Summary
Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l'adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.
Abstract
Come ingrediente principale dei vaccini, gli adiuvanti possono indurre o migliorare direttamente le risposte immunitarie potenti, diffuse, innate e adattative associate agli antigeni. Ophiopogonin D (OP-D), un componente purificato estratto dalla pianta Ophiopogon japonicus, è stato trovato utile come adiuvante del vaccino. I problemi della bassa solubilità e tossicità dell'OP-D possono essere efficacemente superati utilizzando un metodo di emulsificazione a bassa energia per preparare la nanoemulsione ofiopogonina D (NOD). In questo articolo vengono esaminati una serie di protocolli in vitro per la valutazione dell'attività cellulare. Gli effetti citotossici di L929 sono stati determinati utilizzando un test kit-8 per il conteggio delle cellule. Quindi, i livelli di citochine secreti e il corrispondente numero di cellule immunitarie dopo la stimolazione e la coltura di splenociti da topi immunizzati sono stati rilevati con metodi ELISA ed ELISpot. Inoltre, la capacità di assorbimento dell'antigene nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC), che sono state isolate da topi C57BL / 6 e maturate dopo l'incubazione con GM-CSF più IL-4, è stata osservata mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM). È importante sottolineare che l'attivazione dei macrofagi è stata confermata misurando i livelli di IL-1β, IL-6 e citochine del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) mediante kit ELISA dopo aver cocoltivato macrofagi peritoneali (PM) da topi bianchi con l'adiuvante per 24 ore. Si spera che questo protocollo fornirà ad altri ricercatori approcci sperimentali diretti ed efficaci per valutare l'efficacia della risposta cellulare di nuovi adiuvanti vaccinali.
Introduction
I vaccini sono un mezzo importante per prevenire e curare le malattie infettive e non trasmissibili. L'aggiunta appropriata di adiuvanti e veicoli di somministrazione alle formulazioni dei vaccini è utile per migliorare l'immunogenicità degli antigeni e generare risposte immunitarie durature1. Oltre al classico allume adiuvante (sale di alluminio), ci sono sei tipi di adiuvanti per i vaccini che sono attualmente commercializzati: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Generalmente, quando il corpo umano incontra un attacco virale, la prima e la seconda linea di difesa (pelle, mucosa e macrofagi) prendono il comando nell'eliminazione del virus e, infine, viene attivata la terza linea di difesa, che coinvolge gli organi immunitari e le cellule immunitarie. L'alluminio e i sali di alluminio sono stati gli adiuvanti più utilizzati per i vaccini umani sin dai primi anni 1920, suscitando un'efficace risposta immunitaria innata6. Tuttavia, è stato proposto che l'attivazione delle cellule presentanti l'antigene (APC) da parte degli adiuvanti classici, che stimola le cellule immunitarie a generare serie specifiche di citochine e chemochine, è il meccanismo attraverso il quale funzionano gli adiuvanti e può essere uno dei motivi per cui gli adiuvanti esercitano solo effetti transitori su specifiche risposte immunitarie7. La presenza di adiuvanti autorizzati limitati per uso umano è un fattore restrittivo per lo sviluppo di vaccini che suscitano risposte immunitarie efficaci8.
Attualmente, un numero crescente di studi adiuvanti sta dimostrando la capacità di indurre una forte risposta immunitaria cellulare nei topi. QS-21 ha dimostrato di indurre una risposta immunitaria bilanciata T-helper 1 (Th1) e T-helper 2 (Th2), produrre livelli più elevati di titoli anticorpali e prolungare la protezione come adiuvante, ma la sua forte tossicità e le proprietà emolitiche limitano il suo sviluppo come adiuvante clinico autonomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopyranoside) è una delle saponine steroidee isolate dalla radice della pianta medicinale cinese Ophiopogon japonicas4. Inoltre, è il principale componente farmacologicamente attivo (Shen Mai San) trovato in Radix Ophiopogonis ed è noto per avere alcune proprietà farmacologiche11. Inoltre, è un membro della famiglia delle Liliaceae ed è ampiamente utilizzato per i suoi effetti inibitori e protettivi nell'infiammazione cellulare e nel danno miocardico. Ad esempio, OP-D migliora le lesioni simili alla dermatite atopica indotte da DNCB e le cellule HaCaT infiammatorie del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nei topi BALB / c12. È importante sottolineare che OP-D promuove la protezione antiossidante del sistema cardiovascolare e protegge il cuore dal danno autofagico indotto dalla doxorubicina riducendo sia la generazione di specie reattive dell'ossigeno che interrompendo il danno alla membrana mitocondriale. Gli esperimenti hanno dimostrato che l'assunzione di OP-D con mono-desmoside aiuta a migliorare la salute immunitaria, aumentare la conta dei globuli bianchi e la sintesi del DNA e far durare più a lungo gli anticorpi13. In precedenza è stato riscontrato che l'OP-D ha un effetto adiuvante14.
Le nanoemulsioni sono nanoformulazioni olio-in-acqua composte da una combinazione di tensioattivi, olio, tensioattivi e acqua12,15. Questi progetti di nanovaccini consentono di incapsulare insieme antigeni e adiuvanti per migliorare la stimolazione immunitaria, proteggere gli antigeni e promuovere la maturazione delle cellule dendritiche (DC)16. Per lo sviluppo di questi nuovi adiuvanti ottenuti dallo screening, è importante trovare metodi appropriati per valutare le loro capacità di risposta cellulare.
Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare sistematicamente se gli adiuvanti possono migliorare la fagocitosi e l'espressione di cellule immunitarie in colture cellulari in vitro e di elaborare i principali metodi sperimentali. L'esperimento è diviso in quattro sottosezioni: (1) la tossicità di OP-D e NOD per le cellule L929 è determinata dal test del kit-8 (CCK-8) per il conteggio delle cellule; (2) i livelli di citochine di IFN-γ endocrino e IL-17A e il numero di cellule corrispondenti nei topi immunizzati sono rilevati mediante stimolazione degli splenociti e saggi ELISpot; (3) la capacità di presentazione dell'antigene delle DC dopo stimolazione adiuvante è osservata utilizzando la microscopia confocale; e (4) vengono rilevati i tre tipi di citochine, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nei supernatanti ottenuti da macrofagi peritoneali (PM) in topi normali in cocoltura con adiuvanti.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sulle cellule sono stati eseguiti in un laboratorio di ingegneria cellulare dotato di sale operatorie di base, sale tampone, sale di coltura sterili e sale di identificazione e analisi. L'ambiente e le condizioni di lavoro erano privi di contaminazione microbica e altri fattori dannosi. Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sulla base delle linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare.
1. Autoclave e preparazione del materiale
- Preparare i reagenti e i materiali di consumo, come soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), forbici, pinze e rete abrasiva, mediante sterilizzazione a calore umido mediante autoclave a 121 °C per 20 minuti.
- Per i reagenti e le attrezzature necessari, vedere la tabella dei materiali. Per la formula della nanoemulsione in bianco (BNE), controllare la Tabella 1.
2. Saggio di citotossicità L929
- Accendere il bagnomaria e regolare la temperatura a 37 °C. Raccogliere un tubo di cellule L929 congelate dall'azoto liquido e scongelare rapidamente a bagnomaria a 37 °C.
- Pipettare le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 ml subito dopo lo scongelamento, aggiungere 2 ml di DMEM e mescolare bene.
- Centrifugare i campioni a 129 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Quindi, aggiungere 2 ml di DMEM per risospendere le cellule e centrifugare nuovamente i campioni a 129 x g per 5 minuti.
- Eliminare il surnatante, aggiungere 6 mL di terreno completo DMEM (contenente il 10% di FBS) per la risospensione e trasferirlo in un matraccio di coltura T25 in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 in coltura per 48 ore.
- Eliminare il terreno di coltura nel pallone di coltura e lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per digerire le cellule per 1-2 minuti a 37 °C.
- Quando si osserva l'arrotondamento delle cellule, aggiungere 4 ml di mezzo completo DMEM per terminare immediatamente la digestione e mescolare bene. Quindi, aspirare le cellule in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo DMEM. Utilizzare una sospensione cellulare da 20 μL per il conteggio delle cellule utilizzando piastre di conteggio delle cellule e diluire le cellule rimanenti a 1 x 105 cellule / ml con DMEM mezzo completo.
- Aggiungere 100 μL di acqua ultrapura alla periferia di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 100 μL di diluente cellulare solo ai pozzetti interni. Posizionare la piastra nell'incubatore per coltura aderente per 4 ore a 37 °C.
- Dopo che le cellule aderiscono, aggiungere OP-D e NOD separatamente nel mezzo completo DMEM a un volume finale di 200 μL / pozzetto (le concentrazioni finali di ciascun farmaco sono 480 μg / mL, 240 μg / mL, 120 μg / mL, 60 μg / mL e 30 μg / mL). Per ogni concentrazione, utilizzare tre pozzetti come repliche. Quindi, riposizionare le cellule nell'incubatore e nella coltura per altre 24 ore.
- Diluire CCK-8 al 10% con mezzo completo DMEM e aggiungere 100 μL/pozzetto di diluizioni contenenti l'adiuvante e le soluzioni cellulari alla piastra a 96 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore e incubare per altre 2-3 ore.
- Mescolare frequentemente durante la placcatura della soluzione cellulare per evitare disomogeneità dovute alla precipitazione cellulare. Agitare delicatamente la piastra più volte prima e dopo aver aggiunto CCK-8 per mescolare bene il mezzo e la soluzione CCK-8.
- Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Impostare un pozzetto di azzeramento con solo mezzo e CCK-8 per un valore di assorbanza di base. Calcolare valori di assorbanza accurati sottraendo il valore di assorbanza azzerato dal valore di assorbanza ottenuto durante il plottaggio.
- Verificare che non siano presenti bolle in nessun pozzetto prima di eseguire il test con il lettore di micropiastre perché le bolle interferiranno con il test.
3. Stimolazione degli splenociti
- Immunizzare topi BALB/c di età compresa tra 6-8 settimane con 30 μg di antigene proteico più 30 μg di adiuvante tramite iniezione intramuscolare (200 μL) il giorno 0, giorno 7 e giorno 14 secondo i seguenti gruppi sperimentali: (1) gruppo PBS, (2) gruppo antigene (Ag), (3) gruppo antigene + OP-D (Ag/OP-D), (4) gruppo antigene + BNE (Ag/BNE), (5) gruppo antigene + NOD (Ag/NOD) e (6) gruppo antigene + AlPO4 (Ag/Al).
- Sala di preparazione: Il giorno 24 dopo l'immunizzazione primaria, rimuovere i topi dalla stanza degli animali e eutanasizzarli mediante un'iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di pentobarbital di sodio all'1%. Mettere i topi in un piatto di vetro e immergere in alcool al 75% per 5 minuti.
- Posizionare le provette da centrifuga su una griglia per tubi da centrifuga, numerare le piastre di Petri monouso e aggiungere 5 ml di PBS a ciascuna piastra di Petri con una pipetta da 10 ml.
- Fai un'incisione di 6-8 cm con le forbici nel mezzo del lato ventrale sinistro del mouse, apri la pelle, esponi la parete addominale e individua la lunga striscia rossa della milza.
- Sollevare il peritoneo sul lato inferiore della milza con una pinza, tagliarlo e girarlo verso l'alto per esporre la milza. Sollevare la milza con una pinza, separare il tessuto connettivo sotto la milza con forbici oftalmiche e rimuovere la milza.
- Mettere la milza in una piastra di Petri contenente 5 ml di PBS e macinare con un setaccio (200 maglie, 70 μm) e una barra di macinazione. Dopo la macinazione, trasferire il liquido in una provetta da centrifuga da 15 ml con un contagocce, secondo la numerazione.
- Centrifugare il liquido a 453 x g per 5 min. Scartare il surnatante, aggiungere 3 ml di tampone di lisi dei globuli rossi a ciascuna provetta, risospendere le cellule e lisare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere 10-12 ml di PBS a ciascun tubo, mescolare il tubo capovolto e centrifugare a 453 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, aggiungere 10 ml di PBS a ciascuna provetta da centrifuga e risospendere le cellule.
- Prelevare 20 μL di ciascun campione in un pozzetto della piastra di conteggio delle cellule e registrare il numero di cellule vive utilizzando un contatore automatico delle celle.
- Centrifugare i campioni a 453 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule, diluire a 2,5 x 106 cellule/ml con mezzo RF-10 (informazioni sulla formulazione nella Tabella 2) e aggiungere a una piastra da 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto.
- Diluire l'antigene con RF-10 medio a 10 μg/ml, aggiungere 100 μL a ciascun pozzetto e incubare per 3 giorni a 37 °C in 5% di CO2.
- Aspirare la sospensione cellulare ottenuta da ciascun gruppo di cellule in provette da centrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 453 x g per 20 minuti e aspirare il surnatante in una provetta da centrifuga pulita.
- Eseguire il rilevamento del contenuto di IFN-γ e IL-17A rigorosamente secondo le istruzioni del kit ELISA. I metodi e le procedure sono i seguenti.
- Preparare 1x soluzione tampone di lavaggio funzionante (fornita con il kit), soluzione standard di concentrazione gradiente (soluzione standard di citochine diluite a 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/ml e 15,6 pg/mL nel tampone di diluizione R [1x] fornito con il kit), soluzione di lavoro anticorpale biotinilata (soluzione anticorpale biotinilata diluita a 1:100 utilizzando il tampone di diluizione R [1x] fornito con il kit per formare la soluzione di lavoro), e soluzione di lavoro streptavidina-HRP secondo necessità.
- Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione standard di citochine diluite nel pozzetto standard, 100 μL/pozzetto del campione nel pozzetto del campione (il tampone di diluizione R [1x] fornito con il kit viene utilizzato per la diluizione del campione) e 100 μL/pozzetto del tampone di diluizione R (1x) nel pozzetto di controllo in bianco.
- Aggiungere la soluzione di lavoro di anticorpi biotinilati a 50 μL/pozzetto. Mescolare bene, coprire con una membrana sigillante e incubare a 37 °C per 90 minuti.
- Rimuovere il liquido dai pozzetti e aggiungere 1x soluzione tampone di lavaggio funzionante a 300 μL/pozzetto. Scartare il liquido dai pozzetti dopo 1 min. Ripetere questo processo 4 volte lasciando asciugare il liquido su carta da filtro ogni volta.
- Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione di lavoro streptavidina-HRP. Coprire e incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti. Centrifugare i campioni a 453 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
NOTA: La soluzione di lavaggio che rimane nel pozzetto di reazione durante il processo di lavaggio deve essere accuratamente tamponata fino a quando non è possibile vedere alcuna filigrana sulla carta da filtro. - Aggiungere TMB a 100 μL/pozzetto, incubare le piastre a 37 °C per 5-30 minuti al buio e giudicare la reazione di terminazione in base alla profondità di colore nel pozzetto (blu scuro). Di solito, 10-20 minuti per lo sviluppo del colore possono ottenere buoni risultati.
- Terminare rapidamente la reazione aggiungendo soluzione di arresto a 100 μL/pozzetto. Rilevare il valore di assorbanza a 450 nm entro 10 minuti dalla terminazione.
NOTA: Equilibrare il reagente a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
4. Saggio ELISpot
- Eseguire l'immunizzazione dei topi e la raccolta di splenociti esattamente come descritto nei passaggi 3.1-3.10 sopra. Eseguire i test per IFN-γ e IL-17A in stretta conformità con le istruzioni del kit. I metodi e le procedure sono i seguenti.
- Rimuovere la piastra dalla confezione sigillata, lavare 4 volte con PBS sterile (200 μL/pozzetto) e aggiungere 1640 terreno di coltura completo (200 μL/pozzetto) per bilanciarlo a temperatura ambiente per 2 ore.
- Rimuovere il terreno e diluire la sospensione di splenociti con RF-10 medio a 2 x 105 cellule/ml, aggiungendo 50 μL di cellule e antigene per pozzetto (concentrazione finale: 10 μg/mL).
- Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 48 ore. Non spostare la piastra durante questo periodo e adottare misure per evitare l'evaporazione (ad esempio, avvolgere la piastra con un foglio di alluminio).
- Diluire l'anticorpo di rilevazione (BVD6-24G2-biotina) a 1 μg/mL (1:1.000) in soluzione salina tamponata fosfato (0,5 mL:100 mL) contenente 0,5% siero fetale bovino (PBS-0,5% FBS). Aggiungere 100 μL/pozzetto alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2 ore dopo la filtrazione attraverso una membrana da 0,22 μm.
- Decantare il liquido nei pozzetti, aggiungere 1x tampone di lavaggio a 200 μL/pozzetto e lavare 5x. Lasciare agire per 30-60 secondi ogni volta e, per l'ultima volta, lasciare asciugare su carta assorbente.
- Diluire la streptavidina-rafano perossidasi (1:1.000) in PBS-0,5% FBS e aggiungere 100 μL/pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la piastra come al punto 4.6.
- Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione di substrato TMB pronta all'uso e sviluppare fino a quando non appare un punto chiaro. Interrompere lo sviluppo del colore lavando abbondantemente in acqua deionizzata (risciacquare 5x-6x ripetutamente). Se necessario, rimuovere il canale sotterraneo (la plastica morbida sotto la piastra) e sciacquare il lato inferiore della membrana.
- Esaminare e contare le macchie su un lettore ELISpot o un microscopio da dissezione dopo che la lastra si è asciugata.
5. Adozione da parte dei paesi in via di sviluppo
- Eutanasia di topi normali BALB/c mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio all'1%. Immergere i topi in alcool al 75% per 5 minuti.
- Tagliare un'incisione di 6-8 cm sotto l'addome del mouse con le forbici e bloccare le due estremità dell'apertura per separarlo in direzioni diverse ed esporre le gambe del mouse. Separare il femore del topo dal corpo del topo e la tibia dall'articolazione e mantenere intatte le ossa ad entrambe le estremità.
- Rimuovere il tessuto residuo e la cartilagine dalle articolazioni articolari ad entrambe le estremità del femore con forbici e pinze. Immergere i femori in alcool al 75% per 5 minuti, quindi immergerli in una soluzione sterile di PBS per lavare via l'alcol superficiale.
- Tagliare le estremità dei femori con le forbici e sciacquare il midollo osseo in una capsula di Petri sterile con soluzione sterile di PBS seguita da aspirazione con una siringa da 1 ml. Ripetere il lavaggio 3x-5x.
- Filtrare mediante un setaccio cellulare (200 mesh, 70 μm) e raccogliere i BMDC in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare i campioni a 290 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 4 ml di tampone di lisi dei globuli rossi, risospendere e lisare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aggiungere 10 mL di soluzione sterile di PBS per neutralizzare il lisato, centrifugare a 290 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 1 mL di DMEM contenente una soluzione di penicillina-streptomicina all'1% e FBS al 10% e contare. Quindi, aggiungere GM-CSF (20 ng / mL) più IL-4 (10 ng / mL) al mezzo, regolare la concentrazione cellulare a 5 x 105 / ml e inoculare le cellule su vetrini.
- Aggiungere la sospensione della cella in una piastra a 6 pozzetti a 2 mL/pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 48 ore. Cambia completamente il mezzo dopo 2 giorni e cambia metà del mezzo dopo 4 giorni.
- Selezionare cinque pozzetti con cellule in buone condizioni (cellule grandi e radiotrasparenti con sporgenze dendritiche sulla superficie cellulare) utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x per l'esperimento il settimo giorno di coltura. Scartare il surnatante, aggiungere 2 mL di soluzioni GFP, OP-D + GFP e NOD + GFP diluite con DMEM mezzo completo (concentrazione finale GFP: 20 μg/mL; concentrazione finale adiuvante: 10 μg/mL) a ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 °C per 30 minuti al buio.
- Lavare le piastre 3 volte con PBS, aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Rimuovere la paraformaldeide dopo la fissazione, incubare le cellule con falloidina e DAPI ad una concentrazione finale di 10 μg / ml per 10 minuti per la colorazione, quindi lavare 3 volte con PBS.
- Aggiungere 1 mL di PBS a ciascun pozzetto e osservare l'assorbimento dell'antigene utilizzando CLSM, come descritto di seguito.
- Aprire il software CLSM, fare clic su ZEN System e attendere il completamento dell'inizializzazione dell'hardware.
- Fare clic sulle scorciatoie GFP e DAPI nella scheda Trova per trovare l'area che può essere osservata. Spegnere la luce fluorescente e la luce trasmessa.
- Fare clic su Smart Setup nel menu di acquisizione per aprire la libreria di coloranti e aggiungere tre coloranti fluorescenti: EGFP, falloidina e DAPI. Fare clic su Miglior segnale > OK. Fare clic sul canale EGFP nella scheda canali e fare clic su Live per selezionare il campo visivo corretto sull'interfaccia a destra.
- Selezionate 1 UA per il foro stenopeico, ruotate la vite di messa a fuoco fine per regolare la lunghezza focale, quindi selezionate il piano focale appropriato. Fare clic su Indicatore di intervallo e regolare la combinazione di potenza laser e guadagno principale in modo che solo sporadici punti rossi appaiano sull'immagine.
- Regolare i canali falloidina e DAPI con gli stessi parametri senza modificare la potenza del laser.
- Selezionare Stop Live e fare clic su Modalità di acquisizione per modificare i parametri di ripresa: Dimensioni fotogramma: 1024 pixel x 1024 pixel; Velocità di scansione: 7; Media: 2x. Clicca su Snap e seleziona Dividi per visualizzare tutte le immagini scattate. Salvare le immagini.
6. Attivazione dei macrofagi
- Immergere i topi C57BL/6 in alcool al 75% dopo l'eutanasia e metterli a faccia in su in una capsula di Petri di vetro in ordine numerato.
- Passare i topi attraverso la finestra di trasferimento nella sala operatoria sterile e posizionarli sul tavolo operatorio per 5 minuti.
- Utilizzando una siringa, aspirare 10 mL di soluzione salina, inclinare i topi verso il basso di circa 45° e iniettarli al centro della cavità addominale. Aspirare circa 5 mL di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL per ogni 10 mL e ripetere l'iniezione 3x.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per 5 minuti per ottenere macrofagi primari peritoneali di topo. Risospendere le cellule, regolare la concentrazione cellulare a 2 x 106 cellule/ml con RPMI 1640 mezzo completo (contenente il 10% di FBS) e inoculare la sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti per garantire un numero costante di cellule per pozzetto (1 mL/pozzetto).
- Coltura a 37 °C in 5% di CO 2 durante la notte (circa 16-20 ore), seguita da incubazione con PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al (concentrazione finale di Ag: 5 μg/ml; concentrazione finale adiuvante: 10 μg/ml; volume totale:2 ml) per 24 ore. Rilevare i livelli di IL-1β, IL-6 e TNF-α nel surnatante di coltura con kit ELISA utilizzando i metodi e le procedure descritti nei passaggi 3.12-3.19.
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Representative Results
La valutazione dell'attività cellulare degli adiuvanti OP-D e NOD è stata completata in vitro secondo il protocollo. I fibroblasti L929 sono un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro di NOD (Figura 1). La quantificazione dei livelli di citochine infiammatorie nella milza può aiutare i ricercatori a comprendere meglio la risposta immunitaria (Figura 2). Il monitoraggio dei CTL con ELISpot è il gold standard per valutare l'immunità delle cellule T antigene-specifiche negli studi clinici e per lo screening dei candidati vaccini (Figura 3). L'aumento dell'assorbimento di un antigene da parte delle DC può suscitare risposte immunitarie adattative migliorate (Figura 4). I macrofagi svolgono un ruolo importante nella presentazione degli antigeni alle cellule T, oltre a indurre altre cellule presentanti l'antigene ad esprimere molecole costimolatorie, avviando così risposte immunitarie adattative (Figura 5). I risultati sperimentali di cui sopra sono stati pubblicati da Tong et al., e le diverse risposte anticorpali in vivo e l'efficacia di protezione contro i topi possono essere trovate nell'articolo originale14.
Figura 1: Test di citotossicità in vitro delle cellule L929. Sono mostrati gli effetti citotossici di diverse concentrazioni di gradiente di OP-D e NOD (30 μg/mL, 60 μg/mL, 120 μg/mL, 240 μg/mL e 480 μg/mL) quando incubati con cellule L929. Per il rilevamento è stato utilizzato un kit CCK-8. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un software di analisi statistica. Le differenze tra i due gruppi sono state analizzate utilizzando un test t di Student non accoppiato e a due code. Tutti i valori sono espressi come media ± DS (n = 3) e le differenze significative sono espresse come segue: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Questa cifra è stata modificata da Tong et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Livelli di IFN-γ e IL-17A negli splenociti. Gli splenociti dei topi vaccinati sono stati stimolati con l'antigene per 3 giorni e i livelli delle citochine (A) IFN-γ e (B) IL-17A nel surnatante sono stati misurati mediante ELISA. I risultati hanno mostrato che la produzione di IFN-γ e IL-17A era significativamente aumentata nel gruppo Ag / NOD rispetto ai gruppi Ag / OP-D, Ag / BNE e Ag / Al (p < 0,01). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un software di analisi statistica. Le differenze tra i gruppi multipli sono state analizzate utilizzando ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. Tutti i valori sono espressi come media ± SD (n = 8) e le differenze significative sono espresse come segue: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Questa cifra è stata modificata da Tong et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Numero di cellule secernenti IFN-γ e IL-17A nella popolazione di splenociti. (A) Analisi ELISpot di IFN-γ cellule T specifiche dell'antigene spot-forming tra gli splenociti. (B) Analisi ELISpot delle cellule T specifiche dell'antigene spot-forming di IL-17A tra gli splenociti. Analogamente ai risultati delle citochine, i gruppi Ag / OP-D e Ag / NOD hanno mostrato rapporti e numeri significativamente aumentati di cellule che formano IFN-γ e IL-17A nella popolazione di cellule T linfoidi spleniche. Il gruppo Ag / NOD ha indotto risposte immunitarie Th1 (p < 0,001) e Th17 (p < 0,01) più forti rispetto agli altri gruppi. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un software di analisi statistica. Le differenze tra i gruppi multipli sono state analizzate utilizzando ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. Tutti i valori sono espressi come media ± SD (n = 8) e le differenze significative sono espresse come segue: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Questa cifra è stata modificata da Tong et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immagini CLSM dell'assorbimento dell'antigene da parte delle BMDC. La falloidina colora il citoscheletro in rosso, DAPI colora il nucleo in blu e la GFP presenta fluorescenza verde. Come mostrato nella figura, la fluorescenza verde è osservata in CLSM dopo 30 minuti di coincubazione dei gruppi GFP + OP-D e GFP + NOD con BMDC, ma le particelle GFP + NOD sono circondate da strutture vescicolari simili a fagosomi, mentre le particelle GFP + OP-D non lo sono. Questa cifra è stata modificata da Tong et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Impatto dell'antigene formulato adiuvante sull'attivazione dei PM. ELISA per la rilevazione delle concentrazioni delle citochine IL-1β, IL-6 e TNF-α nel surnatante di PM coincubati con PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al. Rispetto alla stimolazione dell'antigene, la stimolazione Ag/NOD, Ag/OP-D e Ag/Al ha aumentato significativamente la secrezione di IL-1β, IL-6 e TNF-α dai PM (p < 0,05). L'attivazione dei macrofagi è stata significativamente migliorata nel gruppo NOD rispetto ai gruppi OP-D e AlPO4 (p < 0,05). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un software di analisi statistica. Le differenze tra i gruppi multipli sono state analizzate utilizzando ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. Tutti i valori sono espressi come media ± SD (n = 8) e le differenze significative sono espresse come segue: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Questa cifra è stata modificata da Tong et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Reagente | Densità | Massa (per 10g) |
| Cremophor EL-35 | massa | 1.92 |
| glicerolo | massa | 0.48 |
| CGT | massa | 0.6 |
| Acqua ultrapura | massa | Quantità residua |
Tabella 1: La formula di BNE.
| Reagente | Densità | Volume |
| β- Mercaptoetanolo | 50μM | 0,366μL |
| Siero bovino fetale | 1X | 10ml |
| Glutamax | 2mM | 1ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85ml |
| HEPES | 10mM | 1ml |
| Aminoacidi non essenziali (100x) | 1X | 1ml |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | 100U/mL | 1ml |
| Piruvato di sodio (100 mM) | 1mM | 1ml |
Tabella 2: Informazioni sulla preparazione del mezzo completo RF-10.
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Discussion
I vaccini a subunità forniscono un'eccellente sicurezza ma scarsa immunogenicità. La strategia principale per migliorare l'immunogenicità consiste nell'assorbire fisicamente o accoppiare gli antigeni con adiuvanti e incorporarli nei sistemi di somministrazione dei farmaci per promuovere l'assorbimento e la presentazione da parte delle DC. Le saponine vegetali naturali come la saponina di quillaia e i suoi derivati sono altamente tossiche e non sono adatte allo sviluppo di vaccini umani17. Pertanto, lo studio degli effetti tossici dei vaccini o degli adiuvanti sulle cellule è un primo passo necessario nella valutazione di nuovi vaccini.
Il protocollo presentato in questo studio viene eseguito secondo la norma ISO 10993-5:200918, che consente una certa flessibilità nella fabbricazione dei campioni. La linea cellulare tossica standard, i fibroblasti L929 e i fibroblasti gengivali hanno livelli simili di citotossicità. Tuttavia, i fibroblasti L929 sono diventati un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro dei nanomateriali a causa della loro eccellente riproducibilità19. MTT e CCK-8 sono comunemente usati per i saggi di vitalità cellulare e citotossicità. I risultati dei test MTT e CCK-8 si contraddicono a vicenda e non sono significativamente correlati, ma la vitalità cellulare del test CCK-8 è significativamente diversa da quella del test MTT20. Una possibile spiegazione per i risultati MTT nello studio precedente è che l'accelerazione della morte cellulare può essere indotta a concentrazioni MTT più elevate21. I risultati sperimentali del metodo CCK-8 sono generalmente coerenti con i risultati delle prove di tossicità sugli animali22. Pertanto, fino a quando non saranno disponibili nuovi metodi di valutazione della citotossicità, l'uso del test CCK-8 per rilevare la tossicità di OP-D e NOD alle cellule L929 è probabilmente l'opzione migliore al momento. Questo metodo continuerà ad essere applicato anche nel campo dei materiali vaccinali e della valutazione degli adiuvanti.
La milza è il più grande organo linfoide secondario nel corpo umano e la quantificazione dei livelli di citochine infiammatorie nella milza può aiutarci a capire la risposta immunitaria23. Si ritiene che ci siano alcune differenze fondamentali nella struttura e nei tipi di cellule tra le milze dei topi e gli esseri umani 24, ma la somiglianza di base di specifici tipi di cellule immunitarie e la funzione della regione della milza rendono gli studi che utilizzano le cellule T della milza dei topi rilevanti24. In questo protocollo, abbiamo misurato i livelli secretori della citochina Th1 IFN-γ e della citochina Th17 IL-17A nella milza utilizzando kit ELISA. Questo test viene solitamente utilizzato per determinazioni quantitative e ha un'elevata sensibilità perché utilizza anticorpi ad alta affinità per lavare via sostanze non specifiche. I principali limiti di questo studio sono il lungo tempo di misurazione e l'elevato consumo di reagenti. Le citochine possono anche essere rilevate con citometria a flusso e metodi Luminex, ma questi metodi richiedono strumenti complessi, nonché costose materie prime e formazione specializzata. Pertanto, questo kit ELISA semplice ed economico è uno strumento prezioso per misurare specifiche risposte immunitarie. ELISpot è diventata una delle tecniche più comunemente utilizzate per determinare le risposte immunitarie di specifiche cellule che formano macchie di citochine. Può essere utilizzato non solo per rilevare le risposte delle cellule T CD8+ suscitate dai candidati vaccini, ma anche per il riconoscimento di antigeni specifici dopo l'immunizzazione25. Con uno screening ad alto rendimento e un limite di rilevamento sensibile (1/100.000 cellule), ELISpot è ampiamente utilizzato in quanto offre anche vantaggi di osservazione diretta delle cellule e analisi rapida. La formazione di ogni punto indica la frequenza di attivazione delle singole cellule T o cellule BLa valutazione della risposta cellulare ai vaccini e agli adiuvanti è di grande importanza che rende ELISpot attualmente insostituibile.
La presentazione degli antigeni da parte delle DC è un prerequisito per suscitare risposte immunitarie14. Le DC, che vengono utilizzate per l'assorbimento dell'antigene, la migrazione ai linfonodi e l'attivazione delle cellule T naïve, sono uno dei tipi di cellule essenziali per lo sviluppo di risposte immunitarie mediate dalle cellule T14. Considerando che l'interazione delle particelle di nanoemulsione con la membrana cellulare è un determinante chiave dell'assorbimento delle particelle, la fagocitosi GFP all'interno delle DC è stata determinata utilizzando CLSM in questo protocollo sperimentale. È stato dimostrato che le DC possono trasportare efficacemente gli antigeni ai linfonodi drenanti, motivo per cui gli adiuvanti aumentano l'immunogenicità dell'antigene in vivo. Inoltre, CLSM è l'implementazione commerciale più comune della tecnica ed è ampiamente utilizzata nei laboratori di imaging. La capacità di sezionamento ottico, la risoluzione chiara e la versatilità dell'imaging 3D26 di CLSM lo rendono lo strumento migliore per analizzare l'assorbimento dell'antigene da parte delle DC, anche se non può essere utilizzato per la raccolta di dati quantitativi.
Il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC I e II) è importante per il riconoscimento specifico degli antigeni. Le molecole funzionali MHC II sono altamente espresse nelle APC e funzionano per indurre l'attivazione delle cellule T CD4+. Le APC includono macrofagi, DC e linfociti B27, che modulano fortemente l'immunità adattativa. I macrofagi sono ampiamente distribuiti nel sistema immunitario dell'ospite e svolgono un ruolo chiave nella difesa e nell'omeostasi28. L'attivazione dei macrofagi è essenziale per avviare le risposte immunitarie adattative29. Nel frattempo, adiuvanti di nanoemulsione che hanno le stesse dimensioni dei patogeni possono promuovere il riconoscimento dell'antigene e la fagocitosi, attivare inflammasomi e macrofagi NALP3 e modulare la presentazione dell'antigene28. In questo protocollo, i PM sono stati utilizzati principalmente come modello per determinare la secrezione delle citochine proinfiammatorie IL-1β e Th2, citochine IL-6 e TNF-α mediante ELISA, che può essere utilizzato per valutare qualitativamente la capacità di attivazione dei macrofagi di vaccini e adiuvanti. Tuttavia, il grado e il meccanismo di attivazione devono essere determinati da più esperimenti. Ad esempio, se EGF, IL-6 e altri fattori necessari per l'attivazione delle cellule immunitarie sono secreti e le relative vie di segnalazione (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, ecc.) devono essere studiate.
In sintesi, sono stati stabiliti una serie di protocolli per confermare le risposte cellulari in vitro a nuovi adiuvanti, tra cui citotossicità, secrezione di citochine, assorbimento di DC e attivazione dei macrofagi. Questi protocolli non solo dimostrano una bassa tossicità e un'elevata consegna cellulare, ma forniscono anche procedure dettagliate per CCK-8, ELISA ed ELISpot. Le valutazioni della risposta cellulare dell'immunopotenziatore di origine vegetale OP-D e del suo potente vaccino adiuvante in nanoemulsione modificato NOD sono state completate in vitro e il protocollo è risultato efficace. Sebbene ELISA, ELISpot e le tecniche di scansione laser confocale siano state classicamente utilizzate per valutare l'immunocompetenza in vitro degli adiuvanti alle cellule, questi metodi presentano molti svantaggi, come lunghi tempi di misurazione, carichi di lavoro pesanti, materiali costosi e la necessità di tecnici professionisti. Molti metodi accurati e tecnologie avanzate, come i chip genetici, il sequenziamento a singola cellula e la tecnologia del trascrittoma, devono essere utilizzati in studi futuri per espandere ulteriormente la portata della tecnica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari o personali concorrenti che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione n. 2021YFC2302603 del National Key Research and Development Program of China, sovvenzioni n. 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 del National Natural Science Foundation Program of China, sovvenzioni n. 2014jcyjA0107 e n. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing, sovvenzione n. CYS21519 del Progetto di ricerca e innovazione post-laurea di Chongqing, sovvenzione n. 2020XBK24 dei progetti speciali dell'Università medica dell'esercito e sovvenzione n. 202090031021 del Programma nazionale di innovazione e imprenditorialità per studenti universitari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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