Summary
Detta protokoll beskriver en optimerad metod för histologisk observation av gallor inducerade av Plasmodiophora brassicae. Vibratomsektioner av hypokotyler rensas före fluorescensavbildning för att studera involvering av transkriptionsfaktorer och fytohormoner under sjukdomsprogression. Detta protokoll övervinner hartsinbäddningsbegränsningar, vilket möjliggör visualisering av fluorescerande proteiner i planta .
Abstract
Infektion av Brassica-grödor av den jordburna protisten Plasmodiophora brassicae leder till gallbildning på de underjordiska organen. Bildandet av galls kräver cellulär omprogrammering och förändringar i metabolismen hos den infekterade växten. Detta är nödvändigt för att upprätta en patogenorienterad fysiologisk sänka mot vilken värdnäringsämnena omdirigeras. För en fullständig förståelse av denna speciella växt-patogeninteraktion och de mekanismer genom vilka värdtillväxt och utveckling undergrävs och remönstered, är det viktigt att spåra och observera de interna förändringarna som åtföljer gallbildning med cellulär upplösning. Metoder som kombinerar fluorescerande fläckar och fluorescerande proteiner används ofta för att studera anatomiska och fysiologiska svar i växter. Tyvärr fungerar den stora storleken på gallor och deras låga transparens som stora hinder för att utföra helmonterade observationer under mikroskopet. Dessutom begränsar låg transparens användningen av fluorescensmikroskopi för att studera klubbrotsjukdomsprogression och gallbildning. Denna artikel presenterar en optimerad metod för fixering och rensning av gallor för att underlätta epifluorescens och konfokalmikroskopi för inspektion av P. brassicae-infekterade gallor. Ett vävnadsrensningsprotokoll för snabb optisk clearing användes följt av vibratomsektionering för att detektera anatomiska förändringar och lokalisera genuttryck med promotorfusioner och reporterlinjer märkta med fluorescerande proteiner. Denna metod kommer att visa sig vara användbar för att studera cellulära och fysiologiska svar i andra patogenutlösta strukturer i växter, såsom nematodinducerad syncytia och rotknutar, samt bladgaller och deformationer orsakade av insekter.
Introduction
Växter som påverkas av patogener eller insekter kan utveckla onormala strukturer (organdeformationer eller galls), vilket gör det möjligt för inkräktaren att inta näringsämnen och reproducera1. Här genomfördes ett effektivt histopatologiskt tillvägagångssätt för att studera de förändringar som sker i galls som utvecklas på de underjordiska delarna av växter infekterade med protisten Plasmodiophora brassicae (Figur 1). Den mindre tråden i samband med denna patogen framgår av det faktum att P. brassicae vilande sporer kan behålla sin förmåga att invadera växter i många år. Vid storskalig odling av raps (Brassica napus) är detta ett allvarligt problem eftersom ekonomiska faktorer begränsar växtföljden, vilket leder till vilande sporansamling i jorden2. Rapsens resistens mot klubbrotssjukdom orsakad av P. brassicae är genetiskt bestämd. Tyvärr överlistar patogenen ofta resistens på grund av dess biologi och den smala genetiska poolen från vilken raps härstammar. Därför har det blivit relevant att studera svaren efter infektion hos värdväxter och deras förmåga att bromsa sjukdomsprogressionen eller förhindra att vissa symtom utvecklas.
Vid clubroot-sjukdom utvärderas svårighetsgraden i allmänhet baserat på utvecklingen av galls och graden av rotsystemskada. Detta är känt som Disease Index-DI3. Det fångar emellertid inte helt den sanna bedömningen av denna växt-patogeninteraktion. I synnerhet tar det inte upp hur patogenen fördelas i rötterna och om växten kan begränsa P. brassicae rörelse i dess vävnader. Vidare är det inte lätt att förutse i vilken utsträckning P. brassicae omprogrammerar underjordisk organanatomi. Studier på modellanläggningen Arabidopsis thaliana har visat att P. brassicae infektion leder till hämning av xylogenes (både initierings- och mognadsstegen) och förbättring av floemdifferentiering inom galls4,5. Dessutom, i rötter och hypokotyler av infekterade växter, slutar kambialcellavkomman inte det mitotiska tillståndet och sprider sig längre än i friska växter6. Denna process styr gallens slutliga storlek och bestämmer antalet patogen vilande sporer som produceras inom den infekterade växten. P. brassicae-driven utvecklings-, metabolisk och fysiologisk omprogrammering i värden är mycket komplex7; Därför är tillämpningen av verktyg som möjliggör inspektion av interna förändringar inom galls avgörande för att korrekt bedöma denna interaktion. Livscykelprogressionen för P. brassicae åtföljs av omprogrammering av värdcellmetabolismen, som kan observeras som stärkelse eller lipidavsättning7,8. Det största hindret för en framgångsrik mikroskopi av galls kommer från deras låga transparens. På grund av detta härstammar majoriteten av histologiska exemplar som presenterar klubbrotdrivna förändringar inom galls från fixerings-inbäddningstekniker (vax eller harts) följt av mikrotomsektionering. Sådana tillvägagångssätt användes framgångsrikt för att lokalisera promotoraktiviteten för många gener som är aktiva i klubbrotgaller4,5 eller olika färgningstekniker som underlättar observationen av P. brassicae livscykelprogression9. Det måste dock noteras att fixerings- och inbäddningsstegen är tidskrävande och resulterar i partiell eller fullständig tvättning av viktiga biomolekyler (t.ex. lipider), vilket avsevärt hindrar vissa observationer. Nyligen P. brassicae livscykelprogression i värden visualiserades med hjälp av Fluorescerande In Situ Hybridization (FISH), där ett metyltransferas av SABATH-typ (PbBSMT) genspecifik sond användes för att markera vilande sporbildning10. Ett bra alternativ är användningen av andra fluorescensbaserade metoder där autofluorescensen hos vissa cellulära komponenter, aktiviteten hos 5'- uppströms reglerande regioner av gener smälta till fluorescerande proteinmarkörer och ackumuleringen av vissa fluorescerande märkta proteiner kan ses. Förutom provernas låga transparens arbetar emellertid en stor nackdel med sådana objekt med ofixerade prover, vilket avsevärt minskar den tid då bilder av god kvalitet kan dokumenteras. År 2015, Kurihara et al.11 utvecklat ett clearingreagens som möjliggör bevarande av fluorescerande proteiner och ökar transparensen hos växtvävnadsprover. Dessutom är den kompatibel med många histologiska fläckar. Nyligen tillämpades samma teknik framgångsrikt för att visualisera olika cellväggskomponenter i växtvävnader12,13. Här har detta protokoll använts för att analysera olika klubbrotsgallutvecklingsaspekter. Arbetsflödet börjar med fixering av galls, vibratomsektionering, vävnadsrensning, färgning och fluorescensavbildning. Beroende på ens behov, direkt eller efter särskild färgning, kan de resulterande sektionerna utsättas för inspektion under ett epifluorescens eller konfokalmikroskop. Denna metod ger en effektiv lösning för att studera lokala förändringar i genuttryck och fysiologiska svar, inklusive fytohormonbalans och signalering. Sjukdomsprogression kan spåras genom att titta på fördelningsmönstret för vilosporer och mognadsdynamik. Dessutom kan protokollet enkelt tillämpas för avbildning av karakteristiska förändringar inom P. brassicae infekterade växter, inklusive hämning av xylogenes eller värdväxtens försvarssvar synliga som lokal lignifiering i resistenta genotyper. Exempel i detta protokoll kommer från avbildning som utförs på Arabidopsis thaliana modell; protokollet kan dock även tillämpas på andra arter av grödor som tillhör Brassicaceae familj. Metoden som beskrivs nedan kommer att underlätta framtida detaljerade studier av cellulära strukturer och molekylära förändringar som åtföljer gallbildning i P. brassicae-infekterade växter.
Protokollets allmänna arbetsflöde är ganska enkelt, och alla stadier av gallutveckling kan enkelt avbildas och karakteriseras (figur 2). Eftersom P. brassicae är en jordburen patogen måste alla experiment utföras i jordbaserade system. Patogenen föredrar sura förhållanden; Därför måste icke-kalkbehandlade jordsubstrat användas. Även om P. brassicae inte utgör ett hot mot människor, är det strikt en växtpatogen som kan spridas genom mark och vatten. Därför måste alla delar av den infekterade växten, liksom jorden, förstöras efter experimentet genom autoklavering eller genom behandling med blekmedel.
Protocol
1. Växttillväxtförhållanden
- Odla Arabidopsis thaliana-växter i en kortdagsljusregim med 9 timmars ljus vid 22 °C och 15 timmar mörkt vid 20 °C och en bestrålning på 120 μmol·m−2s−1 (mätt som den fotosyntetiskt aktiva strålningen, PAR på baldakinnivå, se materialförteckning).
2. Beredning av sporinokulum
OBS: För mer information, se Fuchs et al.14.
- Homogenisera två till tre frysta galls från kinesiska kålväxter (Brassica rapa var. pekinensis cultivar "Granaat") i en mixer som innehåller 300 ml autoklaverat destillerat vatten och filtrera genom fyra lager steril gasbindning.
- Centrifugera filtratet (vid 6 000 x g, i 5 minuter och vid 4 °C) och avlägsna stärkelseskiktet mekaniskt från sporpelleten med hjälp av en spatel. Upprepa denna process tills det mesta av stärkelsen har tagits bort.
- Bestäm sporkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer13 genom att räkna antalet sporer i 20 olika fältområden.
- Se till att den slutliga koncentrationen av sporsuspension som används för inokulering är 1 x 106 sporer·ml−1 för Arabidopsis thaliana. Inokulera varje växt 20 dagar efter spiring med 2 ml kalibrerad sporsuspension.
3. Vävnadsberedning och fixering
- Förbered växtvävnaden.
- Ta försiktigt bort jord från rotsystemen hos klubbrotinfekterade och icke-infekterade växter. Rengör noggrant med vatten och samla hypokotyler och galls (längd mellan 0,5-2 cm) i mikrocentrifugrör.
- Utför PFA-fixering (4% paraformaldehyd, PFA i 1x PBS + 0,01% Triton X-100) enligt stegen nedan.
- Tillsätt 4 g PFA-pulver (se materialtabell) till 100 ml PBS (fosfatbuffrad saltlösning, pH 7.4, tabell 1) under omrörning vid 65 °C (koka inte). Använd KOH (10 M och 1M) droppvis för att få en klar lösning med ett pH på cirka 11.
- Justera pH medH2S04för att få ner det till 6,9 och tillsätt 0,01 % (v/v) Triton X-100 för att förbättra fixeringen. Alikvotera lösningen som ska förvaras vid −20 °C (frys inte in igen) eller förvaras vid 4 °C.
- Utför vävnadsfixering.
- Fixera proverna i 200–500 μl PFA-fixeringsmedel i 1 timme vid rumstemperatur genom att applicera ett konstant vakuum (700 mbar) med hjälp av en vakuumpump. Se till att objektet är helt nedsänkt i PFA-lösningen.
OBS: Proverna kan förvaras i några veckor vid 4 °C (kylskåp) och användas senare för sektionering.
- Fixera proverna i 200–500 μl PFA-fixeringsmedel i 1 timme vid rumstemperatur genom att applicera ett konstant vakuum (700 mbar) med hjälp av en vakuumpump. Se till att objektet är helt nedsänkt i PFA-lösningen.
4. Vävnadsinbäddning och sektionering
- Använd 4% w / v agaros för agaros inbäddning av icke-infekterade hypokotyler och infekterade gallor. Koka lösningen för att lösa upp agaros och häll den när den svalnar medan den fortfarande är viskös.
- Torka föremålet något på en vävnad i några sekunder för att ta bort överskott av PFA.
- Använd tandpetare/tång för att noggrant bädda in och orientera växtobjektet i agaros. För att förhindra sneda sektioner, se till att objektet är orienterat och gjutet korrekt så att dess axel är vinkelrät mot vibratombladets plan (för radiella sektioner).
- För att påskynda agarosförstärkning, placera petri- eller multikulturplattan vid 4 ° C i 10 minuter.
OBS: Om objektet är för stort (som i fallet med större galls av Arabidopsis vid 21 dagar efter inokulering [DPI]) kan objektet sektioneras även utan inbäddning i agaros.
5. Vibratomsektionering
OBS: Vibratomet är utrustat med ett vibrerande rakblad för att skära igenom växtorgan / vävnad. Vibrationshastigheten, amplituden, bladets vinkel och sektionstjocklek är alla parametrar som kan justeras (se Materialförteckning).
- Använd ett blad, skär och forma försiktigt föremålet i ett agarosblock och notera den föredragna orienteringen för sektionering.
- Fäst agarosblocket/den stora gallan för att montera den ordentligt på provhållaren med cyanoakrylat/snabblim och maskeringstejp (se Materialförteckning).
- För Arabidopsis hypokotyler och galls (tidiga stadier), håll tjockleken på sektionerna mellan 30-40 μm för att få bilder av god kvalitet.
OBS: För att analysera de senare stadierna av gallprogression kan tjockleken på sektionerna vara mellan 50-80 μm. - Avstå från att skära tunnare sektioner eftersom det kan förstöra gallprovet på grund av vibrationerna i det rörliga bladet.
- Justera tjockleken för sektioner, hastighet och vibrationsamplitud enligt gallens tjocklek och storlek (40 μm eller 60 μm).
- Tillsätt destillerat vatten till vattenbadet och börja med sektionering.
- Samla försiktigt upp sektioner med pincett eller borste och överför dem till ett mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml 1x PBS-buffert (pH 7,4).
OBS: Vanligtvis, ju högre vibrationsamplitud, desto bättre sektionskvalitet. För icke-infekterade hypokotyler eller galls som inte innehåller mogna vilosporer kan vibrationsamplituden hållas vid 1,2 mm med 0,60 mm · s − 1 hastighet. Vid stora galls med partiell förlust av cellulär integritet och synliga tecken på spormognad bör vibrationsamplituden minskas till 0,55 mm med 0,45 mm·s−1 hastighet.
6. Rensning av prover
- Ta bort 1x PBS från mikrocentrifugröret och tillsätt 200-500 μL clearinglösning (tabell 1).
- Från och med nu, förvara proverna vid rumstemperatur i mörkret. Se till att objekten alltid är nedsänkta i rensningslösningen hela tiden.
- Byt ut rensningslösningen mot den nya om dess färg ändras efter en tid under provbearbetningen.
OBS: Färgen på clearinglösningen kan bli gulaktig på grund av provbehandling. I ett sådant fall rekommenderas att ersätta lösningen för att förbättra rensningen av vävnader.
7. Färgningsförfarande
- För Calcofluor vit färgning för cellväggarna (för utläggning av växtceller), förbered 5% v / v Calcofluor vit fläck (se materialtabell) i clearinglösningen. Fläcka i minst 5 min i mörkret.
- För färgning av lipider med Nile Red (för färgning av vilosporer och oljedroppar i infekterade celler), förbered 1 mg / ml av beståndet (se materialtabell) i clearinglösning. Späd det ytterligare för att få 1:99. Fläcka i minst 10 min i mörkret.
- För basisk Fuchsin-ligninfärgning, förbered 0,2% w / v av fläcken (se materialtabell) i clearinglösning. Fläcka i minst 10 min i mörkret.
OBS: Under dubbel färgning färgas proverna först med Nile Red i 10 minuter före applicering av Calcofluor white. De överflödiga färgningslösningarna avlägsnades efter varje steg. Om föremålet verkar överansträngt, ta bort överflödig fläck genom att tvätta med rensningslösningen. Späd fläckar med clearinglösningen, om det behövs. Färga alltid provet med Nile Red/Basic Fuchsin före Calcofluorfärgning. Färgning först med Calcofluor kan förhindra korrekt färgning av sporerna av Nile Red.
8. Mikroskopi
- Montera rensade sektioner på mikroskopiglaset och observera under en epifluorescens eller ett konfokalmikroskop (se materialförteckning). Använd röjningslösning som monteringsmedium för att förhindra torkning av provet.
- Använd flera förvärvslägen för avbildning av mer än ett fluorescensspektrum samtidigt.
ANMÄRKNING: De excitations-/emissionsspektra som används i det presenterade protokollet är följande: för Nilen Red 553/636 nm, för xylemautofluorescens 380/475 nm, för Basic Fuchsin 561/650 nm, för Calcofluor white 405/475 nm, för erRFP 585/608 nm och för GFP 488/509 nm (tabell 2).
Representative Results
Med Nile Red som fläckar lipider och suberin är det möjligt att se patogenens vilande sporer som innehåller lipider (figur 3A, B). Därför, med hjälp av dubbel färgning, kan skarpa bilder erhållas för att titta på mönstret för patogenfördelning inom galls. Motfärgning med Calcofluor white skapar kontrast och hjälper till att samtidigt spåra xylemutveckling med P. brassicae-mognad (figur 3B).
Xylems bildning och utveckling kan också kontrolleras genom att observera autofluorescens i ostoppade prover (figur 4A) eller genom att använda fläckar som Basic Fuchsin som möjliggör fluorescensbaserad avbildning av lignin (figur 4B).
Genom att använda denna metod kan man spåra genuttrycksförändringar eller svar på tillväxtregulatorer. Ett perfekt exempel är där Arabidopsis-växter som hyser pHCA2: erRFP-konstruktion användes för att visualisera HIGH CAMBIAL ACTIVITY 2 (HCA2) genuttryck i floemvävnad inom klubbrotgaller. HCA2-genaktivitet har tidigare hittats i meristematiskt aktiva kambium- och floem-härstamningsceller15. Här lokaliseras den tillsammans med floemet i de sena stadierna av P. brassicae-driven gallutveckling, och dess aktivitet återspeglar hur P. brassicae ökar floemkomplexiteten (figur 5). Den resulterande bilden visar floemproliferation i det sena stadiet av gallutveckling när kambiumet blir fragmenterat. Figur 5A visar en oklar handdel av gallan, medan figur 5B visar mer skarpa och lokaliserade fluorescerande signaler erhållna genom vibratomsektionering följt av vävnadsrensning. Föremålen motarbetades med Calcofluor white. I figur 6 jämförs denna bild (figur 6B) med ett liknande område som avbildas i hartsinbäddade och mikrotomsektionerade galler (figur 6A) vid 21 DPI. Differentiella cytokininsvar mellan infekterade och icke-infekterade växter bedömdes genom att kontrollera uttrycket av TCS: GFP -markören (Two Component Signalling)16 vid utveckling av galls (figur 7). Vid avbildning av svaga GFP-signaler i galler och vävnader med sekundära förtjockningar är det viktigt att notera att ytterligare bakgrundssignal på grund av autofluorescens av mogna xylemceller också fångas upp under avbildning.
Figur 1: Symtom på klubbrotssjukdom på raps (B. napus) och Arabidopsis thaliana (Columbia-0) vid 26 DPI med Plasmodiophora brassicae-sporer . Under sjukdomsförloppet utvecklas stora galls på hela rotsystemet, vilket gör det extremt sprött. Det avslutas med att släppa sporer i den omgivande jorden för att främja framtida infektioner. De övre delarna av växtkroppen visar också tecken på dålig tillväxt och utveckling. Slutligen ger de infekterade växterna efter för de förödande effekterna på tillväxtmetabolism och utveckling när rotsystemet blir helt skadat och växten inte längre kan hantera sjukdomen. Skalstången representerar 1 cm. -INF står för mock-inoculated, medan +INF står för P. brassicae-inokulerade växter. Vid detta tillfälle tillhandahålls en bild av rapsplantor före markavlägsnandet för att presentera friska rotsystem. Efter tvättning samlas endast hypokotyl och övre delen av roten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Det allmänna arbetsflödet. Tvättade Arabidopsisrotsystem är (A) dissekerade, (B) fixerade, (C) agaros inbäddade, (D) monterade och (E) sektionerade på vibratomet. De resulterande föremålen utsätts för vävnadsrensning (3 dagar till flera veckor vid RT i mörkret, beroende på vävnadstyp och tjocklek). (F) Rensade föremål kan sedan färgas och inspekteras under mikroskopet. (G) Sammanfattning av arbetsflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Märkning av patogensporer med Nilen Röd fläck. (A,B) Nilen Röd fläckar lipider i vilosporer, vilket fungerar perfekt för att spåra P. brassicae mognad. (A) Förstorade celler koloniserade av P. brassicae och fyllda med patogensporer. (B) Mogna xylemceller färgas också av Nile Red. Sektionen har motarbetats med Calcofluor white för att se utlägget av värdceller (A: Objektivlins = 20x och sektionstjocklek = 60 μm; B: Objektivlins = 5x och sektionstjocklek = 60 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Spåra omfattningen av xylemutveckling och mognad. (A) Lignin ger stark autofluorescens vid excitation med UV; Därför kan mogen xylem diskrimineras relativt enkelt. (B) Dubbelfärgning med Basic Fuchsin och Calcofluor ger bättre resultat eftersom alla celler färgas av det senare färgämnet, medan mogen xylem är tydligt färgad med Basic Fuchsin. På detta sätt ger dubbelfärgning bilder med förbättrad kontrast som visar märkbar hämning av xylogenes (A: Objektivlins = 10x och sektionstjocklek = 60 μm; B: Objektivlins = 10x och sektionstjocklek = 60 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Phloem-specifik signal för HCA2-genen i hypokotyler hos P. brassicae-infekterade växter vid 21 DPI. Promotoraktivitet för proHCA2::erRFP som hyser transgen Arabidopsis thaliana kan ses i (A) och (B). Skillnader kan observeras mellan en icke-rensad handsektion i panel (A) där erRFP-signalen verkar diffus på grund av superimposition och överlappande cellskikt, särskilt i ojämna handsektioner. Å andra sidan visar (B) en vibratomsektion efter vävnadsrensning där erRFP-signalen exakt markerar floemcellerna i en mogen vaskulär bunt (Objektivlins = 20x och sektionstjocklek = 60 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Jämförelse mellan TB, hartsbäddad och mikrotomsektionerad galls med hjälp av fluorescens. (A) En jämförelse mellan bilder av Toluidine Blue (TB), hartsbäddade och mikrotomsektionerade gallor och (B) ett representativt objekt (även presenterat i figur 5B) förvärvat med hjälp av fluorescens. Xylem-celler är märkta med gula asterisker, kambialområdet med levande gröna parenteser, floem med cyan-asterisker och Plasmodiophora brassicae-koloniserade celler med en vit PB-symbol. Hartsinbäddade sektioner (A) ger en bra upplösning för att studera fördelningen av vilosporer i hypertrofierade organ, graden av sjukdomsprogression och andra processer såsom lokal lignifiering i resistenta växter. Protokollet som beskrivs här (B) möjliggör emellertid känslig observation av genuttryck eller proteinackumulering och visualisering av andra fysiologiska förändringar och viktiga molekyler såsom lipider (i sporer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Spårning av cytokininsignaleringssvar i hypokotyler hos icke-infekterade (-INF) och P. brassicae-infekterade (+INF) Arabidopsis-växter vid 16 DPI. TCS::GFP-markör användes för karakterisering i planta cytokinin svar. Vibratomsektioner utsattes för röjningsbehandling följt av färgning med Calcofluor white. Baserat på bilden, vid 16 DPI, verkar cytokininsvar till stor del minska i infekterade gallor (höger panel), medan de förblir starka, särskilt i floempoolen (celler som så småningom kommer att differentieras för att bilda floemvävnad), i icke-infekterade växter (vänster panel) (Objektivlins = 5x och tjocklek = 30 μm). Vissa nivåer av xylem autofluorescens kan också vara synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Clearinglösning (giftig) | ||
| Komponenter | Procent (%) | i 100 ml destillerat vatten |
| Xylitol | 10% | 10 g |
| Natriumdeoxikolat | 15% | 15 g |
| Urea | 25% | 25 g |
| 10x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) | 1x PBS (100 ml) | |
| NaCl | 8 g | 10 ml 10x PBS + 90 ml destillerat vatten |
| KCl | 0,2 g | |
| KH2PO4 | 0,24 g | |
| Na2HPO4 · 2H2O | 1,81 g | |
| destillerat vatten | 100 ml | |
| pH | pH justerat till 7,4 med HCl | |
| Autoklav och förvaras vid 4 °C. | ||
Tabell 1: Clearinglösningens sammansättning och fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
| Fluorescerande fläck / Tag | Excitations-/emissionsvåglängder | Mikroskopfilteruppsättning som används |
| Nilen Röd | 553/636 nm | filteruppsättning 43 |
| Xylem autofluorescens | 380/475 nm | filteruppsättning 49 |
| Calcofluor Vit | 405/475 nm | filteruppsättning 49 |
| Grundläggande Fuchsin | 561/650 nm | filteruppsättning 43 |
| erRFP | 585/608 nm | filteruppsättning 43 |
| GFP | 488/509 nm | filteruppsättning 38 |
Tabell 2: Excitations-/emissionsspektra som valts ut för denna studie.
Discussion
Att applicera röjningslösningen på vibratomskurna gallpartier förbättrar säkert förmågan att studera den biotrofiska interaktionen mellan P. brassicae och värdväxten. Även om clearingprotokollet gäller även för handsektioner, fungerar det bättre med vibratomsektioner. Fixering av prover i PFA-fixeringsmedel fungerar som ett kritiskt steg i protokollet eftersom prover sedan kan förvaras vid 4 °C i några dagar innan de fortsätter med sektionering. Detta ger flexibilitet att lagra prover under en begränsad period utan att kompromissa med uttrycket och bevarandet av fluorescerande proteiner under fixering.
Nilen röd (i DMSO eller metanol) är oförenlig med hartssektioner på grund av dess hydrofobicitet, som löser upp harts och förstör hartsinbäddade sektioner17. Således visar vibratomsektioner sig vara avgörande för att studera patogenfördelningen och dess livscykel inom utvecklande galls, vari Nile Red-färgning lätt kan användas.
Clearinglösningen som används i detta protokoll är mycket mångsidig12, vilket gör att en mängd olika fluorescensfläckar kan användas i olika kombinationer för att färga olika biomolekyler / komponenter i cellväggarna (suberin, lignin, cellulosa och kitin i svampinteraktioner). Det är också möjligt att motverka sektioner av fluorescerande GFP-markörlinjer och därigenom korrelera promotoraktiviteten eller proteinackumuleringsmönstret med närvaron av patogenen i vissa celler eller regioner i gallan. Bakgrundsautofluorescens från xylem och patogenfyllda jätteceller kunde emellertid inte elimineras även efter clearingprotokollet. Detta utgör en begränsning för att titta på fluorescerande markörer under de senare stadierna av gallbildning, särskilt när man använder ett epifluorescensmikroskop och avbildar svaga signaler.
På grund av de låga nivåerna av uttryck / ackumulering av fluorescerande signaler är transkriptionsfaktorer svåra att upptäcka, men med denna teknik är det möjligt att få tillfredsställande bilder för dem. Sammantaget utökar kombinationen av vibratomsektionering med vävnadsrensningsmetoden verktygslådan för histologiska observationer av komplexa gallvävnader. Flexibiliteten i detta protokoll underlättar processen för vävnadsfixering och minskar den tid som krävs för att skära och avbilda färska vävnadsprover för att observera fluorescerande proteiner och promotoraktiviteter. Med ytterligare förbättringar och genom att använda andra fluorescerande färgämnen som är specifika för olika biomolekyler kommer denna metod att markera större framsteg inom histologiska studier och bildanalys av täta, ogenomskinliga vävnader med komplex vävnadsorganisation. På senare tid har den presenterade vävnadsrensningsmetoden framstått som ett populärt och allmänt använt protokoll för att kombinera och möjliggöra samtidig förvärv av olika fluorescerande signaler11,12,13. Framtida utveckling och modifieringar av sådana tekniker kommer att förbättra bildupplösningen avsevärt för att observera växtpatogeninteraktioner på cellulär nivå.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av National Science Centre Poland OPUS17 bidrag nr 2019/33/B/NZ9/00751 "Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae". Vi tackar prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, University of Cambridge) för att ha delat proHCA2::erRFP-linjen .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
| Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
| Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
| Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
| Commercial Bleach | Domestos | ||
| Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
| Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
| Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
| Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
| Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
| Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
| Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
| Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
| Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
| Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
| Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
| Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |
References
- Harris, M. O., Pitzschke, A. Plants make galls to accommodate foreigners: Some are friends, most are foes. New Phytologist. 225 (5), 1852-1872 (2020).
- Peng, G., et al. Crop rotation, cultivar resistance, and fungicides/biofungicides for managing clubroot (Plasmodiophora brassicae) on canola. Canadian Journal of Plant Pathology. 36 (1), 99-112 (2014).
- Siemens, J., Nagel, M., Ludwig-Müller, J., Sacristán, M. D. The interaction of Plasmodiophora brassicae and Arabidopsis thaliana: Parameters for disease quantification and screening of mutant lines. Journal of Phytopathology. 150 (11-12), 592-605 (2002).
- Malinowski, R., Smith, J. A., Fleming, A. J., Scholes, J. D., Rolfe, S. A. Gall formation in clubroot-infected Arabidopsis results from an increase in existing meristematic activities of the host but is not essential for the completion of the pathogen life cycle. The Plant Journal. 71 (2), 226-238 (2012).
- Walerowski, P., et al. Clubroot disease stimulates early steps of phloem differentiation and recruits SWEET sucrose transporters within developing galls. The Plant Cell. 30 (12), 3058-3073 (2018).
- Olszak, M., et al. Transcriptional profiling identifies critical steps of cell cycle reprogramming necessary for Plasmodiophora brassicae-driven gall formation in Arabidopsis. Plant Journal. 97 (4), 715-729 (2019).
- Malinowski, R., Truman, W., Blicharz, S. Genius architect or clever thief-How Plasmodiophora brassicae reprograms host development to establish a pathogen-oriented physiological sink. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (10), 1259-1266 (2019).
- Bi, K., et al. Integrated omics study of lipid droplets from Plasmodiophora brassicae. Scientific Reports. 6, 36965 (2016).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Badstöber, J., Gachon, C. M. M., Ludwig-Müller, J., Sandbichler, A. M., Neuhauser, S. Demystifying biotrophs: FISHing for mRNAs to decipher plant and algal pathogen-host interaction at the single cell level. Scientific Reports. 10, 14269 (2020).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Sexauer, M., Shen, D., Schön, M., Andersen, T. G., Markmann, K. Visualizing polymeric components that define distinct root barriers across plant lineages. Development. 148 (23), (2021).
- Fuchs, H., Sacristan, M. Identification of a gene in Arabidopsis thaliana controlling resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) and characterization of the resistance response. Molecular Plant-Microbe Interactions. 9 (2), 91-97 (1996).
- Guo, Y., Qin, G., Gu, H., Qu, L. -JDof56HCA2, a Dof transcription factor gene, regulates interfascicular cambium formation and vascular tissue development in Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (11), 3518-3534 (2009).
- Liu, J., Müller, B. Imaging TCSn::GFP, a Synthetic Cytokinin Reporter, in Arabidopsis thaliana. Plant Hormones: Methods and Protocols. Kleine-Vehn, J., Sauer, M. , Springer. New York. 81-90 (2017).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Fujimoto, T. Histochemical Detection of Lipid Droplets in Cultured Cells. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 483-491 (2013).
