Summary
このプロトコルは、ナノエマルジョンオフィオポゴニンDアジュバントが効果的な細胞性免疫応答を促進するかどうかを評価するための詳細な方法を提示する。
Abstract
ワクチンの主成分として、アジュバントは、抗原に関連する強力で広範囲にわたる自然免疫応答および適応免疫応答を直接誘導または増強することができます。オフィオポゴン・ジャポニクスの植物から抽出した精製成分であるオフィオ ポゴニンD(OP-D)は、ワクチンアジュバントとして有用であることが分かっている。OP−Dの低い溶解性および毒性の問題は、ナノエマルジョンオフィオポゴニンD(NOD)を調製するために低エネルギー乳化法を使用することによって効果的に克服することができる。本稿では、細胞活性評価のための一連の in vitro プロトコルについて検討する。 L929の細胞傷害効果を、細胞計数キット−8アッセイを用いて決定した。次いで、免疫マウスからの脾細胞の刺激および培養後の分泌サイトカインレベルおよび対応する免疫細胞数を、ELISAおよびELISpot法により検出した。さらに、C57BL/6マウスから単離し、GM-CSFとIL-4とのインキュベーション後に成熟させた骨髄由来樹状細胞(BMDC)における抗原取り込み能をレーザー走査型共焦点顕微鏡(CLSM)によって観察した。重要なことに、マクロファージの活性化は、ブランクマウスの腹膜マクロファージ(PM)をアジュバントと24時間共培養した後、ELISAキットによってIL-1β、IL-6、および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)サイトカインのレベルを測定することによって確認されました。このプロトコルが、新しいワクチンアジュバントの細胞応答の有効性を評価するための直接的かつ効果的な実験的アプローチを他の研究者に提供することが期待されています。
Introduction
ワクチンは、感染症や非感染性疾患を予防・治療するための重要な手段です。ワクチン製剤へのアジュバントとデリバリービヒクルの適切な添加は、抗原の免疫原性を高め、長期的な免疫応答を生成するのに有益です1。現在市販されているワクチン用アジュバントには、従来のアジュバントミョウバン(アルミニウム塩)の他に、MF59 2,3、AS04 3、AS03 3、AS01 3、CpG10184、Matrix-M5の6種類があります。一般に、人体がウイルスの攻撃に遭遇すると、第1および第2の防御線(皮膚、粘膜、マクロファージ)が主導権を握ってウイルスを除去し、最後に免疫器官と免疫細胞を含む第3の防御線が活性化されます。アルミニウム塩とアルミニウム塩は、1920年代初頭からヒトワクチンに最も広く使用されているアジュバントであり、効果的な自然免疫応答を誘発しています6。しかし、免疫細胞を刺激してサイトカインとケモカインの特定のセットを生成する古典的なアジュバントによる抗原提示細胞(APC)の活性化は、アジュバントが機能するメカニズムであり、アジュバントが特定の免疫応答に一時的な影響のみを及ぼす理由の1つである可能性が提案されています7。ヒトが使用するための限られた認可されたアジュバントの存在は、効果的な免疫応答を誘発するワクチンを開発するための制限要因です8。
現在、ますます多くのアジュバント研究が、マウスにおいて強力な細胞性免疫応答を誘導する能力を実証している。QS-21は、バランスの取れたTヘルパー1(Th1)およびTヘルパー2(Th2)免疫応答を誘導し、より高いレベルの抗体力価を生成し、アジュバントとしての保護を延長することが示されていますが、その強力な毒性と溶血特性は、スタンドアロンの臨床アジュバントとしての開発を制限します9,10。OP-D(ルスコゲニン-O-α-L-ラムノピラノシー1-(1→2)-β-D-キシロピラノシル-(1→3)-β-D-フコピラノシド)は、中国の薬用植物オフィオポゴンジャポニカス4の根から単離されたステロイドサポニンの1つです。さらに、それは基数オフィオポゴニスに見られる主要な薬理学的に活性な成分(シェンマイサン)であり、特定の薬理学的特性を持っていることが知られています11。さらに、ユリ科のメンバーであり、細胞の炎症や心筋損傷における抑制および保護効果のために広く使用されています。例えば、OP-Dは、BALB/cマウスにおいてDNCB誘発性アトピー性皮膚炎様病変および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)炎症性HaCaT細胞を改善する12。重要なことに、OP-Dは、活性酸素種の生成とミトコンドリア膜損傷の両方を減らすことにより、心臓血管系の抗酸化保護を促進し、ドキソルビシン誘発性オートファジー損傷から心臓を保護します。実験によると、モノデスモシドと一緒にOP-Dを服用すると、免疫の健康を高め、白血球数とDNA合成を増やし、抗体を長持ちさせるのに役立ちます13。OP−Dがアジュバント効果を有することが以前に見出された14。
ナノエマルジョンは、界面活性剤、油、共界面活性剤、および水の組み合わせからなる水中油型ナノ製剤である12,15。これらのナノワクチン設計により、抗原とアジュバントを一緒にカプセル化して、免疫刺激を強化し、抗原を保護し、樹状細胞(DC)の成熟を促進することができます16。スクリーニングから得られるこれらの新規アジュバントの開発には、それらの細胞応答能力を評価するための適切な方法を見つけることが重要です。
このプロトコルの目的は、アジュバントが in vitro 細胞培養における食作用と免疫細胞の発現を増強できるかどうかを体系的に評価し、主な実験方法を詳しく説明することです。実験は4つのサブセクションに分かれています:(1)L929細胞に対するOP-DおよびNODの毒性は、細胞計数キット-8(CCK-8)アッセイによって決定されます。(2)免疫マウスにおける内分泌IFN-γおよびIL-17Aのサイトカインレベルおよび対応する細胞数を脾細胞刺激およびELISpotアッセイによって検出する;(3)アジュバント刺激後のDCの抗原提示能力を共焦点顕微鏡を用いて観察する;(4)アジュバントと共培養したノーマルマウスの腹膜マクロファージ(PM)から得られた上清中にIL-1β、IL-6、TNF-αの3種類のサイトカインが検出される。
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Protocol
すべての細胞実験は、基本的な手術室、緩衝室、滅菌培養室、同定および分析室を備えた細胞工学実験室で実施されました。作業環境と条件には、微生物汚染やその他の有害な要因はありませんでした。動物実験は実験動物の管理と使用に関するガイドラインに基づいて行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。
1.オートクレーブと材料の準備
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、はさみ、鉗子、研磨メッシュなどの試薬と消耗品を、121°Cで20分間オートクレーブ滅菌して湿熱滅菌して準備します。
- 必要な試薬と機器については、 材料表を参照してください。ブランクナノエマルジョン(BNE)の式については、 表1を確認してください。
2. L929細胞毒性アッセイ
- ウォーターバスの電源を入れ、温度を37°Cに調整します。 液体窒素から凍結L929細胞のチューブ1本を採取し、37°Cの水浴中で素早く解凍します。
- 解凍後すぐに細胞を15 mL滅菌遠心チューブにピペットで入れ、2 mLのDMEMを加えてよく混合します。
- サンプルを129 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。次に、2mLのDMEMを加えて細胞を再懸濁し、サンプルを129 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、再懸濁のために6 mLのDMEM完全培地(10%FBSを含む)を加え、5%CO2 を含む37°Cインキュベーター内のT25培養フラスコに移して48時間培養します。
- 培養フラスコ内の培養液を廃棄し、2 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、1 mLの0.25%トリプシンを加えて、37°Cで1〜2分間細胞を消化します。
- 細胞の丸みが観察されたら、4 mLのDMEM完全培地を加えて消化を直ちに終了し、よく混合します。次に、細胞を15 mLの滅菌遠心チューブに吸引し、129 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を1 mLのDMEM完全培地に再懸濁します。細胞計数プレートを使用した細胞計数には20 μLの細胞懸濁液を使用し、残りの細胞をDMEM完全培地で1 x 105 細胞/mLに希釈します。
- 96ウェルプレートの周囲に100 μLの超純水を加え、100 μLの細胞希釈液を内部ウェルのみに追加します。プレートを接着培養用のインキュベーターに入れ、37°Cで4時間処理します。
- 細胞が接着したら、OP-DとNODをDMEM完全培地に別々に添加し、最終容量200 μL/ウェルにします(各薬剤の最終濃度は480 μg/mL、240 μg/mL、120 μg/mL、60 μg/mL、および30 μg/mLです)。濃度ごとに、反復として3つのウェルを使用します。次に、細胞をインキュベーターに戻し、さらに24時間培養します。
- DMEM完全培地でCCK-8を10%に希釈し、アジュバントと細胞溶液を含む100 μL/ウェル希釈液を96ウェルプレートに加えます。プレートをインキュベーターに戻し、さらに2〜3時間インキュベートします。
- 細胞沈殿による不均一性を防ぐために、細胞溶液をめっきしながら頻繁に混合してください。CCK-8を加える前後にプレートを数回静かに振って、培地とCCK-8溶液をよく混合します。
- マイクロプレートリーダーを使用して450 nmの吸光度を測定します。ベースライン吸光度値のために培地とCCK-8のみでゼロ調整ウェルをセットアップします。プロット時に得られた吸光度値からゼロの吸光度値を差し引くことにより、正確な吸光度値を計算します。
- 気泡はアッセイに干渉するため、マイクロプレートリーダーでテストする前に、ウェルに気泡が存在しないことを確認してください。
3.脾細胞刺激
- 6〜8週齢のBALB/cマウスに、0日目、7日目、および14日目に筋肉内注射(200μL)を介して30μgのタンパク質抗原と30μgのアジュバントを以下の実験群に従って免疫する:(1)PBS群、(2)抗原(Ag)群、(3)抗原+ OP-D(AG/OP-D)群、(4)抗原+ BNE(Ag/BNE)群、 (5)抗原+NOD(Ag/NOD)群、および(6)抗原+AlPO4(Ag/Al)群。
- 準備室:一次免疫後24日目に、マウスを動物室から取り出し、1%ペントバルビタールナトリウム100 mg / kgの腹腔内注射によって安楽死させます。マウスをガラス皿に入れ、75%アルコールに5分間浸します。
- 遠沈管を遠沈管チューブラックに置き、使い捨てのペトリ皿に番号を付け、10 mLピペットで各ペトリ皿に5 mLのPBSを追加します。
- マウスの左腹側の中央にハサミで6〜8 cmの切開を行い、皮膚を引き裂き、腹壁を露出させ、脾臓の長い赤い帯を見つけます。
- 脾臓の下側の腹膜を鉗子で持ち上げ、切り開き、上向きにして脾臓を露出させます。鉗子で脾臓を持ち上げ、眼科用ハサミで脾臓の下の結合組織を分離し、脾臓を取り除きます。
- 脾臓を5 mLのPBSを含むペトリ皿に入れ、ふるい(200メッシュ、70 μm)とグラインドバーで粉砕します。粉砕後、番号に従ってエルボースポイト付きの15 mL遠沈管に液体を移します。
- 液体を453 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、各チューブに3 mLの赤血球溶解バッファーを加え、細胞を再懸濁し、室温で10分間溶解します。
- 各チューブに10〜12 mLのPBSを加え、チューブを逆さまに混合し、453 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、各遠沈管に10 mLのPBSを加え、細胞を再懸濁します。
- 細胞計数プレートのウェルに各サンプル20 μLを採取し、自動セルカウンターを使用して生細胞の数を記録します。
- サンプルを453 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を再懸濁し、RF-10培地で2.5 x 106 細胞/mLに希釈し( 製剤情報は表2を参照)、100 μL/ウェルの96ウェルプレートに加えます。
- 抗原をRF-10培地で10 μg/mLに希釈し、各ウェルに100 μLを加え、5%CO2中で37°Cで3日間インキュベートします。
- 各細胞群から得られた細胞懸濁液を1.5 mL遠沈管に吸引し、453 x g で20分間遠心分離し、上清を清浄な遠沈管に吸引する。
- IFN-γおよびIL-17A含有量の検出は、ELISAキットの指示に従って厳密に実行してください。その方法及び手順は以下の通りである。
- 1x洗浄バッファー作業液(キットに付属)、標準グラジエント濃度溶液(キットに付属の希釈バッファーR [1x]でサイトカイン標準溶液を500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.3 pg/mL、および15.6 pg/mLに希釈して作業溶液を調製する)、ビオチン化抗体作業溶液(キットに付属の希釈バッファーR[1x]を使用してビオチン化抗体溶液を1:100に希釈して作業溶液を形成)、 必要に応じてストレプトアビジン-HRP作業溶液。
- 100 μL/ウェルの希釈サイトカイン標準溶液を標準ウェルに、100 μL/ウェルのサンプルをサンプルウェル(キットに付属の希釈バッファーR [1x]をサンプル希釈に使用)、100 μL/ウェルの希釈バッファーR(1x)をブランクコントロールウェルに追加します。
- ビオチン化抗体作動溶液を50 μL/ウェルで添加します。よく混合し、シーリングメンブレンで覆い、37°Cで90分間インキュベートします。
- ウェルから液体を取り除き、300 μL/ウェルで1x洗浄バッファー作業溶液を追加します。1分後にウェルから液体を捨てます。このプロセスを4回繰り返し、毎回濾紙上で液体を乾燥させます。
- 100 μL/ウェルのストレプトアビジン-HRP作業溶液を追加します。サンプルを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。サンプルを453 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
注意: 洗浄プロセス中に反応ウェルに残っている洗浄液は、ろ紙に透かしが見られなくなるまで徹底的に軽くたたく必要があります。 - TMBを100 μL/ウェルで添加し、プレートを暗所で37°Cで5〜30分間インキュベートし、ウェル内の色の深さ(濃い青色)に従って終了反応を判断します。通常、発色に10〜20分で良い結果が得られます。
- 100 μL/ウェルの停止液を加えて反応を速やかに終了します。終了後10分以内に450nmの吸光度値を検出します。
注意: 使用前に試薬を室温で30分間平衡化してください。
4. エリスポットアッセイ
- マウスの免疫化および脾細胞の収集を、上記のステップ3.1〜3.10に記載したとおりに正確に行う。IFN-γおよびIL-17Aのアッセイは、キットの指示に従って厳密に実行してください。その方法及び手順は以下の通りである。
- 密封されたパッケージからプレートを取り出し、滅菌PBS(200 μL/ウェル)で4回洗浄し、1640完全培養培地(200 μL/ウェル)を加えて室温で2時間バランスを取ります。
- 培地を除去し、脾細胞懸濁液をRF-10培地で2 x 105 細胞/mLに希釈し、ウェルあたり50 μLの細胞と抗原を加えます(最終濃度:10 μg/mL)。
- プレートを5%CO2 を含む37°Cの加湿インキュベーターに48時間入れます。この間はプレートを動かさず、蒸発を防ぐための対策を講じてください(プレートをアルミホイルで包むなど)。
- 検出抗体(BVD6-24G2-ビオチン)を、0.5%ウシ胎児血清(PBS-0.5%FBS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(0.5 mL:100 mL)で1 μg/mL(1:1,000)に希釈します。プレートに100 μL/ウェルを加え、0.22 μmメンブレンでろ過した後、室温で2時間インキュベートします。
- ウェル内の液体をデカントし、200 μL/ウェルで1x洗浄バッファーを追加し、5x洗浄します。毎回30〜60秒間放置し、最後に吸い取り紙で乾かします。
- ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(1:1,000)をPBS-0.5%FBSで希釈し、100 μL/ウェルを加えます。プレートを室温で1時間インキュベートします。手順4.6のようにプレートを洗浄します。
- すぐに使用できるTMB基質溶液を100 μL/ウェル加え、明確なスポットが現れるまで現像します。脱イオン水で広範囲に洗浄して発色を停止します(5x〜6xを繰り返しすすぎます)。必要に応じて、カルバート(プレートの下の柔らかいプラスチック)を取り除き、膜の下側をすすぎます。
- プレートが乾いたら、ELISpotリーダーまたは解剖顕微鏡でスポットを調べてカウントします。
5. DCによる取り込み
- 100 mg / kgの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により、BALB / c正常マウスを安楽死させます。.マウスを75%アルコールに5分間浸します。
- マウスの腹部の下の6〜8 cmの切開をハサミで切り、開口部の両端をクランプして異なる方向に分離し、マウスの脚を露出させます。マウスの大腿骨をマウスの体から、脛骨を関節から分離し、両端の骨を無傷に保ちます。
- 大腿骨の両端の関節関節からハサミと鉗子で残留組織と軟骨を取り除きます。大腿骨を75%アルコールに5分間浸してから、滅菌PBS溶液に浸して表面のアルコールを洗い流します。
- ハサミで大腿骨の端を切り取り、滅菌PBS溶液を含む滅菌ペトリ皿で骨髄をすすぎ、続いて1mLシリンジで吸引する。洗濯を3〜5倍繰り返します。
- セルシーブ(200メッシュ、70 μm)でろ過し、BMDCを15 mL遠沈管に回収します。サンプルを290 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、4 mLの赤血球溶解バッファーを加え、再懸濁し、室温で5分間溶解します。
- 滅菌PBS溶液10 mLを加えてライセートを中和し、290 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液と10%FBSを含む1 mLのDMEMに細胞を再懸濁します。次に、GM-CSF(20 ng/mL)とIL-4(10 ng/mL)を培地に加え、細胞濃度を5 x 105/mLに調整し、カバーガラスで細胞を接種します。
- 細胞懸濁液を2 mL/ウェルの6ウェルプレートに加え、プレートを5%CO2 を含む37°Cの加湿インキュベーターに48時間入れます。2日後に培地を完全に交換し、4日後に培地の半分を交換します。
- 培養7日目の実験のために、良好な状態の細胞(細胞表面に樹状突起を有する大型および放射線透過性細胞)を有する5つのウェルを、倍率100倍の倒立顕微鏡を用いて選択した。上清を廃棄し、DMEM完全培地(GFP最終濃度:20 μg/mL、アジュバント最終濃度:10 μg/mL)で希釈したGFP、OP-D + GFP、およびNOD + GFP溶液2 mLを各ウェルに加え、プレートを37°Cで暗所で30分間インキュベートします。
- プレートをPBSで3回洗浄し、各ウェルに1 mLの4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。固定後にパラホルムアルデヒドを除去し、細胞をファロイジンおよびDAPIと共に最終濃度10 μg/mLまで10分間インキュベートして染色した後、PBSで3回洗浄します。
- 各ウェルに1 mLのPBSを加え、後述するようにCLSMを用いて抗原取り込みを観察します。
- CLSMソフトウェアを開き、 ZENシステムをクリックして、ハードウェアの初期化が完了するのを待ちます。
- [場所]タブの[ GFP] および [DAPI ]ショートカットをクリックして、観察できる領域を見つけます。蛍光灯と透過光を消灯してください。
- 取得メニューの スマートセットアップ をクリックして色素ライブラリを開き、EGFP、ファロイジン、DAPIの3つの蛍光色素を追加します。 [ベストシグナル]をクリックして>OKをクリックします。チャンネルタブの EGFP チャンネルをクリックし、 ライブ をクリックして、右側のインターフェースで正しい視野を選択します。
- ピンホールに 1AU を選択し、細かいフォーカスネジを回して焦点距離を調整し、適切な焦点面を選択します。 レンジインジケーター をクリックし、レーザー出力とマスターゲインの組み合わせを調整して、散発的な赤い点のみが画像に表示されるようにします。
- レーザー出力を変更せずに、同じパラメータでファロイジンチャネルとDAPIチャネルを調整します。
- [ ライブ の停止]を選択し、[ 取得モード ]をクリックして、撮影パラメータを変更します。 フレームサイズ:1024ピクセルx 1024ピクセル。スキャン速度:7;平均化:2倍。[ スナップ ]をクリックし、[ 分割 ]を選択して、撮影したすべての画像を表示します。画像を保存します。
6.マクロファージ活性化
- 安楽死後、C57BL / 6マウスを75%アルコールに浸し、番号順にガラスのペトリ皿に表向きに置きます。
- マウスを移送窓から滅菌手術室に通し、手術台に5分間置きます。
- 注射器を使用して、生理食塩水10 mLを吸引し、マウスを約45°で下向きに傾け、腹腔の中央に注射します。約5 mLの細胞懸濁液を10 mLごとに15 mLの遠沈管に引き込み、注射を3回繰り返します。
- 細胞懸濁液を129 x g で5分間遠心分離し、マウス腹膜一次マクロファージを得た。細胞を再懸濁し、RPMI 1640完全培地(10%FBSを含む)で細胞濃度を2 x 106 cells/mLに調整し、細胞懸濁液を24ウェルプレートに接種して、ウェルあたりの細胞数が一定になるようにします(1 mL/ウェル)。
- 37°Cの5%CO2 中で一晩(約16-20時間)培養した後、PBS、Ag、Ag/OP-D、Ag/NOD、およびAg/Al(Ag最終濃度:5 μg/mL、アジュバント最終濃度:10 μg/mL、総容量:2 mL)で24時間インキュベートします。ステップ3.12〜3.19に記載されている方法と手順を使用して、ELISAキットを使用して培養上清中のIL-1β、IL-6、およびTNF-αのレベルを検出します。
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Representative Results
アジュバントOP−DおよびNODの細胞活性評価を、プロトコールに従って インビトロ で完了した。L929線維芽細胞は、NODの in vitro 毒性試験に有用なスクリーニングモデルです(図1)。脾臓の炎症性サイトカインレベルの定量化は、研究者が免疫応答をよりよく理解するのに役立ちます(図2)。ELISpotによるCTLのモニタリングは、臨床試験における抗原特異的T細胞免疫の評価やワクチン候補のスクリーニングのためのゴールドスタンダードです(図3)。DCによる抗原の取り込みの増加は、適応免疫応答の増強を誘発する可能性があります(図4)。マクロファージは、T細胞に抗原を提示するだけでなく、他の抗原提示細胞に共刺激分子を発現させ、それによって適応免疫応答を開始する上で重要な役割を果たします(図5)。上記の実験結果はTongらによって発表されており、 インビボでの 異なる抗体応答およびマウスに対する保護効率は、元の記事14に見出すことができる。
図1:L929細胞のインビトロ細胞毒性試験。L929細胞とインキュベートした場合のOP-DおよびNODの異なる勾配濃度(30 μg/mL、60 μg/mL、120 μg/mL、240 μg/mL、および480 μg/mL)の細胞毒性効果が示されています。検出にはCCK-8キットを使用しました。統計解析は、統計解析ソフトを用いて行った。2つのグループ間の差は、対応のない両側のスチューデントのt検定を使用して分析されました。すべての値は平均± SD (n = 3) で表され、有意差は *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 のように表されます。この図はTongら14から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脾細胞におけるIFN-γおよびIL-17Aのレベル。ワクチン接種マウスの脾細胞を抗原で3日間刺激し、上清中のサイトカイン(A)IFN-γおよび(B)IL-17AのレベルをELISAにより測定した。その結果、IFN-γおよびIL-17A産生は、Ag/OP-D群、Ag/BNE群、およびAg/Al群と比較して、Ag/NOD群で有意に増加したことが示された(p < 0.01)。統計解析は、統計解析ソフトを用いて行った。複数のグループ間の差は、一元配置分散分析を使用して分析され、その後、Tukeyの多重比較検定が行われました。すべての値は平均± SD (n = 8) で表され、有意差は *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 のように表されます。この図はTongら14から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脾細胞集団におけるIFN-γ-およびIL-17A分泌細胞の数。 (A)脾細胞のうちIFN-γスポット形成抗原特異的T細胞のELISpot解析。(B)脾細胞間のIL-17Aスポット形成抗原特異的T細胞のELISpot解析。サイトカインの結果と同様に、Ag/OP-DおよびAg/NODグループは、脾臓リンパ系T細胞集団においてIFN-γおよびIL-17A形成細胞の比率および数が有意に増加したことを示した。Ag/NOD群は、他の群よりも強いTh1(p < 0.001)およびTh17(p < 0.01)の免疫応答を誘導した。統計解析は、統計解析ソフトを用いて行った。複数のグループ間の差は、一元配置分散分析を使用して分析され、その後、Tukeyの多重比較検定が行われました。すべての値は平均± SD(n = 8)で表され、有意差は次のように表されます:*p < 0.05、**p < 0.01、および***p < 0.001。この図はTongら14から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:BMDCによる抗原取り込みのCLSM画像。 ファロイジンは細胞骨格を赤色に染色し、DAPIは核を青色に染色し、GFPは緑色蛍光を示します。図に示すように、GFP + OP-DおよびGFP + NOD群とBMDCとの共培養の30分後にCLSMで緑色の蛍光が観察されますが、GFP+NOD粒子はファゴソームのような小胞構造に囲まれていますが、GFP+OP-D粒子はそうではありません。この図はTongら14から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PMの活性化に対するアジュバント製剤抗原の影響。PBS、Ag、Ag/OP-D、Ag/NOD、およびAg/Alと共インキュベートしたPMの上清中のサイトカインIL-1β、IL-6、およびTNF-αの濃度を検出するためのELISAは、抗原刺激と比較して、Ag/NOD、Ag/OP-D、およびAg/Al刺激はすべて、PMからのIL-1β、IL-6、およびTNF-α分泌を有意に増加させた(p < 0.05)。マクロファージの活性化は、OP-DおよびAlPO4群と比較してNOD群で有意に改善された(p < 0.05)。統計解析は、統計解析ソフトを用いて行った。複数のグループ間の差は、一元配置分散分析を使用して分析され、その後、Tukeyの多重比較検定が行われました。すべての値は平均± SD (n = 8) で表され、有意差は *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001 のように表されます。 この図はTongら14から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 密度 | 質量(10gあたり) |
| クレモフォアEL-35 | 嵩 | 1.92 |
| グリセロール | 嵩 | 0.48 |
| ティッカー | 嵩 | 0.6 |
| 純水 | 嵩 | 残余額 |
表1:BNEの式。
| 試薬 | 密度 | 容積 |
| β-メルカプトエタノール | 50μM | 0.366μL |
| ウシ胎児血清 | 1倍速 | 10ミリリットル |
| グルタマックス | 2ミリメートル | 1ミリリットル |
| グルタマックスRPMI 1640 | 1倍速 | 85ミリリットル |
| ヘペス | 10ミリメートル | 1ミリリットル |
| 非必須アミノ酸(100倍) | 1倍速 | 1ミリリットル |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | 100U/mL | 1ミリリットル |
| ピルビン酸ナトリウム(100 mM) | 1ミリメートル | 1ミリリットル |
表2:RF-10完全培地の調製情報。
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Discussion
サブユニットワクチンは優れた安全性を提供しますが、免疫原性は低くなります。免疫原性を高めるための主な戦略は、抗原を物理的に吸着またはアジュバントと結合させ、それらを薬物送達システムに組み込んで、DCによる取り込みと提示を促進することです。 キライアサポニンとその誘導体などの天然植物サポニンは非常に毒性が高く、ヒトワクチンの開発には適していません17。したがって、細胞に対するワクチンまたはアジュバントの毒性効果の研究は、新しいワクチンの評価における必要な最初のステップです。
この研究で提示されたプロトコルは、ISO 10993-5:200918に従って実行され、サンプル製造にある程度の柔軟性があります。標準的な毒性細胞株であるL929線維芽細胞、および歯肉線維芽細胞は、同様のレベルの細胞毒性を有する。しかし、L929線維芽細胞は、その優れた再現性のために、ナノ材料の in vitro 毒性試験のための有用なスクリーニングモデルとなっている19。MTTおよびCCK-8は、細胞生存率および細胞毒性アッセイに一般的に使用されます。MTTおよびCCK−8アッセイの結果は互いに矛盾し、有意な相関はないが、CCK-8アッセイの細胞生存率はMTTアッセイ20のそれとは有意に異なる。以前の研究におけるMTT結果の考えられる説明は、より高いMTT濃度で加速細胞死を誘導できることです21。CCK-8法の実験結果は、動物毒性試験22の結果と概ね一致している。したがって、新しい細胞毒性評価方法が利用可能になるまで、L929細胞に対するOP-DおよびNODの毒性を検出するためのCCK-8アッセイの使用は、おそらく現在の最良の選択肢です。この方法は、ワクチン材料やアジュバント評価の分野でも引き続き適用されます。
脾臓は人体で最大の二次リンパ器官であり、脾臓の炎症性サイトカインレベルの定量化は、免疫応答を理解するのに役立つ可能性があります23。マウスとヒトの脾臓の間には構造と細胞型にいくつかの根本的な違いがあると考えられています24が、特定の免疫細胞型と脾臓領域の機能の基本的な類似性により、マウスの脾臓T細胞を使用した研究は関連性があります24。このプロトコールでは、ELISAキットを用いて脾臓におけるTh1サイトカインIFN-γおよびTh17サイトカインIL-17Aの分泌レベルを測定した。このアッセイは通常、定量測定に使用され、高親和性抗体を使用して非特異的物質を洗い流すため、感度が高くなります。この研究の主な制限は、長い測定時間と試薬の大量消費です。サイトカインはフローサイトメトリーやルミネックス法でも検出できますが、これらの方法では複雑な機器、高価な原材料、専門的なトレーニングが必要です。したがって、このシンプルで経済的なELISAキットは、特異的免疫応答を測定するための貴重なツールです。ELISpotは、特定のサイトカインスポット形成細胞の免疫応答を決定するために最も一般的に使用される技術の1つになりました。ワクチン候補によって誘発されるCD8+ T細胞応答の検出だけでなく、免疫後の特異的抗原の認識にも使用できます25。ELISpotは、ハイスループットスクリーニングと高感度検出限界(1/100,000細胞)により、細胞の直接観察と迅速な分析の利点も備えているため、広く使用されています。各スポットの形成は、個々のT細胞またはB細胞の活性化の頻度を示しますワクチンおよびアジュバントに対する細胞応答の評価は、現在ELISpotをかけがえのないものにする非常に重要なものです。
DCによる抗原の提示は、免疫応答を誘発するための前提条件です14。抗原の取り込み、リンパ節への移行、ナイーブT細胞の活性化に使用されるDCは、T細胞を介した免疫応答の発生に不可欠な細胞タイプの1つです14。ナノエマルジョン粒子と細胞膜との相互作用が粒子取り込みの重要な決定要因であることを考慮して、DC内のGFP貪食は、この実験プロトコルでCLSMを使用して決定されました。DCは抗原を排出リンパ節に効率的に輸送できることが示されており、これがアジュバントが in vivoで抗原免疫原性を高める理由である可能性があります。さらに、CLSMはこの技術の最も一般的な商業的実装であり、イメージングラボで広く使用されています。CLSMの3Dイメージング26 の光学セクショニング機能、明確な解像度、および汎用性により、定量データの収集に使用できない場合でも、DCによる抗原取り込みを分析するための最良のツールになります。
主要組織適合遺伝子複合体(MHC IおよびII)は、抗原の特異的認識に重要です。MHC II機能性分子はAPCで高発現しており、CD4+ T細胞の活性化を誘導するように機能します。APCには、マクロファージ、DC、およびBリンパ球27が含まれ、これらは適応免疫を強力に調節します。マクロファージは宿主免疫系に広く分布しており、防御と恒常性において重要な役割を果たしています28。マクロファージの活性化は、適応免疫応答を開始するために不可欠である29。一方、病原体と同じサイズのナノエマルジョンアジュバントは、抗原認識と食作用を促進し、NALP3インフラマソームとマクロファージを活性化し、抗原提示を調節することができます28。このプロトコールでは、炎症誘発性サイトカインIL-1βおよびTh2、サイトカインIL-6、TNF-αの分泌をELISAによって決定するためのモデルとして主にPMが使用され、ワクチンおよびアジュバントのマクロファージ活性化能を定性的に評価するために使用できます。ただし、活性化の程度とメカニズムは、より多くの実験によって決定する必要があります。例えば、EGF、IL-6など免疫細胞の活性化に必要な因子が分泌されているかどうか、関連するシグナル伝達経路(JAK-STAT、JNK、PI3K-Aktなど)を調べる必要があります。
要約すると、細胞毒性、サイトカイン分泌、DC取り込み、およびマクロファージ活性化を含む新規アジュバントに対する in vitro 細胞応答を確認するための一連のプロトコルが確立されている。これらのプロトコルは、低毒性と高細胞送達を示すだけでなく、CCK-8、ELISA、およびELISpotの詳細な手順も提供します。植物由来の免疫増強剤OP-Dおよびその修飾された強力なナノエマルジョンワクチンアジュバントNODの細胞応答評価が in vitro で完了し、プロトコルが有効でした。ELISA、ELISpot、および共焦点レーザースキャン技術は、細胞に対するアジュバントの in vitro 免疫能を評価するために古典的に使用されてきましたが、これらの方法には、長い測定時間、重い作業負荷、高価な材料、専門技術者の必要性など、多くの欠点があります。遺伝子チップ、シングルセルシーケンシング、トランスクリプトーム技術など、多くの正確な方法と高度な技術を将来の研究で使用して、技術の範囲をさらに拡大する必要があります。
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Disclosures
著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する経済的または個人的な利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
本研究は、中国国家重点研究開発プログラムの助成金番号2021YFC2302603、中国国家自然科学基金会プログラムの助成金番号31670938、32070924、82041045、および32000651、助成金番号2014jcyjA0107および重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムの助成金番号2019jcyjA-msxmx0159、重慶大学院研究イノベーションプロジェクトの助成金番号CYS21519、 陸軍医科大学特別プロジェクトの助成金番号2020XBK24、および大学生向けの国家イノベーションおよび起業家精神プログラムの助成金番号202090031021。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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