Summary
Den nuværende protokol beskriver en optimeret metode til histologisk observation af galler induceret af Plasmodiophora brassicae. Vibrerende sektioner af hypocotyler ryddes før fluorescensbilleddannelse for at studere involvering af transkriptionsfaktorer og phytohormoner under sygdomsprogression. Denne protokol overvinder begrænsninger for harpiksindlejring, hvilket muliggør plantavisualisering af fluorescerende proteiner.
Abstract
Infektion af Brassica-afgrøder af den jordbårne protist Plasmodiophora brassicae fører til galdedannelse på de underjordiske organer. Dannelsen af galler kræver cellulær omprogrammering og ændringer i metabolismen af den inficerede plante. Dette er nødvendigt for at etablere en patogenorienteret fysiologisk vask, som værtsnæringsstofferne omdirigeres mod. For en fuldstændig forståelse af denne særlige plantepatogeninteraktion og de mekanismer, hvormed værtsvækst og udvikling undergraves og repatternes, er det vigtigt at spore og observere de interne ændringer, der ledsager galdedannelse med cellulær opløsning. Metoder, der kombinerer fluorescerende pletter og fluorescerende proteiner, anvendes ofte til at studere anatomiske og fysiologiske reaktioner i planter. Desværre fungerer den store størrelse af galler og deres lave gennemsigtighed som store forhindringer for at udføre helmonteringsobservationer under mikroskopet. Desuden begrænser lav gennemsigtighed anvendelsen af fluorescensmikroskopi til at studere udvikling af clubroot sygdom og galdedannelse. Denne artikel præsenterer en optimeret metode til fastgørelse og rydning af galler for at lette epifluorescens og konfokal mikroskopi til inspektion af P. brassicae-inficerede galler. En vævsrydningsprotokol til hurtig optisk clearing blev brugt efterfulgt af vibratomsektionering til at detektere anatomiske ændringer og lokalisere genekspression med promotorfusioner og reporterlinjer mærket med fluorescerende proteiner. Denne metode vil vise sig nyttig til at studere cellulære og fysiologiske reaktioner i andre patogenudløste strukturer i planter, såsom nematodeinduceret syncytia og rodknuder samt bladgaller og deformationer forårsaget af insekter.
Introduction
Planter, der er påvirket af patogener eller insekter, kan udvikle unormale strukturer (organdeformationer eller galler), som gør det muligt for angriberen at indtage næringsstoffer og reproducere1. Her blev der foretaget en effektiv histopatologisk tilgang til at studere de ændringer, der finder sted i galler, der udvikler sig på de underjordiske dele af planter inficeret med protisten Plasmodiophora brassicae (figur 1). Den mindre tråd forbundet med dette patogen fremgår af det faktum, at P. brassicae hvilesporer kan bevare deres evne til at invadere planter i mange år. I tilfælde af storstilet dyrkning af raps (Brassica napus) er dette et alvorligt problem, da økonomiske faktorer begrænser sædskiftet, hvilket fører til hvilende sporeophobning i jorden2. Rapsens resistens over for clubroot sygdom forårsaget af P. brassicae er genetisk bestemt. Desværre overgår patogenet ofte resistens på grund af dets biologi og den smalle genetiske pool, hvorfra raps stammer. Derfor er det blevet relevant at studere reaktionerne efter infektion i værtsplanter og deres evne til at bremse sygdomsprogression eller forhindre visse symptomer i at udvikle sig.
