Summary
O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.
Abstract
Como ingrediente principal das vacinas, os adjuvantes podem induzir ou melhorar diretamente as respostas imunes poderosas, generalizadas, inatas e adaptativas associadas aos antígenos. Ophiopogonin D (OP-D), um componente purificado extraído da planta Ophiopogon japonicus, foi encontrado para ser útil como um adjuvante da vacina. Os problemas de baixa solubilidade e toxicidade do OP-D podem ser efetivamente superados usando um método de emulsificação de baixa energia para preparar a ofiopogonina D (NOD) em nanoemulsão. Neste artigo, uma série de protocolos in vitro para avaliação da atividade celular são examinados. Os efeitos citotóxicos da L929 foram determinados usando um ensaio kit-8 de contagem celular. Em seguida, os níveis de citocinas secretadas e o número de células imunes correspondentes após a estimulação e cultura de esplenócitos de camundongos imunizados foram detectados pelos métodos ELISA e ELISpot. Além disso, a capacidade de captação de antígenos em células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs), que foram isoladas de camundongos C57BL/6 e amadurecidas após incubação com GM-CSF mais IL-4, foi observada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). É importante ressaltar que a ativação de macrófagos foi confirmada pela medição dos níveis de citocinas IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por kits ELISA após a cocultura de macrófagos peritoneais (PMs) de camundongos em branco com o adjuvante por 24 h. Espera-se que este protocolo forneça a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais.
Introduction
As vacinas são um meio importante de prevenir e tratar doenças infecciosas e não transmissíveis. A adição adequada de adjuvantes e veículos de entrega às formulações de vacinas é benéfica para aumentar a imunogenicidade dos antígenos e gerar respostas imunes duradouras1. Além do alúmen adjuvante clássico (sal de alumínio), existem seis tipos de adjuvantes para vacinas que são atualmente comercializados: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Geralmente, quando o corpo humano encontra um ataque viral, a primeira e a segunda linhas de defesa (pele, mucosa e macrófagos) assumem a liderança na limpeza do vírus e, finalmente, a terceira linha de defesa, envolvendo os órgãos imunológicos e as células imunes, é ativada. O alumínio e os sais de alumínio têm sido os adjuvantes mais utilizados para vacinas humanas desde o início da década de 1920, provocando uma resposta imune inata eficaz6. No entanto, tem sido proposto que a ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs) por adjuvantes clássicos, que estimula as células imunes a gerar conjuntos específicos de citocinas e quimiocinas, é o mecanismo pelo qual os adjuvantes funcionam e pode ser uma das razões pelas quais os adjuvantes exercem apenas efeitos transitórios sobre respostas imunes específicas7. A presença de adjuvantes licenciados limitados para uso humano é um fator restritivo para o desenvolvimento de vacinas que provocam respostas imunes eficazes8.
Atualmente, um número crescente de estudos adjuvantes está demonstrando a capacidade de induzir uma forte resposta imune celular em camundongos. Demonstrou-se que o QS-21 induz uma resposta imune equilibrada do T-helper 1 (Th1) e do T-helper 2 (Th2), produz níveis mais altos de títulos de anticorpos e prolonga a proteção como adjuvante, mas sua forte toxicidade e propriedades hemolíticas limitam seu desenvolvimento como adjuvante clínico autônomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranosídeo) é uma das saponinas esteroides isoladas da raiz da planta medicinal chinesa Ophiopogon japonicas4. Além disso, é o principal componente farmacologicamente ativo (Shen Mai San) encontrado em Radix Ophiopogonis e é conhecido por ter certas propriedades farmacológicas11. Além disso, é um membro da família Liliaceae e é amplamente utilizado por seus efeitos inibitórios e protetores na inflamação celular e lesão miocárdica. Por exemplo, o OP-D melhora as lesões semelhantes à dermatite atópica induzidas por DNCB e as células inflamatórias HaCaT do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em camundongos BALB/c12. É importante ressaltar que o OP-D promove a proteção antioxidante do sistema cardiovascular e protege o coração contra a lesão autofágica induzida pela doxorrubicina, reduzindo a geração de espécies reativas de oxigênio e interrompendo os danos na membrana mitocondrial. Experimentos mostraram que tomar OP-D com monodesmosídeo ajuda a aumentar a saúde imunológica, aumentar a contagem de glóbulos brancos e a síntese de DNA e fazer com que os anticorpos durem maistempo 13. Verificou-se anteriormente que o OP-D tem um efeito adjuvante14.
