Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Konstruere sykliske peptider ved hjelp av et on-tether sulfoniumsenter

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen presenterer syntesen av sykliske peptider via bisalkylering mellom cystein og metionin og den lettvinte tiol-yne-reaksjonen utløst av propargylsulfoniumsenteret.

Abstract

I de senere år har sykliske peptider tiltrukket seg økende oppmerksomhet innen narkotikaforskning på grunn av deres gode biologiske aktiviteter, og som en konsekvens blir de nå brukt klinisk. Det er derfor viktig å søke effektive strategier for å syntetisere sykliske peptider for å fremme deres anvendelse innen narkotikaforskning. Dette papiret rapporterer en detaljert protokoll for effektiv syntese av sykliske peptider ved bruk av on-harpiks eller intramolekylær (intermolekylær) bisalkylering. Ved hjelp av denne protokollen ble lineære peptider syntetisert ved å dra nytte av fastfase peptidsyntese med cystein (Cys) og metionin (Met) koblet samtidig på harpiksen. Videre ble sykliske peptider syntetisert via bisalkylering mellom Met og Cys ved hjelp av en tunable tether og et on-tether sulfoniumsenter. Hele den syntetiske ruten kan deles inn i tre hovedprosesser: debeskyttelse av Cys på harpiksen, koblingen av linkeren og sykliseringen mellom Cys og Met i en trifluoreddiksyre (TFA) spaltningsløsning. Videre, inspirert av reaktiviteten til sulfoniumsenteret, ble en propargylgruppe festet til Met for å utløse tiol-yne-tilsetning og danne et syklisk peptid. Deretter ble råpeptidene tørket og oppløst i acetonitril, separert og deretter renset ved høyytelses væskekromatografi (HPLC). Molekylvekten til det sykliske peptidet ble bekreftet ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), og stabiliteten til den sykliske peptidkombinasjonen med reduktanten ble videre bekreftet ved bruk av HPLC. I tillegg ble det kjemiske skiftet i det sykliske peptidet analysert ved 1H kjernemagnetisk resonans (1H NMR) spektra. Samlet sett hadde denne protokollen som mål å etablere en effektiv strategi for syntetisering av sykliske peptider.

Introduction

Protein-protein-interaksjoner (PPI)1 spiller en sentral rolle i forskning og utvikling av legemidler. Å konstruere stabiliserte peptider med fast konformasjon ved kjemiske midler er en av de viktigste metodene for å utvikle mimetiske motiver av PPI2. Til dags dato har flere sykliske peptider som retter seg mot PPI blitt utviklet for klinisk bruk3. De fleste peptider er begrenset til en α-helix-konformasjon for å redusere konformasjonsentropien og forbedre metabolsk stabilitet, målbindende affinitet og cellepermeabilitet 4,5. I løpet av de siste 2 tiårene har sidekjedene til Cys6,7, lysin8,9, tryptofan 10, arginin11 og Met 12,13 blitt satt inn i unaturlige aminosyrer for å fikse peptidet i en syklisk konformasjon. Slike sykliske peptider kan målrette mot et unikt kjemisk rom eller spesielle steder, og derved utløse en kovalent reaksjon for å danne protein-peptid kovalent binding14,15,16,17. I en nylig rapport fra Yu et al., ble et kloracetamid forankret på domenet til peptidligander, noe som sikrer en kovalent konjugeringsreaksjon med utmerket proteinspesifisitet18. Videre ble elektrofile stridshoder, som akrylamid og arylsulfonylfluorid (ArSO2F), videre innlemmet i peptider av Walensky et al.19 for å danne stabiliserte peptidkovalente hemmere og forbedre antitumoreffekten av peptidhemmere. Derfor er det svært viktig å introdusere en ekstra funksjonell gruppe for å kovalent modifisere protein-peptidligander20. Disse gruppene reagerer ikke bare med proteiner på sidekjeden, men stabiliserer også den sekundære strukturen til peptidet21. Imidlertid er anvendelsen av kovalent modifiserte proteiner indusert av peptidligander begrenset på grunn av den kompliserte syntetiske ruten og den ikke-spesifikke bindingen av de kjemiske gruppene22,23. Effektive strategier for syntese av sykliske peptider er derfor presserende nødvendig.

Inspirert av de mangfoldige strategiene til sykliske peptider 2,24,25,26, forsøker denne protokollen å utvikle en enkel og effektiv metode for stabilisering av peptider. I tillegg bemerket vi at sidekjedegruppen til et stabilt peptid kunne reagere kovalent med et målprotein når det var romlig nær peptidligandene. Mangelen på kjemisk modifisert Met ble fylt av Deming-gruppen i 2013 ved å utvikle en ny metode for å produsere selektivt modifisert peptidmetionin27. Basert på denne bakgrunnen fokuserte Shi og medarbeidere på utviklingen av ringlukkingen av sidekjeder for å danne et sulfoniumsaltsenter. Når peptidliganden kombineres med målproteinet, reagerer sulfoniumsaltgruppen kovalent med det romlig nære Cys-proteinet. Shi og medarbeidere har de siste årene utviklet en ny metode for stabilisering av syklisk peptid28. Sulfoniumsaltet på det sykliske peptidet ble redusert med et reduksjonsmiddel med en sulfhydrylgruppe som reversibelt ble redusert til Met. Reaksjonen hadde imidlertid lav effektivitet, noe som var skadelig for påfølgende biologiske applikasjonsstudier. I den nåværende studien ble en Met-Cys og propargylbromid-Cys ringlukkingsreaksjon designet, med et enkelt sulfoniumsalt igjen på sidekjeden til det sykliske peptidet. Sulfoniumsaltet fungerte som et nytt stridshode som reagerte kovalent med proteinet Cys under romlig nærhet. Kort fortalt ble et Cys og Met-mutert peptid syklisert ved intramolekylær alkylering, noe som resulterte i generering av et on-tether sulfoniumsenter. I denne prosessen var dannelsen av en sidekjedebro kritisk for sykliske peptider. Samlet sett beskriver denne protokollen en detaljert sulfoniumbasert peptidsyklisering som oppnås ved bruk av enkle reaksjonsforhold og operasjoner. Målet er å utvikle en mulig metode for videre brede biologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av utstyr

FORSIKTIG: Morfolin, N,N-dimetylformamid (DMF), diklormetan (DCM), N,N-diisopropyletylamin (DIPEA), TFA, morfolin, piperidin, dietyleter og metanol er giftige, flyktige og etsende. Disse reagensene kan skade menneskekroppen ved innånding, inntak eller hudkontakt. For alle kjemiske eksperimenter, bruk verneutstyr, inkludert engangshansker, eksperimentelle strøk og vernebriller.