I clubroot sygdom vurderes sværhedsgraden generelt baseret på udviklingen af galler og graden af rodsystemskader. Dette er kendt som sygdomsindekset-DI3. Det fanger dog ikke fuldt ud den sande vurdering af denne plante-patogen-interaktion. Det omhandler især ikke, hvordan patogenet fordeles i rødderne, og om planten kan begrænse P. brassicae bevægelse inden for dets væv. Desuden er det ikke let at forudse i hvilket omfang P. brassicae omprogrammerer underjordisk orgelanatomi. Undersøgelser af modelanlægget Arabidopsis thaliana har vist, at P. brassicae Infektion fører til hæmning af xylogenese (både initierings- og modningstrin) og forbedring af phloemdifferentiering inden for galler4,5. Desuden afslutter cambialcelleafkom i rødder og hypocotyler af inficerede planter ikke den mitotiske tilstand og spredes længere end i sunde planter.6. Denne proces styrer galdens endelige størrelse og bestemmer antallet af patogen hvilende sporer produceret i den inficerede plante. P. brassicae-drevet udviklingsmæssig, metabolisk og fysiologisk omprogrammering i værten er meget kompleks7; Derfor er anvendelsen af værktøjer, der muliggør inspektion af interne ændringer inden for galler, afgørende for korrekt vurdering af denne interaktion. Livscyklusudviklingen af P. brassicae ledsages af omprogrammering af værtscellemetabolismen, som kan observeres som stivelse eller lipidaflejring7,8. Den største hindring for den vellykkede mikroskopi af galler kommer fra deres lave gennemsigtighed. På grund af dette stammer størstedelen af histologiske prøver, der præsenterer klubrodsdrevne ændringer inden for galler, fra fikseringsindlejringsteknikker (voks eller harpiks) efterfulgt af mikrotomsektionering. Sådanne tilgange blev med succes brugt til at lokalisere promotoraktiviteten for adskillige gener, der er aktive i clubroot galls4,5 eller forskellige farvningsteknikker, der letter observationen af P. brassicae udvikling i livscyklussen9. Det skal dog bemærkes, at fikserings- og indlejringsstadierne er tidskrævende og resulterer i delvis eller fuldstændig udvaskning af vigtige biomolekyler (f.eks. lipider), hvilket i væsentlig grad hindrer visse observationer. Nylig P. brassicae livscyklusprogression i værten blev visualiseret ved hjælp af fluorescerende In Situ Hybridization (FISH), hvor en SABATH-type methyltransferase (PbBSMT) genspecifik sonde blev brugt til at markere hvilende sporedannelse10. Et godt alternativ er brugen af andre fluorescensbaserede metoder, hvor autofluorescensen af nogle cellulære komponenter, aktiviteten af 5'- opstrøms regulerende regioner af gener smeltet sammen med fluorescerende proteinmarkører og akkumulering af bestemte fluorescerende mærkede proteiner kan ses. Ud over den lave gennemsigtighed af prøverne arbejder en stor ulempe forbundet med sådanne objekter imidlertid med ikke-fastgjorte prøver, hvilket signifikant reducerer den tid, hvor billeder af god kvalitet kan dokumenteres. I 2015 blev Kurihara et al.11 udviklet et rydningsreagens, som gør det muligt at bevare fluorescerende proteiner og øger gennemsigtigheden af plantevævsprøver. Derudover er den kompatibel med adskillige histologiske pletter. For nylig blev den samme teknik med succes anvendt til at visualisere forskellige cellevægskomponenter i plantevæv12,13. Her er denne protokol blevet brugt til at analysere forskellige aspekter af udviklingen af clubroot galde. Arbejdsgangen begynder med fiksering af galler, vibratomsektionering, vævsrensning, farvning og fluorescensbilleddannelse. Afhængigt af ens behov, direkte eller efter særlig farvning, kan de resulterende sektioner underkastes inspektion under et epifluorescens eller konfokalmikroskop. Denne metode giver en effektiv løsning til at studere lokale ændringer i genekspression og fysiologiske reaktioner, herunder phytohormonbalance og signalering. Sygdomsprogression kan spores ved at se på fordelingsmønsteret for hvilesporer og modningsdynamik. Desuden kan protokollen let anvendes til billeddannelseskarakteristiske ændringer inden for P. brassicae inficerede planter, herunder hæmning af xylogenese eller værtsplanteforsvarsresponser, der er synlige som lokal lignificering i resistente genotyper. Eksempler i denne protokol kommer fra billeddannelse udført på Arabidopsis thaliana model; Protokollen kan dog også anvendes på andre afgrødearter, der tilhører Brassicaceae Familie. Metoden beskrevet nedenfor vil lette fremtidige detaljerede undersøgelser af cellulære strukturer og molekylære ændringer, der ledsager galdedannelse i P. brassicae-inficerede planter.
