Biology

प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका के लिए जीन अभिव्यक्ति और शारीरिक प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन को देखने के लिए समाशोधन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का संयोजन

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/64297

Deeksha Singh¹, Sara Blicharz¹, Karolina Stefanowicz¹, Laura Ragni², Kornel Michalak³, Agnieszka Bagniewska-Zadworna³, Robert Malinowski¹

¹Integrative Plant Biology Team, Institute of Plant Genetics Polish Academy of Sciences, ²ZMBP-Center for Plant Molecular Biology, University of Tübingen, ³Department of General Botany, Institute of Experimental Biology, Faculty of Biology, Adam Mickiewicz University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा प्रेरित पित्ताशय के हिस्टोलॉजिकल अवलोकन के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है। रोग की प्रगति के दौरान प्रतिलेखन कारकों और फाइटोहार्मोन की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेसेंस इमेजिंग से पहले हाइपोकोटाइल के विब्राटोम वर्गों को साफ किया जाता है। यह प्रोटोकॉल राल एम्बेडिंग सीमाओं को दूर करता है, जिससे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्लांटा विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम होता है ।

Abstract

मिट्टी से उत्पन्न प्रोटिस्ट प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा ब्रासिका फसलों के संक्रमण से भूमिगत अंगों पर पित्त का निर्माण होता है। पित्ताशय के गठन के लिए सेलुलर रीप्रोग्रामिंग और संक्रमित पौधे के चयापचय में परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह एक रोगज़नक़-उन्मुख शारीरिक सिंक स्थापित करने के लिए आवश्यक है जिसकी ओर मेजबान पोषक तत्वों को पुनर्निर्देशित किया जाता है। इस विशेष पौधे-रोगज़नक़ बातचीत और तंत्र की पूरी समझ के लिए जिसके द्वारा मेजबान विकास और विकास को विकृत और पुन: पैटर्न किया जाता है, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ पित्त गठन के साथ आंतरिक परिवर्तनों को ट्रैक और निरीक्षण करना आवश्यक है। फ्लोरोसेंट दाग और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संयोजन के तरीकों को अक्सर पौधों में शारीरिक और शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है। दुर्भाग्य से, पित्ताशय का बड़ा आकार और उनकी कम पारदर्शिता माइक्रोस्कोप के तहत पूरे माउंट अवलोकन करने में प्रमुख बाधाओं के रूप में कार्य करती है। इसके अलावा, कम पारदर्शिता क्लबरूट रोग की प्रगति और पित्त गठन का अध्ययन करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रोजगार को सीमित करती है। यह लेख पी ब्रासिके-संक्रमित पित्ताशय का निरीक्षण करने के लिए एपिफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सुविधा के लिए पित्ताशय को ठीक करने और साफ़ करने के लिए एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत करता है। तेजी से ऑप्टिकल क्लियरिंग के लिए एक ऊतक-समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था, जिसके बाद संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए प्रमोटर संलयन और रिपोर्टर लाइनों के साथ जीन अभिव्यक्ति का स्थानीयकरण करने के लिए विब्राटोम सेक्शनिंग का उपयोग किया गया था। यह विधि पौधों में अन्य रोगज़नक़-ट्रिगर संरचनाओं में सेलुलर और शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी साबित होगी, जैसे कि नेमाटोड-प्रेरित सिंकिटिया और रूट गांठ, साथ ही कीड़े के कारण पत्ती के पित्त और विकृतियां।

Introduction

रोगजनकों या कीड़ों से प्रभावित पौधे असामान्य संरचनाओं (अंग विरूपण या पित्ताशय) को विकसित कर सकते हैं, जो आक्रमणकारी को पोषक तत्वों को निगलने^{और प्रजनन} करने की अनुमति देते हैं। यहां, प्रोटिस्ट प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका से संक्रमित पौधों के भूमिगत भागों पर विकसित होने वाले पित्ताशय में होने वाले परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक कुशल हिस्टोपैथोलॉजिकल दृष्टिकोण किया गया था (चित्रा 1)। इस रोगज़नक़ से जुड़ा मामूली धागा इस तथ्य से उभरता है कि पी ब्रासिके आराम करने वाले बीजाणु कई वर्षों तक पौधों पर आक्रमण करने की अपनी क्षमता को बनाए रख सकते हैं। तिलहन रेप (ब्रासिका नेपस) की बड़े पैमाने पर खेती के मामले में, यह एक गंभीर समस्या है क्योंकि आर्थिक कारक फसल रोटेशन को प्रतिबंधित करते हैं, जिससे मिट्टी में बीजाणु संचय होता^है। पी ब्रासिका के कारण क्लबरूट रोग के लिए तिलहन बलात्कार का प्रतिरोध आनुवंशिक रूप से निर्धारित होता है। अफसोस की बात है, रोगज़नक़ अक्सर अपने जीव विज्ञान और संकीर्ण आनुवंशिक पूल के कारण प्रतिरोध को मात देता है जिससे तिलहन बलात्कार उत्पन्न हुआ था। इसलिए, मेजबान पौधों में संक्रमण के बाद की प्रतिक्रियाओं और रोग की प्रगति को धीमा करने या कुछ लक्षणों को विकसित होने से रोकने की उनकी क्षमता का अध्ययन करना प्रासंगिक हो गया है।