As nanoemulsões são nanoformulações de óleo em água compostas por uma combinação de surfactantes, óleo, cosurfactantes e água12,15. Esses desenhos de nanovacinas permitem que antígenos e adjuvantes sejam encapsulados juntos para melhorar a estimulação imunológica, proteger os antígenos e promover a maturação das células dendríticas (DC)16. Para o desenvolvimento desses novos adjuvantes obtidos a partir da triagem, é importante encontrar métodos apropriados para avaliar suas habilidades de resposta celular.
O objetivo deste protocolo é avaliar sistematicamente se os adjuvantes podem aumentar a fagocitose e a expressão de células imunes em cultura de células in vitro e elaborar os principais métodos experimentais. O experimento é dividido em quatro subseções: (1) a toxicidade das células OP-D e NOD para L929 é determinada pelo ensaio kit-8 de contagem de células (CCK-8); (2) os níveis de citocinas de IFN-γ endócrino e IL-17A e os números celulares correspondentes em camundongos imunizados são detectados por estimulação de esplenócitos e ensaios de ELISpot; (3) a capacidade de apresentação do antígeno das CDs após estimulação adjuvante é observada por microscopia confocal; e (4) são detectados os três tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nos sobrenadantes obtidos de macrófagos peritoneais (PMs) em camundongos normais cocultivados com adjuvantes.
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Protocol
Todos os experimentos celulares foram realizados em um laboratório de engenharia celular equipado com salas de cirurgia básicas, salas de tampão, salas de cultura estéreis e salas de identificação e análise. O ambiente e as condições de trabalho estavam livres de contaminação microbiana e outros fatores prejudiciais. Os experimentos com animais foram conduzidos com base nas Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina.
1. Autoclave e preparação de materiais
- Preparar os reagentes e consumíveis, tais como solução salina tamponada com fosfato (PBS), tesoura, pinça e malha abrasiva, por esterilização térmica húmida por autoclave a 121 °C durante 20 min.
- Para os reagentes e equipamentos necessários, consulte a Tabela de Materiais. Para a fórmula da nanoemulsão em branco (BNE), verifique a Tabela 1.
2. Ensaio de citotoxicidade L929
- Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C. Recolher um tubo de células L929 congeladas a partir de azoto líquido e descongelar rapidamente num banho de água a 37 °C.
- Pipetar as células para um tubo centrífugo estéril de 15 mL rapidamente após o descongelamento, adicionar 2 mL de DMEM e misturar bem.
- Centrifugar as amostras a 129 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Em seguida, adicione 2mL de DMEM para ressuspender as células e centrifugar as amostras novamente a 129 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante, adicione 6 mL de meio DMEM completo (contendo 10% de FBS) para ressuspensão, e transfira para um frasco de cultura T25 em incubadora de 37 °C com 5% de CO2 para cultura por 48 h.
- Rejeitar o meio de cultura no balão de cultura e lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS. Em seguida, adicione 1 mL de tripsina a 0,25% para digerir as células por 1-2 min a 37 °C.
- Quando o arredondamento das células for observado, adicione 4 mL de meio DMEM completo para terminar a digestão imediatamente e misture bem. Em seguida, aspirar as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrífuga a 129 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio DMEM completo. Use uma suspensão celular de 20 μL para contagem de células usando placas de contagem de células e dilua as células restantes para 1 x 105 células/mL com meio DMEM completo.
- Adicionar 100 μL de água ultrapura à periferia de uma placa de 96 poços e adicionar 100 μL de diluente celular apenas aos poços internos. Colocar a placa na incubadora para cultura aderente durante 4 h a 37 °C.
- Após a adesão das células, adicione OP-D e NOD separadamente em meio completo DMEM a um volume final de 200 μL/poço (as concentrações finais de cada fármaco são 480 μg/mL, 240 μg/mL, 120 μg/mL, 60 μg/mL e 30 μg/mL). Para cada concentração, use três poços como replicantes. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora e faça cultura por mais 24 horas.
- Diluir CCK-8 a 10% com meio DMEM completo e adicionar diluições de 100 μL/poço contendo as soluções adjuvante e celular à placa de 96 poços. Coloque a placa de volta na incubadora e incube por mais 2-3 h.
