Summary
该方法使用96孔板形式量化微生物丰度，以板菌落形成单位（CFU），并应用于整个果蝇匀浆样品中的 果蝇 微生物组。CFU使用此处提供的自动图像分析软件进行计数。
Abstract
动物的肠道被共生微生物定植，这些微生物会影响宿主的发育、健康和行为。定植的精确定量对于研究宿主和微生物之间的复杂相互作用至关重要，既可以验证微生物组成，又可以研究其影响。 黑腹果蝇具有低天然微生物多样性，并且以确定的微生物组成进行饲养是经济的，已成为研究肠道微生物组的模式生物。分析单个生物体的微生物组需要确定存在哪些微生物物种并量化其绝对丰度。本文提出了一种分析大量个体苍蝇微生物组的方法。果蝇在96孔板中制备，可以一次处理大量样品。通过将多达96个全果蝇匀浆接种在单个琼脂平板上的一系列斑点上，然后计数在每个点中生长的菌落形成单位（CFU）来量化微生物丰度。该电镀系统与自动 CFU 定量平台配对，该平台结合了板的摄影、荧光菌落的分化以及使用 ImageJ 插件的菌落自动计数。优点是（i）该方法足够灵敏，可以检测处理之间的差异，（ii）点镀方法与传统电镀方法一样准确，以及（iii）自动计数过程准确且比手动计数更快。此处介绍的工作流程能够在大量重复中对CFU进行高通量定量，并可应用于其他微生物学研究系统，包括 体外 和其他小动物模型。
Introduction
肠道微生物群与其动物宿主之间的关系越来越处于生物学研究1的最前沿，这表明微生物组的菌株组成对宿主生理学很重要2，3，4。发现的速度受到混杂因素的限制，例如高自然个体间变异和定植细菌的高度多样性5，6，7。果蝇黑腹果蝇因其天然的低多样性微生物组、易于处理和强大的宿主遗传学而成为一种有前途的模型8，9，10，11。苍蝇可以无菌并与定义的微生物群12重新关联，并且已经表明菌群影响苍蝇的生理性状13，14。先天菌群由一组有限的细菌组成，这些细菌都是可培养的，这些细菌的近亲也是哺乳动物肠道的内源性，包括乳酸杆菌、变形杆菌和肠球菌15。
研究微生物组对宿主性状的影响需要根据存在哪些物种及其绝对丰度来量化微生物组16。分析果蝇微生物组的主要方法是菌落形成单位（CFU）计数17，16S rRNA基因扩增子测序9和16S rRNA基因18的qPCR。无需昂贵的试剂即可获得CFU计数，并且它们确认了细菌细胞的活力19。包括qPCR在内的16S技术具有优势，可以在不考虑其生长要求或菌落形态的情况下确定微生物的分类特性20。
在实验使用具有已知细菌（gnotobiotic 苍蝇）定义微生物组的苍蝇的情况下，CFU 计数比测序具有特别的优势21。测序成本高昂，需要DNA提取、基于PCR的文库制备和高通量测序才能获得相对丰度22。由于成本高，通常需要批量执行高通量测序方法，以降低每个样品的价格23。需要进一步的方法，如qPCR以获得绝对丰度16。相比之下，CFU计数快速且便宜，并提供活细胞的绝对数量。果蝇8和其他小微生物组模型24，包括蠕虫秀丽隐杆线虫25，26和幼虫斑马鱼Danio rerio，以GNTOBIO方式生长27，具有有限范围的细菌，它们具有已知的生长特征28。在这些情况下，特别是对于侏儒生物，CFU计数可以区分多物种肠道群落中的所有细菌种类21，27，29。更高通量的CFU计数方法将进一步提高测量微生物组组成的成本效益和速度，并可应用于许多其他微生物学实验。
通过在琼脂基生长培养基上连续稀释细菌悬浮液来计数CFU是整个微生物学领域的标准方法。然后手动计数在平板上生长的菌落。稀释液允许研究人员选择可计数的菌落密度（例如，每个板~100 CFU），这意味着菌落不会相互生长并且可以在合理的时间内计数。大多数微生物学家使用与140年前在Robert Koch实验室开发的CFU计数方法基本相同的方法，对于许多应用，这种方法仍然足够。但是，当寻求量化大量样品时会出现问题。单个样品可能需要对样品进行 1 到 10 次连续稀释才能获得可计数的 CFU，因此涉及几十个样品的实验变得繁重。已经开发了各种方法来提高CFU枚举的效率。自动螺旋镀消除了对连续稀释30的需要，使得CFU计数只需要一个板，但增加了样品铺板的时间。单板连续稀释点样 （SP-SDS） 允许从每个样品31 的更少板中估算 CFU。这些方法是对传统铺层方法的改进，但仍需要单独处理和接种细菌样品，因此对于高通量来说并不理想。在96孔板中处理样品并在矩形琼脂平板上点镀这96个样品可大大提高样品的通量19。
微生物组通常由多种菌株和物种组成。虽然物种通常可以通过菌落形态或生长培养基来区分，但荧光可用于进一步区分不同类型的细菌及其生长性状32。例如，同一物种的不同基因型可以用不同的基因编码荧光蛋白标记。结合荧光的平板成像方法使研究人员能够在基于CFU的测定中利用这些遗传技术32。将荧光纳入高通量CFU计数方法将进一步提高其实用性。
当有大量样品时，手动计数CFU变得很麻烦。CFU的自动计数可以通过拍摄板并使用专用软件处理图像来进行33。Sieuwerts等人使用传统的数码摄影和ImageJ软件19将点镀的提高的接种效率与自动菌落计数相结合。
筛选特定微生物表型和宿主关联的高通量方法将有助于研究微生物群落组装及其对宿主健康和健身的影响。对于果蝇微生物组的研究，高通量微生物学平台将包括以 96 孔板格式处理苍蝇样品、无需细菌裂解的苍 蝇 裂解、点镀效率、使用荧光和区分多个荧光团的能力、用于 CFU 板可重复成像的受控光环境以及可靠的自动菌落计数软件。本文介绍了一种针对gnotobiotic果蝇CFU测定优化的方法，该方法简单，快速且自动化。该协议概述了一种新的工作流程，结合了以前发表的方法的最佳方法，并针对探索 果蝇中的肠道微生物组进行了优化。
Protocol
1. 苍蝇定殖
注意：该方法适用于通过CFU的生长板对具有可培养肠道微生物组的果蝇进行定量分析。之前已经发布了饲养地精蝇的详细方案12。
- 通过共生细菌物种建立稳定的定植。
- 制备新鲜的细菌培养物，在室温下以400×g离心3分钟沉淀，并将细胞沉淀重悬于PBS中至OD 600为1.0。对于该协议， 植物乳杆菌（以前称为植物乳杆菌）在一夜之间生长至OD 600为2.0。
- 将 100 μL 移液到飞瓶中的食物上（参见 材料表）。均匀涂抹，让液体吸收15-30分钟。
- 使用标准小瓶到小瓶翻转技术将20只无菌苍蝇转移到该小瓶中34。每只苍蝇将吃掉大约相等量的细菌剂量35。或者，可以添加无菌鸡蛋。
- 每天将苍蝇转移到新鲜的无菌食物中，持续 3 天。在生物安全柜中进行所有这些操作并使用无菌技术（图1A-1）。
- 在测量CFU负荷之前，将果蝇转移到含有无菌琼脂水的小瓶中4小时，以清除肠道中的瞬时细菌。琼脂水瓶为苍蝇提供水分来源，但对苍蝇或表面的细菌没有营养。它们在与标准食品相同的无菌苍蝇瓶中制备，但仅含有去离子水和1.5%琼脂。
2. 在 96 孔 PCR 板中单独匀浆苍蝇
- 提前准备打珠板。
- 将0.5μm玻璃珠（见 材料表）倒在珠子测量托盘上（在 补充编码文件1 S1-bead-measurer.stl的帮助下3D打印）。将珠子铺在托盘上，使所有孔都充满并水平，然后将多余的珠子刷入锥形管中以回收它们。
- 将半裙边PCR板（见 材料表）倒置在测量托盘上，并通过将其安装到测量托盘上的压痕中将其与孔对齐。然后，快速将其翻转以转移珠子。
- 从PCR板表面去除多余的珠子并用箔纸覆盖。检查PCR板以确保所有孔都含有珠子。如果需要，请使用称量勺将珠子添加到单个孔中。如果静电导致珠子粘在板表面上，请用70%乙醇擦拭或喷洒测量托盘和PCR板的背面。
- 用铝箔覆盖。许多板可以以这种方式制备，然后高压灭菌并储存以备后用。准备使用时，使用 96 通道移液器向每个孔中加入 100 μL PBS（参见 材料表）。
- 在均质化之前，用70%乙醇对微生物定植的苍蝇进行表面灭菌（参见步骤1）。
- 用100%CO2麻醉苍蝇5秒。使用小漏斗将麻醉的苍蝇从小瓶转移到 1.5 mL 微量离心管中（图 1A-2）。在这项研究中，每个管通常添加25只苍蝇。
- 立即将~1mL的70%乙醇喷入试管中，关闭试管并通过倒置混合10秒。然后，用P1000移液管吸出乙醇，注意不要吸出任何苍蝇。用乙醇再次重复，然后用无菌PBS重复两次（图1A-3）。
- 在最后一次PBS洗涤后，关闭管子，盖子面朝下，在工作台上用力敲击几次，使苍蝇进入盖子。
- 打开管子，用镊子将苍蝇分配到孔中（图1A-4）。在每个孔中放置一只苍蝇（图1A-5）。装载时将板放在冰上以保持苍蝇麻醉。
- 使用热粘合热封箔密封板（见 材料表）。
- 首先，清除靠近孔的任何杂散珠子，因为这些珠子会导致箔密封泄漏。确保箔的钝面朝下放在板上，反光的一面朝向热封机。用力按下热封机（见材料表）5秒（图1A-6）。用手涂布器（见材料表）抛光以固定箔。
注意：密封不良是样品损失的原因。
- 首先，清除靠近孔的任何杂散珠子，因为这些珠子会导致箔密封泄漏。确保箔的钝面朝下放在板上，反光的一面朝向热封机。用力按下热封机（见材料表）5秒（图1A-6）。用手涂布器（见材料表）抛光以固定箔。
- 将板固定在摇板器中。均质化5分钟（图1A-7）。在迷你板旋转器（参见材料表）中以350 x g 的速度旋转珠板30秒，以除去密封箔中的液体。
- 在握住板的同时取下箔纸，以免将苍蝇均质液滴溅出孔。
3. 连续稀释果蝇匀浆并点样到 CFU 板上
- 将四个矩形MRS琼脂生长板（见 材料表）放入生物安全柜中并取下盖子。在该协议中，MRS琼脂用于 植物乳杆菌的生长。让这些板干燥至少10分钟（如果它们是新鲜倒入或从储存中冷却，则为20分钟）。
注意：如果板是湿的，来自96孔板的液滴将一起运行并破坏计数。 - 使用 96 通道移液器向无菌 96 孔板的每个孔中加入 100 μL PBS，制备三个稀释板。将 P20 吸头架装入 96 通道移液器上。
- 通过从第 2 节中制备的样品板中吸取 11.1 μL 匀浆进行 1：10 稀释（图 1A-8）。确保从孔的中间而不是孔的底部抽取，因为苍蝇均质和玻璃珠会堵塞移液器。珠子下沉，苍蝇颗粒漂浮，使中间层大部分透明。
- 将 11.1 μL 分配到第一个稀释板中，该稀释板每孔已含有 100 μL 无菌 PBS。将稀释板在摇板器上以600rpm保持10秒。通过上下移液五个循环再次混合。将 11.1 μL 从第一个稀释板转移到第二个稀释板，并对接下来的两个稀释板重复混合步骤。
- 如下所述进行稀释系列电镀。
- 从生物安全柜中取出生长板。
- 从最稀释的平板开始，使用 96 孔移液器将每个孔中的 2 μL 点到琼脂平板上（图 1A-9）。
- 将移液器头缓慢放到盘子上，注意不要刺入琼脂。仔细检查板并确保所有斑点都已分配;如果没有，请手动将 2 μL 添加到适当的位置。检查液体斑点是否迅速浸入琼脂中并且不要一起运行。
- 如果斑点一起运行，请将一组新的新鲜琼脂平板干燥更长时间，然后重新进行斑点。如果有多种平板类型（例如，不同的培养基或抗生素），也要发现这些。将任何剩余的溶液分配回稀释板中，然后继续下一个更高的浓度。
注意：点样稀释液时，将下一次稀释液混合五次，以确保移液器吸头的内容物清除了上一次稀释液。稀释板可以在4°C下储存>8小时而不影响菌落计数35。
- 对剩余的稀释板重复步骤3.5中所述的电镀过程，从最稀释到最浓缩，直到具有原始匀浆的板。
- 当所有液体都被吸收到琼脂中时，将板倒置并放入培养箱中（图1A-10）。对于来自果蝇的乳杆菌和醋杆菌，MRS培养基上的最佳温度为30°C。孵育直到菌落达到最佳大小：菌落足够大以清楚地看到它们，但不会大到它们合并或干扰彼此的生长（参见最佳大小量化的代表性结果）。
注意：最佳生长条件取决于菌株，必须根据经验确定。对于来自果蝇的乳杆菌，MRS琼脂的最佳孵育时间为26小时至30小时。对于来自果蝇的醋杆菌，MRS的最佳孵育时间为30小时至48小时，具体取决于菌株。 - 孵育后，如果需要，将板储存在4°C直至准备计数。
4. CFU的定量
- 通过拍摄平板然后使用自动化软件计数菌落来量化 CFU，如下所述。如果将板储存在4°C，首先让它们达到室温，这样板上就不会有冷凝，从而产生眩光。
- 按逻辑顺序组织图版，并在拍摄时按该顺序保存它们 - 这样可以更轻松地命名文件。调整所有板的方向，使 A1 位于所有板的左上角。建议在A1角贴上唯一的ID标签，以确保照片不会混淆。按顺序堆叠每个稀释系列。
- 取下板盖并将板放在载物台上，A1 朝向正确的角落。包括板照片盒的设计（补充文件 1、补充文件 2），该照片盒针对拍摄这些托盘板进行了优化，并包括用于对荧光菌落进行成像的照明和滤光片选项。
- 对板进行成像。使用具有手动设置的相机（参见 材料表）可在印版之间实现一致的曝光水平。建议使用长焦距设置，以最大程度地减少透视失真。使用遥控快门拍摄照片，以最大程度地减少相机抖动造成的模糊。
- 将图像传输到计算机并重命名它们，包括实验名称、培养基类型、稀释因子和任何其他相关细节。某些操作系统（请参阅 材料表）在 Finder 中具有有用的批量重命名功能，方法是右键单击所选文件。
5. 使用计数套件自动计数菌落（补充文件 3）
- 使用 ImageJ 提供的裁剪插件（补充编码文件 2）裁剪图像。该插件有助于将图像划分为有序的子区域数组（例如，8 x 12 对于 96 孔板）。这些次区域将单独计算。
注意：补充 编码文件 3 Circus_.ijm 中描述了一个名为 Circus 的用于计数圆板的单独插件。- 将要处理以进行量化的图像组织到一个文件夹中。选择区分板的文件名，因为这些文件名将成为每组计数的列标题。在此文件夹中，创建名为“裁剪”和“收据”的子文件夹。
- 启动裁剪，然后单击确定开始裁剪。
注：将显示默认设置，通常就足够了。根据图像的分辨率、照明、光斑尺寸等，调整基本参数可能会有所帮助。 - 如果图像已经是直的，只需按 空格键即可。否则，通过沿应变为水平的边缘绘制一条线来拉直图像。如果图像仍然没有拉直，请根据需要多次重绘线条。
- 接下来，绘制要进行计数的区域的边界框。调整大小和比例，直到所有斑点都在其单元格内。将光标拖到边界框外以刷新网格。当网格看起来不错时，按 空格键。
- 确保下一张图像自动旋转到与第一张图像相同的角度;该插件假设所有照片都对齐相同。如果这是准确的，请按 空格键 继续。否则，请像以前一样拉直图像。网格还会调用与上一个图像相同的位置;如有必要，请进行调整，然后按 空格键。
- 使用提供的 Count-On-It：ImageJ 的 Gridiron 插件（补充编码文件 4）枚举平板上的菌落。有关安装和使用插件的详细说明包含在 补充文件 3 中。
- 启动 Count-On-It > Gridiron。 使用与裁剪相同的网格设置。用户可以批处理整个文件夹、分析单个图像或从当前图像开始。
- 根据像素强度上限和下限设置阈值。使阈值尽可能严格，同时仍然选择所有菌落。理想情况下，所选菌落之间会有一些空间，但该软件能够在一定程度上分割斑点。当阈值令人满意时，在“需要操作”对话框中单击 确定 。
- 要检查结果，请放大并更仔细地查看菌落计数。单击取消将中止插件。单击 “确定 ”继续。
- 在第一个图像上，确保提供继续或返回设置菜单的选项，例如，更改最小菌落大小。要继续批处理，请单击“ 确定”。然后，选择一个文件夹来保存收据和结果表。使用“收据”文件夹或创建一个新文件夹。
- 在第一个图像之后，下一个图像将默认为与先前设置相同的阈值。单击 “确定 ”使用这些设置或调整设置。如果照片一致且设置准确，请在“需要操作”对话框中单击 确定 。
注意：完成批次中的所有图像后，结果表将自动保存在与收据相同的文件夹中。 - 查看软件生成的盘点收据，并手动更正任何盘点错误。ImageJ 插件在统计上是准确的，但确实会发生错误。证明收据以检查异常值并识别错误计数。该软件将CFU数据保存为.csv文件与收据相同的文件夹中。
- 使用用户首选软件分析数据。
Representative Results
使用定植测定法以 96 孔板形式在数百只个体苍蝇中计数 CFU
为了了解许多个体苍蝇微生物组的组成，使用随附的协议测量了CFU，从而能够识别存在的物种，定植的苍蝇百分比以及每只苍蝇中细菌的绝对丰度。观察到的微生物组组成中个体间差异大的原因知之甚少，量化定植的统计分布可以帮助研究这种差异36，37。为了获得大量的生物学重复，开发了一种高通量管道，用于使用CFU计数定量许多个体果蝇中的微生物丰度（图1A）。
CFU的最终定量可能会受到分析前苍蝇处理方式的影响，例如，包括表面灭菌，细菌消耗后的时间以及从肠道中清除瞬时细菌在内的因素。首先，专注于果蝇共生细菌物种L. plantarum（Lp;参见Obadia等人中的Lp菌株WF36），给果蝇喂食~105 CFUs的Lp剂量，并每瓶保持25只苍蝇的组。将这些苍蝇放在同一个小瓶中3天或每天转移（转移）到新鲜的无菌食物中（图1B）。然后将未转移的苍蝇在乙醇中洗涤以去除表面细菌（洗涤）或不洗涤（未洗涤）。洗涤导致测量的总CFUs没有显着减少（图1B），表明在这些高度控制的接种条件下，苍蝇表面在3天内不会被细菌显着定植。每天转移其他组苍蝇，以减少细菌在食物上生长的积累（转移）;此外，在采样前将一组转移到新鲜食品中4小时（转移后），或者将它们放入仅装有无菌琼脂水的小瓶中4小时（清除），以使暂时摄入的微生物从肠道中清除。这些步骤中的每一个都提供了更严格的定植测量，除了乙醇表面洗涤外，果蝇中CFU的丰度都产生了统计学上的显着降低。在测量前转移到无菌食品（转移后）或琼脂水（清除）4小时产生难以区分的效果，表明在测量前4小时转移到无菌条件下可减少细菌负荷。这一结果与以下解释一致：苍蝇肠道中的一些肠道细菌是短暂的，而另一些肠道细菌则更稳定地相关35。Lp的丰度范围从清除苍蝇的1 x 104.3 CFUs/苍蝇到未洗苍蝇中的1 x 104.9 CFU（n = 724只苍蝇）。
接下来，使用Acetobacter indonesiensis（Ai）进行相同的测定，这是一种在苍蝇肠道定植的革兰氏阴性细菌（图1C;参见Obadia等人36中的菌株Ai SB003）。与Lp定植的苍蝇一样，表面灭菌产生的CFU没有显着减少。同样，每天转移到无菌食品显着降低了细菌负荷，并且在均质化之前转移到无菌条件下4小时产生了细菌负荷的进一步降低。Ai的丰度范围从清除苍蝇中的1 x 10 4.7 CFUs/苍蝇到未洗苍蝇中的1 x 105.0 CFU（n = 528只苍蝇）。因此，肠道细菌的准确定量取决于转移的频率，包括转移当天。通过乙醇洗涤去除外部细菌负荷没有显着效果，但对于不同的细菌菌株或不同的培养条件，可能会观察到更显着的影响。这些因素应该通过实验来控制。
还测试了均质法对CFU计数的潜在影响。使用100 μL PBS中含有0.5 μm玻璃珠的珠打浆器对果蝇进行均质化，这可能会降低细菌细胞的活力。首先，在PBS中制备培养物中的Lp细菌悬浮液，然后接种以计数CFU作为阳性对照。将相同的培养物放入珠打浆器板中，（i）用珠子均质，（ii）用珠子和无菌苍蝇匀浆，或（iii）在没有珠子的PBS中均质（图1D）。当苍蝇存在时，珠子中的均质化不会显着影响溶液中活细胞的丰度，而在没有苍蝇的情况下细菌的均质化会杀死大量细菌细胞。在没有磁珠的PBS中均质化也显着减少了活细胞的数量。同样，在苍蝇存在下均质化时保留了Ai活力，而没有苍蝇的匀浆减少了溶液中活细胞的数量（图1E）。这些结果表明，苍蝇组织在均质过程中保护细菌免受珠子的破坏。然而，图1D和图1E中的实验是用每孔超过10个8个CFU进行的。在实践中，发现每孔~106个细胞或更少的孔在没有苍蝇的情况下使用磁珠时几乎没有细胞损失。在磁珠跳动中途在冰上冷却板也可以提高细胞活力。这些结果的意义在于，读者应该意识到这些潜在的问题，并为其特定用例设计适当的控件。
点镀96孔板的准确性，用于高通量CFU定量
由于目标是测量数百到数千只苍蝇的CFU丰度，因此传统的铺展电镀方法耗费了大量的时间和材料。点镀是CFU生长和计数的有效方法19，31。点镀方法使用 96 通道移液器将 2 μL 细菌悬浮液分配到矩形托盘板中制备的培养基上（图 2A）。每个斑点代表单个样品的细菌负荷，因此可以用单个板分析96只苍蝇（图2B）。将点镀的准确性与传统电镀进行比较，方法是使用完全相同的0.0001 OD悬浮液接种生长板，用于两种 方法。 悬浮液在PBS中连续稀释五倍。作为头对头比较，将 50 μL 接种物铺在单个圆板上，或在矩形 MRS 板上制作 2 μL 斑点。然后将板在30°C下孵育，直到菌落可数。每次稀释的结果CFU计数用于计算悬浮液的原始浓度并进行比较（图2C）。将具有50-500 CFU的圆板计为对照。在高通量和传统圆镀方法之间没有观察到显着差异。
由于菌落密度会影响其生长和定量，因此测试了CFU密度对最终计数的影响。与传统的圆板方法相比，每个点具有2至25个菌落的斑点在最终计数方面没有差异（图2C）。平均具有35个菌落的斑点产生的结果略低于对照扩散板（图2C; p = 0.0017）。仔细检查单个斑点的照片表明，这种偏斜是由于菌落在密集斑点中重叠。基于每个斑点平均11个菌落的斑点的测量导致浓度最接近基于扩散板的浓度（图2C;扩展板：平均值 = 1 x 104.4 CFU;SD = 0.086 vs. 具有 11 个平均菌落的斑点：平均值 = 1 x 104.4 CFU;SD = 0.12， p = 0.42，韦尔奇 t 检验）。
使用具有白光或荧光的专用摄影平台生成用于定量的高质量图像
高通量点镀自然会产生大量靶区，必须准确计数。高质量的照片可用于记录数据并促进CFU的计数。使用市售材料开发了一个强大而直接的摄影平台（图3A）。数码相机连接到定制灯箱顶部的支架上，称为FluoroBox，并直接指向下方，垂直于板的中心。彩色发射滤光片可选择使用滤光片滑块放置在镜头前方。遮光罩通过阻挡来自下方 LED 灯条的直射光来防止镜头眩光。LED 灯条从侧面而不是上方照亮板，以防止板上眩光。除白光外，单色蓝色和绿色LED分别用于激发绿色和红色荧光蛋白。盘子由抽屉上的板架固定到位，抽屉配有抽屉滑块，便于插入盘子。完整的设计可在 补充文件 1 和 补充文件 2 中找到。
使用白光LED和数码相机拍摄Lp菌落点板的照片，以帮助计数菌落并区分不同的颜色和形态（图3B）。为了验证照明强度是否均匀，在平板照片的不同区域测量琼脂的背景强度（图3C）。为了证明菌落可以与背景清楚地区分开来，测量了板不同部位上10个不同菌落直径的强度，发现比背景高约~300%（图3C）。该板接种有表达mCherry荧光蛋白的质粒的Lp，以及一些不含质粒的Lp，因此菌落为mCherry阳性或mCherry阴性。为了区分这两种类型的菌落，使用相同的相机拍摄带有绿色LED光（515-525nm）和红色滤光片（Tiffen #29）的平板，使mCherry阳性菌落发出荧光（图3D）。通过测量菌落样本（n = 10个菌落）的强度来量化mCherry阳性和mCherry阴性之间的强度差异。m樱桃阳性菌落的强度比m樱桃阴性高~1，000%（图3E）。使用蓝色LED灯（465-475nm）和绿色滤光片（Tiffen #58）拍摄表达GFP的Ai菌落和不表达荧光的Ai菌落（图3F）。GFP阳性菌落的强度比GFP阴性高200%（图3G）。
使用自定义 ImageJ 插件自动计数点板上的 CFU 计数
照片本身有助于计数菌落（例如，通过存储数据、共享数据、放大、标记叠加、分离颜色等）。但是，手动计数和组织数百个点的结果的行为可能很乏味、耗时，并且容易在最终计数中出现人与人之间的差异。为了加快计数过程并标准化计数的可重复性，我们开发了一种名为 Count-On-It 的专用 ImageJ 插件（图 4A）。该插件可实现琼脂平板上CFU的精确半自动计数。用户通过首先使用附加的裁剪插件裁剪和拉直图像来准备图像以进行计数。可以选择对照片进行批处理，并且可以为每个印版调整阈值。其他几个选项允许用户提高平板计数的准确性，包括调整光波长（RGB 图像）、设置菌落大小范围（以像素为单位）、更改最大纵横比以及自定义活动选择网格的尺寸。Count-On-It输出一个结果表，每个板表示为CFU计数列。它还生成显示叠加层的照片收据，以直观地记录其计数结果并有助于手动纠错（图 4B）。虽然确实会发生错误，但当手动计数的菌落数量与使用此插件计数的菌落数量进行比较时（图4C），关系通常是相等的，手动和自动计数之间的线性回归显示斜率为0.95，准确度超过90%（R2 = 0.93），尽管当菌落数量超过20时误差增加。
Count-On-It还可用于使用FluoroBox的荧光功能单独计数荧光菌落。与手动相比，软件插件的mCherry阳性菌落计数（图4D）的R2为0.92（图4E）。同样，使用软件插件与手动计数的GFP阳性菌落（图4F）的R2为0.90（图4G）。荧光菌落与非荧光菌落可以在单个样品中区分，菌落大小和形状还可用于区分单独的亚群（图4H-K）。照片收据提供了一个记录，允许用户快速检查计数的准确性并手动更正错误。在图4C，E，G，I，K中，照片收据尚未用于提高计数精度，以便读者可以看到该方法的原始输出。如图4G所示的情况，手动计数为1会产生自动计数为21，可以使用照片收据快速检测到。在这种情况下，板边缘的眩光会产生被视为菌落的斑点。对于每个用例，需要在高吞吐量计数之前确定软件插件的最佳设置。
图 1：定植测定使用 96 孔板格式测量数百只个体果蝇中的 CFU。 （A）如协议部分所述使用的定植测定和高通量定量方法的图示概述。（B）使用高通量CFU定量方法在不同条件下测量定植测定后苍蝇中的植物乳杆菌（Lp）丰度。将苍蝇在同一小瓶中保存3天，然后匀浆并铺板（未洗涤），电镀前用乙醇洗涤（洗涤），每天洗涤和转移（转移），每天转移然后在电镀前保存在无菌食品上（转移后），或仅用水的小瓶中保存4小时（清除）（n = 724只苍蝇，每次处理3个生物重复和~72只苍蝇）。（C）使用印度尼西亚醋杆菌（Ai）（n = 528只苍蝇）进行与（B）相同的测定。（D）在PBS中制备Lp细菌悬浮液，然后铺板计数CFU或首先通过珠子打浆，与无菌（GF）苍蝇组合打珠，或在无珠子或苍蝇的珠打浆器上摇匀（n = 236个样品孔）。（E）均质化后的Ai活性以与（D）相同的方式进行测试（n = 282个样品孔）。面板（B-E）的统计显著性使用Kruskal-Wallis检验计算，然后成对Wilcoxon秩和检验与Bonferroni的多重比较校正。框给出四分位距。线表示中位数。晶须提供总范围。请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于高通量 CFU 定量的点镀 96 孔板的准确性。 （A） 使用 96 通道移液器点镀，将 2 μL 分配到矩形托盘板中制备的培养基上。（B）MRS-琼脂生长平板，具有96个 Lp 菌落点。（C）基于传统圆板（n = 24个板）的CFU计数的 Lp 悬浮液浓度与基于点板（n = 680个点）的CFU计数的浓度相比，连续稀释并按每个点的平均菌落计数排列（三个重复板的每个稀释因子~48个点计数）。每个数据点代表每个点的确切菌落，而每列代表该稀释的平均菌落。水平虚线表示所接种培养物的计算CFU计数。绿色轮廓点突出显示了传统的圆板计数。红色填充点突出显示了每 2 μL 点 11 CFU 的最佳菌落密度。使用普通单因素方差分析计算统计显著性，将每列的均值与具有Bonferroni多重比较校正的扩散板对照柱的均值进行比较。框给出四分位距。线表示中位数。晶须提供总范围。**p < 0.01。ns = 不显著。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：摄影平台使用白光或荧光生成可量化的印版图像 。 （A） 氟盒设计概述。（B）使用白光的 Lp 菌落点板的照片。（C）白光下单个菌落的强度分布与背景强度（BKG）的比较（n = 10个菌落，虚线表示标准偏差）。（D）与（B）相同的点板的照片，使用单色绿灯和红色滤光片选择mCherry阳性Lp 菌落。（E）单个菌落的强度分布，说明有和没有mCherry发射的菌落之间的差异。（F）含有 Ai 菌落的斑点板的照片，其中一些具有GFP标签。（G）单个菌落的强度分布，说明GFP阴性和GFP阳性菌落之间的差异。E， F， G： n = 每个地块有 10 个菌落。菌落直径约为1.5毫米。虚线为SD。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过 Count-On-It ImageJ 插件对点板进行准确计数。 （A） 插件设置窗口的屏幕截图。（B） 插件生成收据以记录计数并协助纠错。 插入： 覆盖每个斑点区域计数的菌落数量;黄色轮廓表示计数单个菌落，红色轮廓表示计数多个菌落。（C） 显示使用白光图像时手动计数的菌落数与使用插件（自动）计数的菌落数的图，其中图表上的每个点代表手动或自动计数的单个点（拟合斜率 = 0.95，青色线;1：1 线为红色虚线;R2 = 0.93，皮尔逊相关系数， p < 0.0001）。（D）使用照片盒的荧光特征选择mCherry阳性菌落时来自插件的照片收据图像。（E）显示使用红色荧光时使用手动与自动方法计数的mCherry阳性菌落数的图（拟合斜率= 1.1，青色线;1：1线为红色虚线;R2 = 0.92，皮尔逊相关系数， p < 0.0001）。请注意，尚未使用 E、G、I、K 的分析收据更正异常值和错误。（F）使用照片框的绿色荧光特征选择GFP阳性菌落并使用插件选择绿色通道时来自插件的照片收据图像。（G）显示使用绿色荧光照明时使用手动与自动方法计数的GFP阳性菌落数的图（拟合斜率= 1.1，青色线;1：1线为红色虚线;R2 = 0.90，皮尔逊相关系数， p < 0.0001）。（H）mCherry阳性菌落选自混合菌落形态，在插件中使用高荧光阈值。（I）显示使用红色荧光照明时使用手动与自动方法计数的mCherry阳性菌落数量的图（拟合斜率= 0.99;R2 = 0.91，皮尔逊相关系数， p < 0.0001）。（J）使用低荧光阈值从混合菌落形态中选择的mCherry阴性菌落。（K） 显示当强度阈值设置为选择非荧光菌落时，使用手动与自动方法计数的mCherry阴性菌落数的图（拟合斜率= 1.1;R2 = 0.85，皮尔逊相关系数， p < 0.0001）。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：氟盒组装说明。 此文件将引导读者逐步完成视频中使用的受控照明盒的构造。 请点击此处下载此文件。
补充文件2：氟盒亚克力激光切割。 该文件提供了一个切割模板，用于激光切割受控照明盒的亚克力件。该文件可以发送给激光切割亚克力供应商。请参阅此协议中使用的供应商的材料 表 。 请点击此处下载此文件。
补充文件3：软件说明。 此文件将引导读者逐步完成此协议提供的 Croptacular 和 Count-On-It 软件的安装和使用。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件1：珠子测量托盘的3D打印代码 （S1-bead-measurer.stl）。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件 2：矩形板照片裁剪器 ImageJ 插件 （Croptacular_.ijm）。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件 3：圆板照片裁剪器插件 （Circus_.ijm）。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件 4：矩形板 96 点计数器插件 （Gridiron_.ijm）。 请点击此处下载此文件。
Discussion
这里介绍的详细技术使CFU计数实验中可以评估的样品数量增加了>100倍。该技术通过使用96孔板格式测定单个苍蝇，推进了果蝇12，35，36微生物组实验的现有方法。此外，它应用了更有效的点镀方法19，31以及具有摄影和菌落计数平台的自动化工作流程。这种方法对果蝇的意义在于将实验标准化为 96 孔板格式，从而能够同时处理大量生物重复，实现 CFU 的高通量定量。
96孔平台表明，转移频率的增加和瞬时细菌的“清除”导致样品之间的平均丰度和变化显着降低（图1B，C），证明了这种改进方案的严格性。共同居住苍蝇的一个限制是苍蝇之间细菌的水平转移。建议的解决方案是以96孔板的形式单独饲养苍蝇，例如全动物喂养平板38。
虽然在乙醇中洗涤苍蝇时没有观察到细菌负荷的显着降低，但这些苍蝇仅在外部细菌存在下保存了3天。长时间的住房可能允许更大的细菌负荷积累39。因此，仍然建议用乙醇洗涤。
将苍蝇转移到96孔板中是设置工作流程的关键第一步（图1A）。一旦苍蝇被清洗，它们就会一次一个地分配到井中。在此阶段，板图可用于记录每个孔中存在哪些条件，并添加任何注释，例如“苍蝇丢失”。均质化是另一个关键步骤，但有一些重要的注意事项。当苍蝇存在时，细菌在均质化过程中存活下来（图1D，E），据推测，当细菌在苍蝇的肠道内时，这一原理也是如此。然而，当细菌仅在珠子打浆板中均质化时，它们也会被杀死，这表明均质化在某些情况下可以杀死细菌细胞，例如，如果对解剖的肠道进行均质化，这一限制可能很重要。值得注意的是，均质化时CFU的损失取决于样品中CFU的数量，当每孔使用~105 CFU时，损失最小。通过中途停止均质化并在冰上冷却板，可以实现CFU的进一步保存。
根据对照实验，在该协议中进行了5分钟的均质化，其中已知数量的CFU与无菌苍蝇混合，这在经验上对苍蝇细菌起作用。较少的跳动导致存在较大的苍蝇部件，从而干扰移液，而~10分钟的均质化时间明显更长，使CFU计数更加可变。与圆柱形2 mL管相比，观察到锥形板孔的较小体积和角度形状会降低磁珠跳动效率。这种通用方法的许多变体是可能的，包括使用哪种细菌菌株、哪种珠子跳动容器、哪些珠子和哪种苍蝇基因型。单个用户案例需要使用积极的控制来建立他们的方法。
以特定方式采用点镀方法：将PBS中植物 乳杆菌 WF的1：2稀释液点样到MRS板上，并在30°C下孵育2天（可以实施更短的孵育时间以产生更小的菌落大小）。该方法需要对设备进行一些前期投资，主要是磁珠打浆器和96通道移液器（图2A），这对于稀释系列和点镀都是必需的。但是，可以使用较便宜的选择，包括带有开槽引脚的96孔板复制器。稀释系列是影响CFU计数结果准确性的关键步骤。就故障模式而言，移液器吸头可能会被飞部件或玻璃珠堵塞，移液器吸头无法正确密封到移液器上或由于其他原因而失效。所有这些问题都导致受影响油井的计数不足，应加以监测。稀释系列的每一步的充分混合也至关重要。每次稀释液应通过将板放在摇板器上或上下移液 15-20 次来彻底混合，这也可用于冲洗吸头。通过从最稀释到最不稀释的板点样，吸头可以重复使用整个稀释系列。使用 1：2 稀释度，在 2-25 个菌落的范围内计数准确，跨越一个数量级（图 2C）。因此，1：10稀释可节省时间和材料。另一个可以利用的变量是孵育时间，可以调整孵育时间以产生更小的菌落，从而通过防止相邻菌落的合并来增加可计数斑点的范围。
板的高质量照片至关重要，因为它成为分析CFU的原始源数据，并且可以无限期存档。FluoroBox旨在生成具有均匀光强度的平板照片，从而最大限度地减少琼脂表面的眩光。此外，该设计能够使用单色LED灯和彩色照片滤光片选择性地拍摄荧光菌落（图3A）。像FluoroBox这样的设置的构建，具有受控的照明和相机设置，可以大大提高CFU图像的可重复性，这对于自动分析非常重要。菌落形态、荧光强度以及时间或密度对菌落生长的影响只是可以使用照片分析的几个特性。如果不使用荧光细菌，则可以在没有滤色片和单色灯的情况下构建照片盒，从而降低成本和复杂性。如果实验室使用不同的荧光团，则可以使用不同的激发光和发射滤光片代替此处推荐的激发光和发射滤光片。使用应用程序通过WiFi连接到平板电脑的相机对于自动快门功能以防止晃动和易于数据传输都很有用。图像可以传输到平板电脑，然后使用无线文件传输软件传输到笔记本电脑。具有这些功能的推荐相机在 材料表中注明。
Count-On-It是用ImageJ编写的插件。自动 CFU 计数软件将板图像分割成统一的 96 孔网格，对每个网格细胞中的菌落进行计数，并将结果批处理到简单的电子表格中。由于专色网格在印版和照片中的位置始终存在变化，因此用户必须使用 Croptacular 插件手动使网格与照片保持一致。这也有助于排除板边缘附近有眩光的区域。设置阈值是从图像中获取最准确的 CFU 计数的关键。如果阈值设置得太高，菌落将合并;如果阈值设置得太低，菌落将被排除在外。设置阈值后，宏应用高斯模糊来柔化边缘并减少锯齿，分水岭过滤器划分重叠的菌落，并使用分析粒子对斑点进行计数。
有时，特定地点的菌落密度过高。Count-On-It提供了一种处理此问题的方法。为了估计具有部分合并菌落的网格细胞中的菌落数量，首先将整个板中圆形斑点的平均面积取为Cavg。然后，将斑点A 1 的面积除以圆形斑点 A1/C的平均面积。 此数字四舍五入到最接近的整数，这是 blob 中菌落数的估计值。此功能是阈值会影响计数结果的原因之一：根据阈值对合并斑点的影响，相对平均菌落面积与合并斑点面积会有所不同。
所介绍的方法有几个局限性。其中包括需要从 96 孔板准确分配液体培养基的设备。这种设备，无论是 96 通道移液器还是开槽复制器销工具，可能需要花费数千美元才能获得。存在更便宜的替代品，但不太准确。通过 Count-On-It 自动 计数也存在一些限制。例如，如果仅根据大小分隔混合种群中的两种菌落类型，则 blob 计数将无法将菌落分配给正确的类型。在这种情况下，需要从计数中消除带有斑点的斑点。基于形态学的菌落进一步分化将是目前尚未实施的方法的有价值的扩展。使用选择性培养基（包括菌株特异性营养素和抗生素）简化了对复杂图像分析的需求。
在 96 孔板中维持果蝇实验可使可在单个实验中测试的样品和条件数量成倍增加，并且可以促进 果蝇-细菌关联表型的高通量筛选。我们设想这种方法可以通过使用选择性培养基来区分复杂混合物中的许多细菌菌株来扩展。该方法不仅限于对苍蝇微生物组的研究。CFU的定量在微生物学的许多应用中都很常见，从饮用水中的大肠菌群计数到病原体的鉴定。这里介绍的CFU电镀系统可实现高通量筛分，以及结果的自动采集、处理、存储和交付。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Kerwyn Casey Huang博士，Andrés Aranda-Díaz博士，Ted Cooper和Ludington实验室的成员对该协议的开发提供了宝贵的意见。资金由NSF IOS拨款2032985，NIH拨款DP5OD017851，加拿大卡内基研究所拨款和卡内基科学研究所捐赠基金提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead beating and spot plating | |||
| Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
| Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
| Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
| Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
| Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
| MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
| Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
| TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
| Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
| Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
| Photobox construction | |||
| ¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
| ¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
| ¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
| 1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
| 22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
| 22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
| 4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
| 4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
| 6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
| 6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
| 8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
| Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
| Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
| Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
| Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
| Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
| Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
| Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
| Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
| Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
| SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
| Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
| Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
| Software | |||
| ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
| MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
| Unix | BSD | N/A | 64 bit |
| Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |
References
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