  1. Konstruer alle peptidsubstrater på Rink-amid 4-metylbenzhydrylamin (MBHA) harpiks ved standard manuell Fmoc-basert fastfase peptidsyntese (SPPS) 29, som vist i figur 1.
  2. Bruk ett av de to alternativene for å konstruere lineære peptider: en, syntetisere peptidet ved bruk av kondenseringsmiddel 2- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HATU) og et reagens av DIPEA; eller to, syntetisere ved bruk av 1-hydroksybenzotriazol (HOBT) og N,N'-diisopropylkarbodimid (DIC) som amidkondensasjonsreagens. Velg en passende protokoll for peptidsyntese i henhold til peptidets sekvens.
  3. For å etablere en manuell peptidsynteseanordning, sett opp modifisert vakuum fastfaseekstraksjonsutstyr i en avtrekkshette og koble den til en treveis stoppekran. Deretter plasserer du en polypropylenfilterpatron eller glassreaktor på utstyret mens den er koblet til nitrogen (N2) gass.
    MERK: For å modifisere det vakuumfaste faseekstraksjonsutstyret, fjern ekstraksjonsrøret og behold det vakuumforseglede systemet.
  4. Legg MBHA-harpiksen i de harpiksfylte kolonnene og oppløs den i DMF. Juster bryteren til de treveis stoppekranene for N2 boblende, og fjern deretter løsningsmidlet i kolonnen ved hjelp av en arbeidspumpe koblet til et vakuumsystem. Beregn mengden aminosyre eller kondenseringsmiddel som kreves ved å bruke følgende formel:
    Aminosyre (g) og kondenseringsmiddel (g) = harpiksskala (g) × harpiks lastekapasitet (mM/g) × ekvivalent (5 eq) × molekylvekt (g/M)
    MERK: Velg mengden lastet harpiks i henhold til lengden på koblingspeptidet. Flere ekvivalenter (eq) av aminosyrer brukes til å reagere mer fullstendig. Flytende løsningsmidler må omdannes til volum etter tetthet. 5 eq viser at inngangsmengden til den beregnede forbindelsen forsterkes med en faktor på fem.

2. Harpiks forberedelse

MERK: Velg mengden lastet harpiks i henhold til lengden på koblingspeptidet.

  1. Vei 302 mg Rink-amid MBHA-harpiks (0,331 mM/g lastet) i en kolonne (20 ml reservoar). Tilsett 5-10 ml DCM eller DMF i kolonnen for å hovne harpiksen under N2 boblende i 30 min.
  2. Deretter lukker du N2-bryteren , og slår deretter på sugebryteren for vakuumpumpen for å fjerne løsningsmidlet. Vask deretter harpiksen sekvensielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.

3. N-terminal Fmoc debeskyttelse

MERK: Debeskyttelse med morfolin krever 30 min, og debeskyttelse med piperidin tar 5 min.

  1. Klargjør den N-terminale 9-fluorenylmetyloksykarbonyl(Fmoc) debeskyttelsesløsningen: Klargjør et tilstrekkelig volum (500 ml) på 20 % (v/v) piperidin eller 50 % (v/v) morfolin i DMF i en glassbeholder for beskyttelse av Fmoc-gruppen.
  2. Tilsett 10 ml av debeskyttelsesløsningen i kolonnen, boble N2 inn i løsningen i 30 minutter eller 5 min 2x, og gjenta debeskyttelsesprosedyrene 2x.
  3. Tøm løsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekvensielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  4. Oppdag harpiksen som en mørk gul fargeløsning med 5% ninhydrin (Kaiser-test) etter hver debeskyttelse for å bekrefte fraværet av Fmoc-gruppen før koblingstrinnet. I detalj tilsett 1 ml DMF til en liten mengde harpiks og tilsett 200 μL 5% ninhydrin til et glassrør oppvarmet ved 130 ° C i 3 minutter for å vurdere endringer i harpiksfargen.
  5. Tøm løsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekvensielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.

4. Koble det lineære peptidet (figur 2)

MERK: Når de syntetiske peptidsekvensene inneholder to eller flere repeterende enheter, kan koblingsprosedyren utføres direkte ved å velge aminosyretype, for eksempel Fmoc-AA-OH eller Fmoc-AAA-OH, og så videre. Noen spesielle aminosyrer med sterisk hindring og peptider med lengre aminosyresekvenser er nødvendige for å forlenge reaksjonstiden for kobling riktig.

  1. For et enkelt koblingstrinn, ta koblingen av Cys-rester som et eksempel (syntetisere 300 mg harpiksskalaer). Klargjør en blandingsløsning inkludert Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) og HATU (5 eq, 206 mg) eller Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) og HOBT (5 eq, 106 mg) i et polypropylenrør og oppløs den i 3 ml DMF.
  2. Tilsett 173 μL DIPEA (10 eq) eller 154 μL DIC (10 eq) til løsningen av Cys for å aktivere aminosyren. La blandingen forhåndsaktiveres i 1 min. Tilsett blandingen i kolonnen med harpiks, og boble den med N 2 i2 timer.
    MERK: Den spesifikke reaksjonstiden som kreves, bør standardiseres for å oppdage 5% ninhydrin.
  3. Etter kobling tilsettes 1 ml DMF til en liten mengde harpiks og tilsett 200 μL 5% ninhydrin til et glassrør oppvarmet ved 130 °C i 3 minutter. Vær oppmerksom på harpiksendringen til fargeløs for å bekrefte fraværet av en fri aminogruppe før debeskyttelsestrinnet.
  4. Tøm løsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekvensielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  5. Tilsett 10 ml av debeskyttelsesløsningen i kolonnen, boble med N2 i 30 minutter eller 5 min 2x, tilsett ny løsning og gjenta debeskyttelsesprosedyrene 2x.
  6. Gjenta følgende trinn: debeskyttelse av Fmoc-gruppen; oppdage harpiksbeskyttelse; vaske harpiksen; kobling av aminosyren; oppdage koblingsreaksjonen. Gjenta koblingstrinnet til alle peptidene er syntetisert.
    MERK: Bruk Kaiser-testen for å overvåke om hvert trinn med debeskyttelse er fullført eller om hvert trinn i aminosyrekoblingen er grundig. Alternativt kan en liten mengde peptid spaltes fra harpiksen og kontrolleres av LC-MS for vellykket kobling.

5. Bisalkylering mellom Met og Cys (figur 3)

  1. Konstruer et lineært peptid med Met og Cys ved å gjenta trinn 4.1-4.6. Tilsett 10 ml vannfri metanol til kolonnen med harpiks for dehydrering og tørk med N2 til neste bruk (gjenta 2x) etter lineær peptidkobling.
  2. Vei 100 mg av harpiksen oppnådd i forrige trinn i en kolonne (20 ml reservoar) og vask harpiksen med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) før koblingstrinnet.
  3. Forbered en løsning for fjerning av Cys trt (trityl) beskyttelsesgruppe. Forbered et tilstrekkelig volum (100 ml) av TFA / TIS / DCM (3:5:92) blanding i en glassbeholder for å fjerne protectiove-gruppen.
  4. Tilsett 5-10 ml av oppløsningen av TFA/TIS/DCM (3:5:92) i kolonnen for å fjerne beskyttelsesgruppen i 10 minutter. Gjenta seks ganger med N2 boblende til den gule fargen helt forsvinner.
  5. Tøm løsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekvensielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  6. Forbered en løsning for å reagere med debeskyttet Cys. Klargjør et tilstrekkelig volum (50 ml) blandingsoppløsning (DMF) inkludert di-halogenert linker (2 eq) og DIPEA (4 eq) for å reagere med debeskyttet Cys.
  7. Tilsett 5-10 ml av reaksjonsoppløsningen til kolonnen for å reagere med debeskyttet Cys i minst 3 timer med N2 boblende. Dehydrer med vannfri metanol og tørk med N2 til neste bruk.
  8. Tøm løsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekvensielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  9. Forbered en løsning for peptidsyklisering: Fremstill et tilstrekkelig volum (20 ml) TFA-blanding (TFA: TIS: H 2 O = 95: 2, 5:2, 5) i en glassbeholder i avtrekkshetten for peptidcyklisering.
  10. Tilsett 5-10 ml av TFA-blandingsløsningen til polypropylenrøret og spalt harpiksen under TFA-cocktailen i 3 timer.
    FORSIKTIG: TFA er svært etsende og irriterende; Peptidspaltningsprosessen skal utføres i en avtrekkshette.
  11. Utfør trinn 7.1-7.5 for å oppnå en lineær peptidløsning ved omvendt fase væskefaserensing (HPLC). Frysetørk løsningen til neste bruk.