- Misture frequentemente enquanto chapeia a solução celular para evitar a não homogeneidade devido à precipitação celular. Agite suavemente a placa várias vezes antes e depois de adicionar o CCK-8 para misturar bem o meio e a solução de CCK-8.
- Meça a absorbância a 450 nm usando um leitor de microplacas. Configure um poço de zeragem com apenas médio e CCK-8 para um valor de absorbância de linha de base. Calcule valores precisos de absorbância subtraindo o valor de absorvância zerado do valor de absorvência obtido ao plotar.
- Confirme se não há bolhas presentes em nenhum poço antes de testar com o leitor de microplacas, pois as bolhas interferirão no ensaio.
3. Estimulação dos eplenócitos
- Imunizar camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas com 30 μg de antígeno proteico mais 30 μg de adjuvante através de uma injeção intramuscular (200 μL) no dia 0, dia 7 e dia 14 de acordo com os seguintes grupos experimentais: (1) grupo PBS, (2) grupo antígeno (Ag), (3) antígeno + grupo OP-D (Ag/OP-D), (4) antígeno + BNE (Ag/BNE), (5) grupo antígeno + NOD (Ag/NOD) e (6) antígeno + AlPO4 (Ag/Al).
- Sala de preparação: No dia 24 após a imunização primária, retire os ratos da sala de animais e eutanasie-os por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%. Coloque os ratos em um prato de vidro e mergulhe em álcool a 75% por 5 min.
- Coloque os tubos de centrífuga em um rack de tubos de centrífuga, numere as placas de Petri descartáveis e adicione 5 mL de PBS a cada placa de Petri com uma pipeta de 10 mL.
- Faça uma incisão de 6-8 cm com uma tesoura no meio do lado ventral esquerdo do rato, rasgue a pele, exponha a parede abdominal e localize a longa faixa vermelha do baço.
- Levante o peritônio no lado inferior do baço com pinças, corte-o aberto e vire-o para cima para expor o baço. Levante o baço com pinças, separe o tecido conjuntivo sob o baço com uma tesoura oftálmica e remova o baço.
- Coloque o baço em uma placa de Petri contendo 5 mL de PBS e moça com peneira (200 malhas, 70 μm) e barra de moagem. Após a moagem, transfira o líquido para um tubo de centrífuga de 15 mL com um conta-gotas de cotovelo de acordo com a numeração.
- Centrifugar o líquido a 453 x g durante 5 minutos. Descarte o sobrenadante, adicione 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos a cada tubo, ressuspenda as células e lise à temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 10-12 mL de PBS a cada tubo, misture o tubo de cabeça para baixo e centrifugar a 453 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, adicione 10 mL de PBS a cada tubo de centrífuga e ressuspenda as células.
- Pegue 20 μL de cada amostra em um poço da placa de contagem de células e registre o número de células vivas usando um contador de células automatizado.
- Centrifugar as amostras a 453 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender as células, diluir para 2,5 x 106 células/mL com meio RF-10 (informações de formulação na Tabela 2) e adicionar a uma placa de 96 poços a 100 μL/poço.
- Diluir o antígeno com meio RF-10 a 10 μg/mL, adicionar 100 μL a cada poço e incubar por 3 dias a 37 °C em 5% de CO2.
- Aspirar a suspensão celular obtida de cada grupo de células em tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrífuga a 453 x g por 20 min e aspirar o sobrenadante em um tubo de centrífuga limpo.
- Realize a detecção de conteúdo IFN-γ e IL-17A estritamente de acordo com as instruções do kit ELISA. Os métodos e procedimentos são os seguintes.
- Preparar 1x solução de trabalho tampão de lavagem (fornecida com o kit), solução de concentração de gradiente padrão (solução padrão de citocinas diluídas a 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/mL e 15,6 pg/mL no tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit), solução de trabalho de anticorpos biotinilados (solução de anticorpo biotinilado diluído a 1:100 usando o tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit para formar a solução de trabalho), e solução de trabalho treptavidina-HRP, conforme necessário.
- Adicionar 100 μL/poço de solução padrão de citocina diluída no poço padrão, 100 μL/poço de amostra no poço de amostra (o tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit é usado para a diluição da amostra) e 100 μL/poço de tampão de diluição R (1x) no poço de controle em branco.
- Adicionar solução de trabalho de anticorpos biotinilados a 50 μL/bem. Misture bem, cubra com uma membrana de vedação e incube a 37 °C por 90 min.
