica ha generato composti biologicamente attivi, indicando che i peptidi ciclici sono candidati farmaci promettenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Riconosciamo il sostegno finanziario del National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); le sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (21778009 e 21977010); la Fondazione per le scienze naturali della provincia del Guangdong (2022A1515010996 e 2020A1515010521): il Comitato per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 e JCYJ20200109140406047); e la sovvenzione Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Gli autori riconoscono il supporto della rivista Chemical Science , The Royal Society of Chemistry per il riferimento 30 e The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, per il riferimento 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography		 SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

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References

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Chimica Numero 187 Peptidi ciclici bisalchilazione/dealchilazione bromuro di propargile stabilizzazione cisteina metionina
Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether
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Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,… More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

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