Summary
Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.
Abstract
Als Hauptbestandteil von Impfstoffen können Adjuvantien die starken, weit verbreiteten, angeborenen und adaptiven Immunantworten, die mit Antigenen verbunden sind, direkt induzieren oder verstärken. Ophiopogonin D (OP-D), eine gereinigte Komponente, die aus der Pflanze Ophiopogon japonicus extrahiert wird, hat sich als nützliches Impfstoff-Adjuvans erwiesen. Die Probleme der geringen Löslichkeit und Toxizität von OP-D können durch die Verwendung eines niederenergetischen Emulgierungsverfahrens zur Herstellung der Nanoemulsion Ophiopogonin D (NOD) effektiv überwunden werden. In diesem Artikel wird eine Reihe von In-vitro-Protokollen zur Bewertung der Zellaktivität untersucht. Die zytotoxischen Wirkungen von L929 wurden mit einem Zellzähl-Kit-8-Assay bestimmt. Dann wurden die sezernierten Zytokinspiegel und die entsprechenden Immunzellzahlen nach der Stimulation und Kultur von Splenozyten von immunisierten Mäusen durch ELISA- und ELISpot-Methoden nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Antigenaufnahmefähigkeit in aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDCs), die aus C57BL/6-Mäusen isoliert und nach Inkubation mit GM-CSF plus IL-4 gereift waren, durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Wichtig ist, dass die Makrophagenaktivierung durch die Messung der Zytokine von IL-1β, IL-6 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) durch ELISA-Kits bestätigt wurde, nachdem Peritonealmakrophagen (PMs) von leeren Mäusen mit dem Adjuvans für 24 Stunden kokulturiert wurden. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze zur Verfügung stellen wird, um die Wirksamkeit der zellulären Reaktion neuartiger Impfstoffadjuvantien zu bewerten.
Introduction
Impfstoffe sind ein wichtiges Mittel zur Verhütung und Behandlung von Infektionskrankheiten und nichtübertragbaren Krankheiten. Die angemessene Zugabe von Adjuvantien und Verabreichungsvehikeln zu Impfstoffformulierungen ist vorteilhaft für die Verbesserung der Immunogenität von Antigenen und die Erzeugung lang anhaltender Immunantworten1. Neben dem klassischen Adjuvans Alaun (Aluminiumsalz) gibt es sechs Arten von Adjuvantien für Impfstoffe, die derzeit auf dem Markt sind: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 und Matrix-M5. Wenn der menschliche Körper auf einen Virusangriff trifft, übernehmen im Allgemeinen die erste und zweite Verteidigungslinie (Haut, Schleimhaut und Makrophagen) die Führung bei der Beseitigung des Virus, und schließlich wird die dritte Verteidigungslinie, an der die Immunorgane und Immunzellen beteiligt sind, aktiviert. Aluminium und Aluminiumsalze sind seit den frühen 1920er Jahren die am häufigsten verwendeten Adjuvantien für Impfstoffe beim Menschen und lösen eine wirksame angeborene Immunantwort aus6. Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) durch klassische Adjuvantien, die die Immunzellen dazu anregen, spezifische Sätze von Zytokinen und Chemokinen zu erzeugen, der Mechanismus ist, durch den Adjuvantien wirken und einer der Gründe sein kann, warum Adjuvantien nur vorübergehende Wirkungen auf spezifische Immunantworten ausüben7. Das Vorhandensein von begrenzt zugelassenen Adjuvantien für den menschlichen Gebrauch ist ein einschränkender Faktor für die Entwicklung von Impfstoffen, die wirksame Immunantworten hervorrufen8.
Derzeit zeigen immer mehr adjuvante Studien die Fähigkeit, eine starke zelluläre Immunantwort bei Mäusen zu induzieren. Es wurde gezeigt, dass QS-21 eine ausgewogene T-Helfer-1 (Th1) und T-Helfer 2 (Th2) Immunantwort induziert, höhere Konzentrationen von Antikörpertitern produziert und den Schutz als Adjuvans verlängert, aber seine starke Toxizität und hämolytischen Eigenschaften begrenzen seine Entwicklung als eigenständiges klinisches Adjuvans 9,10. OP-D (Ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranosid) ist eines der steroidalen Saponine, die aus der Wurzel der chinesischen Heilpflanze Ophiopogon japonicas4 isoliert wurden. Darüber hinaus ist es die pharmakologisch aktive Hauptkomponente (Shen Mai San), die in Radix Ophiopogonis gefunden wird und von der bekannt ist, dass sie bestimmte pharmakologische Eigenschaften aufweist11. Darüber hinaus ist es ein Mitglied der Familie der Liliaceae und wird häufig wegen seiner hemmenden und schützenden Wirkung bei zellulären Entzündungen und Myokardverletzungen verwendet. Zum Beispiel verbessert OP-D DNCB-induzierte atopische Dermatitis-ähnliche Läsionen und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) entzündliche HaCaT-Zellen in BALB/c-Mäusen12. Wichtig ist, dass OP-D den antioxidativen Schutz des Herz-Kreislauf-Systems fördert und das Herz vor Doxorubicin-induzierten autophagischen Verletzungen schützt, indem es sowohl die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies als auch die Schädigung der mitochondrialen Membran reduziert. Experimente haben gezeigt, dass die Einnahme von OP-D mit Monodesmosid dazu beiträgt, die Immungesundheit zu stärken, die Anzahl der weißen Blutkörperchen und die DNA-Synthese zu erhöhen und die Antikörper länger haltbar zu machen13. Es wurde bereits festgestellt, dass OP-D eine adjuvante Wirkunghat 14.
Nanoemulsionen sind Öl-in-Wasser-Nanoformulierungen, die aus einer Kombination von Tensiden, Öl, Cotensiden und Wasser12,15 bestehen. Diese Nanoimpfstoff-Designs ermöglichen es, Antigene und Adjuvantien zusammen zu verkapseln, um die Immunstimulation zu verbessern, die Antigene zu schützen und die Reifung der dendritischen Zellen (DC) zu fördern16. Für die Entwicklung dieser neuartigen Adjuvantien, die aus dem Screening gewonnen werden, ist es wichtig, geeignete Methoden zu finden, um ihre zellulären Reaktionsfähigkeiten zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, systematisch zu bewerten, ob Adjuvantien die Phagozytose und die Expression von Immunzellen in In-vitro-Zellkulturen verbessern können, und die wichtigsten experimentellen Methoden zu erläutern. Das Experiment ist in vier Unterabschnitte unterteilt: (1) Die Toxizität von OP-D und NOD für L929-Zellen wird durch den Zellzählkit-8 (CCK-8) Assay bestimmt; (2) Die Zytokinspiegel von endokrinem IFN-γ und IL-17A und die entsprechenden Zellzahlen in immunisierten Mäusen werden durch Splenozytenstimulation und ELISpot-Assays nachgewiesen. (3) Die Antigenpräsentationsfähigkeit von DCs nach adjuvanter Stimulation wird mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. und (4) die drei Arten von Zytokinen, IL-1β, IL-6 und TNF-α, in den Überständen nachgewiesen werden, die aus Peritonealmakrophagen (PMs) in normalen Mäusen gewonnen werden, die mit Adjuvantien kokultiviert wurden.
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Protocol
Alle Zellexperimente wurden in einem zelltechnischen Labor durchgeführt, das mit einfachen Operationssälen, Pufferräumen, sterilen Kulturräumen sowie Identifikations- und Analyseräumen ausgestattet war. Die Arbeitsumgebung und die Arbeitsbedingungen waren frei von mikrobieller Kontamination und anderen schädlichen Faktoren. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.
1. Autoklavieren und Materialaufbereitung
- Bereiten Sie die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Schere, Pinzette und Schleifgewebe durch Sterilisation mit feuchter Hitze durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min vor.
- Informationen zu den erforderlichen Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle. Die Formel der Blank-Nanoemulsion (BNE) finden Sie in Tabelle 1.
2. L929 Zytotoxizitätstest
- Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Ein Röhrchen gefrorener L929-Zellen wird aus flüssigem Stickstoff entnommen und in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell aufgetaut.
- Pipettieren Sie die Zellen schnell nach dem Auftauen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 2 ml DMEM hinzu und mischen Sie gut.
- Die Proben werden bei 129 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Fügen Sie dann 2 ml DMEM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 129 x g für 5 Minuten.
- Der Überstand wird verworfen, 6 ml vollständiges DMEM-Medium (mit 10 % FBS) zur Resuspension zugegeben und 48 h in einen T25-Kulturkolben in einem 37 °C-Inkubator mit 5 %CO2 in die Kultur überführt.
- Entsorgen Sie das Nährmedium im Kulturkolben und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Dann fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu, um die Zellen für 1-2 min bei 37 ° C zu verdauen.
- Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie 4 ml DMEM-Füllmedium hinzu, um die Verdauung sofort zu beenden und gut zu mischen. Anschließend werden die Zellen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen abgesaugt und bei 129 x g für 5 min zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM-Vollmedium. Verwenden Sie eine 20 μL Zellsuspension für die Zellzählung mit Zellzählplatten und verdünnen Sie die verbleibenden Zellen auf 1 x 105 Zellen/ml mit DMEM-Füllmedium.
- Geben Sie 100 μL Reinstwasser an den Rand einer 96-Well-Platte und geben Sie 100 μL Zellverdünnungsmittel nur in die internen Vertiefungen. Legen Sie die Platte für 4 h bei 37 °C in den Inkubator für adhärente Kultur.
- Nachdem die Zellen anhaften, fügen Sie OP-D und NOD separat im vollständigen DMEM-Medium zu einem Endvolumen von 200 μl / Well hinzu (die Endkonzentrationen jedes Arzneimittels betragen 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml und 30 μg / ml). Verwenden Sie für jede Konzentration drei Vertiefungen als Replikate. Dann legen Sie die Zellen für weitere 24 Stunden zurück in den Inkubator und kultivieren Sie.
- CCK-8 wird mit vollständigem DMEM-Medium auf 10 % verdünnt und 100 μL/Well-Verdünnungen, die das Adjuvans und die Zelllösungen enthalten, in die 96-Well-Platte gegeben. Legen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie für weitere 2-3 h.
- Mischen Sie häufig, während Sie die Zelllösung plattieren, um Inhomogenität durch Zellausfällung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte vor und nach der Zugabe des CCK-8 vorsichtig mehrmals, um das Medium und die CCK-8-Lösung gut zu mischen.
- Die Extinktion wird bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader gemessen. Richten Sie eine Nullbohrung mit nur Medium und CCK-8 ein, um einen Absorptionswert zu erhalten. Berechnen Sie genaue Extinktionswerte, indem Sie beim Plotten den Null-Absorptionswert vom erhaltenen Absorptionswert subtrahieren.
- Vergewissern Sie sich, dass keine Blasen in den Vertiefungen vorhanden sind, bevor Sie mit dem Mikrotiterplatten-Reader testen, da die Blasen den Assay stören.
3. Stimulation der Splenozyten
- Immunisierung von BALB/c-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen mit 30 μg Proteinantigen plus 30 μg Adjuvans über eine intramuskuläre Injektion (200 μl) an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 gemäß den folgenden Versuchsgruppen: (1) PBS-Gruppe, (2) Antigengruppe (Ag), (3) Antigen + OP-D (Ag/OP-D)-Gruppe, (4) Antigen + BNE (Ag/BNE)-Gruppe, (5) Antigen + NOD (Ag/NOD) Gruppe und (6) Antigen + AlPO4 (Ag/Al) Gruppe.
- Vorbereitungsraum: Am 24. Tag nach der Grundimmunisierung werden die Mäuse aus dem Tierraum entnommen und durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Natriumpentobarbital eingeschläfert. Die Mäuse in eine Glasschale geben und 5 Minuten in 75% Alkohol einweichen.
- Legen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Zentrifugenröhrchengestell, nummerieren Sie die Einweg-Petrischalen und geben Sie 5 ml PBS mit einer 10-ml-Pipette in jede Petrischale.
- Machen Sie einen 6-8 cm langen Schnitt mit einer Schere in der Mitte der linken Bauchseite der Maus, reißen Sie die Haut auf, legen Sie die Bauchdecke frei und lokalisieren Sie den langen roten Streifen der Milz.
- Heben Sie das Peritoneum auf der unteren Seite der Milz mit einer Pinzette an, schneiden Sie es auf und drehen Sie es nach oben, um die Milz freizulegen. Heben Sie die Milz mit einer Pinzette an, trennen Sie das Bindegewebe unter der Milz mit einer Augenschere und entfernen Sie die Milz.
- Die Milz in eine Petrischale mit 5 ml PBS geben und mit einem Sieb (200 mesh, 70 μm) und einem Mahlstab mahlen. Nach dem Mahlen wird die Flüssigkeit entsprechend der Nummerierung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem Winkeltropfer überführt.
- Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit bei 453 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen in jedes Röhrchen, resuspendieren Sie die Zellen und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Geben Sie 10-12 ml PBS in jedes Röhrchen, mischen Sie das Röhrchen kopfüber und zentrifugieren Sie es bei 453 x g für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 10 ml PBS in jedes Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen.
- Nehmen Sie 20 μL jeder Probe in eine Vertiefung der Zellzählplatte und erfassen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.
- Die Proben werden bei 453 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen resuspendieren, auf 2,5 x 106 Zellen/ml mit RF-10-Medium verdünnen (Formulierungsinformationen in Tabelle 2) und bei 100 μl/Well auf eine 96-Well-Platte geben.
- Das Antigen wird mit RF-10-Medium auf 10 μg/ml verdünnt, 100 μl in jede Vertiefung gegeben und 3 Tage bei 37 °C in 5%CO2 inkubiert.
- Die aus jeder Zellgruppe erhaltene Zellsuspension wird in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen abgesaugt, 20 Minuten lang bei 453 x g zentrifugiert und der Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen abgesaugt.
- Führen Sie die IFN-γ- und IL-17A-Inhaltserkennung streng gemäß den Anweisungen des ELISA-Kits durch. Die Methoden und Verfahren sind wie folgt.
- Bereiten Sie 1x Waschpuffer-Arbeitslösung (im Lieferumfang enthalten), Standard-Gradientenkonzentrationslösung (verdünnte Zytokin-Standardlösung auf 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml und 15,6 pg/ml in dem mit dem Kit gelieferten Verdünnungspuffer R [1x]), biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung (verdünnte biotinylierte Antikörperlösung auf 1:100 unter Verwendung des mit dem Kit gelieferten Verdünnungspuffers R [1x] zur Bildung der Arbeitslösung), und Streptavidin-HRP-Arbeitslösung nach Bedarf.
- Geben Sie 100 μl/Well verdünnte Zytokin-Standardlösung in die Standardvertiefung, 100 μL/Well der Probe in die Probenvertiefung (der mit dem Kit gelieferte Verdünnungspuffer R [1x] wird für die Probenverdünnung verwendet) und 100 μL/Well des Verdünnungspuffers R (1x) in die Blindkontrollmulde.
- Fügen Sie eine biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung in einer Dosis von 50 μl/well hinzu. Gut mischen, mit einer Dichtungsmembran abdecken und bei 37 °C 90 min inkubieren.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und fügen Sie 1x Waschpuffer-Arbeitslösung bei 300 μL/Welle hinzu. Entsorgen Sie die Flüssigkeit nach 1 Minute aus den Vertiefungen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x und lassen Sie die Flüssigkeit jedes Mal auf Filterpapier trocknen.
- Fügen Sie 100 μl/Well Streptavidin-HRP-Arbeitslösung hinzu. Die Proben werden abgedeckt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Proben werden bei 453 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
HINWEIS: Die Waschlösung, die während des Waschvorgangs in der Reaktionsmulde verbleibt, sollte gründlich abgeklopft werden, bis kein Wasserzeichen mehr auf dem Filterpapier zu sehen ist. - TMB bei 100 μL/Welle zugeben, die Platten bei 37 °C für 5-30 min im Dunkeln inkubieren und die Abbruchreaktion entsprechend der Farbtiefe in der Vertiefung (dunkelblau) beurteilen. In der Regel können 10-20 Minuten für die Farbentwicklung gute Ergebnisse erzielen.
- Beenden Sie die Reaktion schnell durch Zugabe von Stopplösung bei 100 μl/Well. Der Extinktionswert bei 450 nm ist innerhalb von 10 Minuten nach Beendigung zu bestimmen.
HINWEIS: Gleichgewichten Sie das Reagenz vor Gebrauch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. ELISpot-Assay
- Führen Sie die Immunisierung der Mäuse und die Entnahme von Splenozyten genau wie in den Schritten 3.1-3.10 oben beschrieben durch. Führen Sie die Tests für IFN-γ und IL-17A in strikter Übereinstimmung mit den Anweisungen des Kits durch. Die Methoden und Verfahren sind wie folgt.
- Nehmen Sie die Platte aus der versiegelten Verpackung, waschen Sie sie 4x mit sterilem PBS (200 μL/Well) und fügen Sie 1640 komplettes Kulturmedium (200 μL/Well) hinzu, um sie bei Raumtemperatur für 2 h auszugleichen.
- Entfernen Sie das Medium und verdünnen Sie die Splenozytensuspension mit RF-10-Medium auf 2 x 105 Zellen/ml, wobei 50 μL Zellen und Antigen pro Vertiefung hinzugefügt werden (Endkonzentration: 10 μg/ml).
- Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h. Bewegen Sie die Platte während dieser Zeit nicht und ergreifen Sie Maßnahmen, um Verdunstung zu vermeiden (z. B. die Platte mit Alufolie umwickeln).
- Verdünnen Sie den Nachweisantikörper (BVD6-24G2-Biotin) auf 1 μg/ml (1:1.000) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,5 ml:100 ml), die 0,5 % fötales Rinderserum (PBS-0,5 % FBS) enthält. Geben Sie 100 μL/Well in die Platte und inkubieren Sie sie nach der Filtration durch eine 0,22 μm Membran 2 h bei Raumtemperatur.
- Dekantieren Sie die Flüssigkeit in den Vertiefungen, geben Sie 1x Waschpuffer bei 200 μL/Well, und waschen Sie 5x. Jeweils 30-60 s einwirken lassen und ein letztes Mal auf Löschpapier trocknen lassen.
- Verdünnen Sie die Streptavidin-Meerrettichperoxidase (1:1.000) in PBS-0,5% FBS und fügen Sie 100 μL/Well hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platte wie in Schritt 4.6.
- Fügen Sie 100 μL/Well gebrauchsfertige TMB-Substratlösung hinzu und entwickeln Sie, bis ein klarer Fleck erscheint. Stoppen Sie die Farbentwicklung, indem Sie ausgiebig in entionisiertem Wasser waschen (5x-6x wiederholt spülen). Entfernen Sie bei Bedarf den Düker (den weichen Kunststoff unter der Platte) und spülen Sie die Unterseite der Membran ab.
- Untersuchen und zählen Sie die Flecken auf einem ELISpot-Lesegerät oder Seziermikroskop, nachdem die Platte getrocknet ist.
5. Aufnahme durch die Entwicklungsländer
- Einschläferung normaler BALB/c-Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Natriumpentobarbital. Die Mäuse 5 Minuten lang in 75% Alkohol einweichen.
- Schneiden Sie mit einer Schere einen 6-8 cm langen Schnitt unter dem Bauch der Maus und klemmen Sie die beiden Enden der Öffnung ein, um sie in verschiedene Richtungen zu trennen und die Beine der Maus freizulegen. Trennen Sie den Oberschenkelknochen der Maus vom Körper der Maus und das Schienbein vom Gelenk und halten Sie die Knochen an beiden Enden intakt.
- Entfernen Sie das restliche Gewebe und den Knorpel aus den Gelenkgelenken an beiden Enden des Oberschenkelknochens mit Schere und Pinzette. Weichen Sie die Oberschenkelknochen 5 Minuten lang in 75% igem Alkohol ein und weichen Sie sie dann in steriler PBS-Lösung ein, um den Oberflächenalkohol abzuwaschen.
- Schneiden Sie die Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere ab und spülen Sie das Knochenmark in einer sterilen Petrischale mit steriler PBS-Lösung ab, gefolgt von einer Aspiration mit einer 1-ml-Spritze. Wiederholen Sie das Waschen 3x-5x.
- Mit einem Zellsieb (200 mesh, 70 μm) filtrieren und die BMDCs in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen sammeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 290 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 4 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu, resuspendieren Sie und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- Fügen Sie 10 ml sterile PBS-Lösung hinzu, um das Lysat zu neutralisieren, zentrifugieren Sie bei 290 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% FBS enthält, und zählen Sie. Geben Sie dann GM-CSF (20 ng / ml) plus IL-4 (10 ng / ml) in das Medium, stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 105 / ml ein und impfen Sie die Zellen auf Deckgläsern.
- Die Zellsuspension wird auf eine 6-Well-Platte mit 2 ml/Vertiefung gegeben und 48 h lang bei 37 °C mit 5 %CO2 in einen befeuchteten Inkubator gestellt. Wechseln Sie das Medium nach 2 Tagen vollständig und wechseln Sie die Hälfte des Mediums nach 4 Tagen.
- Wählen Sie fünf Vertiefungen mit Zellen in gutem Zustand (große und röntgendurchlässige Zellen mit dendritischen Vorsprüngen auf der Zelloberfläche) mit einem inversen Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung für das Experiment am siebten Tag der Kultur. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 2 ml GFP-, OP-D + GFP- und NOD + GFP-Lösungen, verdünnt mit DMEM-Komplettmedium (GFP-Endkonzentration: 20 μg/ml; adjuvante Endkonzentration: 10 μg/ml) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 30 min im Dunkeln.
- Waschen Sie die Platten 3x mit PBS, geben Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min. Entfernen Sie das Paraformaldehyd nach der Fixierung, inkubieren Sie die Zellen mit Phalloidin und DAPI auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml für 10 min zur Färbung und waschen Sie dann 3x mit PBS.
- Geben Sie 1 ml PBS in jede Vertiefung und beobachten Sie die Antigenaufnahme mit CLSM, wie unten beschrieben.
- Öffnen Sie die CLSM-Software, klicken Sie auf ZEN-System und warten Sie, bis die Hardwareinitialisierung abgeschlossen ist.
- Klicken Sie auf die GFP- und DAPI-Verknüpfungen auf der Registerkarte "Suchen", um den Bereich zu finden, der beobachtet werden kann. Schalten Sie das Leuchtstofflicht und das Durchlicht aus.
- Klicken Sie im Erfassungsmenü auf Smart Setup , um die Farbstoffbibliothek zu öffnen, und fügen Sie drei Fluoreszenzfarbstoffe hinzu: EGFP, Phalloidin und DAPI. Klicken Sie auf Bestes Signal > OK. Klicken Sie auf den EGFP-Kanal auf der Registerkarte Kanäle und klicken Sie auf Live , um das richtige Sichtfeld auf der rechten Benutzeroberfläche auszuwählen.
- Wählen Sie 1 AE für die Lochblende, drehen Sie die Feinfokussierschraube, um die Brennweite einzustellen, und wählen Sie die entsprechende Brennebene. Klicken Sie auf Reichweitenanzeige und passen Sie die Kombination aus Laserleistung und Hauptverstärkung so an, dass nur sporadische rote Punkte auf dem Bild erscheinen.
- Stellen Sie die Phalloidin- und DAPI-Kanäle mit den gleichen Parametern ein, ohne die Laserleistung zu ändern.
- Wählen Sie Live stoppen und klicken Sie auf Aufnahmemodus, um die Aufnahmeparameter zu ändern: Bildgröße: 1024 Pixel x 1024 Pixel; Scan-Geschwindigkeit: 7; Mittelwert: 2x. Klicken Sie auf Snap und wählen Sie Split, um alle aufgenommenen Bilder anzuzeigen. Speichern Sie die Bilder.
6. Makrophagenaktivierung
- Tauchen Sie C57BL / 6-Mäuse nach der Euthanasie in 75% Alkohol ein und legen Sie sie mit dem Gesicht nach oben in eine gläserne Petrischale in nummerierter Reihenfolge.
- Führen Sie die Mäuse durch das Transferfenster in den sterilen Operationssaal und legen Sie sie für 5 Minuten auf den Operationstisch.
- Mit einer Spritze 10 ml Kochsalzlösung absaugen, die Mäuse um ca. 45° nach unten kippen und in die Mitte der Bauchhöhle injizieren. Ziehen Sie etwa 5 ml Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für jeweils 10 ml und wiederholen Sie die Injektion 3x.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für 5 Minuten, um peritoneale primäre Makrophagen der Maus zu erhalten. Resuspendieren Sie die Zellen, stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 106 Zellen/ml mit RPMI 1640 vollständigem Medium (mit 10% FBS) ein und beimpfen Sie die Zellsuspension in einer 24-Well-Platte, um eine konstante Anzahl von Zellen pro Welle (1 ml/Well) zu gewährleisten.
- Kultur bei 37 °C in 5%CO2 über Nacht (ca. 16-20 h), gefolgt von Inkubation mit PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD und Ag/Al (Ag-Endkonzentration: 5 μg/ml; adjuvante Endkonzentration: 10 μg/ml; Gesamtvolumen: 2 ml) für 24 h. Die Konzentrationen von IL-1β, IL-6 und TNF-α im Kulturüberstand werden mit ELISA-Kits unter Verwendung der in den Schritten 3.12-3.19 beschriebenen Methoden und Verfahren nachgewiesen.
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Representative Results
Die Bewertung der zellulären Aktivität der Adjuvantien OP-D und NOD wurde in vitro gemäß dem Protokoll durchgeführt. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD (Abbildung 1). Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann den Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen (Abbildung 2). Die Überwachung von CTLs mit ELISpot ist der Goldstandard für die Beurteilung der Antigen-spezifischen T-Zell-Immunität in klinischen Studien und für das Screening von Impfstoffkandidaten (Abbildung 3). Die erhöhte Aufnahme eines Antigens durch DCs kann eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorrufen (Abbildung 4). Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Präsentation von Antigenen für T-Zellen sowie bei der Induktion anderer Antigen-präsentierender Zellen, kostimulatorische Moleküle zu exprimieren, wodurch adaptive Immunantworten ausgelöst werden (Abbildung 5). Die oben genannten experimentellen Ergebnisse wurden von Tong et al. veröffentlicht, und die unterschiedlichen Antikörperreaktionen in vivo und die Schutzeffizienz gegen Mäuse sind im ursprünglichen Artikel14 zu finden.
Abbildung 1: In-vitro-Zytotoxizitätstest von L929-Zellen. Die zytotoxischen Wirkungen verschiedener Gradientenkonzentrationen von OP-D und NOD (30 μg/ml, 60 μg/ml, 120 μg/ml, 240 μg/ml und 480 μg/ml) bei Inkubation mit L929-Zellen werden gezeigt. Für die Detektion wurde ein CCK-8-Kit verwendet. Die statistische Analyse wurde mit einer statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden mit einem ungepaarten, zweiseitigen Student's t-Test analysiert. Alle Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt, und signifikante Unterschiede werden wie folgt ausgedrückt: *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Diese Zahl wurde von Tong et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Konzentrationen von IFN-γ und IL-17A in Splenozyten. Splenozyten von geimpften Mäusen wurden 3 Tage lang mit dem Antigen stimuliert, und die Konzentrationen der Zytokine (A) IFN-γ und (B) IL-17A im Überstand wurden mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Produktion von IFN-γ und IL-17A in der Ag/NOD-Gruppe im Vergleich zu den Ag/OP-D-, Ag/BNE- und Ag/Al-Gruppen signifikant gesteigert war (p < 0,01). Die statistische Analyse wurde mit einer statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Alle Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 8) ausgedrückt, und signifikante Unterschiede werden wie folgt ausgedrückt: *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Diese Zahl wurde von Tong et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Anzahl der IFN-γ- und IL-17A-sezernierenden Zellen in der Splenozytenpopulation. (A) ELISpot-Analyse von IFN-γ punktbildenden Antigen-spezifischen T-Zellen unter den Splenozyten. (B) ELISpot-Analyse von IL-17A-punktbildenden Antigen-spezifischen T-Zellen unter den Splenozyten. Ähnlich wie bei den Zytokin-Ergebnissen zeigten die Ag/OP-D- und Ag/NOD-Gruppen signifikant erhöhte Verhältnisse und Anzahlen von IFN-γ- und IL-17A-bildenden Zellen in der Milz-lymphatischen T-Zellpopulation. Die Ag/NOD-Gruppe induzierte stärkere Th1- (p < 0,001) und Th17 (p < 0,01) Immunantworten als die anderen Gruppen. Die statistische Analyse wurde mit einer statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Alle Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 8) ausgedrückt, und signifikante Unterschiede werden wie folgt ausgedrückt: *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Diese Zahl wurde von Tong et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: CLSM-Bilder der Antigenaufnahme durch BMDCs. Phalloidin färbt das Zytoskelett rot, DAPI färbt den Zellkern blau und GFP zeigt grüne Fluoreszenz. Wie in der Abbildung gezeigt, wird eine grüne Fluoreszenz in CLSM nach 30 min Koinkubation der GFP + OP-D- und GFP + NOD-Gruppen mit BMDCs beobachtet, aber die GFP + NOD-Partikel sind von phagosomenartigen vesikulären Strukturen umgeben, während die GFP + OP-D-Partikel nicht sind. Diese Zahl wurde von Tong et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Einfluss des adjuvans formulierten Antigens auf die Aktivierung von PMs. ELISA zum Nachweis der Konzentrationen der Zytokine IL-1β, IL-6 und TNF-α im Überstand von PMs, die mit PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD und Ag/Al koinkubiert wurden. Im Vergleich zur Antigenstimulation erhöhte die Ag/NOD-, Ag/OP-D- und Ag/Al-Stimulation signifikant die IL-1β-, IL-6- und TNF-α-Sekretion aus den PMs (p < 0,05). Die Aktivierung von Makrophagen war in der NOD-Gruppe im Vergleich zu den OP-D- und AlPO-4-Gruppen signifikant verbessert (p < 0,05). Die statistische Analyse wurde mit einer statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Alle Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 8) ausgedrückt, und signifikante Unterschiede werden wie folgt ausgedrückt: *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Diese Zahl wurde von Tong et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Reagenz | Dichte | Masse (pro 10g) |
| Cremophor EL-35 | Masse | 1.92 |
| Glycerin | Masse | 0.48 |
| AGB | Masse | 0.6 |
| Reinstwasser | Masse | Restbetrag |
Tabelle 1: Die BNE-Formel.
| Reagenz | Dichte | Volumen |
| β- Mercaptoethanol | 50μM | 0,366 μL |
| Fötales Rinderserum | 1-fach | 10 ml |
| Glutamax | 2 mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1-fach | 85 ml |
| HEPES | 10 mM | 1 ml |
| Nicht-essentielle Aminosäuren (100x) | 1-fach | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | 100U/ml | 1 ml |
| Natriumpyruvat (100 mM) | 1mM | 1 ml |
Tabelle 2: Vorbereitungsinformationen für das RF-10-Komplettmedium.
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Discussion
Subunit-Impfstoffe bieten eine ausgezeichnete Sicherheit, aber eine schlechte Immunogenität. Die Hauptstrategie zur Verbesserung der Immunogenität besteht darin, Antigene physisch zu adsorbieren oder mit Adjuvantien zu koppeln und sie in die Wirkstoffabgabesysteme zu integrieren, um die Aufnahme und Präsentation durch DCs zu fördern. Natürliche Pflanzensaponine wie Quillaia-Saponin und seine Derivate sind hochtoxisch und nicht für die Entwicklung von Humanimpfstoffengeeignet 17. Daher ist die Untersuchung der toxischen Wirkungen von Impfstoffen oder Adjuvantien auf Zellen ein notwendiger erster Schritt bei der Bewertung neuer Impfstoffe.
Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll wird gemäß ISO 10993-5:2009-18 durchgeführt, was eine gewisse Flexibilität bei der Probenherstellung ermöglicht. Die standardmäßige toxische Zelllinie, L929-Fibroblasten und gingivale Fibroblasten weisen eine ähnliche Zytotoxizität auf. L929-Fibroblasten haben sich jedoch aufgrund ihrer hervorragenden Reproduzierbarkeit zu einem nützlichen Screening-Modell für In-vitro-Toxizitätstests von Nanomaterialien entwickelt19. MTT und CCK-8 werden häufig für Zelllebensfähigkeits- und Zytotoxizitätstests verwendet. Die Ergebnisse der MTT- und CCK-8-Assays widersprechen sich und sind nicht signifikant korreliert, aber die Zelllebensfähigkeit des CCK-8-Assays unterscheidet sich signifikant von der des MTT-Assays20. Eine mögliche Erklärung für die MTT-Ergebnisse in der vorangegangenen Studie ist, dass bei höheren MTT-Konzentrationen ein beschleunigter Zelltod induziert werden kann21. Die experimentellen Ergebnisse der CCK-8-Methode stimmen im Allgemeinen mit den Ergebnissen der Toxizitätsversuche an Tierenüberein 22. Daher ist die Verwendung des CCK-8-Assays zum Nachweis der Toxizität von OP-D- und NOD-Zellen für L929-Zellen derzeit wahrscheinlich die beste Option, bis neue Methoden zur Bewertung der Zytotoxizität zur Verfügung stehen. Diese Methode wird auch weiterhin im Bereich der Impfstoffmaterialien und der adjuvanten Bewertung angewendet.
Die Milz ist das größte sekundäre lymphatische Organ im menschlichen Körper, und die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann uns helfen, die Immunantwortzu verstehen 23. Es wird angenommen, dass es einige grundlegende Unterschiede in der Struktur und den Zelltypen zwischen der Milz von Mäusen und Menschen gibt24, aber die grundlegende Ähnlichkeit spezifischer Immunzelltypen und der Funktion der Milzregion machen Studien mit den Milz-T-Zellen von Mäusen relevant24. In diesem Protokoll haben wir die sekretorischen Spiegel des Th1-Zytokins IFN-γ und des Th17-Zytokins IL-17A in der Milz unter Verwendung von ELISA-Kits gemessen. Dieser Assay wird normalerweise für quantitative Bestimmungen verwendet und hat eine hohe Sensitivität, da er hochaffine Antikörper verwendet, um unspezifische Substanzen wegzuwaschen. Die Haupteinschränkungen dieser Studie sind die lange Messzeit und der hohe Verbrauch von Reagenzien. Zytokine können auch mit Durchflusszytometrie und Luminex-Methoden nachgewiesen werden, aber diese Methoden erfordern komplexe Instrumente sowie teure Rohstoffe und spezielle Schulungen. Daher ist dieses einfache und kostengünstige ELISA-Kit ein wertvolles Werkzeug zur Messung spezifischer Immunantworten. ELISpot hat sich zu einer der am häufigsten verwendeten Techniken entwickelt, um die Immunantwort spezifischer Zytokin-Fleckenzellen zu bestimmen. Es kann nicht nur zum Nachweis von CD8+ T-Zellantworten verwendet werden, die durch Impfstoffkandidaten hervorgerufen werden, sondern auch für die Erkennung spezifischer Antigene nach der Immunisierung25. Mit Hochdurchsatz-Screening und einer empfindlichen Nachweisgrenze (1/100.000 Zellen) ist ELISpot weit verbreitet, da es auch Vorteile der direkten Beobachtung von Zellen und der schnellen Analyse bietet. Die Bildung jedes Flecks zeigt die Häufigkeit der Aktivierung einzelner T-Zellen oder B-Zellen an.Die Bewertung der zellulären Reaktion auf Impfstoffe und Adjuvantien ist von großer Bedeutung, was ELISpot derzeit unersetzlich macht.
Die Präsentation von Antigenen durch DCs ist eine Voraussetzung für die Auslösung von Immunantworten14. DCs, die für die Antigenaufnahme, die Migration in die Lymphknoten und die Aktivierung naiver T-Zellen verwendet werden, sind einer der essentiellen Zelltypen für die Entwicklung von T-Zell-vermittelten Immunantworten14. In Anbetracht der Tatsache, dass die Wechselwirkung von Nanoemulsionspartikeln mit der Zellmembran eine Schlüsseldeterminante für die Partikelaufnahme ist, wurde die GFP-Phagozytose innerhalb von DCs unter Verwendung von CLSM in diesem experimentellen Protokoll bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass DCs Antigene effizient zu drainierenden Lymphknoten transportieren können, weshalb Adjuvantien die Antigenimmunogenität in vivo verstärken können. Darüber hinaus ist CLSM die gebräuchlichste kommerzielle Implementierung der Technik und wird häufig in bildgebenden Laboratorien eingesetzt. Die optische Schnittfähigkeit, die klare Auflösung und die Vielseitigkeit der 3D-Bildgebung26 von CLSM machen sie zum besten Werkzeug für die Analyse der Antigenaufnahme durch DCs, auch wenn sie nicht für die Erfassung quantitativer Daten verwendet werden kann.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC I und II) ist wichtig für die spezifische Erkennung von Antigenen. MHC-II-funktionelle Moleküle werden in APCs stark exprimiert und induzieren die Aktivierung von CD4+ T-Zellen. Zu den APCs gehören Makrophagen, DCs und B-Lymphozyten27, die die adaptive Immunität stark modulieren. Makrophagen sind im Immunsystem des Wirts weit verbreitet und spielen eine Schlüsselrolle bei der Abwehr und Homöostase28. Die Aktivierung von Makrophagen ist essentiell für die Initiierung adaptiver Immunantworten29. In der Zwischenzeit können Nanoemulsions-Adjuvantien, die die gleiche Größe wie Krankheitserreger haben, die Antigenerkennung und Phagozytose fördern, NALP3-Inflammasomen und Makrophagen aktivieren und die Antigenpräsentation modulieren28. In diesem Protokoll wurden PMs hauptsächlich als Modell verwendet, um die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und Th2, der Zytokine IL-6 und TNF-α mittels ELISA zu bestimmen, mit denen die Makrophagenaktivierungsfähigkeit von Impfstoffen und Adjuvantien qualitativ bewertet werden kann. Der Grad und der Mechanismus der Aktivierung müssen jedoch durch weitere Experimente bestimmt werden. Zum Beispiel, ob EGF, IL-6 und andere Faktoren, die für die Aktivierung von Immunzellen notwendig sind, sezerniert werden und die damit verbundenen Signalwege (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, etc.) müssen untersucht werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Reihe von Protokollen zur Bestätigung der zellulären In-vitro-Reaktionen auf neuartige Adjuvantien, einschließlich Zytotoxizität, Zytokinsekretion, DC-Aufnahme und Makrophagenaktivierung, etabliert wurde. Diese Protokolle zeigen nicht nur eine geringe Toxizität und eine hohe zelluläre Abgabe, sondern bieten auch detaillierte Verfahren für CCK-8, ELISA und ELISpot. Die Bewertung des zellulären Ansprechens des pflanzlichen Immunpotentiators OP-D und seines modifizierten starken Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans NOD wurde in vitro durchgeführt, und das Protokoll war wirksam. Obwohl ELISA, ELISpot und konfokale Laserscanning-Techniken klassischerweise verwendet wurden, um die In-vitro-Immunkompetenz von Adjuvantien für Zellen zu bewerten, haben diese Methoden viele Nachteile, wie lange Messzeiten, hohe Arbeitsbelastung, teure Materialien und den Bedarf an professionellen Technikern. Viele genaue Methoden und fortschrittliche Technologien, wie Genchips, Einzelzellsequenzierung und Transkriptomtechnologie, müssen in zukünftigen Studien verwendet werden, um den Umfang der Technik weiter zu erweitern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen oder persönlichen Interessen gibt, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die Zuschüsse Nr. 2021YFC2302603 des National Key Research and Development Program of China, Zuschüsse Nr. 31670938, 32070924, 82041045 und 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Zuschüsse Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Grant No. CYS21519 des Postgraduate Research and Innovation Project of Chongqing, Zuschuss Nr. 2020XBK24 der Army Medical University Sonderprojekte und Zuschuss Nr. 202090031021 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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