- Retire o líquido dos poços e adicione 1x solução de trabalho tampão de lavagem a 300 μL/poço. Descarte o líquido dos poços após 1 min. Repita este processo 4x permitindo que o líquido seque em papel de filtro de cada vez.
- Adicionar 100 μL/poço de solução de trabalho treptavidina-HRP. Cobrir e incubar as amostras a 37 °C durante 30 minutos. Centrifugar as amostras a 453 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
NOTA: A solução de lavagem que permanece no poço de reação durante o processo de lavagem deve ser cuidadosamente acariciada até que nenhuma marca d'água possa ser vista no papel de filtro. - Adicionar TMB a 100 μL/poço, incubar as placas a 37 °C por 5-30 min no escuro e julgar a reação de terminação de acordo com a profundidade de cor no poço (azul escuro). Normalmente, 10-20 min para o desenvolvimento de cores pode alcançar bons resultados.
- Terminar a reação rapidamente adicionando a solução de parada a 100 μL/poço. Detectar o valor de absorbância a 450 nm no prazo de 10 minutos após a terminação.
NOTA: Equilibre o reagente à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da utilização.
4. Ensaio ELISpot
- Realizar a imunização dos camundongos e a coleta de esplenócitos exatamente como descrito nas etapas 3.1-3.10 acima. Execute os ensaios para IFN-γ e IL-17A em estrita conformidade com as instruções do kit. Os métodos e procedimentos são os seguintes.
- Retire a placa da embalagem selada, lave 4x com PBS estéril (200 μL/poço) e adicione 1640 meios de cultura completos (200 μL/poço) para equilibrá-la à temperatura ambiente por 2 h.
- Retirar o meio e diluir a suspensão de esplêncitos com meio RF-10 a 2 x 105 células/mL, adicionando 50 μL de células e antígeno por poço (concentração final: 10 μg/mL).
- Colocar a placa numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2 durante 48 h. Não mova a placa durante esse período e tome medidas para evitar a evaporação (por exemplo, envolva a placa com papel alumínio).
- Diluir o anticorpo de detecção (BVD6-24G2-biotina) para 1 μg/mL (1:1.000) em solução salina tamponada com fosfato (0,5 mL:100 mL) contendo 0,5% de soro fetal bovino (PBS-0,5% FBS). Adicionar 100 μL/poço à placa e incubá-la à temperatura ambiente durante 2 h após filtração através de uma membrana de 0,22 μm.
- Decantar o líquido nos poços, adicionar 1x tampão de lavagem a 200 μL/poço e lavar 5x. Deixe por 30-60 s de cada vez e, pela última vez, deixe secar no papel borrado.
- Diluir a peroxidase de treptavidina-rábano (1:1.000) em PBS-0,5% FBS e adicionar 100 μL/poço. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar a placa como indicado no passo 4.6.
- Adicionar 100 μL/poço de solução de substrato TMB pronta a utilizar e desenvolver até que apareça um ponto límpido. Pare o desenvolvimento da cor lavando extensivamente em água deionizada (enxaguar 5x-6x repetidamente). Se necessário, remova o bueiro (o plástico macio sob a placa) e enxágue o lado inferior da membrana.
- Examine e conte as manchas em um leitor ELISpot ou microscópio de dissecação após a placa ter secado.
5. Absorção por CDs
- Eutanasiar camundongos normais BALB/c por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%. Mergulhe os ratos em álcool a 75% por 5 min.
- Corte uma incisão de 6-8 cm abaixo do abdômen do rato com uma tesoura e prenda as duas extremidades da abertura para separá-la em direções diferentes e expor as pernas do rato. Separe o fêmur do rato do corpo do rato e a tíbia da articulação e mantenha os ossos intactos em ambas as extremidades.
- Remova o tecido residual e a cartilagem das articulações articulares em ambas as extremidades do fêmur com tesoura e pinça. Mergulhe os fêmures em álcool a 75% por 5 minutos e, em seguida, mergulhe em solução estéril de PBS para lavar o álcool da superfície.
- Corte as extremidades dos fêmures com uma tesoura e lave a medula óssea em uma placa de Petri estéril com solução estéril de PBS seguida de aspiração com seringa de 1 mL. Repita a lavagem 3x-5x.
- Filtrar por uma peneira celular (200 malhas, 70 μm) e recolher os BMDCs num tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar as amostras a 290 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante, adicione 4 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos, ressuspeite e lise à temperatura ambiente por 5 min.
- Adicionar 10 mL de solução estéril de PBS para neutralizar o lisado, centrifugar a 290 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 1 mL de DMEM contendo solução de penicilina-estreptomicina a 1% e FBS a 10% e contagem. Em seguida, adicione GM-CSF (20 ng/mL) mais IL-4 (10 ng/mL) ao meio, ajuste a concentração celular para 5 x 105/mL e inocular as células em coberturas.
- Adicionar a suspensão celular a uma placa de 6 poços a 2 mL/poço e colocar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h. Mude o meio completamente após 2 dias e mude metade do meio após 4 dias.
- Selecionar cinco poços com células em bom estado (células grandes e radiolúcidas com saliências dendríticas na superfície celular) utilizando um microscópio invertido com ampliação de 100x para o experimento no sétimo dia de cultura. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de soluções de GFP, OP-D + GFP e NOD + GFP diluídas com meio DMEM completo (concentração final de GFP: 20 μg/mL; concentração final adjuvante: 10 μg/mL) a cada poço e incube as placas a 37 °C por 30 min no escuro.
- Lave as placas 3x com PBS, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% a cada poço e incube à temperatura ambiente por 15 min. Remova o paraformaldeído após a fixação, incube as células com faloidina e DAPI até uma concentração final de 10 μg/mL por 10 min para coloração e, em seguida, lave 3x com PBS.
- Adicione 1 mL de PBS a cada poço e observe a absorção de antígenos usando CLSM, conforme descrito abaixo.
- Abra o software CLSM, clique em Sistema ZEN e aguarde a conclusão da inicialização do hardware.
- Clique nos atalhos GFP e DAPI na guia localizar para encontrar a área que pode ser observada. Desligue a luz fluorescente e a luz transmitida.
- Clique em Configuração inteligente no menu de aquisição para abrir a biblioteca de corantes e adicione três corantes fluorescentes: EGFP, faloidina e DAPI. Clique em Melhor Sinal > OK. Clique no canal EGFP na guia canais e clique em Ao vivo para selecionar o campo de visão correto na interface direita.
- Selecione 1 UA para o orifício, gire o parafuso de foco fino para ajustar a distância focal e selecione o plano focal apropriado. Clique em Range Indicator e ajuste a combinação de potência do laser e ganho mestre para que apenas pontos vermelhos esporádicos apareçam na imagem.
- Ajuste os canais de faloidina e DAPI com os mesmos parâmetros sem alterar a potência do laser.
- Selecione Stop Live e clique em Modo de aquisição para alterar os parâmetros de disparo: Tamanho do quadro: 1024 pixels x 1024 pixels; Velocidade de digitalização: 7; Média: 2x. Clique em Encaixar e selecione Dividir para ver todas as imagens tiradas. Salve as imagens.
6. Ativação de macrófagos
- Mergulhe os ratos C57BL/6 em álcool a 75% após a eutanásia e coloque-os virados para cima em uma placa de Petri de vidro em ordem numerada.
- Passe os ratos através da janela de transferência para a sala de operação estéril e coloque na mesa de operação por 5 minutos.
- Usando uma seringa, aspirar 10 mL de solução salina, inclinar os ratos para baixo a aproximadamente 45° e injetar no meio da cavidade abdominal. Retirar cerca de 5 ml de suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 ml por cada 10 ml e repetir a injeção 3x.
- Centrifugar a suspensão celular a 129 x g durante 5 minutos para obter macrófagos primários peritoneais de rato. Ressuspeite as células, ajuste a concentração celular para 2 x 106 células/mL com meio completo RPMI 1640 (contendo 10% de FBS) e inocular a suspensão celular em uma placa de 24 poços para garantir um número consistente de células por poço (1 mL/poço).
- Cultura a 37 °C em CO 2 a 5% durante a noite (aproximadamente 16-20 h), seguida de incubação com PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al (concentração final de Ag: 5 μg/mL; concentração final adjuvante: 10 μg/mL; volume total:2 mL) por 24 h. Detectar os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α no sobrenadante de cultura com kits ELISA usando os métodos e procedimentos descritos nas etapas 3.12-3.19.
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Representative Results
A avaliação da atividade celular dos adjuvantes OP-D e NOD foi concluída in vitro de acordo com o protocolo. Os fibroblastos L929 são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro do NOD (Figura 1). A quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode ajudar os pesquisadores a entender melhor a resposta imune (Figura 2). O monitoramento de CTLs com ELISpot é o padrão-ouro para avaliar a imunidade de células T antígeno-específicas em ensaios clínicos e para triagem de candidatas a vacinas (Figura 3). O aumento da captação de um antígeno pelas CDs pode provocar respostas imunes adaptativas aprimoradas (Figura 4). Os macrófagos desempenham um papel importante na apresentação de antígenos às células T, bem como na indução de outras células apresentadoras de antígenos a expressar moléculas costimulatórias, iniciando assim respostas imunes adaptativas (Figura 5). Os resultados experimentais acima foram publicados por Tong et al., e as diferentes respostas de anticorpos in vivo e eficiência de proteção contra camundongos podem ser encontradas no artigo original14.
Figura 1: Ensaio de citotoxicidade in vitro das células L929. Os efeitos citotóxicos de diferentes concentrações gradientes de OP-D e NOD (30 μg/mL, 60 μg/mL, 120 μg/mL, 240 μg/mL e 480 μg/mL) quando incubados com células L929 são mostrados. Um kit CCK-8 foi utilizado para detecção. A análise estatística foi realizada por meio de um software de análise estatística. As diferenças entre os dois grupos foram analisadas por meio do teste t de Student bicaudal não pareado. Todos os valores são expressos como média ± DP (n = 3), e as diferenças significativas são expressas da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Esse número foi modificado a partir de Tong et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Níveis de IFN-γ e IL-17A em esplenócitos. Esplenócitos de camundongos vacinados foram estimulados com o antígeno por 3 dias, e os níveis das citocinas (A) IFN-γ e (B) IL-17A no sobrenadante foram medidos por ELISA. Os resultados mostraram que a produção de IFN-γ e IL-17A aumentou significativamente no grupo Ag/NOD em comparação com os grupos Ag/OP-D, Ag/BNE e Ag/Al (p < 0,01). A análise estatística foi realizada por meio de um software de análise estatística. As diferenças entre os múltiplos grupos foram analisadas por meio de ANOVA one-way seguida do teste de comparação múltipla de Tukey. Todos os valores são expressos como média ± DP (n = 8), e as diferenças significativas são expressas da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Esse número foi modificado a partir de Tong et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Número de células secretoras de IFN-γ e IL-17A na população de esplenócitos. (A) Análise ELISpot de células T específicas de antígeno formadoras de IFN γ entre os esplenócitos. (B) Análise ELISpot de células T específicas de antígeno formador pontual de IL-17A entre os esplenócitos. Semelhante aos resultados das citocinas, os grupos Ag/OP-D e Ag/NOD mostraram proporções e números significativamente aumentados de células formadoras de IFN-γ e IL-17A na população de células T linfoides esplênicas. O grupo Ag/NOD induziu respostas imunes Th1 (p < 0,001) e Th17 (p < 0,01) mais fortes do que os demais grupos. A análise estatística foi realizada por meio de um software de análise estatística. As diferenças entre os múltiplos grupos foram analisadas por meio de ANOVA one-way seguida do teste de comparação múltipla de Tukey. Todos os valores são expressos como média ± DP (n = 8), e as diferenças significativas são expressas da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Esse número foi modificado a partir de Tong et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens CLSM da captação de antígenos por BMDCs. A faloidina cora o citoesqueleto em vermelho, a DAPI colore o núcleo em azul e a GFP apresenta fluorescência verde. Como mostrado na figura, a fluorescência verde é observada no CLSM após 30 min de coincubação dos grupos GFP + OP-D e GFP + NOD com BMDCs, mas as partículas GFP + NOD são cercadas por estruturas vesiculares semelhantes a fagossomos, enquanto as partículas GFP + OP-D não são. Esse número foi modificado a partir de Tong et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Impacto do antígeno formulado por adjuvante na ativação de PMs. ELISA para a detecção das concentrações das citocinas IL-1β, IL-6 e TNF-α no sobrenadante de PMs coincubadas com PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al. Em comparação com a estimulação de antígenos, a estimulação de Ag/NOD, Ag/OP-D e Ag/Al aumentou significativamente a secreção de IL-1β, IL-6 e TNF-α das PMs (p < 0,05). A ativação de macrófagos melhorou significativamente no grupo NOD em comparação com os grupos OP-D e AlPO4 (p < 0,05). A análise estatística foi realizada por meio de um software de análise estatística. As diferenças entre os múltiplos grupos foram analisadas por meio de ANOVA one-way seguida do teste de comparação múltipla de Tukey. Todos os valores são expressos como média ± DP (n = 8), e as diferenças significativas são expressas da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Esse número foi modificado a partir de Tong et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Densidade | Massa (por 10g) |
| Cremophor EL-35 | granel | 1.92 |
| Glicerol | granel | 0.48 |
| GTCC | granel | 0.6 |
| Água ultrapura | granel | quantidade residual |
Tabela 1: A fórmula da BNE.
| Reagente | Densidade | Volume |
| β- Mercaptoetanol | 50μM | 0,366μL |
| Soro fetal bovino | 1X | 10mL |
| Glutamax | 2mM | 1mL |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85mL |
| HEPES | 10mM | 1mL |
| Aminoácidos não essenciais (100x) | 1X | 1mL |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina | 100U/mL | 1mL |
| Piruvato de sódio (100 mM) | 1mM | 1mL |
Tabela 2: Informações de preparação para o meio completo RF-10.
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Discussion
As vacinas de subunidade fornecem excelente segurança, mas baixa imunogenicidade. A principal estratégia para aumentar a imunogenicidade é adsorver fisicamente ou acoplar antígenos com adjuvantes e incorporá-los aos sistemas de liberação de fármacos para promover a captação e apresentação por CDs. As saponinas vegetais naturais, como a saponina quillaia e seus derivados, são altamente tóxicas e não são adequadas para o desenvolvimento de vacinas humanas17. Portanto, o estudo dos efeitos tóxicos das vacinas ou adjuvantes nas células é um primeiro passo necessário na avaliação de novas vacinas.
O protocolo apresentado neste estudo é realizado de acordo com a norma ISO 10993-5:200918, o que permite alguma flexibilidade na fabricação da amostra. A linhagem celular tóxica padrão, os fibroblastos L929 e os fibroblastos gengivais têm níveis semelhantes de citotoxicidade. No entanto, os fibroblastos L929 tornaram-se um modelo de triagem útil para testes de toxicidade in vitro de nanomateriais devido à sua excelente reprodutibilidade19. MTT e CCK-8 são comumente usados para ensaios de viabilidade celular e citotoxicidade. Os resultados dos ensaios MTT e CCK-8 contradizem-se e não estão significativamente correlacionados, mas a viabilidade celular do ensaio CCK-8 é significativamente diferente da do ensaio MTT20. Uma possível explicação para os resultados do MTT no estudo anterior é que a aceleração da morte celular pode ser induzida em concentrações mais elevadas de MTT21. Os resultados experimentais do método CCK-8 são geralmente consistentes com os resultados dos ensaios de toxicidade em animais22. Portanto, até que novos métodos de avaliação de citotoxicidade estejam disponíveis, o uso do ensaio CCK-8 para detectar a toxicidade das células OP-D e NOD para L929 é provavelmente a melhor opção no momento. Este método continuará também a ser aplicado no domínio dos materiais vacinais e da avaliação de adjuvantes.
O baço é o maior órgão linfoide secundário do corpo humano, e a quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode nos ajudar a compreender a resposta imune23. Acredita-se que existam algumas diferenças fundamentais na estrutura e nos tipos celulares entre os baços de camundongos e humanos 24, mas a semelhança básica de tipos específicos de células imunes e a função da região do baço tornam relevantes os estudos utilizando as células T do baço de camundongos24. Neste protocolo, foram medidos os níveis secretores da citocina Th1 IFN-γ e da citocina Th17 IL-17A no baço usando kits ELISA. Este ensaio é geralmente usado para determinações quantitativas e tem alta sensibilidade porque usa anticorpos de alta afinidade para lavar substâncias inespecíficas. As principais limitações deste estudo são o longo tempo de mensuração e o alto consumo de reagentes. As citocinas também podem ser detectadas com citometria de fluxo e métodos Luminex, mas esses métodos exigem instrumentos complexos, bem como matérias-primas caras e treinamento especializado. Portanto, este kit ELISA simples e econômico é uma ferramenta valiosa para medir respostas imunes específicas. O ELISpot tornou-se uma das técnicas mais comumente usadas para determinar as respostas imunes de células formadoras de pontos de citocinas específicas. Pode ser utilizado não apenas para detectar respostas de células T CD8+ provocadas por candidatas a vacinas, mas também para o reconhecimento de antígenos específicos após a imunização25. Com triagem de alto rendimento e um limite de detecção sensível (1/100.000 células), o ELISpot é amplamente utilizado, pois também oferece vantagens de observação direta de células e análise rápida. A formação de cada mancha indica a frequência de ativação de células T individuais ou células Ba avaliação da resposta celular a vacinas e adjuvantes é de grande importância, o que torna o ELISpot insubstituível no momento.
A apresentação de antígenos por CDs é um pré-requisito para provocar respostas imunes14. As CDs, que são utilizadas para a captação de antígenos, migração para linfonodos e ativação de células T ingênuas, são um dos tipos celulares essenciais para o desenvolvimento de respostas imunes mediadas por células T14. Considerando que a interação de partículas de nanoemulsão com a membrana celular é um determinante chave da captação de partículas, a fagocitose GFP dentro de CDs foi determinada usando CLSM neste protocolo experimental. Demonstrou-se que as CDs podem transportar eficientemente antígenos para os gânglios linfáticos drenantes, o que pode ser o motivo pelo qual os adjuvantes aumentam a imunogenicidade do antígeno in vivo. Além disso, o CLSM é a implementação comercial mais comum da técnica e é amplamente utilizado em laboratórios de imagem. A capacidade de seccionamento óptico, a resolução clara e a versatilidade da imagem 3D26 do CLSM o tornam a melhor ferramenta para analisar a captação de antígenos por CDs, mesmo que não possa ser usado para a coleta de dados quantitativos.
O complexo principal de histocompatibilidade (MHC I e II) é importante para o reconhecimento específico de antígenos. As moléculas funcionais do MHC II são altamente expressas em APCs e funcionam para induzir a ativação das células T CD4+. As APCs incluem macrófagos, CDs e linfócitos B27, que modulam fortemente a imunidade adaptativa. Os macrófagos estão amplamente distribuídos no sistema imunológico do hospedeiro e desempenham um papel fundamental na defesa e na homeostase28. A ativação de macrófagos é essencial para iniciar respostas imunes adaptativas29. Enquanto isso, os adjuvantes de nanoemulsão do mesmo tamanho que os patógenos podem promover o reconhecimento de antígenos e fagocitose, ativar inflamassomas e macrófagos NALP3 e modular a apresentação do antígeno28. Neste protocolo, os PMs foram utilizados principalmente como modelo para determinar a secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e Th2, citocinas IL-6 e TNF-α por ELISA, que podem ser utilizadas para avaliar qualitativamente a capacidade de ativação de macrófagos de vacinas e adjuvantes. No entanto, o grau e o mecanismo de ativação precisam ser determinados por mais experimentos. Por exemplo, se EGF, IL-6 e outros fatores necessários para a ativação de células imunes são secretados e as vias de sinalização relacionadas (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, etc.) precisam ser estudadas.
Em resumo, uma série de protocolos para confirmar as respostas celulares in vitro a novos adjuvantes, incluindo citotoxicidade, secreção de citocinas, captação de DC e ativação de macrófagos foram estabelecidos. Esses protocolos não apenas demonstram baixa toxicidade e alta administração celular, mas também fornecem procedimentos detalhados para CCK-8, ELISA e ELISpot. As avaliações da resposta celular do imunopotenciador derivado de plantas OP-D e seu poderoso NOD adjuvante modificado da vacina de nanoemulsão foram concluídas in vitro, e o protocolo foi eficaz. Embora as técnicas de ELISA, ELISpot e varredura a laser confocal tenham sido classicamente usadas para avaliar a imunocompetência in vitro de adjuvantes às células, esses métodos têm muitas desvantagens, como longos tempos de medição, cargas de trabalho pesadas, materiais caros e a necessidade de técnicos profissionais. Muitos métodos precisos e tecnologias avançadas, como chips genéticos, sequenciamento de célula única e tecnologia de transcriptoma, precisam ser usados em estudos futuros para expandir ainda mais o escopo da técnica.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesses financeiros ou pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China, bolsas nº 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 do Programa Nacional da Fundação de Ciências Naturais da China, bolsas nº 2014jcyjA0107 e nº 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, concessão nº CYS21519 do Projeto de Pesquisa e Inovação de Pós-Graduação de Chongqing, concessão nº 2020XBK24 dos projetos especiais da Universidade Médica do Exército e concessão nº 202090031021 do Programa Nacional de Inovação e Empreendedorismo para estudantes universitários.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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