क्लबरूट रोग में, गंभीरता का मूल्यांकन आम तौर पर पित्ताशय के विकास और जड़ प्रणाली क्षति की डिग्री के आधार पर किया जाता है। इसे रोग सूचकांक-डीआई के रूप में जाना जाता है³. हालांकि, यह इस पौधे-रोगज़नक़ बातचीत के सही मूल्यांकन को पूरी तरह से कैप्चर नहीं करता है। विशेष रूप से, यह संबोधित नहीं करता है कि रोगज़नक़ जड़ों के भीतर कैसे वितरित किया जाता है और यदि पौधे रोक सकता है P. brassicae इसके ऊतकों के भीतर आंदोलन। इसके अलावा, यह अनुमान लगाना आसान नहीं है कि किस हद तक P. brassicae भूमिगत अंग शरीर रचना विज्ञान को पुन: प्रोग्राम करता है। मॉडल संयंत्र पर अध्ययन Arabidopsis thaliana दिखाया है कि P. brassicae संक्रमण से जाइलोजेनेसिस (दीक्षा और परिपक्वता चरण दोनों) के निषेध और पित्ताशय के भीतर फ्लोएम भेदभाव में वृद्धि होती है⁴^,⁵. इसके अलावा, संक्रमित पौधों की जड़ों और हाइपोकोटिल में, कैम्बियल सेल संतान माइटोटिक अवस्था को नहीं छोड़ती है और स्वस्थ पौधों की तुलना में लंबे समय तक फैलती है⁶. यह प्रक्रिया पित्ताशय के अंतिम आकार को नियंत्रित करती है और संक्रमित पौधे के भीतर उत्पादित रोगज़नक़ आराम करने वाले बीजाणुओं की संख्या निर्धारित करती है। P. brassicaeमेजबान में संचालित विकास, चयापचय और शारीरिक रीप्रोग्रामिंग बहुत जटिल है⁷; इसलिए, पित्ताशय के भीतर आंतरिक परिवर्तनों के निरीक्षण की अनुमति देने वाले उपकरणों का अनुप्रयोग इस बातचीत का ठीक से आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। जीवन चक्र की प्रगति P. brassicae मेजबान सेल चयापचय के रीप्रोग्रामिंग के साथ है, जिसे स्टार्च या लिपिड जमाव के रूप में देखा जा सकता है⁷^,⁸. पित्ताशय की सफल माइक्रोस्कोपी के लिए मुख्य बाधा उनकी कम पारदर्शिता से आती है। इसके कारण, पित्ताशय के भीतर क्लबरूट-संचालित परिवर्तन प्रस्तुत करने वाले अधिकांश हिस्टोलॉजिकल नमूने निर्धारण-एम्बेडिंग (मोम या राल) तकनीकों से उत्पन्न होते हैं, जिसके बाद माइक्रोटोम सेक्शनिंग होती है। इस तरह के दृष्टिकोणों का सफलतापूर्वक क्लबरूट पित्त में सक्रिय कई जीनों के लिए प्रमोटर गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था⁴^,⁵ या विभिन्न धुंधला तकनीकें किसके अवलोकन की सुविधा प्रदान करती हैं? P. brassicae जीवन-चक्र की प्रगति⁹. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फिक्सिंग और एम्बेडिंग चरण समय लेने वाले होते हैं और इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण बायोमोलेक्यूल्स (जैसे, लिपिड) आंशिक या पूर्ण रूप से धुल जाते हैं, जो कुछ अवलोकनों में काफी बाधा डालते हैं। हाल ही में P. brassicae मेजबान में जीवन चक्र की प्रगति को फ्लोरोसेंट इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) की मदद से देखा गया था, जिसमें एक सबाथ-प्रकार मेथिलट्रांसफेरेज़ (PbBSMT) जीन-विशिष्ट जांच का उपयोग बीजाणु गठन को चिह्नित करने के लिए किया गया था¹⁰. एक अच्छा विकल्प अन्य प्रतिदीप्ति-आधारित तरीकों का उपयोग है जहां कुछ सेलुलर घटकों की ऑटोफ्लोरेसेंस, फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों से जुड़े जीन के 5'- अपस्ट्रीम नियामक क्षेत्रों की गतिविधि, और विशेष फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन का संचय देखा जा सकता है। हालांकि, नमूनों की कम पारदर्शिता के अलावा, ऐसी वस्तुओं से जुड़ी एक बड़ी खामी अनिर्धारित नमूनों के साथ काम करना है, जो उस समय को काफी कम कर देता है जिसमें अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों को प्रलेखित किया जा सकता है। 2015 में, कुरिहारा एट अल।¹¹ एक समाशोधन अभिकर्मक विकसित किया, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संरक्षण की अनुमति देता है और पौधे के ऊतक नमूनों की पारदर्शिता को बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, यह कई हिस्टोलॉजिकल दाग के साथ संगत है। हाल ही में, पौधे के ऊतकों में विभिन्न सेल दीवार घटकों की कल्पना करने के लिए एक ही तकनीक को सफलतापूर्वक लागू किया गया था¹²^,¹³. यहां, इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न क्लबरूट पित्त विकास पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। वर्कफ़्लो पित्ताशय, विब्राटोम सेक्शनिंग, ऊतक समाशोधन, धुंधलापन और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के निर्धारण के साथ शुरू होता है। किसी की जरूरतों के आधार पर, सीधे या विशेष धुंधला होने के बाद, परिणामी वर्गों को एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण के अधीन किया जा सकता है। यह विधि जीन अभिव्यक्ति और शारीरिक प्रतिक्रियाओं में स्थानीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी समाधान प्रदान करती है, जिसमें फाइटोहार्मोन संतुलन और सिग्नलिंग शामिल है। आराम करने वाले बीजाणुओं और परिपक्वता गतिशीलता के वितरण पैटर्न को देखकर रोग की प्रगति को ट्रैक किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को आसानी से इमेजिंग विशेषता परिवर्तनों के लिए लागू किया जा सकता है P. brassicae संक्रमित पौधे, जिसमें जाइलोजेनेसिस का निषेध या मेजबान पौधे रक्षा प्रतिक्रियाएं प्रतिरोधी जीनोटाइप में स्थानीय लिग्निफिकेशन के रूप में दिखाई देती हैं। इस प्रोटोकॉल में उदाहरण साइट पर आयोजित इमेजिंग से आते हैं Arabidopsis thaliana नमूना; हालांकि, प्रोटोकॉल को अन्य फसल प्रजातियों से संबंधित अन्य फसल प्रजातियों पर भी लागू किया जा सकता है Brassicaceae परिवार। नीचे वर्णित विधि सेलुलर संरचनाओं और पित्त गठन के साथ आणविक परिवर्तनों के भविष्य के विस्तृत अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी P. brassicaeसंक्रमित पौधे।

