Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3, 1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo presenta la síntesis de péptidos cíclicos a través de la bisalquilación entre cisteína y metionina y la reacción fácil tiol-yne desencadenada por el centro de propargil sulfonio.

Abstract

En los últimos años, los péptidos cíclicos han atraído cada vez más atención en el campo del descubrimiento de fármacos debido a sus excelentes actividades biológicas y, como consecuencia, ahora se utilizan clínicamente. Por lo tanto, es fundamental buscar estrategias efectivas para sintetizar péptidos cíclicos para promover su aplicación en el campo del descubrimiento de fármacos. Este documento informa un protocolo detallado para la síntesis eficiente de péptidos cíclicos utilizando bisalquilación en resina o intramolecular (intermolecular). Usando este protocolo, los péptidos lineales se sintetizaron aprovechando la síntesis de péptidos en fase sólida con cisteína (Cys) y metionina (Met) acopladas simultáneamente en la resina. Además, los péptidos cíclicos se sintetizaron a través de la bisalquilación entre Met y Cys utilizando una correa sintonizable y un centro de sulfonio en la correa. Toda la ruta sintética se puede dividir en tres procesos principales: la desprotección de Cys en la resina, el acoplamiento del enlazador y la ciclación entre Cys y Met en una solución de escisión de ácido trifluoroacético (TFA). Además, inspirado por la reactividad del centro de sulfonio, se unió un grupo propargil al Met para desencadenar la adición de tiol-yne y formar un péptido cíclico. Después de eso, los péptidos crudos se secaron y disolvieron en acetonitrilo, se separaron y luego se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El peso molecular del péptido cíclico se confirmó mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), y la estabilidad de la combinación de péptidos cíclicos con el reductor se confirmó aún más mediante HPLC. Además, el cambio químico en el péptido cíclico se analizó mediante espectros de resonancia magnética nuclear 1H (RMN 1H). En general, este protocolo tenía como objetivo establecer una estrategia efectiva para sintetizar péptidos cíclicos.

Introduction

Las interacciones proteína-proteína (IBP)1 desempeñan un papel fundamental en la investigación y el desarrollo de fármacos. La construcción de péptidos estabilizados con una conformación fija por medios químicos es uno de los métodos más importantes para desarrollar motivos miméticos de IBP2. Hasta la fecha, varios péptidos cíclicos que se dirigen a los IBP han sido desarrollados para uso clínico3. La mayoría de los péptidos están restringidos a una conformación de α hélice para disminuir la entropía conformacional y mejorar la estabilidad metabólica, la afinidad de unión al objetivo y la permeabilidad celular 4,5. En las últimas 2 décadas, las cadenas laterales de Cys6,7, lisina 8,9, triptófano 10, arginina 11 y Met 12,13 se han insertado en aminoácidos no naturales para fijar el péptido en una conformación cíclica. Tales péptidos cíclicos pueden dirigirse a un espacio químico único o sitios especiales, desencadenando así una reacción covalente para formar la unión covalente proteína-péptido14,15,16,17. En un informe reciente de Yu et al., una cloroacetamida se ancló en el dominio de los ligandos peptídicos, asegurando una reacción de conjugación covalente con excelente especificidad proteica18. Además, Walensky et al.19 incorporaron ojivas electrofílicas, como la acrilamida y el fluoruro de arilo sulfonilo (ArSO2F), a péptidos para formar inhibidores covalentes peptídicos estabilizados y mejorar el efecto antitumoral de los inhibidores peptídicos. Por lo tanto, es muy importante introducir un grupo funcional adicional para modificar covalentemente los ligandos proteína-péptido20. Estos grupos no solo reaccionan con proteínas en la cadena lateral, sino que también estabilizan la estructura secundaria del péptido21. Sin embargo, la aplicación de proteínas modificadas covalentemente inducidas por ligandos peptídicos es limitada debido a la complicada ruta sintética y a la unión no específica de los grupos químicos22,23. Por lo tanto, se requieren urgentemente estrategias efectivas para la síntesis de péptidos cíclicos.