6. Propargylsulfoniumsaltsyklisering (figur 4)

  1. Konstruer et lineært peptid med Met og Cys ved å gjenta trinn 4.1-4.6. Tilsett 10 ml vannfri metanol til kolonnen med harpiksen for dehydrering og tørk med N2 til neste bruk (gjenta to ganger) etter lineær peptidkobling.
  2. Vei 100 mg av harpiksen oppnådd i forrige trinn i en kolonne (20 ml reservoar) og vask harpiksen med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) før koblingstrinnet.
  3. Utfør trinn 7.1-7.5 for å oppnå en lineær peptidløsning ved HPLC, og frysetørk prøven, som nevnt, for neste bruk.
  4. Forbered en 1% HCOOH vandig løsning (i volum) og 1,0 mM propargylbromid (5 eq) og tilsett Met-peptidoppløsningen (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml MeCN / H2O [1: 1, v / v]).
  5. Rist deretter koblingsreaksjonen til Met og propargylbromid ved romtemperatur i 12 timer.
  6. Etter reaksjonen oppløses produktet i et polypropylenrør i acetonitril og filtrerer det gjennom en 0,22 μmfiltermembran. Rens deretter løsningen med omvendt fase HPLC umiddelbart og frysetørk den til pulver til neste bruk.
  7. I det siste trinnet tilsettes peptidet med propargylbromid til et polypropylenrør, opprettholder reaksjonsløsningens pH ved 8,0 ved å tilsette (NH4)2CO3-oppløsning og rist reaksjonsblandingen ved 37 °C i 12 timer. Dette trinnet oppnår det sykliske peptidet av propargylsulfoniumsalt.
  8. Samle den siste reaksjonsblandingen: Oppløs den i et polypropylenrør i acetonitril og filtrer den gjennom en 0,22 μm filtermembran. Rens deretter løsningen med omvendt fase HPLC umiddelbart og frysetørk den til pulver til neste bruk.

7. Rensing av sykliske peptider

  1. Konstruer lineære peptidsubstrater på Rink-amid MBHA-harpiks ved å gjenta trinn 4.1-4.6. Tilsett 10 ml vannfri metanol til kolonnen med harpiks for dehydrering og tørk med N2 til neste bruk (gjenta to ganger) etter lineær peptidkobling.
  2. Tilbered et tilstrekkelig volum spaltecocktail (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) i avtrekksviften. Tilsett 1-5 ml TFA-blandingsløsning til polypropylenrøret og spalt harpiksen under TFA-cocktailen i 3 timer.
  3. Deretter tørker du harpiksen sekvensielt under en damp på N2 i kolonnen. Alternativt kan du bruke en filteranordning til å filtrere harpiksen og samle peptidløsningen. Tilsett deretter 20 ml eter til peptidoppløsningen for å utfelle peptidet, sentrifuge ved 3,500 x g i 5 minutter, og gjenta to ganger. Samle det rå peptidutfellingen og tørk det under en strøm av N2 for neste trinn.
  4. Oppløs 200 mg råpeptid i et polypropylenrør i 4 ml acetonitrilvannløsning og filtrer det gjennom et 0,22 μm filter. Overfør peptidet til en HPLC hetteglassinnsats. Plasser innsatsen i autosampleren til et semi-forberedende omvendt fase HPLC-system utstyrt med en C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm kolonne og en 1 ml injeksjonssløyfe.
  5. Rens og isoler peptidet ved hjelp av et gradientprogram på 5% -95% acetonitril i vann med 0,1% TFA over 30 minutter mens du overvåker HPLC-spektrene ved bruk av UV ved 254 nm. Bekreft peptidmolekylvekten ved LC-MS, samle løsningen av peptidet og frysetørk det til pulver til neste bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle de lineære peptidene ble syntetisert på Rink-amid MBHA-harpiks ved standard manuell Fmoc fastfasesyntese. En modell syklisk heksapeptid (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) ble konstruert som beskrevet i figur 5A. Spesielt ble et nytt on-tether kiralt senter generert av Met-alkylering, med de to epimerer av syklisk peptid (Ia, Ib) bekreftet av omvendt fase HPLC. Videre ble konvertering og forhold mellom epimerer bestemt ved bruk av integrasjon av omvendt fase HPLC. Syklisk Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2 peptider 1-Ia og 1-Ib, generert fra hexapeptid Ac-WMAAAC-NH2, viste forskjellige retensjonstider og identiske molekylvekter (figur 5B). Deretter ble toleransen av det sykliske peptidet til forskjellige funksjonelle grupper ytterligere testet, som vist i figur 5C. Sløyfelukkingseffektiviteten til de 10 lineære peptidene ble evaluert ved hjelp av en di-halogenert linker, med resultatene som viste at alle peptidene effektivt genererte de tilsvarende sykliske peptidene. Sammenlignet med de andre sykliske peptidene ga en modell heksacyklisk syklisk peptid med høye konverteringshastigheter et differensialforhold på 1:1 av epimerene og kunne separeres av HPLC. I noen tilfeller kunne peptidepimerene imidlertid ikke separeres under HPLC-forhold, sannsynligvis på grunn av at sulfoniumkiralt senter av epimeren ikke var veldig stabilt og langsomt ble racemisert til epimerblandinger. Reaksjonseffektiviteten til epimerene (1-Ia) med pyridinrthioler (PyS) (10 mM) ble deretter undersøkt av HPLC. Figur 5D viser HPLC-sporene av den tidsavhengige konverteringen mellom det sykliske peptidet (1 mM) og dets konjugerte produkt. Sporene viser tydelig den tidsavhengige reduksjonen av peptid 1-Ia med PyS i PBS (pH 7,4).

En annen strategi for lukking av peptidring var at for det første en propargylgruppe ble festet til Met, og deretter utløste det dannede propargylsulfoniumsenteret en tiol-yne-reaksjon for å generere et syklisk peptid. I denne strategien påvirket ikke ringstørrelsen og peptidsekvensen sykliseringsreaksjonen, med peptidet som inneholdt to eller tre aminosyrer bare brukt som en modell for å lukke sløyfen. Den syntetiske ruten for intramolekylær peptidsyklisering er beskrevet i figur 6A. I tillegg ble et forenklet propargylert Met-modellpeptid konstruert som beskrevet i figur 6B. Resultatene viste at modellens peptid MC-utbytte kunne være opptil 80% når reaksjonsløsningens pH ble satt til 8,0 (MC refererer til et modellsyklisk peptid syntetisert ved denne ruten; Figur 6A). Videre ble modellpeptidet MC isolert og renset av HPLC (figur 6D), og molekylvekten ble bekreftet av LC-MS (figur 6C). Som vist i figur 6E ble det kjemiske skiftet videre preget av 1H NMR og heteronukleær enkelt kvantekoherens (HSQC). I tillegg ble dithiothreitol (DTT) tilsatt for å forsøke å åpne sulfoniumringen for å utforske stabiliteten til MC. Resultatene viste ingen tilsetnings- eller ringåpningsprodukter etter 24 timer (figur 6F).

Figure 1
Figur 1: Diagram over det eksperimentelle oppsettet for et Fmoc-basert fastfasepeptid for syntetisering av peptider. Peptidkolonnen ble plassert på fastfasereaktoren via treveis stoppekraner med nitrogen eller argon som boblet gjennom kolonnen under peptidsyntese. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Intermolekylære lineære CM-peptider på harpiks. Alle de lineære peptidene ble syntetisert på Rink-amid MBHA-harpiks ved standard manuell Fmoc fastfasesyntese. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Syntetiske ruter for peptidsyklisering via Cys og Met-bisalkylering. De lineære peptidene som inneholder Met og Cys ble konstruert som stabiliserte sykliske peptider. Først ble den trt-beskyttede Cys debeskyttet med 3% TFA i DCM. Deretter ble en di-halogenert linker (2 eq) og DIPEA (4 eq) lagt til for å reagere med Cys i 3 timer. Til slutt ble syklisering mellom Cys og Met fullført da harpiksen ble spaltet i en TFA-spaltningsløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Syntetiske ruter for peptidsyklisering via Cys og Met thiol-yne. Først ble de lineære peptidene renset og karakterisert ved HPLC og LC-MS. Reaksjonen skjedde under følgende forhold: En oppløsning inkludert forbindelsen (0,2 mM, 1,0 eq) i 0,2 ml MeCN/H2O (1:1, v/v), 1 % HCOOH vandig oppløsning (i volum) og propargylbromid (1,0 mM, 5,0 eq) ble ristet ved romtemperatur i 12 timer ved en pH på 8,0. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Synteseskjema av sykliske peptider ved bruk av bisalkylering mellom Cys og Met. (A) Skjematisk illustrasjon av peptidsyklisering av Cys og Met. (B) HPLC- og LC-MS-spekteret til epimerene (1-Ia og 1-Ib). (C) Den funksjonelle resttoleransen til de forskjellige peptidene ble testet. (D) HPLC-spor av den tidsavhengige konverteringen mellom epimerer (1-Ia; 1 mM) og deres konjugerte produkter. Dette tallet er en modifikasjon av det som Wang et al.30 rapporterte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Synteseskjema av sykliske peptider ved bruk av en tiol-yne type reaksjon. (A) Lettvint konstruksjon av peptidsyklisering ved tiol-yne-reaksjonen. MC refererer til en modell syklisk peptid syntetisert av ruten. (B) Intramolekylær peptidsyklisering av forskjellige lineære peptider. a = 1 ml av 1 M (NH4)2CO3 vandig løsning. b = 1% Et3N i 1 ml av MeCN / H2O (1:1). Forkortelser: Ahx = 6-aminokapronsyre. Utbyttet ble beregnet som prosentandelen av produktet bestemt ved veiing. Konvertering representerte mengden utgangsmateriale som reagerte av HPLC. (C) LC-MS-spekteret til MC-sykliseringspeptidet. (D) HPLC-spekteret til MC-sykliseringspeptidet. (E) 1H NMR og HSQC spektra karakterisering av MC sykliske peptider. (F) 1H NMR-spektra av den tidsavhengige konverteringen mellom MC-syklisk peptid og DTT i D2O i 3 timer, 6 timer, 12 timer og 24 timer. Dette tallet er en modifikasjon av det som er rapportert av Hou et al.31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den syntetiske tilnærmingen beskrevet i dette papiret gir en metode for å syntetisere sykliske peptider ved hjelp av Cys og Met i peptidsekvensen, der de grunnleggende lineære peptidene er konstruert av vanlige fastfase peptidsynteseteknikker. For bisalkylering av sykliske peptider mellom Cys og Met, kan hele syntetiske ruten deles inn i tre hovedprosesser: debeskyttelse av Cys på harpiksen, koblingen av linkeren og sykliseringen mellom Cys og Met i en trifluoreddiksyrespaltningsløsning. Spesielt ble fjerningen av den beskyttende gruppen Cys funnet å være et kritisk skritt for den påfølgende ringlukkingsreaksjonen. Derfor ble trt-Cys debeskyttet, og dette ble gjort til løsningen ikke hadde noen tilsynelatende gul farge. Videre studier viste at sykliske peptider utviklet ved bisalkylering mellom Cys og Met-metodikk kunne utvides til sløyfelukking i en rekke peptider, med betingelsen at peptidet inneholder aminosyrene Cys og Met. I tillegg kunne peptidsekvensen og linkeren også justeres ytterligere i henhold til det eksperimentelle designet (figur 5). Det var derfor nødvendig å overvåke syntesen ved LC-MS.

For sykliske peptider i tiol-yne-typereaksjonen ble for det første lineære peptider også konstruert ved vanlige fastfasepeptidsynteseteknikker på harpiks, med følgende reaksjoner utført i væskefaseoppløsningen. Rå peptider ble deretter spaltet fra harpiksen og renset ved omvendt fase HPLC. En løsning av peptider og propargylbromid ble tilsatt reaksjonen i 12 timer, sammen med 0,2 ml MeCN / H2O (1: 1, v / v) og 1% HCOOH vandig løsning, og produktene ble deretter renset umiddelbart ved omvendt fase HPLC. Overraskende oppstod ringlukkingsreaksjonen når pH i reaksjonsoppløsningen ble økt til 8,0. Denne studien har utviklet en metode som begrenser peptidet til en syklisk konformasjonsstruktur med god stabilitet via en tiol-yne type reaksjon. Videre var det nødvendig å justere løsningsmidlet for peptidsløyfelukkingen på grunn av at hydrofiliteten og hydrofobisiteten til peptidene var forskjellige. For eksempel ble pH i det hydrofile peptidet justert med (NH4)2 CO 3, og det hydrofobe peptidet ble deretter justert med et blandet løsningsmiddel (1% Et3 N-løsning i 50% MeCN / H 2O; Figur 6).

I de senere år har ulike ligeringsteknologier blitt utviklet for å syntetisere sykliske peptider, med disse teknologiene som genererer naturlige peptidbindinger og unaturlige ryggradsforbindelser32. Det er imidlertid fortsatt utfordringer på det syntetiske sykliske peptidfeltet. For det første har aminosyresekvensen av peptidet en sterisk effekt, og effektiviteten av syklisering kan påvirkes av restene nær sykliseringsstedet. For det andre er den romlige strukturen til peptider mangfoldig, og det kan være nødvendig å nøye velge tilkoblingsstedet under ringlukking på samme sted. Endelig inneholder peptidsekvenser hydrofile eller hydrofobe aminosyrer, og derfor må oppløseligheten av reaksjonsløsningsmidlet vurderes. Derfor bør det legges mer vekt på å identifisere syklisering på stedet, løselighet og isomerer for å videreutvikle sykliske peptidapplikasjoner i farmasøytisk industri.

I denne undersøkelsen ble en serie lettvinte makrocykliseringsprotokoller ved bruk av bisalkylering mellom Cys og Met eller via en tiol-yne-type reaksjon designet for å løse utfordringene ved syntetisering av sykliske peptider. Heldigvis var disse reaksjonene lettvinte, svært effektive og metallkatalysatorfrie. Metodene som er utviklet har vist seg å utføre både intermolekylært og intramolekylært og har tilfredsstillende funksjonell gruppetoleranse. Videre ble disse metodene utviklet for å introdusere begrensningssyklisering, slik at peptidkjeden er mer konformasjonsstabilisert, og dermed forbedre målproteinbindingsaffiniteten og redusere ikke-spesifikk proteinbinding. I tillegg, ved å bruke rimelige design, kan selektiviteten på reaksjonsstedet også forbedres ved å danne et konformasjonsstabilisert sykliseringspeptid. Samlet sett genererte peptidkjedecyklisering biologisk aktive forbindelser, noe som indikerer at sykliske peptider er lovende legemiddelkandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner økonomisk støtte fra National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); Natural Science Foundation of China tilskudd (21778009, og 21977010); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2022A1515010996 og 2020A1515010521): Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 og JCYJ20200109140406047); og Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions grant (2019SHIBS0004). Forfatterne anerkjenner tidsskriftstøtte fra Chemical Science , The Royal Society of Chemistry for referanse 30 og The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, for referanse 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography
SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Tags

Kjemi utgave 187 Sykliske peptider bisalkylering/dealkylering propargylbromid stabilisering cystein metionin
Konstruere sykliske peptider ved hjelp av et on-tether sulfoniumsenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter