Summary
Detta protokoll presenterar syntesen av cykliska peptider via bisalkylering mellan cystein och metionin och den facila tiolen-yne-reaktionen som utlöses av propargylsulfoniumcentret.
Abstract
Under de senaste åren har cykliska peptider väckt ökad uppmärksamhet inom läkemedelsupptäckt på grund av deras utmärkta biologiska aktiviteter, och som en följd av detta används de nu kliniskt. Det är därför viktigt att söka effektiva strategier för att syntetisera cykliska peptider för att främja deras tillämpning inom läkemedelsupptäckt. Detta dokument rapporterar ett detaljerat protokoll för effektiv syntes av cykliska peptider med användning av on-harts eller intramolekylär (intermolekylär) bisalkylering. Med hjälp av detta protokoll syntetiserades linjära peptider genom att dra nytta av fastfaspeptidsyntes med cystein (Cys) och metionin (Met) kopplade samtidigt på hartset. Vidare syntetiserades cykliska peptider via bisalkylering mellan Met och Cys med hjälp av en avstämbar tjuder och ett on-tether sulfoniumcenter. Hela den syntetiska vägen kan delas in i tre huvudprocesser: avskyddet av Cys på hartset, kopplingen av länkaren och cykliseringen mellan Cys och Met i en trifluorättiksyra (TFA) klyvningslösning. Dessutom, inspirerad av sulfoniumcentrets reaktivitet, fästes en propargylgrupp till Met för att utlösa tiolon-yne-tillsats och bilda en cyklisk peptid. Därefter torkades de råa peptiderna och löstes i acetonitril, separerades och renades sedan genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Molekylvikten för den cykliska peptiden bekräftades genom vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS), och stabiliteten hos den cykliska peptidkombinationen med reduktanten bekräftades ytterligare med användning av HPLC. Dessutom analyserades det kemiska skiftet i den cykliska peptiden med 1 H kärnmagnetisk resonans (1H NMR) spektra. Sammantaget syftade detta protokoll till att upprätta en effektiv strategi för att syntetisera cykliska peptider.
Introduction
Protein-proteininteraktioner (PPI)1 spelar en avgörande roll i läkemedelsforskning och utveckling. Att konstruera stabiliserade peptider med en fast konformation med kemiska medel är en av de viktigaste metoderna för att utveckla mimetiska motiv av PPI2. Hittills har flera cykliska peptider som riktar sig mot PPI utvecklats för klinisk användning3. De flesta peptider är begränsade till en α-helix-konformation för att minska konformationsentropin och förbättra den metaboliska stabiliteten, målbindande affinitet och cellpermeabilitet 4,5. Under de senaste 2 decennierna har sidokedjorna av Cys 6,7, lysin8,9, tryptofan 10, arginin 11 och Met12,13 satts in i onaturliga aminosyror för att fixera peptiden i en cyklisk konformation. Sådana cykliska peptider kan rikta in sig på ett unikt kemiskt utrymme eller speciella platser och därigenom utlösa en kovalent reaktion för att bilda protein-peptidkovalent bindning14,15,16,17. I en ny rapport från Yu et al., en kloracetamid förankrades på domänen för peptidligander, vilket säkerställde en kovalent konjugeringsreaktion med utmärkt proteinspecificitet18. Dessutom införlivades elektrofila stridsspetsar, såsom akrylamid och arylsulfonylfluorid (ArSO2F), ytterligare i peptider av Walensky et al.19 för att bilda stabiliserade peptidkovalenta hämmare och förbättra antitumöreffekten av peptidhämmare. Därför är det mycket viktigt att införa ytterligare en funktionell grupp för att kovalent modifiera proteinpeptidligander20. Dessa grupper reagerar inte bara med proteiner på sidokedjan utan stabiliserar också peptidens sekundära struktur21. Appliceringen av kovalent modifierade proteiner inducerade av peptidligander är emellertid begränsad på grund av den komplicerade syntetiska vägen och den ospecifika bindningen av de kemiska grupperna22,23. Effektiva strategier för syntes av cykliska peptider är därför brådskande.
Inspirerad av de mångsidiga strategierna för cykliska peptider 2,24,25,26, försöker detta protokoll utveckla en enkel och effektiv metod för att stabilisera peptider. Dessutom noterade vi att sidokedjegruppen i en stabil peptid kunde reagera kovalent med ett målprotein när det var rumsligt nära peptidliganderna. Bristen på kemiskt modifierad Met fylldes av Deming-gruppen 2013 genom att utveckla en ny metod för att producera selektivt modifierad peptidmetionin27. Baserat på denna bakgrund fokuserade Shi et al. på utvecklingen av ringförslutningen av sidokedjor för att bilda ett sulfoniumsaltcentrum. När peptidliganden kombineras med målproteinet reagerar sulfoniumsaltgruppen kovalent med det rumsligt nära Cys-proteinet. har under de senaste åren utformat en ny metod för att stabilisera cyklisk peptid28. Sulfoniumsaltet på den cykliska peptiden reducerades av ett reduktionsmedel med en sulfhydrylgrupp som reversibelt reducerades till Met. Reaktionen hade emellertid låg effektivitet, vilket var skadligt för efterföljande biologiska applikationsstudier. I den aktuella studien designades en Met-Cys- och propargylbromid-Cys-ringstängningsreaktion, med ett enda sulfoniumsalt kvar på sidokedjan av den cykliska peptiden. Sulfoniumsaltet fungerade som en ny stridsspets som reagerade kovalent med proteinet Cys under rumslig närhet. Kortfattat cyklades en Cys- och Met-muterad peptid genom intramolekylär alkylering, vilket resulterade i generering av ett on-tether sulfoniumcenter. I denna process var bildandet av en sidokedjebro avgörande för cykliska peptider. Sammantaget beskriver detta protokoll en detaljerad sulfoniumbaserad peptidcyklisering som uppnås med hjälp av enkla reaktionsbetingelser och operationer. Syftet är att utveckla en potentiell metod för ytterligare breda biologiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av utrustning
VARNING: Morfolin, N,N-dimetylformamid (DMF), diklormetan (DCM), N,N-diisopropyletylamin (DIPEA), TFA, morfolin, piperidin, dietyleter och metanol är giftiga, flyktiga och frätande. Dessa reagenser kan skada människokroppen genom inandning, intag eller hudkontakt. För alla kemiska experiment, använd skyddsutrustning, inklusive engångshandskar, experimentella rockar och skyddsglasögon.
- Konstruera alla peptidsubstrat på rink-amid 4-metylbenshydrylamin (MBHA) harts med standard manuell Fmoc-baserad fastfaspeptidsyntes (SPPS)29, som visas i figur 1.
- Använd något av de två alternativen för att konstruera linjära peptider: en, syntetisera peptiden med hjälp av kondenseringsmedel 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tetrametyluroniumhexafluorfosfat (HATU) och ett reagens av DIPEA; eller två, syntetisera med användning av 1-hydroxibensotriazol (HOBT) och N,N'-diisopropylkarbodiimid (DIC) som amidkondensationsreagens. Välj ett lämpligt protokoll för peptidsyntes enligt peptidsekvensen.
- För att upprätta en manuell peptidsyntesanordning, ställ in modifierad vakuum fastfasutsugningsutrustning i en dragskåp och anslut den med en trevägs stoppkran. Placera sedan en polypropenfilterpatron eller glasreaktor på utrustningen medan den är ansluten till kväve (N2) gas.
OBS: För att modifiera vakuumutsugningsutrustningen, ta bort extraktionsröret och behåll det vakuumförseglade systemet. - Ladda MBHA-harts i de hartsfyllda kolumnerna och lös upp det i DMF. Justera omkopplaren på trevägsstoppkranarna för N2-bubblande och ta sedan bort lösningsmedlet i kolonnen med en arbetspump ansluten till ett vakuumsystem. Beräkna mängden aminosyra eller kondenseringsmedel som krävs med följande formel:
Aminosyra (g) och kondenseringsmedel (g) = hartsskala (g) × hartsbelastningskapacitet (mM/g) × ekvivalent (5 ekv) × molekylvikt (g/M)
OBS: Välj mängden laddat harts enligt längden på kopplingspeptiden. Flera ekvivalenter (eq) av aminosyror används för att reagera mer fullständigt. Flytande lösningsmedel måste omvandlas till volym efter densitet. 5 eq visar att ingångsmängden för den beräknade föreningen förstärks med en faktor fem.
2. Hartsberedning
OBS: Välj mängden laddat harts enligt längden på kopplingspeptiden.
- Väg upp 302 mg Rink-amid MBHA-harts (0,331 mM/g laddat) i en kolonn (20 ml behållare). Tillsätt 5-10 ml DCM eller DMF i kolonnen för att svälla hartset under N2 bubblande i 30 minuter.
- Stäng sedan N2-omkopplaren och slå sedan på vakuumpumpens sugbrytare för att ta bort lösningsmedlet. Tvätta sedan hartserna sekventiellt med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) 5x.
3. N-terminal Fmoc avskydd
OBS: Avskydd med morfolin kräver 30 min, och avskydd med piperidin tar 5 min.
- Förbered den N-terminala 9-fluorylmetyloxikarbonylen (Fmoc) avskyddslösningen: förbered en tillräcklig volym (500 ml) 20% (v / v) piperidin eller 50% (v / v) morfolin i DMF i en glasbehållare för Fmoc-gruppavskydd.
- Tillsätt 10 ml av avskyddslösningen till kolonnen, bubbla N2 i lösningen i 30 min eller 5 min 2x och upprepa avskyddsprocedurerna 2x.
- Töm lösningen med en vakuumpump och tvätta hartset sekventiellt med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) 5x.
- Upptäck hartset som en mörkgul färglösning med 5% ninhydrin (Kaiser-test) efter varje avskydd för att bekräfta frånvaron av Fmoc-gruppen före kopplingssteget. Tillsätt i detalj 1 ml DMF till en liten mängd harts och tillsätt 200 μl 5% ninhydrin till ett glasrör uppvärmt vid 130 ° C i 3 minuter för att bedöma förändringar i hartsfärgen.
- Töm lösningen med en vakuumpump och tvätta hartset sekventiellt med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) 5x.
4. Koppling av den linjära peptiden (figur 2)
OBS: När de syntetiska peptidsekvenserna innehåller två eller flera upprepande enheter kan kopplingsförfarandet utföras direkt genom att välja aminosyratyp, såsom Fmoc-AA-OH eller Fmoc-AAA-OH, och så vidare. Vissa speciella aminosyror med steriska hinder och peptider med längre aminosyrasekvenser krävs för att korrekt förlänga reaktionstiden för koppling.
- För ett enda kopplingssteg, ta kopplingen av Cys-rester som ett exempel (syntetisera 300 mg hartsskalor). Bered en blandningslösning inklusive Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 ekv, 292 mg) och HATU (5 ekv, 206 mg) eller Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 ekv, 292 mg) och HOBT (5 ekv, 106 mg) i ett polypropenrör och lös upp det i 3 ml DMF.
- Tillsätt 173 μl DIPEA (10 ekv) eller 154 μl DIC (10 ekv) till lösningen av Cys för att aktivera aminosyran. Låt blandningen föraktiveras i 1 min. Tillsätt blandningen till kolonnen med harts och bubbla den medN2 i 2 timmar.
OBS: Den specifika reaktionstiden som krävs bör standardiseras för att detektera 5% ninhydrin. - Efter koppling, tillsätt 1 ml DMF till en liten mängd harts och tillsätt 200 μl 5% ninhydrin till ett glasrör uppvärmt vid 130 °C i 3 minuter. Observera hartsförändringen till färglös för att bekräfta frånvaron av en fri aminogrupp före avskyddssteget.
- Töm lösningen med en vakuumpump och tvätta hartset sekventiellt med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) 5x.
- Tillsätt 10 ml av avskyddslösningen till kolonnen, bubbla medN2 i 30 min eller 5 min 2x, tillsätt ny lösning och upprepa avskyddsprocedurerna 2x.
- Upprepa följande steg: avskydd av Fmoc-gruppen; upptäcka hartsavskydd; tvätta hartset; koppling av aminosyran; detektera kopplingsreaktionen. Upprepa kopplingssteget tills alla peptider har syntetiserats.
OBS: Använd Kaiser-testet för att övervaka om varje steg i avskyddet är klart eller om varje steg i aminosyrakopplingen är grundligt. Alternativt kan en liten mängd peptid klyvas från hartset och kontrolleras av LC-MS för framgångsrik koppling.
5. Bisalkylering mellan Met och Cys (figur 3)
- Konstruera en linjär peptid med Met och Cys genom att upprepa steg 4.1-4.6. Tillsätt 10 ml vattenfri metanol till kolonnen med harts för dehydratisering och torka medN2 för nästa användning (upprepa 2x) efter linjär peptidkoppling.
- Väg upp 100 mg av hartset som erhållits i föregående steg i en kolonn (20 ml behållare) och tvätta hartset med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) före kopplingssteget.
- Förbered en lösning för att ta bort skyddsgruppen Cys trt (trityl). Bered en tillräcklig volym (100 ml) TFA/TIS/DCM-blandning (3:5:92) i en glasbehållare för att avlägsna skyddsgruppen.
- Tillsätt 5-10 ml av lösningen av TFA/TIS/DCM (3:5:92) i kolonnen för att ta bort skyddsgruppen i 10 minuter. Upprepa sex gånger med N2 bubblande tills den gula färgen helt försvinner.
- Töm lösningen med en vakuumpump och tvätta hartset sekventiellt med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) 5x.
- Förbered en lösning för att reagera med avskyddad Cys. Bered en tillräcklig volym (50 ml) blandningslösning (DMF) inklusive dihalogenerad linker (2 ekv) och DIPEA (4 eq) för att reagera med avskyddad Cys.
- Tillsätt 5-10 ml av reaktionslösningen till kolonnen för att reagera med avskyddad Cys i minst 3 timmar med N2 bubblande. Dehydrera med vattenfri metanol och torka medN2 för nästa användning.
- Töm lösningen med en vakuumpump och tvätta hartset sekventiellt med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) 5x.
- Förbered en lösning för peptidcyklisering: förbered en tillräcklig volym (20 ml) TFA-blandning (TFA: TIS:H2O = 95: 2.5: 2.5) i en glasbehållare i rökhuven för peptidcyklisering.
- Tillsätt 5-10 ml av TFA-blandningslösningen till polypropenröret och klyv hartset under TFA-cocktailen i 3 timmar.
VARNING: TFA är mycket frätande och irriterande; Peptidklyvningsprocessen bör utföras i en dragskåp. - Utför steg 7.1-7.5 för att erhålla en linjär peptidlösning genom omvänd fas vätskefasrening (HPLC). Frys-torka lösningen för nästa användning.
6. Propargylsulfoniumsaltcyklisering (figur 4)
- Konstruera en linjär peptid med Met och Cys genom att upprepa steg 4.1-4.6. Tillsätt 10 ml vattenfri metanol till kolonnen med hartset för dehydratisering och torka medN2 för nästa användning (upprepa två gånger) efter linjär peptidkoppling.
- Väg upp 100 mg av hartset som erhållits i föregående steg i en kolonn (20 ml behållare) och tvätta hartset med DCM (5-10 ml) och DMF (5-10 ml) före kopplingssteget.
- Utför steg 7.1-7.5 för att erhålla en linjär peptidlösning med HPLC och frystorka provet, som nämnts, för nästa användning.
- Bered en 1% HCOOH vattenlösning (i volym) och 1,0 mM propargylbromid (5 ekv) och tillsätt till Met-peptidlösningen (0,2 mM, 1 ekv; 0,2 ml MeCN/H2O[1:1, v/v]).
- Skaka sedan kopplingsreaktionen för Met och propargylbromid vid rumstemperatur i 12 timmar.
- Efter reaktionen löser du upp produkten i ett polypropenrör i acetonitril och filtrerar det genom ett 0,22 μmfiltermembran. Rena sedan lösningen med omvänd fas HPLC omedelbart och frystorka den till pulver för nästa användning.
- I det sista steget tillsätt peptiden med propargylbromid till ett polypropenrör, håll reaktionslösningens pH vid 8,0 genom tillsats av (NH4)2CO3-lösning och skaka reaktionsblandningen vid 37 °C i 12 timmar. Detta steg erhåller den cykliska peptiden av propargylsulfoniumsalt.
- Samla den sista reaktionsblandningen: lös upp den i ett polypropenrör i acetonitril och filtrera den genom ett 0,22 μm filtermembran. Rena sedan lösningen med omvänd fas HPLC omedelbart och frystorka den till pulver för nästa användning.
7. Rening av cykliska peptider
- Konstruera linjära peptidsubstrat på Rink-amid MBHA-harts genom att upprepa steg 4.1-4.6. Tillsätt 10 ml vattenfri metanol till kolonnen med harts för dehydratisering och torka medN2 för nästa användning (upprepa två gånger) efter linjär peptidkoppling.
- Förbered en tillräcklig volym klyvningscocktail (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) i dragskåpet. Tillsätt 1-5 ml TFA-blandningslösning till polypropenröret och klyva hartset under TFA-cocktailen i 3 timmar.
- Torka sedan hartset sekventiellt under en ånga avN2 i kolonnen. Alternativt kan du använda en filteranordning för att filtrera hartset och samla peptidlösningen. Tillsätt sedan 20 ml eter till peptidlösningen för att fälla ut peptiden, centrifugera vid 3 500 x g i 5 minuter och upprepa två gånger. Samla upp den råa peptidfällningen och torka den under en ström avN2 för nästa steg.
- Lös upp 200 mg råpeptid i ett polypropenrör i 4 ml acetonitrilvattenlösning och filtrera den genom ett 0,22 μm filter. Överför peptiden till en HPLC-injektionsflaska. Placera insatsen i autosamplern i ett semi-preparativt HPLC-system med omvänd fas som är utrustat med en C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm kolonn och en 1 ml injektionsslinga.
- Rena och isolera peptiden med hjälp av ett gradientprogram på 5% -95% acetonitril i vatten med 0,1% TFA över 30 min medan du övervakar HPLC-spektra med UV vid 254 nm. Bekräfta peptidmolekylvikten med LC-MS, samla lösningen av peptiden och frystorka den i pulver för nästa användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla linjära peptider syntetiserades på Rink-amid MBHA-harts genom standard manuell Fmoc fastfassyntes. En modellcyklisk hexapeptid (Ac (cyklo-I)-WMAAAC-NH2) konstruerades enligt beskrivningen i figur 5A. I synnerhet genererades ett nytt on-tether kiralt centrum genom Met-alkylering, med de två epimererna av cyklisk peptid (Ia, Ib) bekräftad av omvänd fas HPLC. Vidare bestämdes omvandlingen och förhållandet mellan epimerer med användning av integrationen av omvänd fas HPLC. Cykliska Ac-(cyklo-I)-WMAAAC-NH2 peptider 1-Ia och 1-Ib, genererade från hexapeptid Ac-WMAAAC-NH2, uppvisade distinkta retentionstider och identiska molekylvikter (figur 5B). Därefter testades toleransen för den cykliska peptiden till olika funktionella grupper ytterligare, vilket visas i figur 5C. Slingförslutningseffektiviteten för de 10 linjära peptiderna utvärderades med hjälp av en dihalogenerad länkare, där resultaten visade att alla peptider effektivt genererade motsvarande cykliska peptider. Jämfört med de andra cykliska peptiderna producerade en modell hexacyklisk cyklisk peptid med höga omvandlingshastigheter ett differentiellt förhållande på 1: 1 av epimererna och kunde separeras av HPLC. I vissa fall kunde emellertid peptidepimererna inte separeras under HPLC-förhållanden, troligen på grund av att epimerens sulfoniumkirala centrum inte var särskilt stabilt och långsamt racemiserades till epimerblandningar. Reaktionseffektiviteten hos epimererna (1-Ia) med pyridinrthioler (PyS) (10 mM) undersöktes sedan av HPLC. Figur 5D visar HPLC-spåren av den tidsberoende omvandlingen mellan den cykliska peptiden (1 mM) och dess konjugerade produkt. Spåren visar tydligt den tidsberoende reduktionen av peptid 1-Ia med PyS i PBS (pH 7,4).
En annan strategi för peptidringsförslutning var att först en propargylgrupp fästes vid Met, och sedan utlöste det bildade propargylsulfoniumcentret en tiolyn-yne-reaktion för att generera en cyklisk peptid. I denna strategi påverkade ringstorleken och peptidsekvensen inte cykliseringsreaktionen, med peptiden innehållande två eller tre aminosyror som bara användes som modell för att stänga slingan. Den syntetiska vägen för intramolekylär peptidcyklisering beskrivs i figur 6A. Dessutom konstruerades en förenklad propargylerad Met-modellpeptid enligt beskrivningen i figur 6B. Resultaten visade att modellpeptid MC: s utbyte kunde vara upp till 80% när reaktionslösningens pH sattes till 8,0 (MC hänvisar till en modellcyklisk peptid syntetiserad av denna väg; Figur 6A). Dessutom isolerades och renades modellpeptiden MC med HPLC (figur 6D), och dess molekylvikt bekräftades av LC-MS (figur 6C). Som visas i figur 6E kännetecknades det kemiska skiftet ytterligare av 1H NMR och heteronukleär enkel kvantkoherens (HSQC). Dessutom tillsattes ditiotreitol (DTT) för att försöka öppna sulfoniumringen för att utforska stabiliteten hos MC. Resultaten visade inga tillsats- eller ringöppningsprodukter efter 24 timmar (figur 6F).
Figur 1: Diagram över den experimentella installationen för en Fmoc-baserad fastfaspeptid för syntetisering av peptider. Peptidkolonnen placerades på fastfasreaktorn via trevägs stoppkranar med kväve eller argon som bubblade genom kolonnen under peptidsyntesen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Intermolekylära syntetiska linjära CM-peptider på harts. Alla linjära peptider syntetiserades på Rink-amid MBHA-harts genom standard manuell Fmoc fastfassyntes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Syntetiska vägar för peptidcyklisering via Cys och Met-bisalkylering. De linjära peptiderna innehållande Met och Cys konstruerades som stabiliserade cykliska peptider. Först avskyddades den trt-skyddade Cys med 3% TFA i DCM. Därefter tillsattes en dihalogenerad linker (2 eq) och DIPEA (4 eq) för att reagera med Cys i 3 timmar. Slutligen slutfördes cykliseringen mellan Cys och Met när hartset klyvdes i en TFA-klyvningslösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Syntetiska vägar för peptidcyklisering via Cys och Met-tiol-yne. Först renades de linjära peptiderna och kännetecknades av HPLC och LC-MS. Reaktionen inträffade under följande betingelser: en lösning inklusive föreningen (0,2 mM, 1,0 ekv) i 0,2 ml MeCN/H2O(1:1, v/v), 1 % HCOOH vattenlösning (i volym) och propargylbromid (1,0 mM, 5,0 ekv) skakades vid rumstemperatur i 12 timmar vid ett pH av 8,0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Syntesschema för cykliska peptider med bisalkylering mellan Cys och Met. (A) Schematisk illustration av peptidcyklisering av Cys och Met. (B) Epimerernas HPLC- och LC-MS-spektrum (1-Ia och 1-Ib). (C) Den funktionella resttoleransen för de olika peptiderna testades. D) HPLC-spår av den tidsberoende omvandlingen mellan epimerer (1-Ia; 1 mM) och deras konjugerade produkter. Denna siffra är en modifiering av den som rapporterats av Wang et al.30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Syntesschema för cykliska peptider med användning av en tiol-yne-typreaktion. (A) Facil konstruktion av peptidcyklisering genom tiol-yne-reaktionen. MC hänvisar till en modell cyklisk peptid syntetiserad av vägen. (B) Intramolekylär peptidcyklisering av olika linjära peptider. a = 1 ml 1 M (NH4)2CO3 vattenlösning. b = 1% Et3N i 1 ml MeCN/H2O (1:1). Förkortningar: Ahx = 6-aminokapronsyra. Utbytet beräknades som den procentandel av produkten som bestämdes genom vägning. Konvertering representerade mängden utgångsmaterial som reagerade av HPLC. (C) LC-MS-spektrumet för MC-cykliseringspeptiden. (D) HPLC-spektrumet för MC-cykliseringspeptiden. (E) 1H NMR- och HSQC-spektrakarakterisering av MC-cykliska peptider. (F) 1H NMR-spektra av den tidsberoende omvandlingen mellan MC-cyklisk peptid och DTT iD2Oi 3 h, 6 h, 12 h och 24 h. Denna siffra är en modifiering av den som rapporterats av Hou et al.31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det syntetiska tillvägagångssättet som beskrivs i detta dokument ger en metod för att syntetisera cykliska peptider med användning av Cys och Met i peptidsekvensen, där de grundläggande linjära peptiderna konstrueras av vanliga fastfaspeptidsyntestekniker. För bisalkylering av cykliska peptider mellan Cys och Met kan hela den syntetiska vägen delas in i tre huvudprocesser: avskyddet av Cys på hartset, kopplingen av länkaren och cykliseringen mellan Cys och Met i en trifluorättiksyraklyvningslösning. I synnerhet befanns avlägsnandet av den skyddande gruppen av Cys vara ett kritiskt steg för den efterföljande ringstängningsreaktionen. Därför avskyddades trt-Cys, och detta gjordes tills lösningen inte hade någon uppenbar gul färg. Ytterligare studier visade att cykliska peptider som utvecklats genom bisalkylering mellan Cys och Met-metodiken kunde utvidgas till loopförslutning i en mängd olika peptider, med villkoret att peptiden innehåller aminosyrorna Cys och Met. Dessutom kan peptidsekvensen och länkaren också justeras ytterligare enligt den experimentella designen (figur 5). Det var därför nödvändigt att övervaka syntesen av LC-MS.
För cykliska peptider i tiol-yne-typreaktionen konstruerades för det första linjära peptider också genom vanliga fastfaspeptidsyntestekniker på harts, med följande reaktioner utförda i vätskefaslösningen. Råpeptider klyvdes sedan från hartset och renades med omvänd fas HPLC. En lösning av peptider och propargylbromid tillsattes till reaktionen i 12 timmar, tillsammans med 0,2 ml MeCN/H2O(1:1, v/v) och 1% HCOOH vattenlösning, och produkterna renades sedan omedelbart med omvänd fas HPLC. Överraskande inträffade ringstängningsreaktionen när reaktionslösningens pH ökades till 8,0. Denna studie har utvecklat en metod som begränsar peptiden till en cyklisk konformationsstruktur med god stabilitet via en tiol-yne-typreaktion. Dessutom var det nödvändigt att justera lösningsmedlet för peptidslingans stängning på grund av att peptidernas hydrofilicitet och hydrofobicitet var olika. Exempelvis justerades pH för den hydrofila peptiden med (NH4)2CO3, och den hydrofoba peptiden justerades sedan med ett blandat lösningsmedel (1% Et3N-lösningi 50% MeCN/H2O; Figur 6).
Under de senaste åren har olika ligeringstekniker utvecklats för att syntetisera cykliska peptider, med dessa tekniker som genererar naturliga peptidbindningar och onaturliga ryggradslänkar32. Utmaningar kvarstår dock inom det syntetiska cykliska peptidfältet. För det första har aminosyrasekvensen hos peptiden en sterisk effekt, och effektiviteten av cyklisering kan påverkas av resterna nära cykliseringsstället. För det andra är peptidernas rumsliga struktur olika, och det kan vara nödvändigt att noggrant välja anslutningsplatsen under ringstängning på samma plats. Slutligen innehåller peptidsekvenser hydrofila eller hydrofoba aminosyror, och därför måste lösligheten hos reaktionslösningsmedlet beaktas. Därför bör mer ansträngning läggas på att identifiera cyklisering på platsen, löslighet och isomerer för att vidareutveckla cykliska peptidapplikationer inom läkemedelsindustrin.
I denna forskning utformades en serie facila makrocykliseringsprotokoll med bisalkylering mellan Cys och Met eller via en tiol-yne-typreaktion för att lösa utmaningarna med att syntetisera cykliska peptider. Lyckligtvis var dessa reaktioner enkla, mycket effektiva och metallkatalysatorfria. De utvecklade metoderna har visat sig fungera både intermolekylärt och intramolekylärt och har tillfredsställande funktionell grupptolerans. Dessutom utvecklades dessa metoder för att införa begränsningscyklisering, vilket säkerställer att peptidkedjan stabiliseras mer konformationsstabiliserad, vilket förbättrar målproteinbindningsaffiniteten och minskar ospecifik proteinbindning. Dessutom, genom att använda rimliga mönster, kan reaktionsplatsens selektivitet också förbättras genom att bilda en konformationsstabiliserad cykliseringspeptid. Sammantaget genererade peptidkedjecyklisering biologiskt aktiva föreningar, vilket indikerar att cykliska peptider är lovande läkemedelskandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner ekonomiskt stöd från Kinas nationella nyckel-FoU-program (2021YFC2103900); Natural Science Foundation of China beviljar (21778009 och 21977010); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2022A1515010996 och 2020A1515010521): Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 och JCYJ20200109140406047); och Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions bidrag (2019SHIBS0004). Författarna erkänner tidskriftsstöd från Chemical Science, The Royal Society of Chemistry för referens 30 och Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, för referens 31.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
| 1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
| 1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
| 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
| 2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
| 6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
| Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
| Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
| Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
| Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
| Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
| Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
| Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
| Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
| Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
| Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
| Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
| Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
| Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
| Formic acid | Energy | W810042 | |
| High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
| Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
| Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
| Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
| Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Triethylamine | Energy | B010737 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
| Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
- Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
- Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
- Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
- Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
- Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
- Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
- Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
- Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
- Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
- Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
- Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
- Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
- Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
- Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
- Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
- Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
- Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
- Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