Inspirado en las múltiples estrategias de péptidos cíclicos 2,24,25,26, este protocolo intenta desarrollar un método simple y eficiente para estabilizar péptidos. Además, observamos que el grupo de cadena lateral de un péptido estable podría reaccionar covalentemente con una proteína diana cuando estaba espacialmente cerca de los ligandos peptídicos. La falta de Met modificado químicamente fue cubierta por el grupo de Deming en 2013 mediante el desarrollo de un nuevo método para producir metionina27 peptídica modificada selectivamente. Basándose en estos antecedentes, Shi et al. se centraron en el desarrollo del cierre de anillo de cadenas laterales para formar un centro de sal de sulfonio. Cuando el ligando peptídico se combina con la proteína diana, el grupo de la sal de sulfonio reacciona covalentemente con la proteína Cys espacialmente cercana. En los últimos años, Shi et al. han diseñado un nuevo método para estabilizar el péptido cíclico28. La sal de sulfonio en el péptido cíclico se redujo mediante un agente reductor con un grupo sulfhidrilo que se redujo reversiblemente a Met. Sin embargo, la reacción tuvo una baja eficiencia, lo que fue perjudicial para los estudios de aplicación biológica posteriores. En el estudio actual, se diseñó una reacción de cierre de anillo Met-Cys y bromuro de propargilo-Cys, con una sola sal de sulfonio restante en la cadena lateral del péptido cíclico. La sal de sulfonio actuó como una nueva ojiva que reaccionó covalentemente con la proteína Cys en proximidad espacial. Brevemente, un péptido mutado Cys y Met fue ciclado por alquilación intramolecular, lo que resultó en la generación de un centro de sulfonio en la correa. En este proceso, la formación de un puente de cadena lateral fue crítica para los péptidos cíclicos. En general, este protocolo describe una ciclación peptídica detallada a base de sulfonio que se logra utilizando condiciones de reacción y operaciones simples. El objetivo es desarrollar un método potencial para otras aplicaciones biológicas amplias.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación del equipo

PRECAUCIÓN: Morfolina, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, éter dietílico y metanol son tóxicos, volátiles y corrosivos. Estos reactivos pueden dañar el cuerpo humano a través de la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Para todos los experimentos químicos, use equipo de protección, incluidos guantes desechables, abrigos experimentales y anteojos protectores.

  1. Construir todos los sustratos peptídicos en resina Rink-amida 4-metilbenzhidrilamina (MBHA) mediante la síntesis manual estándar de péptidos en fase sólida (SPPS)29, como se muestra en la Figura 1.
  2. Utilice cualquiera de las dos opciones para construir péptidos lineales: uno, sintetizar el péptido utilizando agente condensador 2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU) y un reactivo de DIPEA; o dos, sintetizar utilizando 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) como reactivo de condensación de amida. Seleccione un protocolo apropiado para la síntesis de péptidos de acuerdo con la secuencia del péptido.
  3. Para establecer un dispositivo manual de síntesis de péptidos, configure un equipo de extracción de fase sólida al vacío modificado en una campana extractora de humos y conéctelo con una llave de paso de tres vías. A continuación, coloque un cartucho de filtro de polipropileno o un reactor de vidrio en el equipo mientras está conectado al gas nitrógeno (N2).
    NOTA: Para modificar el equipo de extracción en fase sólida al vacío, retire el tubo de extracción y mantenga el sistema sellado al vacío.
  4. Cargue la resina MBHA en las columnas llenas de resina y disuélvala en DMF. Ajuste el interruptor de las llaves de paso de tres vías para el burbujeo de N2 y luego retire el disolvente en la columna utilizando una bomba de trabajo conectada a un sistema de vacío. Calcule la cantidad de aminoácido o agente condensador requerido utilizando la siguiente fórmula:
    Aminoácido (g) y agente condensador (g) = escala de resina (g) × capacidad de carga de resina (mM/g) × equivalente (5 eq) × peso molecular (g/M)
    NOTA: Elija la cantidad de resina cargada de acuerdo con la longitud del péptido de acoplamiento. Se utilizan múltiples equivalentes (eq) de aminoácidos para reaccionar más plenamente. Los disolventes líquidos deben convertirse en volumen por densidad. El 5 eq muestra que la cantidad de entrada del compuesto calculado se amplifica por un factor de cinco.

2. Preparación de la resina

NOTA: Elija la cantidad de resina cargada de acuerdo con la longitud del péptido de acoplamiento.

  1. Pesar 302 mg de resina Rink-amide MBHA (0,331 mM/g cargada) en una columna (depósito de 20 ml). Agregue 5-10 ml de DCM o DMF en la columna para hinchar la resina bajo N2 burbujeando durante 30 min.
  2. A continuación, cierre el interruptor N2 y luego encienda el interruptor de succión de la bomba de vacío para eliminar el solvente. Luego, lave las resinas secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.

3. Desprotección Fmoc N-terminal

NOTA: La desprotección por morfolina requiere 30 min, y la desprotección por piperidina toma 5 min.

  1. Prepare la solución de desprotección N-terminal de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc): prepare un volumen suficiente (500 ml) de piperidina al 20% (v/v) o morfolina al 50% (v/v) en DMF en un recipiente de vidrio para la desprotección del grupo Fmoc.
  2. Añadir 10 ml de la solución de desprotección a la columna, burbujear N2 en la solución durante 30 min o 5 min 2x, y repetir los procedimientos de desprotección 2x.
  3. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
  4. Detectar la resina como una solución de color amarillo oscuro con ninhidrina al 5% (prueba de Kaiser) después de cada desprotección para confirmar la ausencia del grupo Fmoc antes del paso de acoplamiento. En detalle, agregue 1 ml de DMF a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 μL de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio calentado a 130 ° C durante 3 minutos para evaluar los cambios en el color de la resina.
  5. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.

4. Acoplamiento del péptido lineal (Figura 2)

NOTA: Cuando las secuencias de péptidos sintéticos contienen dos o más unidades repetitivas, el procedimiento de acoplamiento se puede llevar a cabo directamente seleccionando el tipo de aminoácido, como Fmoc-AA-OH o Fmoc-AAA-OH, y así sucesivamente. Se requieren algunos aminoácidos especiales con impedimento estérico y péptidos con secuencias de aminoácidos más largas para extender adecuadamente el tiempo de reacción para el acoplamiento.

  1. Para un solo paso de acoplamiento, tome como ejemplo el acoplamiento del residuo de Cys (sintetice escamas de resina de 300 mg). Preparar una solución de mezcla que incluya Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) y HATU (5 eq, 206 mg) o Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) y HOBT (5 eq, 106 mg) en un tubo de polipropileno y disolverla en 3 mL de DMF.
  2. Añadir 173 μL de DIPEA (10 eq) o 154 μL de DIC (10 eq) a la solución de Cys para activar el aminoácido. Deje que la mezcla se active previamente durante 1 minuto. Añadir la mezcla a la columna con resina, y burbujear conN2 durante 2 h.
    NOTA: El tiempo de reacción específico requerido debe estandarizarse para detectar ninhidrina al 5%.
  3. Después del acoplamiento, agregue 1 ml de DMF a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 μL de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio calentado a 130 ° C durante 3 minutos. Observe el cambio de resina a incolora para confirmar la ausencia de un grupo amino libre antes del paso de desprotección.
  4. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
  5. Agregue 10 ml de la solución de desprotección a la columna, burbujee con N2 durante 30 min o 5 min 2x, agregue solución nueva y repita los procedimientos de desprotección 2x.
  6. Repita los siguientes pasos: desprotección del grupo Fmoc; detección de desprotección de resina; lavado de la resina; acoplamiento del aminoácido; Detección de la reacción de acoplamiento. Repita el paso de acoplamiento hasta que se sinteticen todos los péptidos.
    NOTA: Use la prueba de Kaiser para controlar si cada paso de la desprotección está completo o si cada paso del acoplamiento de aminoácidos es completo. Alternativamente, una pequeña cantidad de péptido puede ser escindido de la resina y comprobado por LC-MS para un acoplamiento exitoso.