Protokollens generelle arbejdsgang er ret ligetil, og alle stadier af galdeudvikling kan let afbildes og karakteriseres (figur 2). Da P. brassicae er et jordbåren patogen, skal alle eksperimenter udføres i jordbaserede systemer. Patogenet foretrækker sure forhold; Derfor skal der anvendes ikke-kalkbehandlede jordsubstrater. Selvom P. brassicae ikke udgør en trussel mod mennesker, er det strengt et plantepatogen, der kan spredes gennem jord og vand. Derfor skal alle dele af den inficerede plante såvel som jorden ødelægges efter eksperimentet ved autoklavering eller ved behandling med blegemiddel.
Protocol
1. Plantevækstbetingelser
- Dyrk Arabidopsis thaliana-planter i et kortdagslysregime med 9 timers lys ved 22 °C og 15 timers mørke ved 20 °C og en bestråling på 120 μmol·m-2s−1 (målt som den fotosyntetisk aktive stråling, PAR på baldakinniveau, se Materialetabel).
2. Fremstilling af spore inokulum
BEMÆRK: For detaljer, se Fuchs et al.14.
- Homogeniser to til tre frosne galler fra kinesiske kålplanter (Brassica rapa var. pekinensis cultivar "Granaat") i en blender indeholdende 300 ml autoklaveret destilleret vand og filtrer gennem fire lag sterilt gasbind.
- Filtratet centrifugeres (ved 6.000 x g, i 5 minutter og ved 4 °C), og stivelseslaget fjernes mekanisk fra sporepelleten ved hjælp af en spatel. Gentag denne proces, indtil det meste af stivelsen er fjernet.
- Sporekoncentrationen bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer13 ved at tælle antallet af sporer i 20 forskellige feltområder.
- Sørg for, at den endelige koncentration af sporesuspension, der anvendes til podning, er 1 x 106 sporer·mL−1 for Arabidopsis thaliana. Pod hver plante 20 dage efter spiring med 2 ml kalibreret sporesuspension.
3. Vævsforberedelse og fiksering
- Forbered plantevævet.
- Fjern forsigtigt jord fra rodsystemerne af clubroot-inficerede og ikke-inficerede planter. Rengør grundigt med vand og opsaml hypocotyler og galler (længde mellem 0,5-2 cm) i mikrocentrifugerør.
- Udfør PFA-fiksering (4% paraformaldehyd, PFA i 1x PBS + 0,01% Triton X-100) ved at følge nedenstående trin.
- Der tilsættes 4 g PFA-pulver (se materialetabel) til 100 ml PBS (fosfatbufferet saltvand, pH 7,4, tabel 1) under omrøring ved 65 °C (kog ikke). Brug KOH (10 M og 1M) dråbevis for at opnå en klar opløsning med en pH-værdi på omkring 11.
- Juster pH-værdien med H2SO4 for at bringe den ned til 6,9 og tilføj 0,01% (v/v) Triton X-100 for at forbedre fikseringen. Aliquot opløsningen til opbevaring ved -20 °C (genfrys ikke) eller opbevares ved 4 °C.
- Udfør vævsfiksering.
- Prøverne fastgøres i 200-500 μL PFA-fikseringsmiddel i 1 time ved stuetemperatur ved at anvende et konstant vakuum (700 mbar) ved hjælp af en vakuumpumpe. Sørg for, at objektet er helt nedsænket i PFA-løsningen.
BEMÆRK: Prøver kan opbevares i et par uger ved 4 ° C (køleskab) og bruges senere til sektionering.
- Prøverne fastgøres i 200-500 μL PFA-fikseringsmiddel i 1 time ved stuetemperatur ved at anvende et konstant vakuum (700 mbar) ved hjælp af en vakuumpumpe. Sørg for, at objektet er helt nedsænket i PFA-løsningen.
4. Vævsindlejring og sektionering
- Brug 4% w/v agarose til agaroseindlejring af ikke-inficerede hypocotyler og inficerede galler. Kog opløsningen for at opløse agarose og hæld den, når den køler ned, mens den stadig er tyktflydende.
- Tør genstanden lidt på et væv i et par sekunder for at fjerne overskydende PFA.
- Brug tandstikkere/tang til omhyggeligt at indlejre og orientere planteobjektet i agarose. For at forhindre skrå sektioner skal du sikre dig, at objektet er orienteret og støbt korrekt, så dets akse er vinkelret på vibrationsbladets plan (til radiale sektioner).
- For at fremskynde størkningen af agarosen anbringes Petri- eller multikulturpladen ved 4 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Hvis objektet er for stort (som i tilfælde af større galler Arabidopsis 21 dage efter podning [DPI]), kan objektet sektioneres selv uden indlejring i agarose.
5. Vibratom sektionering
BEMÆRK: Vibratomet er udstyret med et vibrerende barberblad til at skære gennem planteorganer / væv. Vibrationshastigheden, amplituden, bladets vinkel og sektionstykkelse er alle parametre, der kan justeres (se Materialetabel).
- Brug et blad til omhyggeligt at skære og forme objektet i en agaroseblok og notere den foretrukne orientering til sektionering.
- Sæt agaroseblokken/den store galde fast for at montere den korrekt på prøveholderen ved hjælp af cyanoacrylat/instant lim og maskeringstape (se Materialetabel).
- For Arabidopsis hypocotyls og galls (tidlige stadier) skal du holde tykkelsen af sektioner mellem 30-40 μm for at opnå billeder af god kvalitet.
BEMÆRK: Til analyse af de senere stadier af galdeprogression kan tykkelsen af sektioner være mellem 50-80 μm. - Afstå fra at skære tyndere sektioner, da det kan ødelægge galdeprøven på grund af vibrationerne i det bevægelige blad.
- Juster tykkelsen for sektioner, hastighed og vibrationsamplitude i henhold til galdens tykkelse og størrelse (40 μm eller 60 μm).
- Tilsæt destilleret vand til vandbadet og begynd med sektionering.
- Saml forsigtigt sektioner ved hjælp af tang eller børste, og overfør dem til et mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml 1x PBS-buffer (pH 7,4).
BEMÆRK: Jo højere vibrationsamplitude er, desto bedre er sektionskvaliteten. For ikke-inficerede hypocotyler eller galler, der ikke indeholder modne hvilesporer, kan vibrationsamplituden holdes ved 1,2 mm med 0,60 mm·s-1 hastighed. I tilfælde af store galler med delvist tab af cellulær integritet og synlige tegn på sporemodning skal vibrationsamplituden reduceres til 0,55 mm med 0,45 mm · s-1 hastighed.
6. Rydning af prøver
- 1x PBS fjernes fra mikrocentrifugerøret, og der tilsættes 200-500 μL clearingopløsning (tabel 1).
- Fra nu af skal prøverne opbevares ved stuetemperatur i mørke. Sørg for, at objekterne altid er nedsænket i rydningsløsningen til enhver tid.
- Udskift rydningsopløsningen med den nye, hvis farven ændres efter nogen tid under prøvebehandlingen.
BEMÆRK: Farven på rydningsopløsningen kan blive gullig på grund af prøvebehandling. I et sådant tilfælde anbefales udskiftning af opløsningen for at forbedre rydningen af væv.
7. Farvning procedure
- For Calcofluor hvid farvning til cellevæggene (til udlæg af planteceller) fremstilles 5% v/v Calcofluor hvid plet (se Materialetabel) i rydningsopløsningen. Plet i mindst 5 minutter i mørket.
- Til farvning af lipider med Nilrød (til farvning af hvilesporer og oliedråber i inficerede celler) fremstilles 1 mg / ml af stammen (se materialetabel) i rydningsopløsning. Fortynd det yderligere for at opnå 1:99. Plet i mindst 10 minutter i mørket.
- Til grundlæggende Fuchsin ligninfarvning skal du forberede 0,2% w/v af pletten (se Materialetabel) i rydningsopløsningen. Plet i mindst 10 minutter i mørket.
BEMÆRK: Under dobbeltfarvning farves prøver først med Nile Red i 10 minutter før Calcofluor hvid påføring. De overskydende farvningsopløsninger blev fjernet efter hvert trin. Hvis genstanden virker overstained, skal du fjerne den overskydende plet ved at vaske med rydningsopløsningen. Fortynd pletter ved hjælp af rydningsopløsningen, hvis det kræves. Pletter altid prøven med Nile Red/Basic Fuchsin inden Calcofluor-farvning. Farvning først med Calcofluor kan forhindre korrekt farvning af sporerne af Nile Red.
8. Mikroskopi
- Monter ryddede sektioner på mikroskopirutsjebanen og observer under en epifluorescens eller et konfokalmikroskop (se Materialetabel). Brug rydningsopløsningen som monteringsmedium for at forhindre tørring af prøven.
- Brug flere anskaffelsestilstande til billeddannelse af mere end et fluorescensspektrum samtidigt.
BEMÆRK: De excitations-/emissionsspektre, der anvendes i den præsenterede protokol, er som følger: for Nile Red 553/636 nm, for xylem autofluorescens 380/475 nm, for Basic Fuchsin 561/650 nm, for Calcofluor hvid 405/475 nm, for erRFP 585/608 nm og for GFP 488/509 nm (tabel 2).
Representative Results
Med Nile Red, der pletter lipider og suberin, er det muligt at se patogenet hvilende sporer indeholdende lipider (figur 3A, B). Derfor kan der ved hjælp af dobbelt farvning opnås skarpe billeder for at se på mønsteret af patogenfordeling i gallerne. Modfarvning med Calcofluor hvid skaber kontrast og hjælper med samtidig at spore xylemudvikling med P. brassicae modning (figur 3B).
Xylemdannelse og -udvikling kan også kontrolleres ved at observere autofluorescens i ufarvede prøver (figur 4A) eller ved at anvende pletter såsom Basic Fuchsin, der muliggør fluorescensbaseret billeddannelse af lignin (figur 4B).
Ved at bruge denne metode kunne man spore genekspressionsændringer eller reaktioner på vækstregulatorer. Et perfekt eksempel er, hvor Arabidopsis-planter, der huser pHCA2: erRFP-konstruktion, blev brugt til at visualisere HIGH CAMBIAL ACTIVITY 2 (HCA2) genekspression i phloemvæv i clubroot galls. HCA2-genaktivitet er tidligere fundet i meristematicaly aktive cambium- og phloem-afstamningsceller15. Her lokaliserer den sammen med floemet i de sene stadier af P. brassicae-drevet galdeudvikling, og dens aktivitet afspejler, hvordan P. brassicae øger phloem-kompleksiteten (figur 5). Det resulterende billede viser phloem spredning i det sene stadium af galdeudvikling, når cambium bliver fragmenteret. Figur 5A viser en uklar håndsektion af galden, mens figur 5B viser mere skarpe og lokaliserede fluorescerende signaler opnået ved vibratomsektion efterfulgt af vævsrensning. Genstandene blev modfarvet med Calcofluor hvid. Figur 6 sammenligner dette billede (figur 6B) med et lignende område afbildet i harpiksindlejrede og mikrotom-sektionerede galler (figur 6A) ved 21 DPI. Differentielle cytokininresponser mellem inficerede og ikke-inficerede planter blev vurderet ved at kontrollere ekspressionen af TCS: GFP (Two Component Signalling) markør16 i udvikling af galler (figur 7). Mens billeddannelse af svage GFP-signaler i galler og væv med sekundære fortykkelser, er det vigtigt at bemærke, at yderligere baggrundssignal på grund af autofluorescens af modne xylemceller også fanges under billeddannelse.
Figur 1: Symptomer på Clubroot sygdom på raps (B. napus) og Arabidopsis thaliana (Columbia-0) ved 26 DPI med Plasmodiophora brassicae sporer. I løbet af sygdommen udvikler store galler sig på hele rodsystemet, hvilket gør det ekstremt skørt. Det afsluttes med at frigive sporer i den omgivende jord for at fremme fremtidige infektioner. De øverste dele af plantekroppen viser også tegn på dårlig vækst og udvikling. Endelig bukker de inficerede planter under for de ødelæggende virkninger på vækstmetabolisme og udvikling, når rodsystemet bliver fuldstændig beskadiget, og planten ikke længere kan klare sygdommen. Skalabjælken repræsenterer 1 cm. -INF står for mock-inokuleret, mens +INF står for P. brassicae-podede planter. Ved denne lejlighed gives et billede af rapsplanter før jordfjernelsen for at præsentere sunde rodsystemer. Efter vask opsamles kun hypocotyl og øvre del af roden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Den generelle arbejdsgang. Vaskede Arabidopsis rodsystemer er (A) dissekeret, (B) fastgjort, (C) agarose indlejret, (D) monteret og (E) sektioneret på vibratomet. De resulterende genstande udsættes for vævsrensning (3 dage til flere uger ved RT i mørke, afhængigt af vævstype og tykkelse). (F) Ryddede genstande kan derefter farves og inspiceres under mikroskopet. (G) Opsummering af arbejdsgangen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mærkning af patogensporer med Nilrød plet . (A, B) Nile Red pletter lipider i hvilesporer, hvilket fungerer perfekt til at spore P. brassicae modning. (A) Forstørrede celler koloniseret af P. brassicae og fyldt med patogensporer. (B) Modne xylemceller bliver også farvet af Nile Red. Sektionen er blevet modfarvet med Calcofluor hvid for at se udlægget af værtsceller (A: Objektiv linse = 20x og sektionstykkelse = 60 μm; B: Objektiv linse = 5x og sektionstykkelse = 60 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sporing af omfanget af xylemudvikling og modning. (A) Lignin giver stærk autofluorescens ved excitation med UV; Derfor kan moden xylem diskrimineres relativt let. (B) Dobbeltfarvning med Basic Fuchsin og Calcofluor giver bedre resultater, da alle celler bliver farvet af sidstnævnte farvestof, mens moden xylem er tydeligt farvet med Basic Fuchsin. På denne måde giver dobbeltfarvning billeder med forbedret kontrast, der viser mærkbar hæmning af xylogenese (A: Objektiv linse = 10x og sektionstykkelse = 60 μm; B: Objektiv linse = 10x og sektionstykkelse = 60 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Phloem-specifikt signal for HCA2-genet i hypocotyler af P. brassicae-inficerede planter ved 21 DPI. Promotoraktivitet for proHCA2::erRFP med transgen Arabidopsis thaliana kan ses i (A) og (B). Forskelle kan observeres mellem en ikke-ryddet håndsektion i panel (A), hvor erRFP-signalet ser ud til at være diffust på grund af overlejring og overlappende cellelag, især i ujævne håndsektioner. På den anden side viser (B) en vibratomsektion efter vævsrensning, hvor erRFP-signalet præcist markerer floemcellerne i et modent vaskulært bundt (objektiv linse = 20x og sektionstykkelse = 60 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Sammenligning mellem TB, harpiksindlejret og mikrotom-sektionerede galler ved hjælp af fluorescens. (A) En sammenligning mellem billeder af Toluidine Blue (TB), harpiks-indlejrede og mikrotom-sektionerede galler, og (B) et repræsentativt objekt (også præsenteret i figur 5B) erhvervet ved hjælp af fluorescens. Xylemceller er mærket med gule stjerner, det cambiale område med levende grønne parenteser, phloem med cyan stjerner og Plasmodiophora brassicae-koloniserede celler med et hvidt PB-symbol. Harpiksindlejrede sektioner (A) giver en god opløsning til at studere fordelingen af hvilesporer i hypertrofierede organer, graden af sygdomsprogression og andre processer såsom lokal lignificering i resistente planter. Den her beskrevne protokol (B) muliggør imidlertid følsom observation af genekspression eller proteinakkumulering og visualisering af andre fysiologiske ændringer og vigtige molekyler såsom lipider (i sporer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Sporing af cytokininsignaleringsresponser i hypocotyler af ikke-inficerede (-INF) og P. brassicae-inficerede (+INF) Arabidopsis-planter ved 16 DPI. TCS:: GFP-markør blev brugt til karakterisering i planta cytokinin-responser. Vibratomsektioner blev udsat for rydningsbehandling efterfulgt af farvning med Calcofluor hvid. Baseret på billedet, ved 16 DPI, synes cytokininresponser stort set at være formindsket i inficerede galler (højre panel), mens de forbliver stærke, især i phloem-poolen (celler, der i sidste ende vil differentiere sig til dannelse af phloemvæv), i ikke-inficerede planter (venstre panel) (objektiv linse = 5x og tykkelse = 30 μm). Visse niveauer af xylem autofluorescens kan også være synlige. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Rydningsopløsning (giftig) | ||
| Komponenter | Procentdel (%) | i 100 ml destilleret vand |
| Xylitol | 10% | 10 g |
| Natriumdeoxycholat | 15% | 15 g |
| Urinstof | 25% | 25 g |
| 10x PBS (fosfatbufferet saltvand) | 1x PBS (100 ml) | |
| NaCl | 8 g | 10 ml 10x PBS + 90 ml destilleret vand |
| KCl | 0,2 g | |
| KH2PO4 | 0,24 g | |
| Na2HPO4 · 2H2O | 1,81 g | |
| destilleret vand | 100 ml | |
| ph | pH justeret til 7,4 ved hjælp af HCI | |
| Autoklave og opbevares ved 4 °C. | ||
Tabel 1: Sammensætning af clearingopløsningen og fosfatbufferet saltvand (PBS).
| Fluorescerende plet / Tag | Excitations-/emissionsbølgelængder | Mikroskop filtersæt brugt |
| Nilen rød | 553/636 nm | filter sæt 43 |
| Xylem autofluorescens | 380/475 nm | filter sæt 49 |
| Calcofluor Hvid | 405/475 Nm | filter sæt 49 |
| Grundlæggende Fuchsin | 561/650 nm | filter sæt 43 |
| erRFP | 585/608 nm | filter sæt 43 |
| Gfp | 488/509 nm | filter sæt 38 |
Tabel 2: Excitations-/emissionsspektre udvalgt til denne undersøgelse.
Discussion
Anvendelse af rydningsopløsningen på vibratomskårne sektioner af galler forbedrer helt sikkert evnen til at studere den biotrofiske interaktion mellem P. brassicae og værtsplanten. Selvom clearingprotokollen gælder selv for håndsektioner, fungerer den bedre med vibratomsektioner. Fastgørelse af prøver i PFA-fikseringsmiddel fungerer som et kritisk trin i protokollen, da prøver derefter kan opbevares ved 4 °C i et par dage, før de fortsætter med sektionering. Dette giver fleksibilitet til at opbevare prøver i en begrænset periode uden at gå på kompromis med ekspressionen og konserveringen af fluorescerende proteiner under fiksering.
Nile Red (i DMSO eller methanol) er uforenelig med harpikssektioner på grund af dets hydrofobicitet, som opløser harpiks og ødelægger harpiksindlejrede sektioner17. Således viser vibratomsektioner sig at være medvirkende til at studere patogenfordelingen og dens livscyklus inden for udvikling af galler, hvor Nilrød farvning let kan bruges.
Rydningsopløsningen, der anvendes i denne protokol, er meget alsidig12, hvilket gør det muligt at anvende en række fluorescenspletter i forskellige kombinationer til at plette forskellige biomolekyler / komponenter i cellevæggene (suberin, lignin, cellulose og chitin i svampeinteraktioner). Det er også muligt at modfarve sektioner af fluorescerende GFP-markørlinjer og derved korrelere promotoraktiviteten eller proteinakkumuleringsmønsteret med tilstedeværelsen af patogenet i bestemte celler eller områder af galden. Imidlertid kunne baggrundsautofluorescens fra xylem og patogenfyldte kæmpeceller ikke elimineres, selv efter clearingprotokollen. Dette udgør en begrænsning for at se på fluorescerende markører i de senere stadier af galdedannelse, især når man bruger et epifluorescensmikroskop og billeddannelse af svage signaler.
På grund af de lave niveauer af ekspression/akkumulering af fluorescerende signaler er transkriptionsfaktorer vanskelige at opdage, men med denne teknik er det muligt at opnå tilfredsstillende billeder for dem. Samlet set udvider kombinationen af vibratomsektionering med vævsrensningsmetoden værktøjskassen til histologiske observationer af komplekse galdevæv. Fleksibiliteten i denne protokol letter processen med vævsfiksering og reducerer den tid, der kræves til skæring og billeddannelse af friske vævsprøver for at observere fluorescerende proteiner og promotoraktiviteter. Med yderligere forbedringer og ved at udnytte andre fluorescerende farvestoffer, der er specifikke for forskellige biomolekyler, vil denne metode markere større fremskridt inden for histologiske undersøgelser og billedanalyse af tæt, uigennemsigtigt væv med kompleks vævsorganisation. I nyere tid har den præsenterede vævsrensningsmetode vist sig som en populær og udbredt protokol til at kombinere og muliggøre samtidig erhvervelse af forskellige fluorescerende signaler11,12,13. Fremtidig udvikling og modifikationer i sådanne teknikker vil i høj grad forbedre billedopløsningen til observation af plantepatogeninteraktioner på celleniveau.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af National Science Centre Poland OPUS17 bevilling nr. 2019/33/B/NZ9/00751 "Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae". Vi takker prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, University of Cambridge) for at dele proHCA2::erRFP-linjen .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
| Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
| Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
| Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
| Commercial Bleach | Domestos | ||
| Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
| Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
| Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
| Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
| Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
| Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
| Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
| Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
| Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
| Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
| Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
| Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |
References
- Harris, M. O., Pitzschke, A. Plants make galls to accommodate foreigners: Some are friends, most are foes. New Phytologist. 225 (5), 1852-1872 (2020).
- Peng, G., et al. Crop rotation, cultivar resistance, and fungicides/biofungicides for managing clubroot (Plasmodiophora brassicae) on canola. Canadian Journal of Plant Pathology. 36 (1), 99-112 (2014).
- Siemens, J., Nagel, M., Ludwig-Müller, J., Sacristán, M. D. The interaction of Plasmodiophora brassicae and Arabidopsis thaliana: Parameters for disease quantification and screening of mutant lines. Journal of Phytopathology. 150 (11-12), 592-605 (2002).
- Malinowski, R., Smith, J. A., Fleming, A. J., Scholes, J. D., Rolfe, S. A. Gall formation in clubroot-infected Arabidopsis results from an increase in existing meristematic activities of the host but is not essential for the completion of the pathogen life cycle. The Plant Journal. 71 (2), 226-238 (2012).
- Walerowski, P., et al. Clubroot disease stimulates early steps of phloem differentiation and recruits SWEET sucrose transporters within developing galls. The Plant Cell. 30 (12), 3058-3073 (2018).
- Olszak, M., et al. Transcriptional profiling identifies critical steps of cell cycle reprogramming necessary for Plasmodiophora brassicae-driven gall formation in Arabidopsis. Plant Journal. 97 (4), 715-729 (2019).
- Malinowski, R., Truman, W., Blicharz, S. Genius architect or clever thief-How Plasmodiophora brassicae reprograms host development to establish a pathogen-oriented physiological sink. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (10), 1259-1266 (2019).
- Bi, K., et al. Integrated omics study of lipid droplets from Plasmodiophora brassicae. Scientific Reports. 6, 36965 (2016).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Badstöber, J., Gachon, C. M. M., Ludwig-Müller, J., Sandbichler, A. M., Neuhauser, S. Demystifying biotrophs: FISHing for mRNAs to decipher plant and algal pathogen-host interaction at the single cell level. Scientific Reports. 10, 14269 (2020).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Sexauer, M., Shen, D., Schön, M., Andersen, T. G., Markmann, K. Visualizing polymeric components that define distinct root barriers across plant lineages. Development. 148 (23), (2021).
- Fuchs, H., Sacristan, M. Identification of a gene in Arabidopsis thaliana controlling resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) and characterization of the resistance response. Molecular Plant-Microbe Interactions. 9 (2), 91-97 (1996).
- Guo, Y., Qin, G., Gu, H., Qu, L. -JDof56HCA2, a Dof transcription factor gene, regulates interfascicular cambium formation and vascular tissue development in Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (11), 3518-3534 (2009).
- Liu, J., Müller, B. Imaging TCSn::GFP, a Synthetic Cytokinin Reporter, in Arabidopsis thaliana. Plant Hormones: Methods and Protocols. Kleine-Vehn, J., Sauer, M. , Springer. New York. 81-90 (2017).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Fujimoto, T. Histochemical Detection of Lipid Droplets in Cultured Cells. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 483-491 (2013).