प्रोटोकॉल का सामान्य वर्कफ़्लो काफी सीधा है, और पित्त विकास के सभी चरणों को आसानी से चित्रित और विशेषता दी जा सकती है (चित्रा 2)। चूंकि पी ब्रासिका एक मिट्टी जनित रोगज़नक़ है, इसलिए सभी प्रयोगों को मिट्टी आधारित प्रणालियों में किया जाना चाहिए। रोगज़नक़ अम्लीय स्थितियों को पसंद करता है; इसलिए, गैर-चूने-उपचारित मिट्टी सब्सट्रेट्स का उपयोग किया जाना चाहिए। हालांकि पी ब्रासिका मनुष्यों के लिए खतरा पैदा नहीं करता है, यह सख्ती से एक पौधे रोगज़नक़ है जो मिट्टी और पानी के माध्यम से फैल सकता है। इसलिए, संक्रमित पौधे के सभी हिस्सों, साथ ही मिट्टी को प्रयोग के बाद ऑटोक्लेविंग या ब्लीच के साथ उपचार द्वारा नष्ट करने की आवश्यकता होती है।

Protocol

1. पौधे की वृद्धि की स्थिति

एराबिडोप्सिस थैलियाना के पौधों को 22 डिग्री सेल्सियस पर 9 घंटे प्रकाश और 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 घंटे अंधेरे और 120 ^{μmol-2 s-1}की विकिरण के साथ एक अल्पकालिक प्रकाश व्यवस्था में उगाएं (प्रकाश संश्लेषक रूप से सक्रिय विकिरण के रूप में मापा जाता है, कैनोपी स्तर पर PAR, सामग्री तालिका देखें)।

2. बीजाणु इनोकुलम की तैयारी

नोट: विवरण के लिए, देखें Fuchs et ^al.14.

चीनी गोभी के पौधों से दो से तीन जमे हुए पित्ताशय (ब्रासिका रैपा वर पेकिनेंसिस कल्टीवेटर "ग्रैनाट") को एक ब्लेंडर में 300 एमएल ऑटोक्लेव्ड आसुत पानी युक्त करें और बाँझ धुंध की चार परतों के माध्यम से फ़िल्टर करें।
फिल्ट्रेट (6,000 x g पर, 5 मिनट के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर) को सेंट्रीफ्यूज करें और यांत्रिक रूप से स्पैटुला का उपयोग करके बीजाणु गोली से स्टार्च परत को हटा दें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि अधिकांश स्टार्च हटा न दिया जाए।
20 विभिन्न क्षेत्र क्षेत्रों में बीजाणुओं की संख्या की गणना करके हेमोसाइटोमीटर¹³ का उपयोग करके बीजाणु एकाग्रता का निर्धारण करें।
सुनिश्चित करें कि एराबिडोप्सिस थैलियाना के लिए उपयोग किए जाने वाले बीजाणु निलंबन की अंतिम सांद्रता 1 x 10⁶ बीजाणु-एमएल-1 है। अंकुरण के 20 दिन बाद प्रत्येक पौधे को 2 एमएल कैलिब्रेटेड बीजाणु निलंबन के साथ टीका लगाएं।

3. ऊतक तैयारी और निर्धारण

पौधे के ऊतक तैयार करें।
1. क्लबरूट-संक्रमित और गैर-संक्रमित पौधों की जड़ प्रणालियों से मिट्टी को सावधानीपूर्वक हटा दें। पानी के साथ अच्छी तरह से साफ करें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में हाइपोकोटिल और गॉल्स (0.5-2 सेमी के बीच की लंबाई) एकत्र करें।
नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पीएफए निर्धारण (4% पैराफॉर्मलडिहाइड, पीएफए 1x PBS + 0.01% Triton X-100 में) निष्पादित करें।
1. 65 डिग्री सेल्सियस पर हिलाकर पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड खारा, पीएच 7.4, तालिका 1) के 100 एमएल में 4 ग्राम पीएफए पाउडर (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें (उबालें नहीं)। लगभग 11 के पीएच के साथ एक स्पष्ट समाधान प्राप्त करने के लिए KOH (10 M और 1M) ड्रॉपवाइज का उपयोग करें।
2. पीएच को 6.9 तक_लानेके लिए एच 2 एसओ₄ के साथ समायोजित करें और निर्धारण में सुधार के लिए 0.01% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 जोड़ें। एलिकोट समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए (फिर से फ्रीज न करें) या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
ऊतक निर्धारण करें।
1. वैक्यूम पंप का उपयोग करके एक निरंतर वैक्यूम (700 एमबार) लागू करके कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीएफए फिक्सेटिव के 200-500 μL में नमूने ठीक करें। सुनिश्चित करें कि ऑब्जेक्ट पूरी तरह से पीएफए समाधान में डूबा हुआ है।
  नोट: नमूने 4 डिग्री सेल्सियस (फ्रिज) पर कुछ हफ्तों के लिए संग्रहीत किए जा सकते हैं और बाद में सेक्शनिंग के लिए उपयोग किए जा सकते हैं।

