Summary
Protokollet presenterar detaljerade metoder för att utvärdera om nanoemulsionen ophiopogonin D-adjuvans främjar effektiva cellulära immunsvar.
Abstract
Som en huvudingrediens i vacciner kan adjuvanser direkt inducera eller förbättra de kraftfulla, utbredda, medfödda och adaptiva immunsvaren associerade med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renad komponent extraherad från växten Ophiopogon japonicus, har visat sig vara användbar som ett vaccinadjuvans. Problemen med den låga lösligheten och toxiciteten hos OP-D kan effektivt övervinnas genom att använda en lågenergiemulgeringsmetod för att framställa nanoemulsionophiopogonin D (NOD). I den här artikeln undersöks en serie in vitro-protokoll för utvärdering av cellulär aktivitet. De cytotoxiska effekterna av L929 bestämdes med hjälp av en cellräkningssats-8-analys. Därefter detekterades de utsöndrade cytokinnivåerna och motsvarande immuncellnummer efter stimulering och odling av splenocyter från immuniserade möss med ELISA- och ELISpot-metoder. Dessutom observerades antigenupptagningsförmågan i benmärgsderiverade dendritiska celler (BMDC), som isolerades från C57BL/6-möss och mognade efter inkubation med GM-CSF plus IL-4, genom laserskanningskonfokalmikroskopi (CLSM). Viktigt är att makrofagaktivering bekräftades genom att mäta nivåerna av IL-1β, IL-6 och tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) cytokiner av ELISA-kit efter kokulturering av peritoneala makrofager (PM) från tomma möss med adjuvansen i 24 timmar. Förhoppningen är att detta protokoll kommer att ge andra forskare direkta och effektiva experimentella metoder för att utvärdera cellulära svarseffektiviteter hos nya vaccinadjuvanser.
Introduction
Vacciner är ett viktigt sätt att förebygga och behandla smittsamma och icke-överförbara sjukdomar. Lämplig tillsats av adjuvanser och leveransfordon till vaccinformuleringar är fördelaktigt för att förbättra antigenernas immunogenicitet och generera långvariga immunsvar1. Förutom den klassiska adjuvansalun (aluminiumsalt) finns det sex typer av adjuvanser för vacciner som för närvarande marknadsförs: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 och Matrix-M5. I allmänhet, när människokroppen stöter på en viral attack, tar den första och andra försvarslinjen (hud, slemhinna och makrofager) ledningen för att rensa viruset, och slutligen aktiveras den tredje försvarslinjen, som involverar immunorganen och immuncellerna. Aluminium- och aluminiumsalter har varit de mest använda adjuvanserna för humana vacciner sedan början av 1920-talet, vilket framkallar ett effektivt medfött immunsvar6. Det har emellertid föreslagits att aktiveringen av antigenpresenterande celler (APC) av klassiska adjuvanser, som stimulerar immuncellerna att generera specifika uppsättningar cytokiner och kemokiner, är den mekanism genom vilken adjuvanser fungerar och kan vara en av anledningarna till att adjuvanser endast utövar övergående effekter på specifika immunsvar7. Förekomsten av begränsade licensierade adjuvanser för humant bruk är en begränsande faktor för att utveckla vacciner som framkallar effektiva immunsvar8.
För närvarande visar ett ökande antal adjuvansstudier förmågan att inducera ett starkt cellulärt immunsvar hos möss. QS-21 har visat sig inducera ett balanserat T-hjälparsvar 1 (Th1) och T-hjälpare 2 (Th2), producera högre nivåer av antikroppstitrar och förlänga skyddet som ett adjuvans, men dess starka toxicitet och hemolytiska egenskaper begränsar dess utveckling som ett fristående kliniskt adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) är en av de steroida saponinerna isolerade från roten till den kinesiska medicinalväxten Ophiopogon japonicas4. Dessutom är det den främsta farmakologiskt aktiva komponenten (Shen Mai San) som finns i Radix Ophiopogonis och är känd för att ha vissa farmakologiska egenskaper11. Dessutom är det en medlem av familjen Liliaceae och används i stor utsträckning för dess hämmande och skyddande effekter vid cellulär inflammation och hjärtskada. Till exempel förbättrar OP-D DNCB-inducerade atopiska dermatitliknande lesioner och tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) inflammatoriska HaCaT-celler i BALB / c-möss12. Viktigt är att OP-D främjar det antioxidativa skyddet av hjärt-kärlsystemet och skyddar hjärtat mot doxorubicininducerad autofagisk skada genom att minska både reaktiv syreartgenerering och störa mitokondriell membranskada. Experiment har visat att intag av OP-D med mono-desmoside hjälper till att öka immunförsvaret, öka antalet vita blodkroppar och DNA-syntesen och få antikroppar att hålla längre13. Det har tidigare visat sig att OP-D har en adjuvanseffekt14.
Nanoemulsioner är olja-i-vatten-nanoformuleringar som består av en kombination av ytaktiva ämnen, olja, samsurfakter och vatten12,15. Dessa nanovaccindesigner gör att antigener och adjuvanser kan kapslas in tillsammans för att förbättra immunstimulering, skydda antigenerna och främja mognad av dendritiska celler (DC)16. För utveckling av dessa nya adjuvanser erhållna från screening är det viktigt att hitta lämpliga metoder för att utvärdera deras cellulära svarsförmåga.
Syftet med detta protokoll är att systematiskt utvärdera om adjuvanser kan förbättra fagocytos och uttrycket av immunceller i in vitro-cellodling och att utarbeta de viktigaste experimentella metoderna. Experimentet är indelat i fyra underavsnitt: (1) toxiciteten hos OP-D och NOD för L929-celler bestäms av cellräkningssats-8 (CCK-8) -analysen; (2) cytokinnivåerna av endokrina IFN-γ och IL-17A och motsvarande cellnummer hos immuniserade möss detekteras genom splenocytstimulering och ELISpot-analyser; (3) DCs antigenpresentationsförmåga efter adjuvansstimulering observeras med konfokalmikroskopi; och (4) de tre typerna av cytokiner, IL-1β, IL-6 och TNF-α, i supernatanterna erhållna från peritoneala makrofager (PM) hos normala möss som odlas med adjuvanser detekteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla cellexperiment utfördes i ett celltekniskt laboratorium utrustat med grundläggande operationssalar, buffertrum, sterila odlingsrum och identifierings- och analysrum. Arbetsmiljön och förhållandena var fria från mikrobiell kontaminering och andra skadliga faktorer. Djurförsöken utfördes utifrån riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur och godkändes av laboratoriedjurens djurskydds- och etikkommitté vid det tredje militärmedicinska universitetet.
1. Autoklavering och materialberedning
- Förbered reagenserna och förbrukningsvarorna, såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS), sax, pincett och slipmedel, genom fuktig värmesterilisering genom autoklavering vid 121 ° C i 20 minuter.
- För erforderliga reagenser och utrustning, se materialförteckningen. För formeln för den tomma nanoemulsionen (BNE), se tabell 1.
2. Analys av cytotoxicitet för L929
- Slå på vattenbadet och justera temperaturen till 37 °C. Samla ett rör med frysta L929-celler från flytande kväve och tina snabbt i ett 37 °C vattenbad.
- Pipettera cellerna till ett 15 ml sterilt centrifugrör snabbt efter upptining, tillsätt 2 ml DMEM och blanda väl.
- Centrifugera proverna vid 129 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Tillsätt sedan 2 ml DMEM för att återsuspendera cellerna och centrifugera proverna igen vid 129 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten, tillsätt 6 ml DMEM-komplett medium (innehållande 10 % FBS) för återsuspension och överför till en T25-odlingskolv i en 37 °C-inkubator med 5 %CO2 till odling i 48 timmar.
- Kassera odlingsmediet i odlingskolven och tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS. Tillsätt sedan 1 ml 0,25% trypsin för att smälta cellerna i 1-2 minuter vid 37 °C.
- När avrundning av cellerna observeras, tillsätt 4 ml DMEM komplett medium för att avsluta matsmältningen omedelbart och blanda väl. Aspirera sedan cellerna i ett 15 ml sterilt centrifugrör och centrifugera vid 129 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml DMEM komplett medium. Använd en 20 μL cellsuspension för cellräkning med hjälp av cellräkningsplattor och späd de återstående cellerna till 1 x 105 celler / ml med DMEM komplett medium.
- Tillsätt 100 μl ultrarent vatten i periferin av en 96-brunnsplatta och tillsätt endast 100 μl cellutspädningsmedel till de inre brunnarna. Placera plattan i inkubatorn för vidhäftande kultur i 4 timmar vid 37 °C.
- Efter att cellerna har fäst, tillsätt OP-D och NOD separat i DMEM-komplett medium till en slutlig volym på 200 μl / brunn (de slutliga koncentrationerna av varje läkemedel är 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml och 30 μg / ml). För varje koncentration, använd tre brunnar som replikat. Placera sedan cellerna tillbaka i inkubatorn och odla i ytterligare 24 timmar.
- Späd CCK-8 till 10% med DMEM komplett medium och tillsätt 100 μl/brunnsutspädningar innehållande adjuvans- och celllösningarna till 96-brunnsplattan. Placera plattan tillbaka i inkubatorn och inkubera i ytterligare 2-3 timmar.
- Blanda ofta medan du pläterar celllösningen för att förhindra inhomogenitet på grund av cellutfällning. Skaka försiktigt plattan flera gånger före och efter tillsats av CCK-8 för att blanda mediet och CCK-8-lösningen väl.
- Mät absorbansen vid 450 nm med en mikroplattläsare. Ställ in en nollställningsbrunn med endast medium och CCK-8 för ett baslinjeabsorbansvärde. Beräkna exakta absorbansvärden genom att subtrahera det nollade absorbansvärdet från det erhållna absorbansvärdet vid plottning.
- Bekräfta att inga bubblor finns i några brunnar innan du testar med mikroplattläsaren eftersom bubblor kommer att störa analysen.
3. Splenocyt stimulering
- Immunisera BALB/c-möss i åldern 6-8 veckor med 30 μg proteinantigen plus 30 μg adjuvans via en intramuskulär injektion (200 μL) dag 0, dag 7 och dag 14 enligt följande experimentella grupper: (1) PBS-grupp, (2) antigen (Ag) grupp, (3) antigen + OP-D (Ag / OP-D) grupp, (4) antigen + BNE (Ag / BNE) grupp, (5) antigen + NOD (Ag/NOD) grupp och (6) antigen + AlPO4 (Ag/Al) grupp.
- Förberedelserum: På dag 24 efter den primära immuniseringen, ta bort mössen från djurrummet och avliva dem genom en intraperitoneal injektion av 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital. Lägg mössen i en glasskål och blötlägg i 75% alkohol i 5 min.
- Placera centrifugrören på ett centrifugrörsställ, numrera engångsformarna petriskålar och tillsätt 5 ml PBS till varje petriskål med en pipett på 10 ml.
- Gör ett snitt på 6-8 cm med sax i mitten av musens vänstra ventrala sida, riv upp huden, exponera bukväggen och lokalisera den långa röda remsan av mjälten.
- Lyft bukhinnan på den underlägsna sidan av mjälten med pincett, skär upp den och vrid den uppåt för att exponera mjälten. Lyft mjälten med pincett, separera bindväven under mjälten med oftalmisk sax och ta bort mjälten.
- Lägg mjälten i en petriskål som innehåller 5 ml PBS och kvarn med en sil (200 maskor, 70 μm) och slipstång. Efter slipning, överför vätskan till ett 15 ml centrifugrör med en armbågsdroppare i enlighet med numreringen.
- Centrifugera vätskan vid 453 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten, tillsätt 3 ml lysbuffert för röda blodkroppar till varje rör, återsuspendera cellerna och lysera vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Tillsätt 10-12 ml PBS till varje rör, blanda röret upp och ner och centrifugera vid 453 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten, tillsätt 10 ml PBS till varje centrifugrör och återsuspendera cellerna.
- Ta 20 μl av varje prov i en brunn på cellräkningsplattan och registrera antalet levande celler med hjälp av en automatiserad cellräknare.
- Centrifugera proverna vid 453 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Återsuspendera cellerna, späd till 2,5 x 106 celler/ml med RF-10-medium (formuleringsinformation i tabell 2) och tillsätt till en 96-brunnsplatta vid 100 μl/brunn.
- Späd antigenet med RF-10-medium till 10 μg/ml, tillsätt 100 μl till varje brunn och inkubera i 3 dagar vid 37 °C i 5 %CO2.
- Aspirera cellsuspensionen erhållen från varje grupp av celler i 1,5 ml centrifugrör, centrifugera vid 453 x g i 20 minuter och aspirera supernatanten i ett rent centrifugrör.
- Utför IFN-γ och IL-17A-innehållsdetektering strikt enligt ELISA-kitinstruktionerna. Metoderna och förfarandena är följande.
- Bered 1x tvättbuffertarbetslösning (medföljer satsen), standardlösning för gradientkoncentration (utspädd cytokinstandardlösning till 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml och 15,6 pg/ml i utspädningsbufferten R [1x] som medföljer satsen), biotinylerad antikroppsarbetslösning (utspädd biotinylerad antikroppslösning till 1:100 med användning av utspädningsbufferten R [1x] som medföljer satsen för att bilda arbetslösningen), och streptavidin-HRP arbetslösning efter behov.
- Tillsätt 100 μl/brunn utspädd cytokinstandardlösning i standardbrunnen, 100 μl/brunn av provet i provbrunnen (utspädningsbufferten R [1x] som medföljer satsen används för provutspädningen) och 100 μl/brunn utspädningsbuffert R (1x) i blindprovskontrollbrunnen.
- Tillsätt biotinylerad antikroppsarbetslösning vid 50 μl/brunn. Blanda väl, täck med ett tätningsmembran och inkubera vid 37 °C i 90 minuter.
- Ta bort vätskan från brunnarna och tillsätt 1x tvättbuffertarbetslösning vid 300 μl/brunn. Kassera vätskan från brunnarna efter 1 min. Upprepa denna process 4x så att vätskan torkar på filterpapper varje gång.
- Tillsätt 100 μl / brunn streptavidin-HRP-arbetslösning. Täck över och inkubera proverna vid 37 °C i 30 minuter. Centrifugera proverna vid 453 x g i 5 minuter och kassera supernatanten.
OBS: Tvättlösningen som finns kvar i reaktionsbrunnen under tvättprocessen bör klappas ordentligt tills ingen vattenstämpel kan ses på filterpapperet. - Tillsätt TMB vid 100 μl/brunn, inkubera plattorna vid 37 °C i 5-30 min i mörker och bedöm avslutningsreaktionen efter färgdjupet i brunnen (mörkblå). Vanligtvis kan 10-20 min för färgutveckling uppnå bra resultat.
- Avsluta reaktionen snabbt genom att tillsätta stopplösning vid 100 μl/brunn. Upptäck absorbansvärdet vid 450 nm inom 10 minuter efter avslutning.
OBS: Balansera reagenset vid rumstemperatur i 30 minuter före användning.
4. ELISpot-analys
- Utför immunisering av mössen och insamlingen av splenocyter exakt som beskrivs i steg 3.1-3.10 ovan. Utför analyserna för IFN-γ och IL-17A i strikt överensstämmelse med kitinstruktionerna. Metoderna och förfarandena är följande.
- Ta bort plattan från den förseglade förpackningen, tvätta 4x med steril PBS (200 μl / brunn) och tillsätt 1640 komplett odlingsmedium (200 μl / brunn) för att balansera den vid rumstemperatur i 2 h.
- Ta bort mediet och späd splenocytsuspensionen med RF-10-medium till 2 x 105 celler/ml, tillsätt 50 μl celler och antigen per brunn (slutlig koncentration: 10 μg/ml).
- Placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5%CO2 i 48 timmar. Flytta inte plattan under denna tid och vidta åtgärder för att undvika avdunstning (t.ex. linda in plattan med aluminiumfolie).
- Späd detektionsantikroppen (BVD6-24G2-biotin) till 1 μg/ml (1:1 000) i fosfatbuffrad saltlösning (0,5 ml:100 ml) innehållande 0,5 % fetalt bovint serum (PBS-0,5 % FBS). Tillsätt 100 μl/brunn till plattan och inkubera den vid rumstemperatur i 2 timmar efter filtrering genom ett 0,22 μm membran.
- Dekantera vätskan i brunnarna, tillsätt 1x tvättbuffert vid 200 μl/brunn och tvätta 5x. Låt stå i 30-60 s varje gång, och låt för sista gången torka på blottingpapper.
- Späd streptavidin-pepparrotsperoxidaset (1:1 000) i PBS-0,5% FBS och tillsätt 100 μl/brunn. Inkubera plattan i 1 h vid rumstemperatur. Tvätta plattan som i steg 4.6.
- Tillsätt 100 μl/brunn färdig TMB-substratlösning och utveckla tills en tydlig fläck visas. Stoppa färgutvecklingen genom att tvätta i stor utsträckning i avjoniserat vatten (skölj 5x-6x upprepade gånger). Ta vid behov bort kulverten (den mjuka plasten under plattan) och skölj membranets undersida.
- Undersök och räkna fläckarna på en ELISpot-läsare eller dissekeringsmikroskop efter att plattan har torkat.
5. Upptag av domänkontrollanter
- Avliva BALB/c normala möss genom en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital. Blötlägg mössen i 75% alkohol i 5 min.
- Skär ett 6-8 cm snitt under musens buk med sax och kläm fast de två ändarna av öppningen för att separera den i olika riktningar och exponera musens ben. Separera musens lårben från muskroppen och skenbenet från leden och håll benen intakta i båda ändarna.
- Ta bort restvävnaden och brosket från ledlederna i båda ändarna av lårbenet med sax och pincett. Blötlägg lårbenen i 75% alkohol i 5 minuter och blötlägg sedan i steril PBS-lösning för att tvätta bort ytalkoholen.
- Skär av ändarna på lårbenen med sax och skölj benmärgen i en steril petriskål med steril PBS-lösning följt av aspiration med en 1 ml spruta. Upprepa tvätten 3x-5x.
- Filtrera med en cellsikt (200 maskor, 70 μm) och samla BMDC:erna i ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera proverna vid 290 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten, tillsätt 4 ml lysbuffert för röda blodkroppar, återupplivning och lysera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Tillsätt 10 ml steril PBS-lösning för att neutralisera lysatet, centrifugera vid 290 x g i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml DMEM innehållande 1% penicillin-streptomycinlösning och 10% FBS och räkna. Lägg sedan till GM-CSF (20 ng / ml) plus IL-4 (10 ng / ml) till mediet, justera cellkoncentrationen till 5 x 105 / ml och inokulera cellerna på täckglas.
- Tillsätt cellsuspensionen till en 6-brunnsplatta vid 2 ml/brunn och placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5 %CO2 i 48 timmar. Byt mediet helt efter 2 dagar och byt hälften av mediet efter 4 dagar.
- Välj fem brunnar med celler i gott skick (stora och radioaktiva celler med dendritiska utsprång på cellytan) med hjälp av ett inverterat mikroskop med 100x förstoring för experimentet på den sjunde odlingsdagen. Kassera supernatanten, tillsätt 2 ml GFP-, OP-D + GFP- och NOD + GFP-lösningar utspädda med DMEM-komplett medium (GFP-slutkoncentration: 20 μg/ml; slutlig koncentration av adjuvans: 10 μg/ml) till varje brunn och inkubera plattorna vid 37 °C i 30 minuter i mörker.
- Tvätta plattorna 3x med PBS, tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 15 min. Ta bort paraformaldehyden efter fixering, inkubera cellerna med falloidin och DAPI till en slutlig koncentration av 10 μg / ml i 10 min för färgning och tvätta sedan 3x med PBS.
- Tillsätt 1 ml PBS till varje brunn och observera antigenupptaget med CLSM, enligt beskrivningen nedan.
- Öppna CLSM-programvaran, klicka på ZEN System och vänta tills maskinvaruinitieringen är klar.
- Klicka på GFP - och DAPI-genvägarna på lokaliseringsfliken för att hitta det område som kan observeras. Stäng av lysröret och överfört ljus.
- Klicka på Smart Setup i förvärvsmenyn för att öppna färgämnesbiblioteket och lägg till tre fluorescerande färgämnen: EGFP, phalloidin och DAPI. Klicka på Bästa signal > OK. Klicka på EGFP-kanalen på fliken kanaler och klicka på Live för att välja rätt synfält i rätt gränssnitt.
- Välj 1 AU för pinhålet, vrid finfokuseringsskruven för att justera brännvidden och välj lämpligt brännvidd. Klicka på Range Indicator och justera kombinationen av laserkraft och masterförstärkning så att endast sporadiska röda prickar visas på bilden.
- Justera falloidin- och DAPI-kanalerna med samma parametrar utan att ändra lasereffekten.
- Välj Stop Live och klicka på Förvärvsläge för att ändra fotograferingsparametrarna: Ramstorlek: 1024 pixlar x 1024 pixlar; Skanningshastighet: 7; Medelvärde: 2x. Klicka på Snap och välj Split för att se alla bilder som tagits. Spara bilderna.
6. Aktivering av makrofag
- Sänk ner C57BL/6 möss i 75% alkohol efter eutanasi och placera dem med framsidan uppåt i en petriskål i glas i numrerad ordning.
- För mössen genom överföringsfönstret in i det sterila operationsrummet och placera på operationsbordet i 5 minuter.
- Använd en spruta, aspirera 10 ml saltlösning, luta mössen nedåt vid cirka 45 ° och injicera i mitten av bukhålan. Dra ca 5 ml cellsuspension i ett 15 ml centrifugrör för varje 10 ml och upprepa injektionen 3x.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 129 x g i 5 minuter för att erhålla musens peritoneala primära makrofager. Återsuspendera cellerna, justera cellkoncentrationen till 2 x 106 celler / ml med RPMI 1640 komplett medium (innehållande 10% FBS) och inokulera cellsuspensionen i en 24-brunnsplatta för att säkerställa ett konsekvent antal celler per brunn (1 ml / brunn).
- Odling vid 37 °C i 5%CO2 över natten (cirka 16-20 timmar), följt av inkubation med PBS, Ag, Ag / OP-D, Ag / NOD och Ag / Al (Ag slutlig koncentration: 5 μg / ml; adjuvans slutlig koncentration: 10 μg / ml; total volym: 2 ml) i 24 timmar. Detektera nivåerna av IL-1β, IL-6 och TNF-α i odlingssupernatanten med ELISA-kit med hjälp av de metoder och procedurer som beskrivs i steg 3.12-3.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den cellulära aktivitetsutvärderingen av adjuvanserna OP-D och NOD slutfördes in vitro enligt protokollet. L929 fibroblaster är en användbar screeningmodell för in vitro-toxicitetstestning av NOD (figur 1). Kvantifieringen av inflammatoriska cytokinnivåer i mjälten kan hjälpa forskare att bättre förstå immunsvaret (figur 2). Övervakning av CTL med ELISpot är guldstandarden för bedömning av antigenspecifik T-cellsimmunitet i kliniska prövningar och för screening av vaccinkandidater (figur 3). Det ökade upptaget av ett antigen av DC kan framkalla förbättrade adaptiva immunsvar (figur 4). Makrofager spelar en viktig roll för att presentera antigener för T-celler, liksom att inducera andra antigenpresenterande celler att uttrycka kostimulatoriska molekyler och därigenom initiera adaptiva immunsvar (figur 5). Ovanstående experimentella resultat publicerades av Tong et al., och de olika antikroppssvaren in vivo och skyddseffektiviteten mot möss finns i den ursprungliga artikeln14.
Figur 1: In vitro-cytotoxicitetstest av L929-celler. De cytotoxiska effekterna av olika gradientkoncentrationer av OP-D och NOD (30 μg/ml, 60 μg/ml, 120 μg/ml, 240 μg/ml och 480 μg/ml) vid inkubering med L929-celler visas. Ett CCK-8-kit användes för detektering. Statistisk analys utfördes med hjälp av en statistisk analysprogramvara. Skillnaderna mellan de två grupperna analyserades med hjälp av ett oparat, tvåsidigt Students t-test. Alla värden uttrycks som medelvärde ± SD (n = 3) och signifikanta skillnader uttrycks enligt följande: *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Denna siffra har modifierats från Tong et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Nivåer av IFN-γ och IL-17A i splenocyter. Splenocyter från vaccinerade möss stimulerades med antigenet i 3 dagar, och nivåerna av cytokinerna (A) IFN-γ och (B) IL-17A i supernatanten mättes med ELISA. Resultaten visade att IFN-γ- och IL-17A-produktionen ökade signifikant i Ag/NOD-gruppen jämfört med grupperna Ag/OP-D, Ag/BNE och Ag/Al (p < 0,01). Statistisk analys utfördes med hjälp av en statistisk analysprogramvara. Skillnader mellan de flera grupperna analyserades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest. Alla värden uttrycks som medelvärde ± SD (n = 8) och signifikanta skillnader uttrycks enligt följande: *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Denna siffra har modifierats från Tong et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Antal IFN-γ- och IL-17A-utsöndrande celler i splenocytpopulationen. (A) ELISpot-analys av IFN-γ spotbildande antigenspecifika T-celler bland splenocyterna. B) ELISpot-analys av IL-17A spotbildande antigenspecifika T-celler bland splenocyterna. I likhet med cytokinresultaten visade Ag / OP-D- och Ag / NOD-grupperna signifikant ökade förhållanden och antal IFN-γ- och IL-17A-bildande celler i mjälten lymfoid T-cellpopulationen. Ag/NOD-gruppen inducerade starkare Th1 (p < 0,001) och Th17 (p < 0,01) immunsvar än de andra grupperna. Statistisk analys utfördes med hjälp av en statistisk analysprogramvara. Skillnader mellan de flera grupperna analyserades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest. Alla värden uttrycks som medelvärde ± SD (n = 8), och signifikanta skillnader uttrycks enligt följande: *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Denna siffra har modifierats från Tong et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CLSM-bilder av BMDC:s antigenupptag. Falloidin fläckar cytoskeletten i rött, DAPI fläckar kärnan i blått och GFP presenterar grön fluorescens. Som visas i figuren observeras grön fluorescens i CLSM efter 30 minuters sammanläggning av GFP + OP-D- och GFP + NOD-grupperna med BMDC, men GFP + NOD-partiklarna är omgivna av fagosomliknande vesikulära strukturer, medan GFP + OP-D-partiklarna inte är det. Denna siffra har modifierats från Tong et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Inverkan av adjuvansformulerat antigen på aktiveringen av PM. ELISA för detektion av koncentrationerna av cytokinerna IL-1β, IL-6 och TNF-α i supernatanten av PM sammanföll med PBS, Ag, Ag / OP-D, Ag / NOD och Ag / Al. Jämfört med antigenstimulering, Ag / NOD, Ag / OP-D och Ag / Al-stimulering ökade alla signifikant IL-1β, IL-6 och TNF-α sekretion från PM: erna (p < 0,05). Aktiveringen av makrofager förbättrades signifikant i NOD-gruppen jämfört med OP-D- och AlPO4-grupperna (p < 0,05). Statistisk analys utfördes med hjälp av en statistisk analysprogramvara. Skillnader mellan de flera grupperna analyserades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest. Alla värden uttrycks som medelvärde ± SD (n = 8), och signifikanta skillnader uttrycks enligt följande: *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Denna siffra har modifierats från Tong et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Täthet | Massa (per 10g) |
| Cremophor EL-35 | omfång | 1.92 |
| Glycerol | omfång | 0.48 |
| Gtcc | omfång | 0.6 |
| Ultrarent vatten | omfång | restbelopp |
Tabell 1: Formeln för BNE.
| Reagens | Täthet | Volym |
| β- Merkaptoetanol | 50 miljoner | 0,366 μL |
| Fetalt bovint serum | 1X | 10 ml |
| Glutamax | 2 mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85 ml |
| HEPES | 10 m | 1 ml |
| Icke-essentiella aminosyror (100x) | 1X | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin lösning | 100U/ml | 1 ml |
| Natriumpyruvat(100 mM) | 1 mM | 1 ml |
Tabell 2: Förberedelseinformation för det kompletta mediet RF-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subenhetsvacciner ger utmärkt säkerhet men dålig immunogenicitet. Huvudstrategin för att förbättra immunogeniciteten är att fysiskt adsorbera eller koppla antigener med adjuvanser och införliva dem i läkemedelsleveranssystemen för att främja upptag och presentation av DCs. Naturliga växtsaponiner som quillaia saponin och dess derivat är mycket giftiga och är inte lämpliga för utveckling av humanvacciner17. Därför är studien av de toxiska effekterna av vacciner eller adjuvanser på celler ett nödvändigt första steg i utvärderingen av nya vacciner.
Protokollet som presenteras i denna studie utförs enligt ISO 10993-5: 200918, vilket möjliggör viss flexibilitet vid provtillverkning. Den vanliga giftiga cellinjen, L929-fibroblaster och gingivalfibroblaster har liknande nivåer av cytotoxicitet. L929-fibroblaster har dock blivit en användbar screeningmodell för in vitro-toxicitetstester av nanomaterial på grund av deras utmärkta reproducerbarhet19. MTT och CCK-8 används ofta för cellviabilitet och cytotoxicitetsanalyser. Resultaten av MTT- och CCK-8-analyser motsäger varandra och är inte signifikant korrelerade, men cellviabiliteten för CCK-8-analysen skiljer sig signifikant från MTT-analysen20. En möjlig förklaring till MTT-resultaten i den tidigare studien är att accelererande celldöd kan induceras vid högre MTT-koncentrationer21. De experimentella resultaten av CCK-8-metoden överensstämmer i allmänhet med resultaten av toxicitetstesterpå djur 22. Därför, tills nya metoder för utvärdering av cytotoxicitet finns tillgängliga, är användningen av CCK-8-analysen för att detektera toxiciteten hos OP-D- och NOD till L929-celler förmodligen det bästa alternativet för närvarande. Denna metod kommer också att fortsätta att tillämpas inom vaccinmaterial och adjuvansutvärdering.
Mjälten är det största sekundära lymfoida organet i människokroppen, och kvantifieringen av inflammatoriska cytokinnivåer i mjälten kan hjälpa oss att förstå immunsvaret23. Man tror att det finns några grundläggande skillnader i struktur och celltyper mellan mjälten hos möss och människor 24, men den grundläggande likheten mellan specifika immuncelltyper och mjältregionens funktion gör studier med hjälp av mössens mjälte T-celler relevanta24. I detta protokoll mätte vi sekretoriska nivåer av Th1-cytokinet IFN-γ och Th17-cytokinet IL-17A i mjälten med hjälp av ELISA-kit. Denna analys används vanligtvis för kvantitativa bestämningar och har hög känslighet eftersom den använder antikroppar med hög affinitet för att tvätta bort ospecifika ämnen. De viktigaste begränsningarna i denna studie är den långa mättiden och den höga förbrukningen av reagenser. Cytokiner kan också detekteras med flödescytometri och Luminex-metoder, men dessa metoder kräver komplexa instrument, liksom dyra råvaror och specialutbildning. Därför är detta enkla och ekonomiska ELISA-kit ett värdefullt verktyg för att mäta specifika immunsvar. ELISpot har blivit en av de vanligaste teknikerna för att bestämma immunsvaren hos specifika cytokinfläckbildande celler. Det kan användas inte bara för att detektera CD8 + T-cellsvar som framkallas av vaccinkandidater utan också för erkännande av specifika antigener efter immunisering25. Med screening med hög genomströmning och en känslig detektionsgräns (1/100 000 celler) används ELISpot i stor utsträckning eftersom det också erbjuder fördelar med direkt observation av celler och snabb analys. Bildandet av varje fläck indikerar frekvensen av aktivering av enskilda T-celler eller B-cellerUtvärderingen av cellulärt svar på vacciner och adjuvanser är av stor betydelse vilket gör ELISpot oersättlig för närvarande.
Presentationen av antigener av DC är en förutsättning för att framkalla immunsvar14. DC, som används för antigenupptag, migration till lymfkörtlar och aktivering av naiva T-celler, är en av de väsentliga celltyperna för utveckling av T-cellmedierade immunsvar14. Med tanke på att interaktionen mellan nanoemulsionspartiklar och cellmembranet är en viktig determinant för partikelupptag, bestämdes GFP-fagocytos inom DC med användning av CLSM i detta experimentella protokoll. Det har visat sig att DC effektivt kan transportera antigener till dränerande lymfkörtlar, vilket kan vara anledningen till att adjuvanser förbättrar antigenimmunogeniciteten in vivo. Dessutom är CLSM den vanligaste kommersiella implementeringen av tekniken och används ofta i bildlaboratorier. Den optiska sektionskapaciteten, den tydliga upplösningen och mångsidigheten hos 3D-avbildning26 i CLSM gör den till det bästa verktyget för att analysera antigenupptag av DCs, även om det inte kan användas för insamling av kvantitativa data.
Det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC I och II) är viktigt för det specifika erkännandet av antigener. MHC II funktionella molekyler uttrycks starkt i APC och fungerar för att inducera CD4 + T-cellaktivering. APC inkluderar makrofager, DC och B-lymfocyter27, som starkt modulerar adaptiv immunitet. Makrofager distribueras i stor utsträckning i värdens immunsystem och spelar en nyckelroll i försvar och homeostas28. Aktiveringen av makrofager är avgörande för att initiera adaptiva immunsvar29. Under tiden kan nanoemulsionsadjuvanser som är lika stora som patogener främja antigenigenkänning och fagocytos, aktivera NALP3-inflammasomer och makrofager och modulera antigenpresentation28. I detta protokoll användes PM huvudsakligen som en modell för att bestämma utsöndringen av de proinflammatoriska cytokinerna IL-1β ochTh2, cytokiner IL-6 och TNF-α av ELISA, som kan användas för att kvalitativt utvärdera makrofagaktiveringsförmågan hos vacciner och adjuvanser. Graden och mekanismen för aktivering måste dock bestämmas av fler experiment. Till exempel, om EGF, IL-6 och andra faktorer som är nödvändiga för aktivering av immunceller utsöndras och de relaterade signalvägarna (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, etc.) behöver studeras.
Sammanfattningsvis har en serie protokoll för att bekräfta in vitro-cellulära svar på nya adjuvanser, inklusive cytotoxicitet, cytokinsekretion, DC-upptag och makrofagaktivering upprättats. Dessa protokoll visar inte bara låg toxicitet och hög cellulär leverans utan ger också detaljerade procedurer för CCK-8, ELISA och ELISpot. Cellulära svarsbedömningar av den växtbaserade immunpotentiatorn OP-D och dess modifierade kraftfulla nanoemulsionsvaccinadjuvans NOD slutfördes in vitro och protokollet var effektivt. Även om ELISA, ELISpot och konfokala laserskanningstekniker klassiskt har använts för att utvärdera in vitro-immunkompetensen hos adjuvanser till celler, har dessa metoder många nackdelar, såsom långa mättider, tung arbetsbelastning, dyra material och behovet av professionella tekniker. Många exakta metoder och avancerad teknik, såsom genchips, encellssekvensering och transkriptomteknik, måste användas i framtida studier för att ytterligare utöka teknikens omfattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande ekonomiska eller personliga intressen som kan ha påverkat det arbete som rapporteras i detta papper.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag nr 2021YFC2302603 från Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram, bidrag nr 31670938, 32070924, 82041045 och 32000651 från National Natural Science Foundation Program of China, bidrag nr 2014jcyjA0107 och nr 2019jcyjA-msxmx0159 från Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, bidrag nr CYS21519 för forskarutbildningsprojektet i Chongqing, bidrag nr 2020XBK24 från Army Medical University Special-projekt och bidrag nr 202090031021 för National Innovation and Entrepreneurship Program för studenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