5. Bisalquilación entre Met y Cys (Figura 3)

  1. Construya un péptido lineal con Met y Cys repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratación y secar conN2 para el siguiente uso (repetir 2x) después del acoplamiento peptídico lineal.
  2. Pesar 100 mg de la resina obtenida en el paso anterior en una columna (depósito de 20 mL) y lavar la resina con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) antes de la etapa de acoplamiento.
  3. Prepare una solución para eliminar el grupo de protección Cys trt(trityl). Preparar un volumen suficiente (100 ml) de mezcla TFA/TIS/DCM (3:5:92) en un recipiente de vidrio para eliminar el grupo protectiove.
  4. Añadir 5-10 ml de la solución de TFA/TIS/DCM (3:5:92) a la columna para retirar el grupo de protección durante 10 min. Repita seis veces con N2 burbujeando hasta que el color amarillo desaparezca por completo.
  5. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
  6. Prepare una solución para reaccionar con Cys desprotegido. Preparar un volumen suficiente (50 ml) de solución de mezcla (DMF) incluyendo enlazador dihalogenado (2 eq) y DIPEA (4 eq) para reaccionar con Cys desprotegido.
  7. Añadir 5-10 ml de la solución de reacción a la columna para reaccionar con Cys desprotegido durante al menos 3 h con burbujeo deN2 . Deshidratar con metanol anhidro y secar conN2 para el siguiente uso.
  8. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
  9. Prepare una solución para la ciclación peptídica: prepare un volumen suficiente (20 ml) de mezcla de TTAP (TTA: TIS:H 2O = 95: 2.5: 2.5) en un recipiente de vidrio en la campana extractora para la ciclación de péptidos.
  10. Añadir 5-10 ml de la solución de mezcla de TFA al tubo de polipropileno y escindir la resina bajo el cóctel de TFA durante 3 h.
    PRECAUCIÓN: El TFA es altamente corrosivo e irritante; El proceso de escisión peptídica debe realizarse en una campana extractora.
  11. Realice los pasos 7.1-7.5 para obtener una solución peptídica lineal mediante purificación en fase líquida en fase inversa (HPLC). Liofilizar la solución para el próximo uso.

6. Ciclación de la sal de propargil sulfonio (Figura 4)

  1. Construya un péptido lineal con Met y Cys repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con la resina para deshidratar y secar conN2 para el siguiente uso (repetir dos veces) después del acoplamiento peptídico lineal.
  2. Pesar 100 mg de la resina obtenida en el paso anterior en una columna (depósito de 20 mL) y lavar la resina con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) antes de la etapa de acoplamiento.
  3. Realice los pasos 7.1-7.5 para obtener una solución peptídica lineal por HPLC y liofilique la muestra, como se mencionó, para su próximo uso.
  4. Preparar una solución acuosa de HCOOH al 1% (en volumen) y bromuro de propargil al 1,0 mM (5 eq) y añadir a la solución peptídica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml de MeCN/H2O[1:1, v/v]).
  5. A continuación, agitar la reacción de acoplamiento de Met y bromuro de propargil a temperatura ambiente durante 12 h.
  6. Después de la reacción, disolver el producto en un tubo de polipropileno en acetonitrilo y filtrarlo a través de una membrana de filtro de 0,22 μm. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.
  7. En el último paso, añadir el péptido con bromuro de propargil a un tubo de polipropileno, mantener el pH de la solución de reacción a 8,0 añadiendo (NH4)2solución de CO3 y agitar la mezcla de reacción a 37 °C durante 12 h. Este paso obtiene el péptido cíclico de la sal de propargil sulfonio.
  8. Recoger la última mezcla de reacción: disolverla en un tubo de polipropileno en acetonitrilo y filtrarla a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.

7. Purificación de péptidos cíclicos

  1. Construya sustratos peptídicos lineales en resina Rink-amide MBHA repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratación y secar conN2 para el siguiente uso (repetir dos veces) después del acoplamiento peptídico lineal.
  2. Prepare un volumen suficiente de cóctel de escote (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) en la campana extractora. Añadir 1-5 ml de solución de mezcla de TFA al tubo de polipropileno y escindir la resina bajo el cóctel de TFA durante 3 h.
  3. A continuación, seque secuencialmente la resina bajo un vapor deN2 en la columna. Alternativamente, use un dispositivo de filtro para filtrar la resina y recolectar la solución peptídica. Luego, agregue 20 ml de éter a la solución peptídica para precipitar el péptido, centrifugar a 3,500 x g durante 5 minutos y repetir dos veces. Recoja el precipitado de péptido crudo y séquelo bajo una corriente de N2 para el siguiente paso.
  4. Disuelva 200 mg de péptido crudo en un tubo de polipropileno en 4 ml de solución de acetonitrilo-agua y fíjelo a través de un filtro de 0,22 μm. Transfiera el péptido a un inserto de vial de HPLC. Coloque el inserto en el muestreador automático de un sistema HPLC semipreparativo de fase inversa equipado con una columna C18 de 5 μm, 4,6 mm x 250 mm y un bucle de inyección de 1 ml.
  5. Purificar y aislar el péptido utilizando un programa de gradiente de 5% -95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de TFA durante 30 minutos mientras monitorea los espectros de HPLC usando UV a 254 nm. Confirme el peso molecular del péptido mediante LC-MS, recoja la solución del péptido y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Todos los péptidos lineales se sintetizaron en resina Rink-amide MBHA mediante síntesis manual estándar de fase sólida Fmoc. Se construyó un modelo de hexapéptido cíclico (Ac (ciclo-I)-WMAAAC-NH2) como se describe en la Figura 5A. En particular, se generó un nuevo centro quiral en la correa por alquilación Met, con los dos epímeros del péptido cíclico (Ia, Ib) confirmados por HPLC de fase inversa. Además, la conversión y la proporción de epímeros se determinaron utilizando la integración de HPLC de fase inversa. Los péptidos cíclicos Ac-(ciclo-I)-WMAAAC-NH2 1-Ia y 1-Ib, generados a partir del hexapéptido Ac-WMAAAC-NH2, exhibieron distintos tiempos de retención e idénticos pesos moleculares (Figura 5B). A continuación, se probó más a fondo la tolerancia del péptido cíclico a diferentes grupos funcionales, como se muestra en la Figura 5C. La eficiencia de cierre de bucle de los 10 péptidos lineales se evaluó utilizando un enlazador dihalogenado, con los resultados mostrando que todos los péptidos generaron eficientemente los péptidos cíclicos correspondientes. En comparación con los otros péptidos cíclicos, un péptido cíclico hexacíclico modelo con altas tasas de conversión produjo una relación diferencial de 1:1 de los epímeros y pudo ser separado por HPLC. Sin embargo, en algunos casos, los epímeros peptídicos no pudieron separarse en condiciones de HPLC, probablemente debido a que el centro quiral de sulfonio del epímero no es muy estable y se racemiza lentamente en mezclas de epímeros. La eficiencia de reacción de los epímeros (1-Ia) con piridirincioles (PyS) (10 mM) se examinó mediante HPLC. La figura 5D muestra las trazas de HPLC de la conversión dependiente del tiempo entre el péptido cíclico (1 mM) y su producto conjugado. Las trazas muestran claramente la reducción dependiente del tiempo del péptido 1-Ia con PyS en PBS (pH 7.4).

Otra estrategia para el cierre del anillo peptídico fue que, en primer lugar, se unió un grupo propargil a Met, y luego el centro de propargil sulfonio formado desencadenó una reacción tiol-yne para generar un péptido cíclico. En esta estrategia, el tamaño del anillo y la secuencia peptídica no afectaron la reacción de ciclación, y el péptido contenía dos o tres aminoácidos solo se usaban como modelo para cerrar el ciclo. La ruta sintética de la ciclación de péptidos intramoleculares se describe en la Figura 6A. Además, se construyó un péptido modelo Met propargilado simplificado como se describe en la Figura 6B. Los resultados mostraron que el rendimiento del péptido modelo MC podría ser de hasta el 80% cuando el pH de la solución de reacción se estableció en 8.0 (MC se refiere a un péptido cíclico modelo sintetizado por esta ruta; Figura 6A). Además, el péptido modelo MC fue aislado y purificado por HPLC (Figura 6D), y su peso molecular fue confirmado por LC-MS (Figura 6C). Como se muestra en la Figura 6E, el cambio químico se caracterizó además por RMN 1H y coherencia cuántica simple heteronuclear (HSQC). Además, se agregó el ditiothreitol (DTT) para intentar abrir el anillo de sulfonio para explorar la estabilidad de MC. Los resultados no mostraron adición o apertura de anillos después de 24 h (Figura 6F).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de la configuración experimental para un péptido de fase sólida basado en Fmoc para sintetizar péptidos. La columna peptídica se colocó en el reactor de fase sólida a través de llaves de paso de tres vías con nitrógeno o argón burbujeando a través de la columna durante la síntesis de péptidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Péptidos CM lineales sintéticos intermoleculares sobre resina. Todos los péptidos lineales se sintetizaron en resina Rink-amide MBHA mediante síntesis manual estándar de fase sólida Fmoc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Rutas sintéticas para la ciclación de péptidos a través de la bisalquilación Cys y Met. Los péptidos lineales que contienen Met y Cys se construyeron como péptidos cíclicos estabilizados. Primero, el Cys protegido por trt fue desprotegido con un 3% de TFA en DCM. Luego, se agregaron un enlazador dihalogenado (2 eq) y DIPEA (4 eq) para reaccionar con Cys durante 3 h. Finalmente, la ciclación entre Cys y Met se completó cuando la resina se escindió en una solución de escisión de TFA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Rutas sintéticas para la ciclación de péptidos a través de Cys y Met tiol-yne. En primer lugar, los péptidos lineales se purificaron y caracterizaron por HPLC y LC-MS. La reacción ocurrió bajo las siguientes condiciones: una solución que incluía el compuesto (0,2 mM, 1,0 eq) en 0,2 ml de MeCN/H2O (1:1, v/v), solución acuosa HCOOH al 1% (en volumen) y bromuro de propargil (1,0 mM, 5,0 eq) se agitó a temperatura ambiente durante12h a un pH de 8,0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Esquema de síntesis de péptidos cíclicos mediante bisalquilación entre Cys y Met. (A) Ilustración esquemática de la ciclación peptídica por Cys y Met. (B) El espectro HPLC y LC-MS de los epímeros (1-Ia y 1-Ib). (C) Se probó la tolerancia funcional al residuo de los diferentes péptidos. (D) Trazas de HPLC de la conversión dependiente del tiempo entre epímeros (1-Ia; 1 mM) y sus productos conjugados. Esta cifra es una modificación de la reportada por Wang et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Esquema de síntesis de péptidos cíclicos utilizando una reacción tipo tiol-yne. (A) Fácil construcción de la ciclación peptídica por la reacción tiol-yne. MC se refiere a un péptido cíclico modelo sintetizado por la ruta. (B) Ciclación peptídica intramolecular de diferentes péptidos lineales. a = 1 ml de solución acuosa de CO3 1 M (NH4)2. b = 1% et3N en 1 mL de MeCN/H2O (1:1). Abreviaturas: Ahx = ácido 6-aminocaproico. El rendimiento se calculó como el porcentaje del producto determinado por pesaje. La conversión representó la cantidad de material de partida que reaccionó por HPLC. (C) El espectro LC-MS del péptido de ciclación MC. (D) El espectro HPLC del péptido de ciclación MC. (E) Caracterizaciónde espectros de RMN y HSQC de 1 H de los péptidos cíclicos MC. (F) espectros de RMN de 1 H dela conversión dependiente del tiempo entre el péptido cíclico MC y la TDT en D2O durante 3 h, 6 h, 12 h y 24 h. Esta cifra es una modificación de la reportada por Hou et al.31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El enfoque sintético descrito en este documento proporciona un método para sintetizar péptidos cíclicos utilizando Cys y Met en la secuencia peptídica, en la que los péptidos lineales básicos se construyen mediante técnicas comunes de síntesis de péptidos en fase sólida. Para la bisalquilación de péptidos cíclicos entre Cys y Met, toda la ruta sintética se puede dividir en tres procesos principales: la desprotección de Cys en la resina, el acoplamiento del enlazador y la ciclación entre Cys y Met en una solución de escisión de ácido trifluoroacético. En particular, se encontró que la eliminación del grupo protector de Cys era un paso crítico para la posterior reacción de cierre del anillo. Por lo tanto, trt-Cys fue desprotegido, y esto se hizo hasta que la solución no tuvo color amarillo aparente. Otros estudios mostraron que los péptidos cíclicos desarrollados por la metodología de bisalquilación entre Cys y Met podrían extenderse al cierre de bucle en una variedad de péptidos, con la condición de que el péptido contenga los aminoácidos Cys y Met. Además, la secuencia peptídica y el enlazador también podrían ajustarse aún más de acuerdo con el diseño experimental (Figura 5). Por lo tanto, era necesario monitorear la síntesis por LC-MS.

Para péptidos cíclicos en la reacción de tipo tiol-yne, en primer lugar, los péptidos lineales también se construyeron mediante técnicas comunes de síntesis de péptidos en fase sólida en resina, con las siguientes reacciones llevadas a cabo en la solución de fase líquida. Los péptidos crudos se separaron de la resina y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Se añadió una solución de péptidos y bromuro de propargil a la reacción durante 12 h, junto con 0,2 ml de MeCN/H2O(1:1, v/v) y una solución acuosa HCOOH al 1%, y los productos se purificaron inmediatamente mediante HPLC de fase inversa. Sorprendentemente, la reacción de cierre de anillo ocurrió cuando el pH de la solución de reacción se incrementó a 8.0. Este estudio ha desarrollado un método que restringe el péptido a una estructura de conformación cíclica con buena estabilidad a través de una reacción de tipo tiol-yne. Además, fue necesario ajustar el disolvente para el cierre del bucle peptídico debido a que la hidrofilicidad y la hidrofobicidad de los péptidos eran diferentes. Por ejemplo, el pH del péptido hidrófilo se ajustó mediante (NH4)2CO 3, y el péptido hidrófobo se ajustó mediante un disolvente mixto (solución de Et3 N al 1% en MeCN/H2Oal 50%; Figura 6).

En los últimos años, se han desarrollado diversas tecnologías de ligadura para sintetizar péptidos cíclicos, generando estas tecnologías enlaces peptídicos naturales y enlaces troncales no naturales32. Sin embargo, persisten desafíos en el campo de los péptidos cíclicos sintéticos. En primer lugar, la secuencia de aminoácidos del péptido tiene un efecto estérico, y la eficiencia de la ciclación puede verse afectada por los residuos cercanos al sitio de ciclación. En segundo lugar, la estructura espacial de los péptidos es diversa, y puede ser necesario elegir cuidadosamente el sitio de conexión durante el cierre del anillo en el mismo sitio. Finalmente, las secuencias peptídicas contienen aminoácidos hidrófilos o hidrófobos y, por lo tanto, se debe considerar la solubilidad del disolvente de reacción. Por lo tanto, se debe poner más esfuerzo en identificar la ciclación en el sitio, la solubilidad y los isómeros para desarrollar aún más las aplicaciones de péptidos cíclicos en la industria farmacéutica.

En esta investigación, se diseñaron una serie de protocolos de macrociclación fáciles utilizando bisalquilación entre Cys y Met o mediante una reacción de tipo tiol-yne para resolver los desafíos de sintetizar péptidos cíclicos. Afortunadamente, estas reacciones fueron fáciles, altamente eficientes y libres de catalizadores metálicos. Se ha demostrado que los métodos desarrollados funcionan tanto intermolecular como intramolecularmente y tienen una tolerancia funcional satisfactoria del grupo. Además, estos métodos se desarrollaron para introducir la ciclación por restricción, asegurando que la cadena peptídica se estabilice más conformacionalmente, mejorando así la afinidad de unión a proteínas diana y reduciendo la unión de proteínas no específicas. Además, mediante el uso de diseños razonables, la selectividad del sitio de reacción también podría mejorarse formando un péptido de ciclación estabilizado conformacionalmente. En general, la ciclación de la cadena peptídica generó compuestos biológicamente activos, lo que indica que los péptidos cíclicos son candidatos prometedores a fármacos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos el apoyo financiero del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFC2103900); las subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de China (21778009 y 21977010); la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2022A1515010996 y 2020A1515010521): el Comité de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 y JCYJ20200109140406047); y la subvención Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Los autores agradecen el apoyo de la revista Chemical Science, The Royal Society of Chemistry para la referencia 30 y The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, para la referencia 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography		 SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Tags

Química Número 187 Péptidos cíclicos bisalquilación/desalquilación bromuro de propargilo estabilización cisteína metionina
Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,… More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter