Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Построение циклических пептидов с использованием сульфония на тросе

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
* These authors contributed equally

Summary

В этом протоколе представлен синтез циклических пептидов путем бисалкилирования между цистеином и метионином и легкой тиол-инной реакции, вызванной центром пропаргилсульфония.

Abstract

В последние годы циклические пептиды привлекают все большее внимание в области открытия лекарств благодаря своей отличной биологической активности, и, как следствие, в настоящее время они используются клинически. Поэтому крайне важно искать эффективные стратегии синтеза циклических пептидов для содействия их применению в области открытия лекарств. В данной работе представлен подробный протокол эффективного синтеза циклических пептидов с использованием смоляного или внутримолекулярного (межмолекулярного) бисалкилирования. Используя этот протокол, линейные пептиды синтезировали с использованием синтеза твердофазных пептидов с цистеином (Cys) и метионином (Met), соединенными одновременно на смоле. Кроме того, циклические пептиды синтезировали путем бисалкилирования между Met и Cys с использованием перестраиваемого троса и сульфония на тросе. Весь синтетический путь можно разделить на три основных процесса: депротекция Cys на смоле, соединение линкера и циклизация между Cys и Met в растворе расщепления трифторуксусной кислоты (TFA). Кроме того, вдохновленная реакционной способностью сульфония центра, пропаргильная группа была присоединена к Met, чтобы вызвать добавление тиол-айна и сформировать циклический пептид. После этого сырые пептиды сушили и растворяли в ацетонитриле, отделяли, а затем очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Молекулярная масса циклического пептида была подтверждена жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS), а стабильность комбинации циклического пептида с восстановителем дополнительно подтверждена с помощью ВЭЖХ. Кроме того, химический сдвиг в циклическом пептиде анализировали по спектрам ядерного магнитного резонанса 1H (1H ЯМР). В целом, этот протокол был направлен на создание эффективной стратегии синтеза циклических пептидов.

Introduction

Белково-белковые взаимодействия (ИПП)1 играют ключевую роль в исследованиях и разработках лекарственных средств. Построение стабилизированных пептидов с фиксированной конформацией химическим путем является одним из важнейших методов разработки миметических мотивов ИПП2. На сегодняшний день несколько циклических пептидов, нацеленных на ИПП, были разработаны для клинического применения3. Большинство пептидов ограничены конформацией α спирали, чтобы уменьшить конформационную энтропию и улучшить метаболическую стабильность, сродство связывания целей и проницаемость клеток 4,5. За последние 2 десятилетия боковые цепи Cys 6,7, лизина 8,9, триптофана10, аргинина11 и Met 12,13 были вставлены в неестественные аминокислоты, чтобы зафиксировать пептид в циклической конформации. Такие циклические пептиды могут нацеливаться на уникальное химическое пространство или специальные участки, тем самым запуская ковалентную реакцию с образованием белка-пептидного ковалентного связывания 14,15,16,17. В недавнем докладе Yu et al. хлорацетамид был закреплен на домене пептидных лигандов, обеспечивая реакцию ковалентной конъюгации с отличной специфичностью белка18. Кроме того, электрофильные боеголовки, такие как акриламид и арилсульфонилфторид (ArSO2F), были дополнительно включены в пептиды Валенским и др.19 для формирования стабилизированных пептидных ковалентных ингибиторов и улучшения противоопухолевого действия пептидных ингибиторов. Поэтому очень важно ввести дополнительную функциональную группу, чтобы ковалентно модифицировать белково-пептидные лиганды20. Эти группы не только вступают в реакцию с белками на боковой цепи, но и стабилизируют вторичную структуру пептида21. Однако применение ковалентно модифицированных белков, индуцированных пептидными лигандами, ограничено из-за сложного синтетического пути и неспецифического связывания химических групп22,23. Поэтому срочно необходимы эффективные стратегии синтеза циклических пептидов.

Вдохновленный разнообразными стратегиями циклических пептидов 2,24,25,26, этот протокол пытается разработать простой и эффективный метод стабилизации пептидов. Кроме того, мы отметили, что группа боковых цепей стабильного пептида может ковалентно реагировать с белком-мишенью, когда он находится пространственно близко к пептидным лигандам. Отсутствие химически модифицированного Met было восполнено группой Деминга в 2013 году путем разработки нового метода получения селективно модифицированного пептида метионина27. Основываясь на этом фоне, Shi et al. сосредоточились на разработке кольцевого замыкания боковых цепей с образованием центра соли сульфония. Когда пептидный лиганд соединяется с целевым белком, группа солей сульфония реагирует ковалентно с пространственно близким белком Cys. В последние годы Shi et al. разработали новый метод стабилизации циклического пептида28. Соль сульфония на циклическом пептиде восстанавливали восстановителем с сульфгидрильной группой, которая обратимо восстанавливалась до Met. Однако реакция имела низкую эффективность, что было вредно для последующих исследований биологического применения. В текущем исследовании была разработана реакция закрытия кольца Met-Cys и пропаргилбромид-Cys, при этом одна соль сульфония осталась на боковой цепи циклического пептида. Соль сульфония действовала как новая боеголовка, которая ковалентно реагировала с белком Cys при пространственной близости. Вкратце, мутировавший пептид Cys and Met был циклизирован внутримолекулярным алкилированием, что привело к образованию центра сульфония на тросе. В этом процессе формирование бокового цепного моста имело решающее значение для циклических пептидов. В целом, этот протокол описывает подробную циклизацию пептидов на основе сульфония, которая достигается с использованием простых условий реакции и операций. Цель состоит в том, чтобы разработать потенциальный метод для дальнейшего широкого биологического применения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка оборудования

ВНИМАНИЕ: Морфолин, N,N-диметилформамид (DMF), дихлорметан (DCM), N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA), TFA, морфолин, пиперидин, диэтиловый эфир и метанол являются токсичными, летучими и коррозионными. Эти реагенты могут нанести вред человеческому организму при вдыхании, проглатывании или контакте с кожей. Для всех химических экспериментов используйте защитное снаряжение, включая одноразовые перчатки, экспериментальные пальто и защитные очки.

  1. Построить все пептидные субстраты на ринк-амидной 4-метилбензгидриламиновой (MBHA) смоле стандартным ручным твердофазным синтезом пептидов на основе Fmoc (SPPS)29, как показано на рисунке 1.
  2. Используют любой из двух вариантов построения линейных пептидов: во-первых, синтезировать пептид с использованием конденсатора 2-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (HATU) и реагента DIPEA; или два, синтезировать с использованием 1-гидроксибензотриазола (HOBT) и N,N'-диизопропилкарбодиимида (ДВС-синдрома) в качестве реагента амидной конденсации. Выбрать подходящий протокол синтеза пептидов в соответствии с последовательностью пептида.
  3. Для установки ручного устройства синтеза пептидов установите модифицированное вакуумное твердофазное экстракционное оборудование в вытяжной вытяжке и соедините его с трехсторонним запорным краном. Затем поместите полипропиленовый фильтрующий картридж или стеклянный реактор на оборудование при подключении к газу азота (N2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для модификации вакуумно-твердофазного экстракционного оборудования снимите экстракционную трубку и сохраните вакуумно-герметичную систему.
  4. Загрузите смолу MBHA в заполненные смолой колонны и растворите ее в DMF. Отрегулируйте переключатель трехходовых запорных кранов для пузырьков N2 , а затем удалите растворитель в колонне с помощью рабочего насоса, подключенного к вакуумной системе. Рассчитайте необходимое количество аминокислоты или конденсирующего агента, используя следующую формулу:
    Аминокислота (g) и конденсирующий агент (g) = смоляная шкала (g) × нагрузочная способность смолы (мМ/г) × эквивалент (5 экв) × молекулярная масса (г/м)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите количество загруженной смолы в соответствии с длиной пептида связи. Множественные эквиваленты (экв) аминокислот используются для более полной реакции. Жидкие растворители должны быть преобразованы в объем по плотности. 5 эквалайзер показывает, что входная величина вычисляемого соединения усиливается в пять раз.

2. Подготовка смолы

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите количество загруженной смолы в соответствии с длиной пептида связи.

  1. Взвесьте 302 мг катковой амидной смолы MBHA (загружено 0,331 мМ/г) в колонну (резервуар 20 мл). Добавьте 5-10 мл DCM или DMF в колонку, чтобы набухать смолу подN2 , пузырящуюся в течение 30 мин.
  2. Затем закройте переключатель N2 , а затем включите всасывающий переключатель вакуумного насоса, чтобы удалить растворитель. Затем промыть смолы последовательно DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) 5x.

3. N-терминал fmoc дезащита

ПРИМЕЧАНИЕ: Депротекция морфолином требует 30 мин, а депротекция пиперидином занимает 5 мин.

  1. Готовят N-концевой 9-фторенилметилоксикарбонил (Fmoc) депротекторный раствор: готовят достаточный объем (500 мл) 20% (v/v) пиперидина или 50% (v/v) морфолина в DMF в стеклянной емкости для депротекции группы Fmoc.
  2. Добавьте 10 мл депротекторного раствора в столб, взбейтеN2 в раствор в течение 30 мин или 5 мин 2x и повторите процедуры дезащиты 2x.
  3. Слейте раствор вакуумным насосом и последовательно промывайте смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) 5x.
  4. Обнаруживайте смолу в виде раствора темно-желтого цвета 5% нингидрином (тест Кайзера) после каждой депротекции, чтобы подтвердить отсутствие группы Fmoc до стадии соединения. В деталях добавляют 1 мл DMF к небольшому количеству смолы и добавляют 200 мкл 5% нингидрина в стеклянную трубку, нагретую при 130 °C в течение 3 мин, чтобы оценить изменения цвета смолы.
  5. Слейте раствор вакуумным насосом и последовательно промывайте смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) 5x.

4. Соединение линейного пептида (рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда синтетические пептидные последовательности содержат две или более повторяющихся единиц, процедуру соединения можно непосредственно проводить путем выбора типа аминокислоты, такой как Fmoc-AA-OH или Fmoc-AAA-OH, и так далее. Некоторые специальные аминокислоты со стериновой помехой и пептиды с более длинными аминокислотными последовательностями необходимы для правильного продления времени реакции для соединения.

  1. Для одной стадии соединения возьмем в качестве примера соединение остатка Cys (синтезируйте 300 мг смоляных чешуек). Приготовьте смесь раствора, включающего Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 экв, 292 мг) и HATU (5 экв, 206 мг) или Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 экв, 292 мг) и HOBT (5 экв, 106 мг) в полипропиленовой трубке и растворите ее в 3 мл ДМФ.
  2. Добавьте 173 мкл DIPEA (10 экв) или 154 мкл ДВС-синдрома (10 экв.) к раствору Cys для активации аминокислоты. Дайте смеси предварительно активироваться в течение 1 мин. Добавьте смесь в столб со смолой и взбейте ееN2 в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое удельное время реакции должно быть стандартизировано для обнаружения 5% нингидрина.
  3. После соединения добавляют 1 мл DMF к небольшому количеству смолы и добавляют 200 мкл 5% нингидрина в стеклянную трубку, нагретую при 130 °C в течение 3 мин. Наблюдайте за изменением смолы на бесцветную, чтобы подтвердить отсутствие свободной аминогруппы до стадии депротекции.
  4. Слейте раствор с помощью вакуумного насоса и последовательно промывайте смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) 5x.
  5. Добавить 10 мл депротекторного раствора в колонку, взбиваемN2 в течение 30 мин или 5 мин 2x, добавить свежий раствор и повторить процедуры дезащиты 2x.
  6. Повторите следующие шаги: снятие защиты с группы Fmoc; обнаружение депротекции смолы; промывка смолы; соединение аминокислоты; обнаружение реакции связи. Повторяйте этап соединения до тех пор, пока не будут синтезированы все пептиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тест Кайзера, чтобы контролировать, завершен ли каждый этап депротекции или каждый этап соединения аминокислот является тщательным. Альтернативно, небольшое количество пептида может быть отделено от смолы и проверено LC-MS для успешного соединения.

5. Бисалкилирование между Met и Cys (рисунок 3)

  1. Постройте линейный пептид с помощью Met и Cys, повторив шаги 4.1-4.6. Добавьте 10 мл безводного метанола в колонку со смолой для обезвоживания и высушитеN2 для следующего использования (повторите 2x) после линейной пептидной связи.
  2. Взвесьте 100 мг смолы, полученной на предыдущем этапе, в колонну (резервуар 20 мл) и промыть смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) перед этапом соединения.
  3. Подготовьте раствор для удаления группы защиты Cys trt(trityl). Приготовьте достаточный объем (100 мл) смеси TFA/TIS/DCM (3:5:92) в стеклянной таре для удаления защитной группы.
  4. Добавить 5-10 мл раствора TFA/TIS/DCM (3:5:92) в колонку для удаления группы защиты на 10 мин. Повторите шесть раз с пузырькамиN2 до полного исчезновения желтого цвета.
  5. Слейте раствор вакуумным насосом и последовательно промывайте смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) 5x.
  6. Приготовьте раствор для реакции с незащищенным Cys. Приготовьте достаточный объем (50 мл) смеси раствора (DMF), включая дигалогенированный линкер (2 экв) и DIPEA (4 экв) для взаимодействия с незащищенным Cys.
  7. Добавляют 5-10 мл реакционного раствора в колонку для реакции с незащищенным Cys в течение не менее 3 ч с пузырькамиN2 . Обезвоживать безводным метанолом и сушитьN2 для следующего использования.
  8. Слейте раствор вакуумным насосом и последовательно промывайте смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) 5x.
  9. Подготовьте раствор для пептидной циклизации: приготовьте достаточный объем (20 мл) смеси TFA (TFA:TIS:H2O = 95:2.5:2.5) в стеклянной емкости в вытяжном шкафу для пептидной циклизации.
  10. Добавьте 5-10 мл раствора смеси TFA в полипропиленовую трубку и расщепляйте смолу под коктейлем TFA в течение 3 ч.
    ВНИМАНИЕ: TFA обладает высокой коррозионной и раздражающей способностью; процесс расщепления пептидов должен осуществляться в вытяжном шкафу.
  11. Выполните шаги 7.1-7.5 для получения линейного пептидного раствора методом обратнофазной жидкофазной очистки (ВЭЖХ). Сублимационная сушка раствора для следующего использования.

6. Циклизация соли пропаргилсульфония (рисунок 4)

  1. Постройте линейный пептид с помощью Met и Cys, повторив шаги 4.1-4.6. Добавьте 10 мл безводного метанола в колонку со смолой для обезвоживания и высушитеN2 для следующего использования (повторите дважды) после линейной пептидной связи.
  2. Взвесьте 100 мг смолы, полученной на предыдущем этапе, в колонну (резервуар 20 мл) и промыть смолу DCM (5-10 мл) и DMF (5-10 мл) перед этапом соединения.
  3. Выполните шаги 7.1-7.5 для получения линейного пептидного раствора методом ВЭЖХ и лиофилизируйте образец, как уже упоминалось, для следующего использования.
  4. Готовят 1% водный раствор HCOOH (в объеме) и 1,0 мМ пропаргилбромида (5 экв) и добавляют в раствор пептида Met (0,2 мМ, 1 экв; 0,2 мл MeCN/H2O[1:1, v/v]).
  5. Далее встряхивают реакцию соединения Мет и пропаргилбромида при комнатной температуре в течение 12 ч.
  6. После реакции растворяют продукт в полипропиленовой трубке в ацетонитриле и фильтруют его через мембрану 0,22 мкмфильтра. Затем немедленно очистите раствор обратнофазной ВЭЖХ и высушите его в порошок для следующего использования.
  7. На последней стадии добавляют пептид с пропаргилбромидом в полипропиленовую трубку, поддерживают рН реакционного раствора на уровне 8,0 путем добавления (NH4)2раствора CO3 и встряхивают реакционную смесь при 37°С в течение 12 ч. На этом этапе получается циклический пептид соли пропаргилсульфония.
  8. Соберите последнюю реакционную смесь: растворите ее в полипропиленовой трубке в ацетонитриле и отфильтруйте через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Затем немедленно очистите раствор обратнофазной ВЭЖХ и высушите его в порошок для следующего использования.

7. Очистка циклических пептидов

  1. Построение линейных пептидных субстратов на ринк-амидной смоле MBHA путем повторения шагов 4.1-4.6. Добавьте 10 мл безводного метанола в колонку со смолой для обезвоживания и высушитеN2 для следующего использования (повторите дважды) после линейной пептидной связи.
  2. Приготовьте достаточный объем коктейля с расщеплением (TFA/H2O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) в вытяжном шкафу. Добавьте 1-5 мл раствора смеси TFA в полипропиленовую трубку и расщепляйте смолу под коктейлем TFA в течение 3 ч.
  3. Далее последовательно сушат смолу под паромN2 в колонне. Альтернативно, используют фильтрующее устройство для фильтрации смолы и сбора пептидного раствора. Затем добавляют 20 мл эфира в пептидный раствор для осаждения пептида, центрифугируют при 3 500 х г в течение 5 мин и повторяют дважды. Соберите сырой пептидный осадок и высушите его под потокомN2 для следующего шага.
  4. Растворите 200 мг сырого пептида в полипропиленовой трубке в 4 мл ацетонитрильно-водного раствора и процедите его через фильтр 0,22 мкм. Переведите пептид во флакон вегетарного флакона. Поместите вставку в автопробоотборник полупрепаратативной системы ВЭЖХ с обратной фазой, оснащенной колонной C18 5 мкм, 4,6 мм x 250 мм и петлей впрыска 1 мл.
  5. Очистите и изолируйте пептид с помощью градиентной программы 5%-95% ацетонитрила в воде с 0,1% TFA в течение 30 мин при мониторинге спектров ВЭЖХ с использованием УФ при 254 нм. Подтвердите молекулярную массу пептида LC-MS, соберите раствор пептида и высушите его в порошок для следующего использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Все линейные пептиды синтезировали на ринк-амидной смоле MBHA стандартным ручным твердофазным синтезом Fmoc. Была построена модель циклического гексапептида (Ac (цикло-I)-WMAAAC-NH2), как описано на рисунке 5А. Примечательно, что новый хиральный центр на тросе был сгенерирован при алкилировании Met, причем два эпимера циклического пептида (Ia, Ib) были подтверждены обратнофазной ВЭЖХ. Далее конверсию и соотношение эпимеров определяли с помощью интеграции обратнофазных ВЭЖХ. Циклические ac-(цикло-I)-WMAAAC-NHпептиды 1-Ia и 1-Ib, полученные из гексапептида Ac-WMAAAC-NH2, демонстрировали различное время удержания и идентичные молекулярные массы (рисунок 5B). Далее была дополнительно проверена толерантность циклического пептида к различным функциональным группам, как показано на рисунке 5С. Эффективность закрытия петли 10 линейных пептидов оценивали с использованием дигалогенированного линкера, причем результаты показали, что все пептиды эффективно генерируют соответствующие циклические пептиды. По сравнению с другими циклическими пептидами, модельный гексациклический циклический пептид с высокими коэффициентами конверсии давал дифференциальное соотношение 1:1 эпимеров и мог быть разделен ВЭЖХ. Однако в некоторых случаях пептидные эпимеры не могут быть разделены в условиях ВЭЖХ, вероятно, из-за того, что хиральный центр сульфония эпимера не очень стабилен и медленно рацемизируется в смеси эпимеров. Эффективность реакции эпимеров (1-Ia) с пиридинртиолами (PyS) (10 мМ) затем исследовали методом ВЭЖХ. На рисунке 5D показаны следы ВЭЖХ зависящего от времени превращения между циклическим пептидом (1 мММ) и его сопряженным продуктом. Следы ясно показывают зависящее от времени снижение пептида 1-Ia с PyS в PBS (pH 7,4).

Другая стратегия закрытия пептидного кольца заключалась в том, что, во-первых, к Met была присоединена пропаргильная группа, а затем образовавшийся центр пропаргилсульфония вызвал тиол-инную реакцию с образованием циклического пептида. В этой стратегии размер кольца и пептидная последовательность не влияли на реакцию циклизации, а пептид, содержащий две или три аминокислоты, просто использовался в качестве модели для закрытия цикла. Синтетический путь внутримолекулярной пептидной циклизации описан на фиг.6А. Кроме того, был построен упрощенный пропаргилированный пептид модели Met, как описано на рисунке 6B. Результаты показали, что выход модели пептида MC может составлять до 80%, когда рН реакционного раствора установлен на уровне 8,0 (MC относится к модельному циклическому пептиду, синтезируемому этим путем; Рисунок 6А). Более того, модельный пептид MC был выделен и очищен методом ВЭЖХ (рисунок 6D), а его молекулярная масса была подтверждена LC-MS (рисунок 6C). Как показано на рисунке 6E, химический сдвиг дополнительно характеризовался 1H ЯМР и гетероядерной одинарной квантовой когерентностью (HSQC). Кроме того, дитиотрейтол (DTT) был добавлен, чтобы попытаться открыть сульфониевое кольцо для изучения стабильности MC. Результаты показали отсутствие сложения или открытия колец через 24 ч (рисунок 6F).

Figure 1
Рисунок 1: Схема экспериментальной установки твердофазного пептида на основе Fmoc для синтеза пептидов. Пептидную колонну помещали на твердофазный реактор через трехсторонние запорные краны с азотом или аргоном, пузырящимися через колонну во время синтеза пептидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Смоляные межмолекулярные синтетические линейные пептиды СМ. Все линейные пептиды синтезировали на ринк-амидной смоле MBHA стандартным ручным твердофазным синтезом Fmoc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Синтетические пути пептидной циклизации посредством бисалкилирования Cys и Met. Линейные пептиды, содержащие Met и Cys, были построены как стабилизированные циклические пептиды. Во-первых, Cys, защищенный trt, был снят с защиты с 3% TFA в DCM. Затем добавляли дигалогенированный линкер (2 экв) и DIPEA (4 экв) для взаимодействия с Cys в течение 3 ч. Наконец, циклизация между Cys и Met была завершена, когда смола была расщеплена в растворе расщепления TFA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Синтетические пути пептидной циклизации через Cys и Met thiol-yne. Во-первых, линейные пептиды были очищены и характеризовались ВЭЖХ и LC-MS. Реакция происходила при следующих условиях: раствор, включающий соединение (0,2 мМ, 1,0 экв) в 0,2 мл MeCN/H2O (1:1, v/v), 1% водный раствор HCOOH (в объеме) и пропаргилбромид (1,0 мМ, 5,0 экв) встряхивали при комнатной температуре в течение 12 ч при рН 8,0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Схема синтеза циклических пептидов с использованием бисалкилирования между Cys и Met. (A) Схематическая иллюстрация циклизации пептидов Cys и Met. (B) Спектр ВЭЖХ и LC-MS эпимеров (1-Ia и 1-Ib). С) Была проверена функциональная толерантность к остаткам различных пептидов. (D) ВЭЖХ следы зависящей от времени конверсии между эпимерами (1-Ia; 1 мМ) и их сопряженными продуктами. Эта цифра является модификацией той, о которой сообщили Wang et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Схема синтеза циклических пептидов с использованием реакции тиол-инного типа. (A) Поверхностная конструкция циклизации пептидов с помощью тиол-инной реакции. MC относится к модельному циклическому пептиду, синтезируемому маршрутом. (B) Внутримолекулярная пептидная циклизация различных линейных пептидов. a = 1 мл 1 M (NH4)2CO3 водного раствора. b = 1% Et3N в 1 мл MeCN/H2O(1:1). Сокращения: Ahx = 6-аминокапроновая кислота. Выход рассчитывался как процент продукта, определяемый взвешиванием. Конверсия представляла собой количество исходного материала, который реагировал с помощью ВЭЖХ. (C) Спектр LC-MS пептида циклизации MC. (D) Спектр ВЭЖХ пептида циклизации MC. (E) 1H ЯМР и HSQC спектры характеристик циклических пептидов MC. (F) 1Ч ЯМР-спектров зависящего от времени преобразования между циклическим пептидом MC и DTT вD2Oв течение 3 ч, 6 ч, 12 ч и 24 ч. Эта цифра является модификацией той, о которой сообщили Хоу и др.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Синтетический подход, описанный в данной работе, обеспечивает способ синтеза циклических пептидов с использованием Cys и Met в пептидной последовательности, в котором основные линейные пептиды конструируются обычными твердофазными методами синтеза пептидов. Для бисалкилирования циклических пептидов между Cys и Met весь синтетический путь можно разделить на три основных процесса: депротекция Cys на смоле, соединение линкера и циклизация между Cys и Met в растворе расщепления трифторуксусной кислоты. Примечательно, что удаление защитной группы Cys было признано критическим шагом для последующей реакции закрытия кольца. Поэтому trt-Cys был снят с защиты, и это делалось до тех пор, пока раствор не имел видимого желтого цвета. Дальнейшие исследования показали, что циклические пептиды, разработанные методом бисалкилирования между Cys и Методологией Met, могут быть расширены до закрытия петли в различных пептидах, при условии, что пептид содержит аминокислоты Cys и Met. Кроме того, пептидная последовательность и линкер также могут быть дополнительно скорректированы в соответствии с экспериментальной конструкцией (рисунок 5). Поэтому необходимо следить за синтезом ЛК-МС.

Для циклических пептидов в реакции типа тиол-ин, во-первых, линейные пептиды также конструировали обычными твердофазными методами синтеза пептидов на смоле, причем следующие реакции проводились в жидкофазном растворе. Затем сырые пептиды отщепляли от смолы и очищали обратнофазной ВЭЖХ. Раствор пептидов и пропаргилбромида добавляли к реакции в течение 12 ч вместе с 0,2 мл MeCN/H2O (1:1, v/v) и 1% HCOOH водным раствором, и затем продукты немедленно очищали обратнофазной ВЭЖХ. Удивительно, но реакция закрытия кольца происходила, когда рН реакционного раствора повышался до 8,0. Это исследование разработало метод, который ограничивает пептид циклической конформационной структурой с хорошей стабильностью через реакцию типа тиол-ин. Кроме того, необходимо было отрегулировать растворитель для закрытия пептидной петли из-за того, что гидрофильность и гидрофобность пептидов различны. Например, рН гидрофильного пептида корректировали с помощью (NH4)2CO3, а затем гидрофобный пептид корректировали смешанным растворителем (1% Раствор Et3N в 50% MeCN/H2O; Рисунок 6).

В последние годы были разработаны различные технологии лигирования для синтеза циклических пептидов, причем эти технологии генерируют естественные пептидные связи и неестественные магистральные связи32. Тем не менее, проблемы остаются в области синтетических циклических пептидов. Во-первых, аминокислотная последовательность пептида обладает стерическим эффектом, и на эффективность циклизации могут влиять остатки, близкие к месту циклизации. Во-вторых, пространственная структура пептидов разнообразна, и может потребоваться тщательный выбор места соединения при закрытии кольца на одном и том же участке. Наконец, пептидные последовательности содержат гидрофильные или гидрофобные аминокислоты, и, следовательно, необходимо учитывать растворимость реакционного растворителя. Поэтому следует приложить больше усилий для выявления циклизации на месте, растворимости и изомеров для дальнейшего развития применения циклических пептидов в фармацевтической промышленности.

В этом исследовании была разработана серия простых протоколов макроциклизации с использованием бисалкилирования между Cys и Met или через реакцию типа тиол-yne для решения проблем синтеза циклических пептидов. К счастью, эти реакции были легкими, высокоэффективными и не содержали металлических катализаторов. Было продемонстрировано, что разработанные методы выполняют как межмолекулярно, так и внутримолекулярно и имеют удовлетворяющую функциональную групповую толерантность. Кроме того, эти методы были разработаны для введения циклизации ограничений, гарантируя, что пептидная цепь более конформационно стабилизирована, тем самым улучшая сродство связывания целевых белков и уменьшая неспецифическое связывание с белками. Кроме того, используя разумные конструкции, селективность места реакции также может быть повышена путем образования конформационно стабилизированного пептида циклизации. В целом, циклизация пептидной цепи генерировала биологически активные соединения, что указывает на то, что циклические пептиды являются перспективными кандидатами в лекарства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы выражаем финансовую поддержку со стороны Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2021YFC2103900); гранты Фонда естественных наук Китая (21778009 и 21977010); Фонд естественных наук провинции Гуандун (2022A1515010996 и 2020A1515010521): Комитет по инновациям в области науки и техники Шэньчжэня (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 и JCYJ20200109140406047); и грант Шэньчжэньско-Гонконгского института науки о мозге-Шэньчжэньские институты фундаментальных исследований (2019SHIBS0004). Авторы признают поддержку журнала от Chemical Science, Королевского химического общества для ссылки 30 и The Journal of Organic Chemistry, Американского химического общества, для ссылки 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography
SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Tags

Химия Выпуск 187 Циклические пептиды бисалкилирование/деалкилирование пропаргилбромид стабилизация цистеин метионин
Построение циклических пептидов с использованием сульфония на тросе
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter