Summary
Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.
Abstract
Als hoofdingrediënt van vaccins kunnen adjuvantia de krachtige, wijdverspreide, aangeboren en adaptieve immuunresponsen geassocieerd met antigenen direct induceren of verbeteren. Ophiopogonine D (OP-D), een gezuiverd bestanddeel geëxtraheerd uit de plant Ophiopogon japonicus, is nuttig gebleken als vaccinadjuvans. De problemen van de lage oplosbaarheid en toxiciteit van OP-D kunnen effectief worden overwonnen door een laagenergetische emulgeringsmethode te gebruiken om nano-emulsie ophiopogonine D (NOD) te bereiden. In dit artikel wordt een reeks in vitro protocollen voor cellulaire activiteitsevaluatie onderzocht. De cytotoxische effecten van L929 werden bepaald met behulp van een celtelkit-8-test. Vervolgens werden de uitgescheiden cytokineniveaus en bijbehorende immuuncelnummers na de stimulatie en kweek van splenocyten van geïmmuniseerde muizen gedetecteerd door ELISA- en ELISpot-methoden. Bovendien werd het antigeenopnamevermogen in beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDC's), die werden geïsoleerd uit C57BL / 6-muizen en rijpten na incubatie met GM-CSF plus IL-4, waargenomen door laserscanning confocale microscopie (CLSM). Belangrijk is dat macrofaagactivatie werd bevestigd door het meten van de niveaus van IL-1β, IL-6 en tumornecrosefactor alfa (TNF-α) cytokines door ELISA-kits na het cocultureren van peritoneale macrofagen (PM's) van blanco muizen met het adjuvans gedurende 24 uur. Gehoopt wordt dat dit protocol andere onderzoekers directe en effectieve experimentele benaderingen zal bieden om de cellulaire responseffectiviteit van nieuwe vaccinadjuvantia te evalueren.
Introduction
Vaccins zijn een belangrijk middel om infectieuze en niet-overdraagbare ziekten te voorkomen en te behandelen. De juiste toevoeging van adjuvantia en toedieningsvoertuigen aan vaccinformuleringen is gunstig voor het verbeteren van de immunogeniciteit van antigenen en het genereren van langdurige immuunresponsen1. Naast de klassieke adjuvante aluin (aluminiumzout), zijn er zes soorten adjuvantia voor vaccins die momenteel op de markt worden gebracht: MF59 2,3, AS043, AS033, AS013, CpG10184 en Matrix-M5. Over het algemeen, wanneer het menselijk lichaam een virale aanval tegenkomt, nemen de eerste en tweede verdedigingslinie (huid, slijmvlies en macrofagen) het voortouw bij het opruimen van het virus, en ten slotte wordt de derde verdedigingslinie, waarbij de immuunorganen en immuuncellen betrokken zijn, geactiveerd. Aluminium- en aluminiumzouten zijn sinds de vroege jaren 1920 de meest gebruikte adjuvantia voor menselijke vaccins, die een effectieve aangeboren immuunrespons opwekken6. Er is echter voorgesteld dat de activering van antigeen-presenterende cellen (APC's) door klassieke adjuvantia, die de immuuncellen stimuleert om specifieke sets cytokines en chemokines te genereren, het mechanisme is waarmee adjuvantia werken en een van de redenen kan zijn waarom adjuvantia alleen voorbijgaande effecten uitoefenen op specifieke immuunresponsen7. De aanwezigheid van beperkte gelicentieerde adjuvantia voor menselijk gebruik is een beperkende factor voor het ontwikkelen van vaccins die effectieve immuunresponsen opwekken8.
Momenteel tonen steeds meer adjuvante studies het vermogen aan om een sterke cellulaire immuunrespons bij muizen te induceren. Van QS-21 is aangetoond dat het een gebalanceerde T-helper 1 (Th1) en T-helper 2 (Th2) immuunrespons induceert, hogere niveaus van antilichaamtiters produceert en de bescherming als adjuvans verlengt, maar de sterke toxiciteit en hemolytische eigenschappen beperken de ontwikkeling ervan als een op zichzelf staand klinisch adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenine-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) is een van de steroïde saponinen geïsoleerd uit de wortel van de Chinese medicinale plant Ophiopogon japonicas4. Bovendien is het de belangrijkste farmacologisch actieve component (Shen Mai San) gevonden in Radix Ophiopogonis en is bekend dat het bepaalde farmacologische eigenschappenheeft 11. Bovendien is het een lid van de Liliaceae-familie en wordt het op grote schaal gebruikt voor zijn remmende en beschermende effecten bij cellulaire ontsteking en myocardiale schade. OP-D verbetert bijvoorbeeld DNCB-geïnduceerde atopische dermatitis-achtige laesies en tumornecrosefactor alfa (TNF-α) inflammatoire HaCaT-cellen in BALB / c-muizen12. Belangrijk is dat OP-D de antioxidatieve bescherming van het cardiovasculaire systeem bevordert en het hart beschermt tegen doxorubicine-geïnduceerde autofagische schade door zowel reactieve zuurstofsoortengeneratie te verminderen als mitochondriale membraanschade te verstoren. Experimenten hebben aangetoond dat het nemen van OP-D met mono-desmoside helpt om de immuungezondheid te stimuleren, het aantal witte bloedcellen en de DNA-synthese te verhogen en antilichamen langer te laten duren13. Eerder is gebleken dat OP-D een adjuvans effect heeft14.
Nano-emulsies zijn olie-in-water nanoformulaties samengesteld uit een combinatie van oppervlakteactieve stoffen, olie, cosurfactanten en water12,15. Met deze nanovaccinontwerpen kunnen antigenen en adjuvantia samen worden ingekapseld om de immuunstimulatie te verbeteren, de antigenen te beschermen en de rijping van dendritische cellen (DC) te bevorderen16. Voor de ontwikkeling van deze nieuwe adjuvantia verkregen uit screening, is het belangrijk om geschikte methoden te vinden om hun cellulaire responsvermogen te evalueren.
Het doel van dit protocol is om systematisch te evalueren of adjuvantia fagocytose en de expressie van immuuncellen in in vitro celkweek kunnen verbeteren en om de belangrijkste experimentele methoden uit te werken. Het experiment is verdeeld in vier subsecties: (1) de toxiciteit van OP-D- en NOD-cellen voor L929-cellen wordt bepaald door de celtelkit-8 (CCK-8) -test; (2) de cytokinespiegels van endocriene IFN-γ en IL-17A en de overeenkomstige celaantallen bij geïmmuniseerde muizen worden gedetecteerd door splenocytenstimulatie en ELISpot-assays; (3) het antigeen presentatievermogen van DC's na adjuvante stimulatie wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie; en (4) de drie soorten cytokines, IL-1β, IL-6 en TNF-α, in de supernatanten verkregen uit peritoneale macrofagen (PM's) in normale muizen die gecocultureerd zijn met adjuvantia worden gedetecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle celexperimenten werden uitgevoerd in een celtechnisch laboratorium uitgerust met basisoperatiekamers, bufferkamers, steriele kweekkamers en identificatie- en analysekamers. De werkomgeving en omstandigheden waren vrij van microbiële besmetting en andere schadelijke factoren. De dierproeven werden uitgevoerd op basis van de Richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Commissie Voor Dierenwelzijn en Ethiek van de Derde Militaire Medische Universiteit.
1. Autoclaveren en materiaalvoorbereiding
- Bereid de reagentia en verbruiksartikelen, zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), schaar, tang en schuurgaas, door sterilisatie met vochtige warmte door gedurende 20 minuten bij 121 °C te autoclaveren.
- Voor de benodigde reagentia en apparatuur, zie de Tabel van materialen. Voor de formule van de blanco nano-emulsie (BNE), zie tabel 1.
2. L929 cytotoxiciteitstest
- Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 °C. Verzamel één tube bevroren L929-cellen uit vloeibare stikstof en ontdooi snel in een waterbad van 37 °C.
- Pipetteer de cellen snel na het ontdooien in een steriele centrifugebuis van 15 ml, voeg 2 ml DMEM toe en meng goed.
- Centrifugeer de monsters op 129 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 2 ml DMEM toe om de cellen te resuspenderen en centrifugeer de monsters opnieuw bij 129 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant weg, voeg 6 ml DMEM compleet medium (met 10% FBS) toe voor resuspensie en breng over in een T25 kweekkolf in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om gedurende 48 uur te kweken.
- Gooi het kweekmedium weg in de kweekkolf en was de cellen twee keer met 2 ml PBS. Voeg vervolgens 1 ml 0,25% trypsine toe om de cellen gedurende 1-2 minuten bij 37 °C te verteren.
- Wanneer afronding van de cellen wordt waargenomen, voegt u 4 ml DMEM compleet medium toe om de spijsvertering onmiddellijk te beëindigen en goed te mengen. Aspirateer vervolgens de cellen in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 129 x g .
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in 1 ml DMEM compleet medium. Gebruik een celsuspensie van 20 μL voor het tellen van cellen met behulp van celtelplaten en verdun de resterende cellen tot 1 x 105 cellen / ml met DMEM compleet medium.
- Voeg 100 μL ultrapuur water toe aan de periferie van een 96-well plaat en voeg 100 μL celverdunningsmiddel toe aan alleen de interne putten. Plaats de plaat in de incubator voor kleefcultuur gedurende 4 uur bij 37 °C.
- Nadat de cellen zich hechten, voegt u OP-D en NOD afzonderlijk toe in DMEM-volledig medium tot een eindvolume van 200 μL / put (de uiteindelijke concentraties van elk geneesmiddel zijn 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml en 30 μg / ml). Gebruik voor elke concentratie drie putten als replicaties. Plaats vervolgens de cellen terug in de incubator en kweek nog eens 24 uur.
- Verdun CCK-8 tot 10% met DMEM compleet medium en voeg 100 μL/put verdunningen met de adjuvans en celoplossingen toe aan de 96-well plaat. Plaats de plaat terug in de couveuse en incubeer nog eens 2-3 uur.
- Meng regelmatig tijdens het plateren van de celoplossing om inhomogeniteit als gevolg van celprecipitatie te voorkomen. Schud de plaat voorzichtig meerdere keren voor en na het toevoegen van de CCK-8 om het medium en de CCK-8-oplossing goed te mengen.
- Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer. Stel een nulpunt in met alleen medium en CCK-8 voor een basisopnamewaarde. Bereken nauwkeurige absorptiewaarden door de nulopnamewaarde af te trekken van de verkregen absorptiewaarde bij het plotten.
- Controleer of er geen bubbels aanwezig zijn in putten voordat u met de microplaatlezer test, omdat bubbels de test zullen verstoren.
3. Splenocytenstimulatie
- Immuniseer BALB/c-muizen van 6-8 weken met 30 μg eiwitantigeen plus 30 μg adjuvans via een intramusculaire injectie (200 μL) op dag 0, dag 7 en dag 14 volgens de volgende experimentele groepen: (1) PBS-groep, (2) antigeen (Ag)-groep, (3) antigeen + OP-D (Ag/OP-D)-groep, (4) antigeen + BNE (Ag/BNE)-groep, (5) antigeen + NOD (Ag/NOD) groep, en (6) antigeen + AlPO4 (Ag/Al) groep.
- Voorbereidingsruimte: Verwijder op dag 24 na de primaire immunisatie de muizen uit de dierenkamer en euthanaseer ze door een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital. Leg de muizen in een glazen schaal en laat 5 min weken in 75% alcohol.
- Plaats de centrifugebuizen op een centrifugebuizenrek, nummer de wegwerp petrischalen en voeg 5 ml PBS toe aan elke petrischaal met een pipet van 10 ml.
- Maak een incisie van 6-8 cm met een schaar in het midden van de linker ventrale kant van de muis, scheur de huid open, leg de buikwand bloot en lokaliseer de lange rode strook van de milt.
- Til het peritoneum aan de inferieure kant van de milt op met een tang, snijd het open en draai het omhoog om de milt bloot te leggen. Til de milt op met een tang, scheid het bindweefsel onder de milt met een oogheelkundige schaar en verwijder de milt.
- Leg de milt in een petrischaaltje met 5 ml PBS en fres met een zeef (200 mazen, 70 μm) en slijpstaaf. Breng na het malen de vloeistof over in een centrifugebuis van 15 ml met een elleboogdruppel in overeenstemming met de nummering.
- Centrifugeer de vloeistof bij 453 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg, voeg 3 ml rode bloedcellysisbuffer toe aan elke buis, resuspendeer de cellen en lyseer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10-12 ml PBS toe aan elke buis, meng de buis ondersteboven en centrifugeer gedurende 5 minuten op 453 x g . Gooi het supernatant weg, voeg 10 ml PBS toe aan elke centrifugebuis en resuspenseer de cellen.
- Neem 20 μL van elk monster in een putje van de celtelplaat en noteer het aantal levende cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.
- Centrifugeer de monsters op 453 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen, verdun tot 2,5 x 106 cellen/ml met RF-10 medium (formuleringsinformatie in tabel 2) en voeg toe aan een 96-well plaat bij 100 μL/put.
- Verdun het antigeen met RF-10 medium tot 10 μg/ml, voeg 100 μL toe aan elke put en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 °C in 5% CO2.
- Aspirateer de celsuspensie verkregen uit elke groep cellen in 1,5 ml centrifugebuizen, centrifugeer bij 453 x g gedurende 20 minuten en aspirateer het supernatant in een schone centrifugebuis.
- Voer IFN-γ en IL-17A-inhoudsdetectie uit volgens de instructies van de ELISA-kit. De methoden en procedures zijn als volgt.
- Bereid 1x wasbufferwerkoplossing (meegeleverd met de kit), standaard gradiëntconcentratieoplossing (verdunde cytokine standaardoplossing tot 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml en 15,6 pg/ml in de verdunningsbuffer R [1x] die bij de kit wordt geleverd), gebiotinyleerde antilichaamwerkoplossing (verdunde gebiotinyleerde antilichaamoplossing tot 1:100 met behulp van de verdunningsbuffer R [1x] die bij de kit is geleverd om de werkoplossing te vormen), bereidt u de standaardoplossing voor de wasbuffer, en streptavidin-HRP werkoplossing indien nodig.
- Voeg 100 μL/putje verdunde cytokine standaardoplossing toe aan de standaardput, 100 μL/putje monster in de monsterput (de verdunningsbuffer R [1x] die bij de kit wordt geleverd, wordt gebruikt voor de monsterverdunning) en 100 μL/putje verdunningsbuffer R (1x) aan de blanco controleput.
- Voeg de gebiotinyleerde antilichaamwerkoplossing toe bij 50 μL/put. Meng goed, dek af met een afdichtingsmembraan en incubeer bij 37 °C gedurende 90 min.
- Haal de vloeistof uit de putjes en voeg 1x wasbuffer werkoplossing toe bij 300 μL/put. Gooi de vloeistof na 1 min uit de putjes. Herhaal dit proces 4x zodat de vloeistof elke keer op filterpapier kan drogen.
- Voeg 100 μL/putje streptavidin-HRP werkoplossing toe. Dek de monsters af en incubeer ze bij 37 °C gedurende 30 minuten. Centrifugeer de monsters op 453 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
OPMERKING: De wasoplossing die tijdens het wasproces in de reactieput achterblijft, moet grondig worden geklopt totdat er geen watermerk op het filterpapier te zien is. - Voeg TMB toe bij 100 μL/put, incubeer de platen bij 37 °C gedurende 5-30 minuten in het donker en beoordeel de beëindigingsreactie op basis van de kleurdiepte in de put (donkerblauw). Meestal kan 10-20 minuten voor kleurontwikkeling goede resultaten opleveren.
- Beëindig de reactie snel door stopoplossing toe te voegen bij 100 μL/put. Detecteer de absorptiewaarde bij 450 nm binnen 10 minuten na beëindiging.
OPMERKING: Breng het reagens gedurende 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur in evenwicht.
4. ELISpot-test
- Voer immunisatie van de muizen en de verzameling van splenocyten precies uit zoals beschreven in stappen 3.1-3.10 hierboven. Voer de testen voor IFN-γ en IL-17A uit in strikte overeenstemming met de kitinstructies. De methoden en procedures zijn als volgt.
- Haal de plaat uit de verzegelde verpakking, was 4x met steriel PBS (200 μL/put) en voeg 1640 compleet kweekmedium (200 μL/put) toe om het gedurende 2 uur op kamertemperatuur te balanceren.
- Verwijder het medium en verdun de splenocytensuspensie met RF-10 medium tot 2 x 105 cellen/ml, voeg 50 μL cellen en antigeen per put toe (eindconcentratie: 10 μg/ml).
- Plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur. Verplaats de plaat gedurende deze tijd niet en neem maatregelen om verdamping te voorkomen (bijv. wikkel de plaat met aluminiumfolie).
- Verdun het detectieantilichaam (BVD6-24G2-biotine) tot 1 μg/ml (1:1.000) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (0,5 ml:100 ml) met 0,5% foetaal runderserum (PBS-0,5% FBS). Voeg 100 μL/put toe aan de plaat en incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 2 uur na filtratie door een membraan van 0,22 μm.
- Decanteer de vloeistof in de putjes, voeg 1x wasbuffer toe bij 200 μL/put en was 5x. Laat elke keer 30-60 s staan en laat voor de laatste keer drogen op vloeipapier.
- Verdun de streptavidin-mierikswortelperoxidase (1:1.000) in PBS-0,5% FBS en voeg 100 μL/put toe. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de plaat zoals in stap 4.6.
- Voeg 100 μL/putje gebruiksklare TMB-substraatoplossing toe en ontwikkel tot er een duidelijke plek verschijnt. Stop de kleurontwikkeling door uitgebreid te wassen in gedeïoniseerd water (5x-6x herhaaldelijk spoelen). Verwijder indien nodig de duiker (het zachte plastic onder de plaat) en spoel de onderkant van het membraan af.
- Onderzoek en tel de vlekken op een ELISpot-lezer of ontleedmicroscoop nadat de plaat is opgedroogd.
5. Opname door DC's
- Euthanaseer BALB/c normale muizen door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital. Week de muizen in 75% alcohol gedurende 5 minuten.
- Knip een incisie van 6-8 cm onder de buik van de muis met een schaar en klem de twee uiteinden van de opening vast om deze in verschillende richtingen te scheiden en de poten van de muis bloot te leggen. Scheid het muisdijbeen van het muizenlichaam en het scheenbeen van het gewricht en houd de botten aan beide uiteinden intact.
- Verwijder het resterende weefsel en kraakbeen uit de gewrichtsgewrichten aan beide uiteinden van het dijbeen met een schaar en een tang. Week de dijbenen gedurende 5 minuten in 75% alcohol en week vervolgens in steriele PBS-oplossing om de oppervlaktealcohol af te wassen.
- Knip de uiteinden van de dijbenen af met een schaar en spoel het beenmerg af in een steriele petrischaal met steriele PBS-oplossing gevolgd door aspiratie met een spuit van 1 ml. Herhaal de was 3x-5x.
- Filtreer door een celzeef (200 mesh, 70 μm) en verzamel de BMDC's in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de monsters bij 290 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg, voeg 4 ml rode bloedcellysisbuffer toe, resuspendeer en lyseer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 10 ml steriele PBS-oplossing toe om het lysaat te neutraliseren, centrifugeer op 290 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM met 1% penicilline-streptomycine-oplossing en 10% FBS en aantal. Voeg vervolgens GM-CSF (20 ng / ml) plus IL-4 (10 ng / ml) toe aan het medium, pas de celconcentratie aan op 5 x 105 / ml ent de cellen op coverslips.
- Voeg de celsuspensie toe aan een 6-wellsplaat op 2 ml / put en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur. Verander het medium volledig na 2 dagen en verander de helft van het medium na 4 dagen.
- Selecteer vijf putten met cellen in goede staat (grote en radiolucente cellen met dendritische uitsteeksels op het celoppervlak) met behulp van een omgekeerde microscoop bij 100x vergroting voor het experiment op de zevende dag van de kweek. Gooi het supernatant weg, voeg 2 ml GFP, OP-D + GFP en NOD + GFP-oplossingen verdund met DMEM-eindmedium (GFP-eindconcentratie: 20 μg / ml; adjuvante eindconcentratie: 10 μg / ml) toe aan elke put en incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
- Was de platen 3x met PBS, voeg 1 ml 4% paraformaldehyde toe aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Verwijder de paraformaldehyde na fixatie, incubeer de cellen met falloïdine en DAPI tot een eindconcentratie van 10 μg / ml gedurende 10 minuten voor kleuring en was vervolgens 3x met PBS.
- Voeg 1 ml PBS toe aan elke put en observeer de antigeenopname met CLSM, zoals hieronder beschreven.
- Open de CLSM-software, klik op ZEN-systeem en wacht tot de hardware-initialisatie is voltooid.
- Klik op de GFP - en DAPI-snelkoppelingen in het tabblad Zoeken om het gebied te vinden dat kan worden waargenomen. Schakel het tl-licht en het doorgelaten licht uit.
- Klik op Smart Setup in het acquisitiemenu om de kleurstofbibliotheek te openen en voeg drie fluorescerende kleurstoffen toe: EGFP, falloidine en DAPI. Klik op Beste signaal > OK. Klik op het EGFP-kanaal in het tabblad Kanalen en klik op Live om het juiste gezichtsveld op de rechterinterface te selecteren.
- Selecteer 1 AU voor het gaatje, draai de fijne scherpstelschroef om de brandpuntsafstand aan te passen en selecteer het juiste brandpuntsvlak. Klik op Range Indicator en pas de combinatie van laservermogen en master gain aan, zodat er slechts sporadische rode stippen op de afbeelding verschijnen.
- Pas de falloidin- en DAPI-kanalen aan met dezelfde parameters zonder het laservermogen te wijzigen.
- Selecteer Stop Live en klik op Acquisitiemodus om de opnameparameters te wijzigen: Framegrootte: 1024 pixels x 1024 pixels; Scansnelheid: 7; Gemiddeld: 2x. Klik op Snap en selecteer Splitsen om alle gemaakte afbeeldingen te bekijken. Sla de afbeeldingen op.
6. Macrofaag activatie
- Dompel C57BL/6 muizen na euthanasie onder in 75% alcohol en plaats ze met het gezicht naar boven in een glazen petrischaaltje in genummerde volgorde.
- Laat de muizen door het transfervenster naar de steriele operatiekamer gaan en plaats ze gedurende 5 minuten op de operatietafel.
- Gebruik een spuit om 10 ml zoutoplossing te zuigen, kantel de muizen naar beneden op ongeveer 45 ° en injecteer in het midden van de buikholte. Trek ongeveer 5 ml celsuspensie in een centrifugebuis van 15 ml voor elke 10 ml en herhaal de injectie 3x.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 129 x g gedurende 5 minuten om peritoneale primaire macrofagen van muizen te verkrijgen. Resuspendeer de cellen, pas de celconcentratie aan op 2 x 106 cellen / ml met RPMI 1640 compleet medium (met 10% FBS) en ent de celsuspensie in een 24-well plaat om een consistent aantal cellen per put (1 ml / put) te garanderen.
- Kweek bij 37 °C in 5% CO2 's nachts (ongeveer 16-20 h), gevolgd door incubatie met PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD en Ag/Al (Ag-eindconcentratie: 5 μg/ml; adjuvante eindconcentratie: 10 μg/ml; totaal volume: 2 ml) gedurende 24 uur. Detecteer de niveaus van IL-1β, IL-6 en TNF-α in het kweeksupernatant met ELISA-kits met behulp van de methoden en procedures die worden beschreven in stap 3.12-3.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cellulaire activiteitsevaluatie van de adjuvantia OP-D en NOD werd in vitro voltooid volgens het protocol. L929 fibroblasten zijn een nuttig screeningsmodel voor het in vitro toxiciteitsonderzoek van NOD (figuur 1). De kwantificering van inflammatoire cytokineniveaus in de milt kan onderzoekers helpen de immuunrespons beter te begrijpen (figuur 2). Monitoring CTL's met ELISpot is de gouden standaard voor het beoordelen van antigeenspecifieke T-celimmuniteit in klinische onderzoeken en voor het screenen van vaccinkandidaten (figuur 3). De verhoogde opname van een antigeen door DC's kan verbeterde adaptieve immuunresponsen veroorzaken (figuur 4). Macrofagen spelen een belangrijke rol bij het presenteren van antigenen aan T-cellen, evenals het induceren van andere antigeen-presenterende cellen om costimulatoire moleculen tot expressie te brengen, waardoor adaptieve immuunresponsen worden geïnitieerd (figuur 5). De bovenstaande experimentele resultaten werden gepubliceerd door Tong et al., en de verschillende antilichaamresponsen in vivo en beschermingsefficiëntie tegen muizen zijn te vinden in het oorspronkelijke artikel14.
Figuur 1: In vitro cytotoxiciteitstest van L929-cellen. De cytotoxische effecten van verschillende gradiëntconcentraties van OP-D en NOD (30 μg/ml, 60 μg/ml, 120 μg/ml, 240 μg/ml en 480 μg/ml) bij incubatie met L929-cellen worden weergegeven. Een CCK-8 kit werd gebruikt voor detectie. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een statistische analyse software. Verschillen tussen de twee groepen werden geanalyseerd met behulp van een ongepaarde, tweezijdige Student's t-test. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3), en significante verschillen worden als volgt uitgedrukt: *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Dit cijfer is aangepast van Tong et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Niveaus van IFN-γ en IL-17A in splenocyten. Splenocyten van gevaccineerde muizen werden gedurende 3 dagen gestimuleerd met het antigeen en de niveaus van de cytokines (A) IFN-γ en (B) IL-17A in het supernatant werden gemeten met ELISA. De resultaten toonden aan dat de ifn-γ en il-17a productie significant verhoogd waren in de Ag/NOD groep in vergelijking met de Ag/OP-D, Ag/BNE en Ag/Al groepen (p < 0,01). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een statistische analyse software. Verschillen tussen de meerdere groepen werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 8) en significante verschillen worden als volgt uitgedrukt: *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Dit cijfer is aangepast van Tong et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Aantal IFN-γ- en IL-17A-afscheidende cellen in de splenocytenpopulatie. (A) ELISpot-analyse van IFN-γ spotvormende antigeenspecifieke T-cellen onder de splenocyten. (B) ELISpot analyse van IL-17A spotvormende antigeen-specifieke T-cellen onder de splenocyten. Vergelijkbaar met de cytokineresultaten vertoonden de Ag/OP-D- en Ag/NOD-groepen significant verhoogde verhoudingen en aantallen IFN-γ- en IL-17A-vormende cellen in de miltlymfoïde T-celpopulatie. De Ag/NOD-groep induceerde sterkere Th1 (p < 0,001) en Th17 (p < 0,01) immuunresponsen dan de andere groepen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een statistische analyse software. Verschillen tussen de meerdere groepen werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 8), en significante verschillen worden als volgt uitgedrukt: *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Dit cijfer is aangepast van Tong et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CLSM-beelden van antigeenopname door BMDC's. Phalloidine kleurt het cytoskelet in rood, DAPI kleurt de kern in blauw en GFP presenteert groene fluorescentie. Zoals te zien is in de figuur, wordt groene fluorescentie waargenomen in CLSM na 30 minuten co-integratie van de GFP + OP-D- en GFP + NOD-groepen met BMDC's, maar de GFP + NOD-deeltjes zijn omgeven door fagosoomachtige vesiculaire structuren, terwijl de GFP + OP-D-deeltjes dat niet zijn. Dit cijfer is aangepast van Tong et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Impact van adjuvans geformuleerd antigeen op de activering van PM's. ELISA voor de detectie van de concentraties van de cytokines IL-1β, IL-6 en TNF-α in het supernatant van PM's gemunt met PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD en Ag/Al. In vergelijking met antigeenstimulatie verhoogden Ag/NOD, Ag/OP-D en Ag/Al stimulatie allemaal significant il-1β, IL-6 en TNF-α secretie van de PM's (p < 0,05). De activering van macrofagen was significant verbeterd in de NOD-groep in vergelijking met de OP-D- en AlPO4-groepen (p < 0,05). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een statistische analyse software. Verschillen tussen de meerdere groepen werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 8) en significante verschillen worden als volgt uitgedrukt: *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Dit cijfer is aangepast van Tong et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Dichtheid | Massa (per 10g) |
| Cremophor EL-35 | omvang | 1.92 |
| glycerol | omvang | 0.48 |
| Gtcc | omvang | 0.6 |
| Ultrapuur water | omvang | restbedrag |
Tabel 1: De formule van BNE.
| Reagens | Dichtheid | Volume |
| β- Mercaptoethanol | 50μM | 0,366μL |
| Foetaal runderserum | 1x | 10 ml |
| Glutamax | 2mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1x | 85 ml |
| Hepes | 10mM | 1 ml |
| Niet-essentiële aminozuren(100x) | 1x | 1 ml |
| Penicilline-Streptomycine Oplossing | 100U/ml | 1 ml |
| Natriumpyruvaat(100 mM) | 1mM | 1 ml |
Tabel 2: Voorbereidingsinformatie voor het rf-10 complete medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subunitvaccins bieden uitstekende veiligheid, maar slechte immunogeniciteit. De belangrijkste strategie om de immunogeniciteit te verbeteren is om antigenen fysiek te adsorberen of te koppelen met adjuvantia en deze op te nemen in de toedieningssystemen voor geneesmiddelen om de opname en presentatie door DC's te bevorderen. Natuurlijke plantensaponinen zoals quillaia saponine en zijn derivaten zijn zeer giftig en zijn niet geschikt voor de ontwikkeling van menselijke vaccins17. Daarom is de studie van de toxische effecten van vaccins of adjuvantia op cellen een noodzakelijke eerste stap in de evaluatie van nieuwe vaccins.
Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, wordt uitgevoerd volgens ISO 10993-5:200918, wat enige flexibiliteit in de fabricage van monsters mogelijk maakt. De standaard toxische cellijn, L929 fibroblasten en gingivale fibroblasten hebben vergelijkbare niveaus van cytotoxiciteit. L929-fibroblasten zijn echter een nuttig screeningmodel geworden voor in vitro toxiciteitstests van nanomaterialen vanwege hun uitstekende reproduceerbaarheid19. MTT en CCK-8 worden vaak gebruikt voor cel levensvatbaarheid en cytotoxiciteit assays. De resultaten van MTT- en CCK-8-assays spreken elkaar tegen en zijn niet significant gecorreleerd, maar de cel levensvatbaarheid van de CCK-8-test verschilt significant van die van de MTT-test20. Een mogelijke verklaring voor de MTT-resultaten in de vorige studie is dat het versnellen van celdood kan worden geïnduceerd bij hogere MTT-concentraties21. De experimentele resultaten van de CCK-8-methode komen over het algemeen overeen met de resultaten van diertoxiciteitstests22. Daarom, totdat nieuwe cytotoxiciteitsevaluatiemethoden beschikbaar zijn, is het gebruik van de CCK-8-test om de toxiciteit van OP-D- en NOD-cellen voor L929-cellen te detecteren op dit moment waarschijnlijk de beste optie. Deze methode zal ook blijven worden toegepast op het gebied van vaccinmaterialen en adjuvante evaluatie.
De milt is het grootste secundaire lymfoïde orgaan in het menselijk lichaam en de kwantificering van inflammatoire cytokineniveaus in de milt kan ons helpen de immuunrespons te begrijpen23. Er wordt aangenomen dat er enkele fundamentele verschillen zijn in de structuur en celtypen tussen de milt van muizen en mensen24, maar de basisovereenkomst van specifieke immuunceltypen en de functie van het miltgebied maken studies met behulp van de milt T-cellen van de muis relevant24. In dit protocol hebben we de secretoire niveaus van het Th1 cytokine IFN-γ en het Th17 cytokine IL-17A in de milt gemeten met behulp van ELISA-kits. Deze test wordt meestal gebruikt voor kwantitatieve bepalingen en heeft een hoge gevoeligheid omdat het antilichamen met een hoge affiniteit gebruikt om niet-specifieke stoffen weg te spoelen. De belangrijkste beperkingen van dit onderzoek zijn de lange meettijd en het hoge verbruik van reagentia. Cytokines kunnen ook worden gedetecteerd met flowcytometrie en Luminex-methoden, maar deze methoden vereisen complexe instrumenten, evenals dure grondstoffen en gespecialiseerde training. Daarom is deze eenvoudige en economische ELISA-kit een waardevol hulpmiddel voor het meten van specifieke immuunresponsen. ELISpot is uitgegroeid tot een van de meest gebruikte technieken voor het bepalen van de immuunresponsen van specifieke cytokine spotvormende cellen. Het kan niet alleen worden gebruikt om CD8 + T-celresponsen te detecteren die worden uitgelokt door vaccinkandidaten, maar ook voor de herkenning van specifieke antigenen na immunisatie25. Met high-throughput screening en een gevoelige detectielimiet (1/100.000 cellen) wordt ELISpot veel gebruikt omdat het ook voordelen biedt van directe observatie van cellen en snelle analyse. De vorming van elke spot geeft de frequentie van activering van individuele T-cellen of B-cellen aanDe evaluatie van cellulaire respons op vaccins en adjuvantia is van groot belang, waardoor ELISpot op dit moment onvervangbaar is.
De presentatie van antigenen door DC's is een voorwaarde voor het opwekken van immuunresponsen14. DC's, die worden gebruikt voor de opname van antigeen, migratie naar lymfeklieren en de activering van naïeve T-cellen, zijn een van de essentiële celtypen voor de ontwikkeling van T-cel-gemedieerde immuunresponsen14. Aangezien de interactie van nano-emulsiedeeltjes met het celmembraan een belangrijke determinant is van deeltjesopname, werd GFP-fagocytose binnen DC's bepaald met CLSM in dit experimentele protocol. Het is aangetoond dat DC's antigenen efficiënt kunnen transporteren naar drainerende lymfeklieren, wat de reden kan zijn waarom adjuvantia de antigeenimmunogeniteit in vivo verbeteren. Bovendien is CLSM de meest voorkomende commerciële implementatie van de techniek en wordt het veel gebruikt in beeldvormingslaboratoria. De optische sectioning-capaciteit, duidelijke resolutie en veelzijdigheid van de 3D imaging26 van CLSM maken het de beste tool voor het analyseren van antigeenopname door DC's, zelfs als het niet kan worden gebruikt voor het verzamelen van kwantitatieve gegevens.
Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC I en II) is belangrijk voor de specifieke herkenning van antigenen. MHC II functionele moleculen worden sterk uitgedrukt in APC's en functioneren om CD4 + T-celactivering te induceren. APC's omvatten macrofagen, DC's en B-lymfocyten27, die de adaptieve immuniteit sterk moduleren. Macrofagen zijn wijd verspreid in het immuunsysteem van de gastheer en spelen een sleutelrol bij verdediging en homeostase28. De activering van macrofagen is essentieel voor het initiëren van adaptieve immuunresponsen29. Ondertussen kunnen nano-emulsieadjuvantia die even groot zijn als pathogenen antigeenherkenning en fagocytose bevorderen, NALP3-inflammasomen en macrofagen activeren en de presentatie van antigeenmoduleren28. In dit protocol werden PM's voornamelijk gebruikt als model om de secretie van de pro-inflammatoire cytokines IL-1β enTh2, cytokines IL-6 en TNF-α door ELISA te bepalen, die kunnen worden gebruikt om het macrofaagactiveringsvermogen van vaccins en adjuvantia kwalitatief te evalueren. De mate en het mechanisme van activering moeten echter door meer experimenten worden bepaald. Bijvoorbeeld of EGF, IL-6 en andere factoren die nodig zijn voor de activering van immuuncellen worden uitgescheiden en de gerelateerde signaalroutes (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, enz.) moeten worden bestudeerd.
Samenvattend is een reeks protocollen vastgesteld om de in vitro cellulaire reacties op nieuwe adjuvantia te bevestigen, waaronder cytotoxiciteit, cytokinesecretie, DC-opname en macrofaagactivering. Deze protocollen tonen niet alleen lage toxiciteit en hoge cellulaire afgifte, maar bieden ook gedetailleerde procedures voor CCK-8, ELISA en ELISpot. Cellulaire responsbeoordelingen van de van planten afgeleide immunopotentiator OP-D en zijn gemodificeerde krachtige nano-emulsievaccin adjuvans NOD werden in vitro voltooid en het protocol was effectief. Hoewel ELISA, ELISpot en confocale laserscantechnieken klassiek zijn gebruikt om de in vitro immunocompetentie van adjuvantia aan cellen te evalueren, hebben deze methoden veel nadelen, zoals lange meettijden, zware werkbelastingen, dure materialen en de behoefte aan professionele technici. Veel nauwkeurige methoden en geavanceerde technologieën, zoals genchips, single-cell sequencing en transcriptoomtechnologie, moeten in toekomstige studies worden gebruikt om de reikwijdte van de techniek verder uit te breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële of persoonlijke belangen zijn die het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd, kunnen hebben beïnvloed.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidie nr. 2021YFC2302603 van het National Key Research and Development Program van China, subsidies nr. 31670938, 32070924, 82041045 en 32000651 van het National Natural Science Foundation Program of China, subsidies nr. 2014jcyjA0107 en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing, subsidie nr. CYS21519 van het Postgraduate Research and Innovation Project van Chongqing, subsidie nr. 2020XBK24 van de Army Medical University Speciale projecten en subsidie nr. 202090031021 van het National Innovation and Entrepreneurship Program voor studenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