4. ऊतक एम्बेडिंग और सेक्शनिंग

गैर-संक्रमित हाइपोकोटिल और संक्रमित पित्ताशय के एगारोस एम्बेडिंग के लिए 4% डब्ल्यू / वी अगारोस का उपयोग करें। अगारोस को घोलने के लिए घोल उबालें और ठंडा होने पर इसे डालें जबकि यह अभी भी चिपचिपा है।
अतिरिक्त पीएफए को हटाने के लिए कुछ सेकंड के लिए एक ऊतक पर वस्तु को थोड़ा सुखाएं।
पौधे की वस्तु को सावधानीपूर्वक एम्बेड करने और अग्रोज करने के लिए टूथपिक्स / फोर्स का उपयोग करें। तिरछे वर्गों को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि वस्तु उन्मुख है और सही ढंग से ढाली गई है ताकि इसकी धुरी विब्राटोम ब्लेड (रेडियल वर्गों के लिए) के विमान के लंबवत हो।
एगारोस को ठोस बनाने में तेजी लाने के लिए, पेट्री या मल्टी-कल्चर प्लेट को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: यदि वस्तु बहुत बड़ी है (जैसा कि टीकाकरण के 21 दिनों के बाद एराबिडोप्सिस के बड़े पित्ताशय के मामले में [डीपीआई]), तो वस्तु को अगारोस में एम्बेड किए बिना भी वर्गीकृत किया जा सकता है।

5. विब्राटोम सेक्शनिंग

नोट: वाइब्रेटोम पौधे के अंगों / ऊतक के माध्यम से काटने के लिए एक कंपन रेजर ब्लेड से लैस है। कंपन गति, आयाम, ब्लेड का कोण, और अनुभाग मोटाई सभी पैरामीटर हैं जिन्हें समायोजित किया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

ब्लेड का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक एक अगारोस ब्लॉक के भीतर वस्तु को काटें और ढालें, सेक्शनिंग के लिए पसंदीदा अभिविन्यास को नोट करें।
साइनोएक्रिलेट/इंस्टेंट गोंद और मास्किंग टेप का उपयोग करके नमूना धारक पर इसे ठीक से माउंट करने के लिए अगारोस ब्लॉक/बड़े पित्ताशय को चिपकाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
एराबिडोप्सिस हाइपोकोटिल्स और पित्ताशय (प्रारंभिक चरणों) के लिए, अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए 30-40 μm के बीच अनुभागों की मोटाई रखें।
नोट: पित्त प्रगति के बाद के चरणों का विश्लेषण करने के लिए, वर्गों की मोटाई 50-80 μm के बीच हो सकती है।
पतले वर्गों को काटने से बचें क्योंकि यह चलती ब्लेड के कंपन के कारण पित्त के नमूने को नष्ट कर सकता है।
पित्ताशय की मोटाई और आकार (40 μm या 60 μm) के अनुसार अनुभागों, गति और कंपन आयाम के लिए मोटाई समायोजित करें।
पानी के स्नान में आसुत जल जोड़ें और सेक्शनिंग से शुरू करें।
फोर्स या ब्रश का उपयोग करके अनुभागों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें और उन्हें 1x PBS बफर (pH 7.4) के 1mL वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: आमतौर पर, कंपन आयाम जितना अधिक होता है, सेक्शनिंग गुणवत्ता उतनी ही बेहतर होती है। गैर-संक्रमित हाइपोकोटिल या पित्ताशय के लिए जिनमें परिपक्व आराम करने वाले बीजाणु नहीं होते हैं, कंपन आयाम को 0.60 मिमी -1 गति के साथ ^1.2 मिमी पर रखा जा सकता है। सेलुलर अखंडता के आंशिक नुकसान और बीजाणु परिपक्वता के दृश्यमान संकेतों के साथ बड़े पित्ताशय के मामले में, कंपन आयाम को 0.45 मिमी ^-1 गति के साथ 0.55 मिमी तक कम किया जाना चाहिए।

6. नमूना समाशोधन

माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से 1x PBS निकालें और समाशोधन समाधान के 200-500 μL जोड़ें (तालिका 1)।
अब से, नमूने को अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि ऑब्जेक्ट हमेशा हर समय क्लियरिंग समाधान में डूबे हुए हैं।
नमूना प्रसंस्करण के दौरान कुछ समय बाद क्लियरिंग समाधान को नए के साथ बदलें।
नोट: नमूना प्रसंस्करण के कारण समाशोधन समाधान का रंग पीला हो सकता है। ऐसे मामले में, ऊतकों की सफाई में सुधार के लिए समाधान को बदलने की सिफारिश की जाती है।

7. धुंधला प्रक्रिया

सेल की दीवारों के लिए कैल्कोफ्लोर सफेद धुंधला करने के लिए (पौधे की कोशिकाओं को हटाने के लिए), समाशोधन समाधान में कैल्कोफ्लोर सफेद दाग का 5% वी / वी तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अंधेरे में कम से कम 5 मिनट के लिए दाग।
नील रेड के साथ लिपिड को धुंधला करने के लिए (संक्रमित कोशिकाओं में बीजाणुओं और तेल की बूंदों को धुंधला करने के लिए), समाधान को साफ़ करने में स्टॉक का 1 मिलीग्राम / एमएल ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। 1:99 प्राप्त करने के लिए इसे और पतला करें। अंधेरे में कम से कम 10 मिनट के लिए दाग।
बेसिक फुचिन लिग्निन धुंधला करने के लिए, समाधान को साफ़ करने में दाग का 0.2% डब्ल्यू / वी तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अंधेरे में कम से कम 10 मिनट के लिए दाग।
नोट: डबल धुंधलापन के दौरान, नमूने पहले कैल्कोफ्लोर सफेद आवेदन से पहले 10 मिनट के लिए नील लाल से दाग दिए जाते हैं। प्रत्येक चरण के बाद अतिरिक्त धुंधला समाधान हटा दिया गया था। यदि वस्तु अधिक दाग वाली लगती है, तो समाशोधन समाधान से धोकर अतिरिक्त दाग को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो समाशोधन समाधान का उपयोग करके दाग को पतला करें। कैल्कोफ्लोर धुंधला होने से पहले नमूने को हमेशा नील लाल / बेसिक फुचिन के साथ दाग दें। कैल्कोफ्लोर के साथ पहले धुंधला करने से नील लाल द्वारा बीजाणुओं के उचित धुंधलापन को रोका जा सकता है।

8. माइक्रोस्कोपी

माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर साफ़ किए गए अनुभागों को माउंट करें और एक एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। नमूने को सूखने से रोकने के लिए बढ़ते माध्यम के रूप में समाशोधन समाधान का उपयोग करें।
एक साथ एक से अधिक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम इमेजिंग के लिए कई अधिग्रहण मोड का उपयोग करें।
नोट: प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा निम्नानुसार हैं: नील रेड 553/636 एनएम के लिए, जाइलम ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए 380/475 एनएम के लिए, बेसिक फुचिन 561/650 एनएम के लिए, कैल्कोफ्लोर व्हाइट के लिए 405/475 एनएम के लिए, ईआरआरएफपी 585/608 एनएम के लिए, और जीएफपी 488/509 एनएम के लिए (तालिका 2)।

Representative Results

नाइल रेड के साथ जो लिपिड और सुबेरिन पर दाग लगाता है, लिपिड युक्त रोगाणुओं को आराम देना संभव है (चित्रा 3 ए, बी)। इसलिए, डबल स्टेनिंग का उपयोग करके, पित्ताशय के भीतर रोगज़नक़ वितरण के पैटर्न को देखने के लिए कुरकुरा चित्र प्राप्त किए जा सकते हैं। कैल्कोफ्लोर सफेद के साथ काउंटरस्टेनिंग कंट्रास्ट बनाता है और पी ब्रासिका परिपक्वता (चित्रा 3 बी) के साथ जाइलम विकास को ट्रैक करने में मदद करता है।

जाइलम गठन और विकास को बिना दाग वाले नमूनों (चित्रा 4 ए) में ऑटोफ्लोरेसेंस का अवलोकन करके या बेसिक फ्यूचिन जैसे दाग का उपयोग करके भी जांचा जा सकता है जो लिग्निन के प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग को सक्षम करते हैं (चित्रा 4 बी)।

इस विधि का उपयोग करके, कोई जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन या विकास नियामकों की प्रतिक्रियाओं को ट्रैक कर सकता है। एक आदर्श उदाहरण यह है कि एराबिडोप्सिस पौधों का उपयोग पीएचसीए 2: ईआरआरएफपी निर्माण को बनाए रखने के लिए किया गया था ताकि क्लबरूट गॉल्स के भीतर फ्लोएम ऊतक में उच्च कैम्बियल गतिविधि 2 (एचसीए 2) जीन अभिव्यक्ति की कल्पना की जा सके। एचसीए 2 जीन गतिविधि पहले मेरिस्टेमेटिक रूप से सक्रिय कैम्बियम और फ्लोएम-वंश कोशिकाओं¹⁵ में पाई गई है। यहां, यह पी ब्रासिका-संचालित पित्त विकास के अंतिम चरणों में फ्लोएम के साथ सह-स्थानीयकरण करता है, और इसकी गतिविधि दर्शाती है कि पी ब्रासिका फ्लोएम जटिलता को कैसे बढ़ाता है (चित्रा 5)। परिणामी छवि पित्ताशय के विकास के अंतिम चरण में फ्लोएम प्रसार दिखाती है जब कैम्बियम खंडित हो जाता है। चित्रा 5 ए पित्ताशय के एक अस्पष्ट हाथ अनुभाग को दर्शाता है, जबकि चित्रा 5 बी ऊतक समाशोधन के बाद विब्राटोम सेक्शनिंग द्वारा प्राप्त अधिक कुरकुरा और स्थानीयकृत फ्लोरोसेंट संकेतों को दर्शाता है। वस्तुओं को कैल्कोफ्लोर सफेद के साथ प्रतिरक्षित किया गया था। चित्रा 6 इस छवि (चित्रा 6 बी) की तुलना 21 डीपीआई पर राल-एम्बेडेड और माइक्रोटोम-सेक्शन्ड गॉल्स (चित्रा 6 ए) में चित्रित एक समान क्षेत्र के साथ करता है। संक्रमित और गैर-संक्रमित पौधों के बीच विभेदक साइटोकिनिन प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन पित्ताशय के विकास में टीसीएस: जीएफपी (दो घटक सिग्नलिंग) मार्कर¹⁶ की अभिव्यक्ति की जांच करके किया गया था (चित्रा 7)। द्वितीयक मोटाई के साथ पित्त और ऊतकों में कमजोर जीएफपी संकेतों की इमेजिंग करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि परिपक्व जाइलम कोशिकाओं के ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण अतिरिक्त पृष्ठभूमि संकेत भी इमेजिंग के दौरान कैप्चर किया जाता है।

चित्र 1: प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका बीजाणुओं के साथ 26 डीपीआई पर तिलहन रेप (बी नेपस) और एराबिडोप्सिस थैलियाना (कोलंबिया -0) पर क्लबरूट रोग के लक्षण। रोग के दौरान, पूरे जड़ प्रणाली पर बड़े पित्ताशय विकसित होते हैं, जिससे यह बेहद भंगुर हो जाता है। यह भविष्य के संक्रमण को बढ़ावा देने के लिए आसपास की मिट्टी में बीजाणुओं को जारी करके समाप्त होता है। पौधे के शरीर के ऊपरी हिस्से भी खराब वृद्धि और विकास के संकेत दिखाते हैं। अंत में, संक्रमित पौधे विकास चयापचय और विकास पर विनाशकारी प्रभावों के शिकार हो जाते हैं जब जड़ प्रणाली पूरी तरह से क्षतिग्रस्त हो जाती है और पौधे अब बीमारी का सामना नहीं कर सकते हैं। स्केल बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। आईएनएफ का मतलब नकली टीका लगाया जाता है, जबकि +आईएनएफ का मतलब पी. ब्रासिका-टीकाकृत पौधों से है। इस अवसर पर, स्वस्थ जड़ प्रणालियों को प्रस्तुत करने के लिए मिट्टी हटाने से पहले तिलहन रेप पौधों की एक तस्वीर प्रदान की जाती है। धोने के बाद, केवल हाइपोकोटिल और जड़ का ऊपरी हिस्सा एकत्र किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2: सामान्य वर्कफ़्लो. धुले हुए एराबिडोप्सिस रूट सिस्टम (ए) विच्छेदित होते हैं, (बी) तय होते हैं, (सी) अगारोस एम्बेडेड, (डी) माउंटेड होते हैं, और (ई) वाइब्रेटोम पर विभाजित होते हैं। परिणामस्वरूप वस्तुओं को ऊतक समाशोधन (ऊतक प्रकार और मोटाई के आधार पर अंधेरे में आरटी में 3 दिन से कई सप्ताह) के अधीन किया जाता है। (एफ) साफ की गई वस्तुओं को तब माइक्रोस्कोप के तहत दाग और निरीक्षण किया जा सकता है। (जी) वर्कफ़्लो का सारांश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 3: रोगज़नक़ बीजाणुओं को नील लाल दाग के साथ चिह्नित करना( ए, बी) नील लाल छिद्रों में लिपिड को आराम करने में, जो पी ब्रासिका परिपक्वता को ट्रैक करने के लिए पूरी तरह से काम करता है। (ए) पी ब्रासिका द्वारा उपनिवेशित और रोगज़नक़ बीजाणुओं से भरी हुई बढ़ी हुई कोशिकाएं। (बी) परिपक्व जाइलम कोशिकाएं नील लाल से भी दागदार हो जाती हैं। मेजबान कोशिकाओं के परिव्यय को देखने के लिए अनुभाग को कैल्कोफ्लोर सफेद के साथ प्रतिरक्षित किया गया है (ए: उद्देश्य लेंस = 20x और अनुभाग मोटाई = 60 μm; बी: उद्देश्य लेंस = 5x और अनुभाग मोटाई = 60 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: जाइलम विकास और परिपक्वता की सीमा पर नज़र रखना। (ए) लिग्निन यूवी के साथ उत्तेजना पर मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस देता है; इसलिए, परिपक्व जाइलम को अपेक्षाकृत आसानी से भेदभाव किया जा सकता है। (बी) बेसिक फुचिन और कैल्कोफ्लोर के साथ डबल धुंधलापन बेहतर परिणाम देता है क्योंकि सभी कोशिकाएं बाद की डाई से दागदार हो जाती हैं, जबकि परिपक्व जाइलम को बेसिक फ्यूचिन के साथ स्पष्ट रूप से दाग दिया जाता है। इस तरह, डबल स्टेनिंग बेहतर कंट्रास्ट के साथ छवियां प्रदान करता है जो जाइलोजेनेसिस के ध्यान देने योग्य अवरोध को दर्शाता है (ए: उद्देश्य लेंस = 10x और अनुभाग मोटाई = 60 μm; बी: उद्देश्य लेंस = 10x और अनुभाग मोटाई = 60 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5: 21 डीपीआई पर पी ब्रासिका-संक्रमित पौधों के हाइपोकोटिल में एचसीए 2 जीन के लिए फ्लोएम-विशिष्ट संकेत। प्रोएचसीए 2 के लिए प्रमोटर गतिविधि: ट्रांसजेनिक एराबिडोप्सिस थैलियाना को आश्रय देने वाले ईआरआरएफपी को (ए) और (बी) में देखा जा सकता है। पैनल (ए) में एक गैर-साफ़ हाथ अनुभाग के बीच अंतर देखा जा सकता है जहां ईआरआरएफपी सिग्नल सुपरइम्पोजिशन और ओवरलैपिंग सेल परतों के कारण फैला हुआ दिखाई देता है, खासकर असमान हाथ वर्गों में। दूसरी ओर, (बी) ऊतक-समाशोधन के बाद एक विब्राटोम अनुभाग दिखाता है जहां ईआरआरएफपी सिग्नल एक परिपक्व संवहनी बंडल में फ्लोएम कोशिकाओं को सटीक रूप से चिह्नित करता है (उद्देश्य लेंस = 20x और अनुभाग मोटाई = 60 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 6: प्रतिदीप्ति की सहायता से TB, राल-एम्बेडेड और माइक्रोटोम-सेक्शन वाले पित्ताशय के बीच तुलना। (A) टोलुइडिन ब्लू (TB), राल-एम्बेडेड, और माइक्रोटोम-सेक्शनेड गॉल्स की छवियों के बीच तुलना, और (B) एक प्रतिनिधि वस्तु ( चित्र 5B में भी प्रस्तुत) को प्रतिदीप्ति की सहायता से प्राप्त किया गया। जाइलम कोशिकाओं को पीले तारांकन के साथ लेबल किया जाता है, ज्वलंत हरे कोष्ठक के साथ कैम्बियल क्षेत्र, सियान तारांकन के साथ फ्लोएम, और सफेद पीबी प्रतीक के साथ प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका-उपनिवेशित कोशिकाएं। राल-एम्बेडेड अनुभाग (ए) अतिवृद्धि अंगों में आराम करने वाले बीजाणुओं के वितरण, रोग की प्रगति की डिग्री और प्रतिरोधी पौधों में स्थानीय लिग्निफिकेशन जैसी अन्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा संकल्प प्रदान करते हैं। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल (बी) जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन संचय के संवेदनशील अवलोकन और अन्य शारीरिक परिवर्तनों और लिपिड (बीजाणुओं में) जैसे महत्वपूर्ण अणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7: 16 डीपीआई पर गैर-संक्रमित (-आईएनएफ) और पी ब्रासिका-संक्रमित (+आईएनएफ) एराबिडोप्सिस पौधों के हाइपोकोटिल में साइटोकिनिन सिग्नलिंग प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करना। टीसीएस:: जीएफपी मार्कर का उपयोग प्लांटा साइटोकिनिन प्रतिक्रियाओं में विशेषता के लिए किया गया था। विब्राटोम वर्गों को कैल्कोफ्लोर सफेद के साथ धुंधला करने के बाद उपचार को साफ़ करने के अधीन किया गया था। छवि के आधार पर, 16 डीपीआई पर, साइटोकिनिन प्रतिक्रियाएं संक्रमित पित्ताशय (दाएं पैनल) में काफी हद तक कम हो जाती हैं, जबकि वे मजबूत रहते हैं, विशेष रूप से फ्लोएम पूल (कोशिकाएं जो अंततः फ्लोएम ऊतक बनाने के लिए अंतर करेंगी), गैर-संक्रमित पौधों (बाएं पैनल) में (उद्देश्य लेंस = 5x और मोटाई = 30 μm)। जाइलम ऑटोफ्लोरेसेंस के कुछ स्तर भी दिखाई दे सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क्लियरिंग समाधान (विषाक्त)
घटक	प्रतिशत (%)	100 एमएल आसुत जल में
Xylitol	10%	10 ग्राम
सोडियम डीऑक्सीकोलेट	15%	15g
यूरिया	25%	25g
10x PBS (फॉस्फेट बफर्ड खारा)		1x PBS (100 mL)
NaCl	8 ग्राम	10 एमएल 10x PBS + 90 mL आसुत जल
KCl	0.2 ग्राम
केएच₂पीओ₄	0.24 ग्राम
Na₂HPO₄ · 2H₂O	1.81 ग्राम
आसुत जल	100 mL
पीएच	hCl का उपयोग करके pH को 7.4 में समायोजित किया गया
आटोक्लेव और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

तालिका 1: क्लियरिंग समाधान और फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) की संरचना।

फ्लोरोसेंट दाग /	उत्तेजना/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य	माइक्रोस्कोप फ़िल्टर सेट का उपयोग किया गया
नील लाल	553/636 एनएम	फ़िल्टर सेट 43
जाइलम ऑटोफ्लोरेसेंस	380/475 एनएम	फ़िल्टर सेट 49
कैल्कोफ्लोर व्हाइट	405/475 एनएम	फ़िल्टर सेट 49
बेसिक फुचिन	561/650 एनएम	फ़िल्टर सेट 43
erRFP	585/608 एनएम	फ़िल्टर सेट 43
GFP	488/509 एनएम	फ़िल्टर सेट 38

तालिका 2: वर्तमान अध्ययन के लिए चयनित उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा।

Discussion

पित्ताशय के विब्राटोम-कट वर्गों पर समाशोधन समाधान लागू करना निश्चित रूप से पी ब्रासिका और मेजबान पौधे के बीच बायोट्रोफिक इंटरैक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को बढ़ाता है। यद्यपि क्लियरिंग प्रोटोकॉल हाथ के वर्गों पर भी लागू होता है, यह विब्राटोम अनुभागों के साथ बेहतर काम करता है। पीएफए फिक्सेटिव में नमूने ठीक करना प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में कार्य करता है क्योंकि नमूने तब सेक्शनिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। यह निर्धारण के दौरान फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति और संरक्षण से समझौता किए बिना सीमित अवधि के लिए नमूने स्टोर करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है।

नील रेड (डीएमएसओ या मेथनॉल में) अपनी हाइड्रोफोबिसिटी के कारण राल वर्गों के साथ असंगत है, जो राल को भंग कर देता है और राल-एम्बेडेड अनुभाग¹⁷ को नष्ट कर देता है। इस प्रकार, वाइब्रेटोम अनुभाग विकासशील पित्ताशय के भीतर रोगज़नक़ वितरण और इसके जीवन-चक्र का अध्ययन करने के लिए सहायक साबित होते हैं, जिसमें नील लाल धुंधलापन आसानी से उपयोग किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला समाशोधन समाधान^{अत्यधिक बहुमुखी} है, जिससे सेल की दीवारों के विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स / घटकों (सुबेरिन, लिग्निन, सेल्यूलोज और फंगल इंटरैक्शन में चिटिन) को दागने के लिए विभिन्न संयोजनों में विभिन्न प्रकार के फ्लोरेसेंस दाग का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट जीएफपी मार्कर लाइनों के काउंटरस्टेन वर्गों को भी संभव है और इस प्रकार विशेष कोशिकाओं या पित्ताशय के क्षेत्रों में रोगज़नक़ की उपस्थिति के साथ प्रमोटर गतिविधि या प्रोटीन संचय पैटर्न को सहसंबंधित करना संभव है। हालांकि, जाइलम और रोगज़नक़ से भरे विशाल कोशिकाओं से पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस को समाशोधन प्रोटोकॉल के बाद भी समाप्त नहीं किया जा सका। यह पित्ताशय के गठन के बाद के चरणों के दौरान फ्लोरोसेंट मार्करों को देखने के लिए एक सीमा प्रस्तुत करता है, खासकर जब एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं और कमजोर संकेतों की इमेजिंग करते हैं।

फ्लोरोसेंट संकेतों की अभिव्यक्ति / संचय के निम्न स्तर के कारण, प्रतिलेखन कारकों का पता लगाना मुश्किल है, लेकिन, इस तकनीक के साथ, उनके लिए संतोषजनक चित्र प्राप्त करना संभव है। कुल मिलाकर, ऊतक-समाशोधन दृष्टिकोण के साथ विब्राटोम सेक्शनिंग का संयोजन जटिल पित्त ऊतकों के हिस्टोलॉजिकल अवलोकनों के लिए टूलकिट का विस्तार करता है। इस प्रोटोकॉल का लचीलापन ऊतक निर्धारण की प्रक्रिया को आसान बनाता है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रमोटर गतिविधियों का निरीक्षण करने के लिए ताजा ऊतक नमूनों को काटने और इमेजिंग करने के लिए आवश्यक समय को कम करता है। आगे के सुधारों के साथ और विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स के लिए विशिष्ट अन्य फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके, यह विधि हिस्टोलॉजिकल अध्ययन और जटिल ऊतक संगठन के साथ घने, अपारदर्शी ऊतकों के छवि विश्लेषण में अधिक प्रगति को चिह्नित करेगी। हाल के दिनों में, प्रस्तुत ऊतक समाशोधन विधि विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों^11,12,13 के एक साथ अधिग्रहण को संयोजित और सक्षम करने के लिए एक लोकप्रिय और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के रूप ^में उभरी है। ऐसी तकनीकों में भविष्य के विकास और संशोधन सेलुलर स्तर पर पौधे-रोगज़नक़ इंटरैक्शन को देखने के लिए छवि संकल्प में काफी सुधार करेंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस सेंटर पोलैंड ओपस 17 अनुदान संख्या 2019/33/बी/एनजेड9/00751 " प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा संक्रमित पौधों में लंबी दूरी के संवहनी समन्वय" द्वारा समर्थित किया गया था। हम प्रोएचसीए 2: : ईआरआरएफपी लाइन साझा करने के लिए प्रोफेसर यर्जो हेलारिट्टा (सैन्सबरी प्रयोगशाला, कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2N Sulfuric acid (H₂SO₄)	Roth	UN2796	pH adjustment
Agarose	PRONA	BGQT100	Embedding
Basic Fuchsin	BIOSHOP	BSF410.5	Fluorescent dye
Calcofluor White	Sigma Aldrich	18909-100ML-F	Fluorescent dye
Commercial Bleach	Domestos
Cyanoacrylate/ Instant glue	Kropelka		Adhesive
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	BIOSHOP	DMS555.500	Solvent
Epifluorescence microscope	Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system	Carl Zeiss M2	Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used
Fully automated Vibratome	Leica	VT1200 S
Lightmeter /Photometer	LI-COR Biosciences	LI-250A + LI-190R quantum sensor	For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband
Masking tape			For sticking agarose block on mould
Murashige & Skoog Medium (MS Medium)	Duchefa Biochemie	MO222.0050	Plant Growth Medium
Nile Red	Sigma Aldrich	N3013-100MG	Fluorescent dye
Paraformaldehyde PFA	Sigma Aldrich	158127-100G	Fixative
Potassium Chloride (KCl)	POCH	739740114	PBS component
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	P1767-250G	pH adjustment
Potassium Phosphate Monobasic (KH₂PO₄)	BIOSHOP	PPM302.500	PBS component
Sodium chloride (NaCl)	BIOSHOP	SOD001.1	PBS component
Sodium Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-25G	Clearing Solution
Sodium Phosphate Dibasic (Na₂HPO₄ · 2H₂O)	POCH	799490116	PBS component
Triton X-100	BIOSHOP	TRX506.100	Fixative
Urea	Sigma Aldrich	U5378-100G	Clearing Solution
Vacuum/Pressure pump and Dessicator	Welch by Gardner Denver	2522C-02	For Vacuum Infilteration
Xylitol	Sigma Aldrich	X3375-25G	Clearing Solution (componenet)