Summary
Deze methode kwantificeert microbiële abundantie met behulp van een 96-well plaatformaat om kolonievormende eenheden (CFU's) te vergulden en wordt toegepast op het Drosophila-microbioom in hele vlieghomogenaatmonsters. CFU's worden geteld met een geautomatiseerde beeldanalysesoftware die hier wordt geleverd.
Abstract
De darmen van dieren worden gekoloniseerd door commensale microben, die de ontwikkeling, gezondheid en het gedrag van de gastheer beïnvloeden. Nauwkeurige kwantificering van kolonisatie is essentieel voor het bestuderen van de complexe interacties tussen gastheer en microbe, zowel om de microbiële samenstelling te valideren als de effecten ervan te bestuderen. Drosophila melanogaster, dat een lage inheemse microbiële diversiteit heeft en economisch is om op te voeden met een gedefinieerde microbiële samenstelling, is naar voren gekomen als een modelorganisme voor het bestuderen van het darmmicrobioom. Het analyseren van het microbioom van een individueel organisme vereist identificatie van welke microbiële soorten aanwezig zijn en kwantificering van hun absolute overvloed. Dit artikel presenteert een methode voor de analyse van een groot aantal individuele vliegenmicrobiomen. De vliegen worden bereid in 96-well platen, waardoor de behandeling van een groot aantal monsters tegelijk mogelijk is. Microbiële abundantie wordt gekwantificeerd door tot 96 hele vlieghomogenaten op een enkele agarplaat op een reeks vlekken te leggen en vervolgens de kolonievormende eenheden (CFU's) te tellen die op elke plek groeien. Dit platingsysteem is gekoppeld aan een geautomatiseerd CFU-kwantificeringsplatform, dat fotografie van de platen, differentiatie van fluorescerende kolonies en geautomatiseerde telling van de kolonies met behulp van een ImageJ-plug-in omvat. Voordelen zijn dat (i) deze methode gevoelig genoeg is om verschillen tussen behandelingen te detecteren, (ii) de spotplating-methode net zo nauwkeurig is als traditionele platingmethoden, en (iii) het geautomatiseerde telproces nauwkeurig en sneller is dan handmatig tellen. De hier gepresenteerde workflow maakt high-throughput kwantificering van CFU's in een groot aantal replicaties mogelijk en kan worden toegepast op andere microbiologische studiesystemen, waaronder in vitro en andere modellen voor kleine dieren.
Introduction
De relatie tussen darmmicrobiota en hun dierlijke gastheer staat steeds meer in de voorhoede van biologische studies1, die aantonen dat de stamsamenstelling van het microbioom belangrijk is voor de gastheerfysiologie 2,3,4. Het tempo van ontdekking is beperkt door verstorende factoren zoals hoge natuurlijke interindividuele variatie en hoge diversiteit van koloniserende bacteriën 5,6,7. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is naar voren gekomen als een veelbelovend model vanwege zijn van nature lage diversiteit microbioom, gebruiksgemak en robuuste gastheergenetica 8,9,10,11. Vliegen kunnen kiemvrij worden gemaakt en opnieuw worden geassocieerd met een gedefinieerde microbiota12, en het is aangetoond dat de flora invloed heeft op de fysiologische eigenschappen van vliegen13,14. De aangeboren flora bestaat uit een beperkte reeks bacteriën die allemaal kweekbaar zijn, en nauwe verwanten hiervan zijn ook endogeen voor de darm van zoogdieren, waaronder Lactobacillen, Proteobacteria en Enterococci15.
Het bestuderen van de invloed van het microbioom op gastheereigenschappen vereist kwantificering van het microbioom in termen van zowel welke soorten aanwezig zijn als hun absolute abundanties16. De belangrijkste manieren om het vliegenmicrobioom te analyseren zijn kolonievormende eenheid (CFU) tellingen17, 16S rRNA-gen amplicon sequencing9 en qPCR van het 16S rRNA-gen18. CFU-tellingen kunnen worden verkregen zonder dure reagentia en ze bevestigen de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen19. De 16S-technieken, waaronder qPCR, hebben voordelen in die zin dat taxonomische identiteiten van microben kunnen worden vastgesteld zonder rekening te houden met hun groeivereisten of koloniemorfologieën20.
In het geval dat experimenten vliegen gebruiken met een gedefinieerd microbioom van bekende bacteriën (gnotobiotische vliegen), hebben CFU-tellingen bijzondere voordelen ten opzichte van sequencing21. Sequencing is duur en vereist DNA-extractie, PCR-gebaseerde bibliotheekvoorbereiding en high-throughput sequencing om relatieve abundanties te verkrijgen22. Vanwege de hoge kosten moeten sequencingmethoden met hoge doorvoer meestal in bulk worden uitgevoerd om de prijs per monster te verlagen23. Verdere methoden zoals qPCR zijn vereist om absolute abundanties te verkrijgen16. CFU-tellingen daarentegen zijn snel en goedkoop en geven de absolute aantallen levensvatbare cellen. Drosophila8 en andere kleine microbioommodellen24, waaronder de worm, Caenorhabditis elegans25,26, en de larvale zebravis, Danio rerio, gnotobiotisch gekweekt27, hebben een beperkt aantal bacteriën, die bekende groeikenmerken hebben28. In deze gevallen, met name bij gnotobiotische dieren, kan CFU-telling alle soorten bacteriën binnen de multispecies darmgemeenschappen onderscheiden 21,27,29. CFU-telmethoden met een hogere doorvoer zouden de kosteneffectiviteit en snelheid van het meten van de samenstelling van het microbioom verder verbeteren en kunnen worden toegepast op vele andere microbiologische experimenten.
Het tellen van CFU's door seriële verdunning van een bacteriële suspensie op op agar gebaseerde groeimedia is een standaardmethode op het gebied van microbiologie. De kolonies die op de platen groeien, worden dan handmatig geteld. De verdunningen stellen de onderzoeker in staat om een dichtheid van kolonies te selecteren die aftelbaar is (bijv. ~ 100 CFU's per plaat), wat betekent dat de kolonies niet in elkaar groeien en in een redelijke hoeveelheid tijd kunnen worden geteld. De meeste microbiologen gebruiken in wezen dezelfde CFU-telmethode die 140 jaar geleden is ontwikkeld in het laboratorium van Robert Koch, en voor veel toepassingen is deze methode nog steeds adequaat. Er ontstaat echter een probleem bij het kwantificeren van een groot aantal monsters. Een enkel monster kan 1 tot 10 seriële verdunningen van het monster vereisen om telbare CFU's te verkrijgen, zodat experimenten met meer dan enkele tientallen monsters belastend worden. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de efficiëntie van CFU-inventarisatie te verhogen. Geautomatiseerde spiraalbeplating elimineert de noodzaak van seriële verdunningen30, waardoor slechts één plaat nodig is voor CFU-telling, maar de tijd om het monster te platen toeneemt. Single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) maakt CFU-schattingen mogelijk van minder platen per monster31. Deze methoden zijn een verbetering ten opzichte van de traditionele spread-plating-methode, maar vereisen nog steeds het afzonderlijk hanteren en plating van bacteriële monsters en zijn dus niet ideaal voor een hoge doorvoer. Het hanteren van monsters in 96-well platen en het spotten van die 96 monsters op rechthoekige agarplaten verbetert de doorvoer van monsters19 aanzienlijk.
Microbiomen zijn meestal samengesteld uit meerdere stammen en soorten. Hoewel soorten vaak kunnen worden onderscheiden door koloniemorfologie of groeimedia, kan fluorescentie worden gebruikt om verschillende soorten bacteriën en hun groeikenmerken verder te onderscheiden32. Verschillende genotypen van dezelfde soort kunnen bijvoorbeeld worden gelabeld met verschillende genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten. Plaatbeeldvormingsmethoden die fluorescentie bevatten, stellen onderzoekers in staat om te profiteren van deze genetische technieken in op CFU gebaseerde assays32. Het opnemen van fluorescentie in CFU-telmethoden met hoge doorvoer zou hun nut verder verbeteren.
Het handmatig tellen van CFU's wordt omslachtig wanneer er een groot aantal monsters is. Geautomatiseerde telling van CFU's kan worden uitgevoerd door de plaat te fotograferen en het beeld te verwerken met behulp van gespecialiseerde software33. Sieuwerts et al. combineerden de verbeterde plating-efficiëntie van spot-plating met geautomatiseerde kolonietellingen met behulp van conventionele digitale fotografie en ImageJ-software19.
Een high-throughput methode om de fenotypen van specifieke microben en gastverenigingen te screenen, zou bijdragen aan studies van microbioomgemeenschapsvergadering en de impact op de gezondheid en fitheid van de gastheer. Voor studies van het Drosophila-microbioom zou een microbiologisch platform met hoge doorvoer de behandeling van vliegenmonsters in 96-wells plaatformaat, vliegenlysis zonder bacteriële lyse, de efficiëntie van spotplating, de mogelijkheid om fluorescentie te gebruiken en meerdere fluoroforen te onderscheiden, een gecontroleerde lichtomgeving voor reproduceerbare beeldvorming van CFU-platen en een betrouwbare geautomatiseerde kolonietelsoftware omvatten. Dit artikel beschrijft een methode die is geoptimaliseerd voor de bepaling van CFU's in gnotobiotische vliegen, die eenvoudig, snel en geautomatiseerd is. Dit protocol schetst een nieuwe workflow die het beste van eerder gepubliceerde methoden combineert en geoptimaliseerd is voor het verkennen van het darmmicrobioom in Drosophila.
Protocol
1. Vliegkolonisatie
OPMERKING: Deze methode is geschikt voor kwantitatieve analyse van vliegen met een cultureerbaar darmmicrobioom door groeiplating van CFU's. Een gedetailleerd protocol voor het fokken van gnotobiotische vliegen is eerder gepubliceerd12.
- Stel stabiele kolonisatie vast door een commensale bacteriesoort.
- Bereid een verse bacteriecultuur, pellet door centrifugeren bij 400 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, en resuspenseer de celpellet in PBS tot een OD600 van 1,0. Voor dit protocol werd Lactiplantibacillus plantarum (voorheen bekend als Lactobacillus plantarum) 's nachts gekweekt tot een OD600 van 2,0.
- Pipetteer 100 μL op het voedsel in een vliegenflacon (zie Materiaaltabel). Verdeel gelijkmatig en laat de vloeistof 15-30 min intrekken.
- Breng 20 kiemvrije vliegen over in deze injectieflacon met behulp van de standaardflacon naar injectieflacon omdraaitechniek34. Elke vlieg eet ongeveer evenveel van de bacteriële dosis35. Als alternatief kunnen kiemvrije eieren worden toegevoegd.
- Breng de vliegen dagelijks gedurende 3 dagen over naar vers steriel voedsel. Doe dit alles in een bioveiligheidskast en gebruik steriele techniek (figuur 1A-1).
- Voordat u de CFU-belasting meet, brengt u de vliegen gedurende 4 uur over naar een injectieflacon met steriel agarwater om voorbijgaande bacteriën uit de darm te verwijderen. De agar-waterflacons bieden een bron van vocht voor de vlieg, maar geen voeding voor de vlieg of bacteriën op het oppervlak. Ze worden bereid in dezelfde steriele vliegenflacons als bij standaardvoedsel, maar bevatten alleen gedeïoniseerd water en 1,5% agar.
2. Homogeniserende vliegen individueel in een 96-well PCR-plaat
- Bereid van tevoren kraalklopperplaten voor.
- Giet 0,5 μm glaskralen (zie Materiaaltabel) op de kraalmeetlade (3D-geprint met behulp van Supplemental Coding File 1 S1-bead-measurer.stl). Spreid de kralen op de lade zodat alle putten vol en waterpas zijn en borstel vervolgens overtollige kralen af in een conische buis om ze te herstellen.
- Plaats een halfronde PCR-plaat (zie Materiaaltabel) ondersteboven op de maatlade en lijn deze uit met de putjes door deze in de inkeping op de maatlade te plaatsen. Draai het vervolgens snel om om de kralen over te brengen.
- Verwijder overtollige kralen van het PCR-plaatoppervlak en bedek het met folie. Inspecteer de PCR-plaat om er zeker van te zijn dat alle putten kralen bevatten. Gebruik indien nodig een weegschep om kralen aan een enkele put toe te voegen. Als statische elektriciteit ervoor zorgt dat er kralen op de plaatoppervlakken blijven plakken, veeg of spuit dan de achterkant van de meetlade en pcr-plaat met 70% ethanol.
- Dek af met aluminiumfolie. Veel platen kunnen op deze manier worden bereid en vervolgens worden geautoclaveerd en opgeslagen voor later gebruik. Voeg, wanneer u klaar bent voor gebruik, 100 μL PBS toe aan elke put met behulp van de 96-kanaals pipettor (zie Materiaaltabel).
- Steriliseer de microbe-gekoloniseerde vliegen (zie stap 1) met 70% ethanol vóór homogenisatie.
- Verdoof de vliegen met 100% CO2 gedurende 5 s. Breng verdoofde vliegen van de injectieflacon over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een kleine trechter (figuur 1A-2). In deze studie werden meestal 25 vliegen per buis toegevoegd.
- Spuit onmiddellijk ~ 1 ml 70% ethanol in de buis, sluit de buis en meng door inversie gedurende 10 s. Zuig vervolgens de ethanol aan met een P1000-pipet en pas op dat u geen vliegen aanzuigt. Herhaal dit nogmaals met ethanol en vervolgens tweemaal met steriel PBS (figuur 1A-3).
- Sluit na de laatste PBS-wasbeurt de buis en tik er met de dopkant naar beneden een paar keer hard op de bank zodat de vliegen in de dop gaan.
- Open de buis en doseer vliegen in de putten met behulp van een tang (figuur 1A-4). Plaats één vlieg in elke put (figuur 1A-5). Houd de plaat op ijs tijdens het laden om de vliegen verdoofd te houden.
- Sluit de plaat af met thermal bond heat sealing folie (zie Materiaaltabel).
- Verwijder eerst alle verdwaalde kralen die zich dicht bij de putten bevinden, omdat deze lekkage in de folieafdichting kunnen veroorzaken. Zorg ervoor dat de doffe kant van de folie naar beneden op de plaat is gericht en de glanzende kant naar de warmtesealer. Druk de warmtesealer (zie Materiaaltabel) gedurende 5 s stevig aan (figuur 1A-6). Brand met de handapplicator (zie Materiaaltafel) om de folie vast te zetten.
OPMERKING: Slechte afdichting is een oorzaak van monsterverlies.
- Verwijder eerst alle verdwaalde kralen die zich dicht bij de putten bevinden, omdat deze lekkage in de folieafdichting kunnen veroorzaken. Zorg ervoor dat de doffe kant van de folie naar beneden op de plaat is gericht en de glanzende kant naar de warmtesealer. Druk de warmtesealer (zie Materiaaltabel) gedurende 5 s stevig aan (figuur 1A-6). Brand met de handapplicator (zie Materiaaltafel) om de folie vast te zetten.
- Bevestig de plaat in de platenschudder. Homogeniseer gedurende 5 minuten (figuur 1A-7). Draai de kraalplaat gedurende 30 s in een mini-platendraaier (zie Materiaaltafel) op 350 x g om vloeistof uit de afdichtingsfolie te verwijderen.
- Verwijder de folie terwijl u de plaat vasthoudt om geen druppels vlieghomogenaat uit de putten te spatten.
3. Seriële verdunning van vlieghomogenaat en spotting op CFU-platen
- Plaats vier rechthoekige MRS agar groeischijven (zie Tabel van Materialen) in de bioveiligheidskast en verwijder hun deksels. In dit protocol werd MRS agar gebruikt voor de groei van L. plantarum. Laat deze platen minstens 10 min drogen (20 min als ze vers zijn gegoten of koud uit de opslag komen).
OPMERKING: Als de platen nat zijn, zullen de druppels van de 96-well plaat samenlopen en de tellingen verpesten. - Bereid drie verdunningsplaten voor door 100 μL PBS toe te voegen aan elke put van een steriele 96-well plaat met behulp van een 96-kanaals pipettor. Plaats een rek met P20-tips op de 96-kanaals pipettor.
- Voer een verdunning van 1:10 uit door 11,1 μL homogenaat uit de in punt 2 bereide monsterplaat te zuigen (figuur 1A-8). Zorg ervoor dat u uit het midden van de putten trekt in plaats van uit de bodem van de putten, omdat de vlieghomogenaat en glaskralen de pipetten zullen verstoppen. De kralen zinken en de vliegdeeltjes drijven, waardoor de middelste laag grotendeels helder blijft.
- Doseer de 11,1 μL in de eerste verdunningsplaat, die al 100 μL steriel PBS per put bevat. Houd de verdunningsplaat 10 s op de platenschudder bij 600 rpm. Meng opnieuw door vijf cycli op en neer te pipetteren. Breng 11,1 μL over van de eerste verdunningsplaat naar de tweede verdunningsplaat en herhaal de mengstappen voor de volgende twee verdunningsplaten.
- Voer verdunningsreeksplating uit zoals hieronder beschreven.
- Haal de groeischijven uit de bioveiligheidskast.
- Begin met de meest verdunde plaat en spot 2 μL van elke put op de agarplaten met behulp van de 96-well pipettor (figuur 1A-9).
- Laat de pipettorkop langzaam op de plaat zakken en zorg ervoor dat je niet in de agar steekt. Onderzoek de plaat zorgvuldig en zorg ervoor dat alle vlekken zijn afgegeven; zo niet, voeg dan handmatig 2 μL toe aan de juiste positie. Controleer of de vloeistofvlekken snel in de agar trekken en niet samen lopen.
- Als de vlekken samenlopen, droog dan een nieuwe set verse agarplaten voor een langere periode en doe de spotting opnieuw. Als er meerdere plaattypen zijn (bijvoorbeeld verschillende media of met antibiotica), zoek die dan ook. Doseer de resterende oplossing terug in de verdunningsplaat en ga verder met de volgende hogere concentratie.
OPMERKING: Meng bij het spotten van verdunningen de volgende verdunning vijf keer om ervoor te zorgen dat de inhoud van de pipetpunten vrij is van de vorige verdunning. De verdunningsplaten kunnen >8 uur bij 4 °C worden bewaard zonder de kolonietellingen35 aan te tasten.
- Herhaal het beplatingsproces zoals beschreven in stap 3.5 voor de resterende verdunningsplaten, gaande van meest verdund naar meest geconcentreerd tot de plaat met het oorspronkelijke homogenaat.
- Wanneer alle vloeistof in de agar is opgenomen, keert u de platen om en plaatst u ze in de incubator (figuur 1A-10). Voor Lactiplantibacillus en Acetobacter van Drosophila is de optimale temperatuur 30 °C op MRS-media. Incubeer totdat de kolonies de optimale grootte hebben bereikt: kolonies zijn groot genoeg om ze duidelijk te zien, maar niet zo groot dat ze samensmelten of interfereren met elkaars groei (zie de representatieve resultaten voor kwantificering van de optimale grootte).
OPMERKING: Optimale groeiomstandigheden zijn spanningsafhankelijk en moeten empirisch worden bepaald. Voor Lactiplantibacillus van Drosophila is de optimale incubatietijd 26 uur tot 30 uur op MRS agar. Voor Acetobacter van Drosophila is de optimale incubatietijd 30 uur tot 48 uur op MRS, afhankelijk van de stam. - Bewaar de platen na incubatie indien nodig bij 4 °C totdat ze klaar zijn om te tellen.
4. Kwantificering van CFU's
- Kwantificeer CFU's door de platen te fotograferen en vervolgens de kolonies te tellen met behulp van geautomatiseerde software, zoals hieronder beschreven. Als de platen bij 4 °C zijn bewaard, laat ze dan eerst op kamertemperatuur komen, zodat er geen condensatie op de platen is, wat verblinding veroorzaakt.
- Organiseer de platen in een logische volgorde en houd ze in die volgorde tijdens het fotograferen - het maakt het gemakkelijker om de bestanden een naam te geven. Oriënteer alle platen zo dat A1 in de linkerbovenhoek staat voor alle platen. Het wordt aanbevolen om de A1-hoek te labelen met een unieke ID om ervoor te zorgen dat de foto's niet worden verward. Stapel elke verdunningsreeks in volgorde.
- Verwijder het plaatdeksel en plaats de plaat op het podium met A1 in de juiste hoek georiënteerd. Ontwerpen zijn inbegrepen voor de plaatfotodoos (Supplemental File 1, Supplemental File 2), die is geoptimaliseerd voor het fotograferen van deze trayplaten en verlichtings- en filteropties bevat om fluorescerende kolonies in beeld te brengen.
- Stel je de platen voor. Gebruik de camera (zie Materiaaltabel) met handmatige instellingen om een consistent belichtingsniveau tussen platen te bereiken. Een instelling voor een lange brandpuntsafstand wordt aanbevolen om perspectiefvervorming te minimaliseren. Leg de foto vast met een externe sluiter om onscherpte door camerabewegingen te minimaliseren.
- Breng de afbeeldingen over naar een computer en wijzig de naam ervan, inclusief de naam van het experiment, het type media, de verdunningsfactor en andere relevante details. Sommige besturingssystemen (zie Materiaaltabel) hebben een handige functie voor het wijzigen van batches in Finder door met de rechtermuisknop op een selectie van bestanden te klikken.
5. Geautomatiseerde kolonietelling met behulp van de Count-On-It-suite (Aanvullend bestand 3)
- Snijd de afbeeldingen bij met behulp van de meegeleverde Croptacular-plug-in (Supplemental Coding File 2) voor ImageJ. Deze plug-in helpt om de afbeelding op te delen in een ordelijke reeks subregio's (bijvoorbeeld 8 x 12 voor een plaat met 96 putten). De subregio's worden individueel geteld.
OPMERKING: Een aparte plug-in voor het tellen van cirkelvormige platen genaamd Circus wordt beschreven in het Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.- Organiseer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt voor kwantificering in een map. Kies bestandsnamen die de platen onderscheiden, omdat deze bestandsnamen kolomtitels worden voor elke reeks tellingen . Maak in deze map submappen met de naam 'bijgesneden' en 'ontvangstbewijzen'.
- Start Croptacular en klik op OK om te beginnen met bijsnijden.
OPMERKING:De standaardinstellingen worden weergegeven en zijn meestal voldoende. Afhankelijk van de resolutie van het beeld, de belichting, de spotgrootte, etc., kan het handig zijn om de basisparameters aan te passen. - Als de afbeelding al recht is, drukt u gewoon op Spatiebalk. Anders kunt u de afbeelding rechttrekken door een lijn te tekenen langs een rand die horizontaal moet worden. Teken de lijn zo vaak als nodig opnieuw als de afbeelding nog steeds niet rechtgetrokken wordt weergegeven.
- Teken vervolgens een grensvak van het gebied waarvoor moet worden geteld. Pas de grootte en verhouding aan totdat alle vlekken zich in hun cellen bevinden. Sleep de cursor buiten het grensvak om het raster te vernieuwen. Wanneer het raster er goed uitziet, drukt u op Spatiebalk.
- Zorg ervoor dat de volgende afbeelding automatisch in dezelfde hoek draait als de eerste. de plug-in gaat ervan uit dat alle foto's hetzelfde zijn uitgelijnd. Als dit juist is, drukt u op Spatiebalk om door te gaan. Anders zet u de afbeelding recht zoals voorheen. Het raster herinnert ook aan dezelfde positie als de vorige afbeelding; indien nodig aanpassen en druk vervolgens op Spatiebalk.
- Som de kolonies op de platen op met behulp van de meegeleverde Count-On-It: Gridiron-plug-in voor ImageJ (Supplemental Coding File 4). Gedetailleerde instructies voor het installeren en gebruiken van de plug-in zijn opgenomen in Supplemental File 3.
- Start Count-On-It > Gridiron. Gebruik dezelfde rasterinstellingen als bij Croptacular. Gebruikers kunnen een hele map batchen, één afbeelding analyseren of beginnen met de huidige afbeelding.
- Stel de drempel in op basis van een bovenste en een lagere pixelintensiteitswaarde. Maak de drempel zo streng mogelijk terwijl u nog steeds alle kolonies selecteert. Idealiter is er enige ruimte tussen de geselecteerde kolonies, maar de software is in staat om de klodders tot op zekere hoogte te segmenteren. Klik op OK in het dialoogvenster "Actie vereist" wanneer de drempel bevredigend is.
- Om de resultaten te inspecteren, zoomt u in en kijkt u beter naar de kolonietellingen. Als u op annuleren klikt, wordt de plug-in afgebroken. Klik op OK om door te gaan.
- Zorg er op de eerste afbeelding voor dat de optie wordt gegeven om door te gaan of terug te keren naar het setup-menu, bijvoorbeeld om de minimale koloniegrootte te wijzigen. Als u wilt doorgaan met het batchproces, klikt u op OK. Selecteer vervolgens een map om de tabel met ontvangstbewijzen en resultaten te bewaren. Gebruik de map "bonnen" of maak een nieuwe map.
- Na de eerste afbeelding worden de volgende afbeeldingen standaard op dezelfde drempel geplaatst als de vorige instellingen. Klik op OK om deze instellingen te gebruiken of de instellingen aan te passen. Als de foto's consistent zijn en de instelling nauwkeurig is, klikt u op OK in het dialoogvenster 'Actie vereist'.
OPMERKING: Zodra alle afbeeldingen in de batch zijn voltooid, wordt de resultatentabel automatisch opgeslagen in dezelfde map als de ontvangstbewijzen. - Controleer de telbewijzen die door de software worden geproduceerd en corrigeer handmatig eventuele telfouten. De ImageJ-plug-in is statistisch nauwkeurig, maar er treden wel fouten op. Bewijs de ontvangsten om uitschieters te onderzoeken en mistellingen te identificeren. De software slaat de CFU-gegevens op als een .csv bestand in dezelfde map als de ontvangstbewijzen.
- Analyseer de gegevens met behulp van de software die door de gebruiker wordt geprefereerd.
Representative Results
Inventarisatie van CFU's in honderden individuele vliegen in 96-well plaatformaat met behulp van kolonisatietest
Om de samenstelling van veel individuele vliegenmicrobiomen te begrijpen, werden CFU's gemeten met behulp van het bijbehorende protocol, dat identificatie van de aanwezige soorten, het percentage gekoloniseerde vliegen en de absolute overvloed aan bacteriën in elke vlieg mogelijk maakte. De redenen voor de grote waargenomen individueel-op-individu variatie in microbioomsamenstelling zijn slecht begrepen, en het kwantificeren van de statistische verdeling van kolonisatie kan helpen om deze variatie te bestuderen36,37. Om een aanzienlijk aantal biologische replicaties te verkrijgen, werd een high-throughput pijplijn ontwikkeld voor de kwantificering van microbenrijkdom in veel individuele vliegen met behulp van CFU-tellingen (figuur 1A).
De uiteindelijke kwantificering van CFU's kan worden beïnvloed door hoe vliegen worden behandeld voorafgaand aan de analyse, bijvoorbeeld factoren zoals oppervlaktesterilisatie, tijd sinds consumptie van bacteriën en klaring van voorbijgaande bacteriën uit de darm. Ten eerste, gericht op de Drosophila commensale bacteriesoort L. plantarum (Lp; zie Lp stam WF in Obadia et al.36), kregen vliegen een dosis van ~ 105 CFU's lp en werden ze in groepen van 25 vliegen per injectieflacon gehouden. Deze vliegen werden ofwel gedurende 3 dagen in dezelfde injectieflacon bewaard of dagelijks overgebracht (overgebracht) naar vers, steriel voedsel (figuur 1B). Niet-overgedragen vliegen werden vervolgens gewassen in ethanol om oppervlaktebacteriën te verwijderen (gewassen) of niet gewassen (ongewassen). Wassen produceerde een niet-significante vermindering van de totale gemeten CFU's (figuur 1B), wat aangeeft dat onder deze sterk gecontroleerde inentingsomstandigheden het vliegoppervlak niet significant gekoloniseerd wordt door bacteriën in 3 dagen. De andere groepen vliegen werden elke dag overgebracht om de ophoping van bacteriën uit de groei op voedsel te verminderen (Overgedragen); bovendien werd een groep gedurende 4 uur overgebracht naar vers voedsel voordat ze werden bemonsterd (post-transfer), of ze werden gedurende 4 uur in injectieflacons met alleen steriel agarwater geplaatst (gewist) om tijdelijk ingenomen microben uit de darm te laten verdwijnen. Elk van deze stappen om strengere kolonisatiemetingen te bieden, produceerde een statistisch significante vermindering van de overvloed aan CFU's in de vliegen, met uitzondering van oppervlaktewassing in ethanol. Overdracht naar steriel voedsel (Post-Transferred) of agar-water (Gewist) gedurende 4 uur vóór de meting veroorzaakte niet te onderscheiden effecten, wat aangeeft dat overdracht naar steriele omstandigheden 4 uur voorafgaand aan de meting de bacteriële belasting vermindert. Dit resultaat komt overeen met de interpretatie dat sommige darmbacteriën in de vliegendarm van voorbijgaande aard zijn, terwijl andere stabieler geassocieerd zijn35. De abundantie van Lp varieerde van 1 x 104,3 CFU's/vliegen in geklaarde vliegen tot 1 x 104,9 CFU's bij de ongewassen vliegen (n = 724 vliegen).
Vervolgens werd dezelfde test uitgevoerd met Acetobacter indonesiensis (Ai), een gramnegatieve bacterie die de vliegendarm koloniseert (figuur 1C; zie stam Ai SB003 in Obadia et al.36). Net als bij Lp-gekoloniseerde vliegen produceerde oppervlaktesterilisatie een niet-significante vermindering van CFU's. Evenzo verminderde dagelijkse overdracht naar steriel voedsel de bacteriële belasting aanzienlijk en de overdracht naar steriele omstandigheden gedurende 4 uur voorafgaand aan homogenisatie veroorzaakte een verdere vermindering van de bacteriële belasting. De abundantie van Ai varieerde van 1 x 104,7 CFU's/vliegen in geklaarde vliegen tot 1 x 105,0 CFU's bij de ongewassen vliegen (n = 528 vliegen). Nauwkeurige kwantificering van darmbacteriën hangt dus af van de frequentie van overdracht, inclusief op de dag van overdracht. Het verwijderen van de externe bacteriële belasting door het wassen in ethanol had een niet-significant effect, maar meer significante effecten kunnen worden waargenomen voor verschillende bacteriestammen of verschillende kweekomstandigheden. Deze factoren moeten experimenteel worden gecontroleerd.
Het potentiële effect van de homogenisatiemethode op CFU-tellingen werd ook getest. De vliegen werden gehomogeniseerd met behulp van een kraalklopper met 0,5 μm glasparels in 100 μL PBS, wat de levensvatbaarheid van bacteriële cellen zou kunnen verminderen. Eerst werd een suspensie van Lp-bacteriën uit cultuur bereid in PBS en vervolgens verguld om CFU's als een positieve controle te tellen. Dezelfde cultuur werd in de kraalklopperplaat geplaatst en (i) gehomogeniseerd met kralen, (ii) gehomogeniseerd met kralen en een kiemvrije vlieg, of (iii) gehomogeniseerd in PBS zonder kralen (figuur 1D). Homogenisatie in kralen wanneer een vlieg aanwezig was, had geen significante invloed op de overvloed aan levensvatbare cellen in oplossing, terwijl de homogenisatie van bacteriën in afwezigheid van een vlieg een aanzienlijk aantal bacteriële cellen doodde. Homogenisatie in PBS zonder kralen verminderde ook het aantal levensvatbare cellen aanzienlijk. Evenzo werd de levensvatbaarheid van Ai behouden wanneer gehomogeniseerd in de aanwezigheid van een vlieg, terwijl homogenisatie zonder een vlieg het aantal levensvatbare cellen in oplossing verminderde (figuur 1E). Deze resultaten geven aan dat het vliegweefsel de bacteriën beschermt tegen vernietiging door de kralen tijdens de homogenisatie. De experimenten in figuur 1D en figuur 1E werden echter uitgevoerd met meer dan 108 CFU's per put. In de praktijk bleken putten met ~106 cellen per put of minder weinig celverlies te vertonen wanneer kralen zonder vlieg werden gebruikt. Het koelen van de plaat op ijs halverwege het kraal kloppen verbetert ook de levensvatbaarheid van de cel. Het belang van deze resultaten is dat lezers zich bewust moeten zijn van deze potentiële problemen en passende controles moeten ontwerpen voor hun specifieke use case.
Nauwkeurigheid van spotplating 96-well platen voor high-throughput CFU kwantificering
Omdat het doel is om de CFU-abundanties voor honderden tot duizenden individuele vliegen te meten, zijn traditionele spread plating-methoden onbetaalbaar tijd- en materiaalintensief. Spotplating is een effectieve en efficiënte methode voor CFU-groei en inventarisatie19,31. De spotplatingmethode maakt gebruik van een 96-kanaals pipettor om 2 μL bacteriële suspensie af te geven op media die zijn bereid in rechthoekige trayplaten (figuur 2A). Elke plek vertegenwoordigt de bacteriële belasting van een enkel monster, zodat 96 vliegen kunnen worden geanalyseerd met een enkele plaat (figuur 2B). De nauwkeurigheid van spotplating werd vergeleken met traditionele beplating door groeischijven te inenten met exact dezelfde 0,0001 OD-suspensie van Lp voor beide methoden. De ophanging werd in PBS vijf keer serieel verdund. Als een head-to-head vergelijking werd 50 μL van het entmateriaal verspreid over individuele ronde platen, of 2 μL vlekken werden gemaakt op rechthoekige MRS-platen. De platen werden vervolgens geïncubeerd bij 30 °C totdat de kolonies telbaar waren. De resulterende CFU-tellingen voor elke verdunning werden gebruikt om de oorspronkelijke concentratie van de suspensie te berekenen en vergeleken (figuur 2C). Ronde platen met 50-500 CFU's werden geteld als de controle. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de high-throughput en traditionele ronde beplatingsmethoden.
Omdat de dichtheid van kolonies hun groei en kwantificering kan beïnvloeden, werd het effect van CFU-dichtheid op de uiteindelijke tellingen getest. Spots met 2 tot 25 kolonies per spot vertoonden geen verschil in uiteindelijke telling in vergelijking met de traditionele ronde plaatmethode (figuur 2C). Vlekken met gemiddeld 35 kolonies leverden resultaten op die iets lager scheef stonden dan de controlestrooiplaten (figuur 2C; p = 0,0017). Nauwkeurig onderzoek van de foto's van individuele vlekken gaf aan dat deze scheefstand te wijten was aan kolonies die elkaar overlappen op dichte plekken. Metingen op basis van vlekken met een gemiddelde van 11 kolonies per spot resulteerden in concentraties die het dichtst bij die op basis van de spread plates lagen (figuur 2C; Spreidplaten: gemiddelde = 1 x 104,4 CFU's; SD = 0,086 vs. spots met 11 gemiddelde kolonies: gemiddelde = 1 x 104,4 CFU's; SD = 0,12, p = 0,42, Welch's t-test).
Het genereren van afbeeldingen van hoge kwaliteit voor kwantificering met behulp van een gespecialiseerd fotografieplatform met wit licht of fluorescentie
High-throughput spot-plating genereert natuurlijk een groot aantal doelgebieden, die nauwkeurig moeten worden geteld. Kwaliteitsfoto's kunnen worden gebruikt om de gegevens te documenteren en het tellen van CFU's te vergemakkelijken. Een robuust en eenvoudig fotografieplatform werd ontwikkeld met behulp van commercieel beschikbare materialen (figuur 3A). Een digitale camera werd bevestigd aan een beugel bovenop een op maat gemaakte lichtbak, FluoroBox genaamd, en werd direct naar beneden gericht, loodrecht op het midden van de plaat. Een gekleurd emissiefilter werd optioneel voor de lens geplaatst met behulp van een filterschuifregelaar. Een lichtscherm voorkwam lensflare door direct licht van de LED-strips eronder te blokkeren. LED-strips verlichtten de plaat vanaf de zijkanten, in plaats van erboven, om verblinding op de plaat te voorkomen. Naast wit licht werden eenkleurige blauwe en groene LED's gebruikt om respectievelijk groene en rode fluorescerende eiwitten te exciteren. De plaat werd op zijn plaats gehouden door een plaathouder op de lade en de lade was uitgerust met ladeschuifregelaars om het plaatsen van de plaat gemakkelijk te maken. Complete ontwerpen zijn beschikbaar in Aanvullend bestand 1 en Aanvullend bestand 2.
Een foto van een spotplaat van Lp-kolonies werd genomen met behulp van witlicht-LED's en een digitale camera om te helpen bij het tellen van kolonies en het onderscheiden van verschillende kleuren en morfologieën (figuur 3B). Om te valideren dat de lichtintensiteit gelijkmatig was, werd de achtergrondintensiteit van de agar gemeten over verschillende gebieden van een plaatfoto (figuur 3C). Om aan te tonen dat de kolonies duidelijk van de achtergrond te onderscheiden zijn, werd de intensiteit over de diameter van 10 verschillende kolonies op verschillende delen van de plaat gemeten en bleek ongeveer ~ 300% hoger te zijn dan de achtergrond (figuur 3C). De plaat werd ingeënt met Lp met een mCherry fluorescerend eiwit-expresserend plasmide, evenals sommige Lp die het plasmide niet bevatten, dus kolonies waren mCherry-positief of mCherry-negatief. Om deze twee soorten kolonies te onderscheiden, werd de plaat gefotografeerd met dezelfde camera met groen LED-licht (515-525 nm) en een rood filter (Tiffen #29), waardoor mCherry-positieve kolonies fluoresceren (figuur 3D). Het verschil in intensiteit tussen mCherry-positief en mCherry-negatief werd gekwantificeerd door de intensiteit over een steekproef van kolonies te meten (n = 10 kolonies). mCherry-positieve kolonies waren ~1.000% hogere intensiteit dan mCherry-negatief (figuur 3E). Kolonies van Ai die GFP uitdrukken en kolonies van Ai die geen fluorescentie uitdrukken, werden gefotografeerd met blauwe LED-lampjes (465-475 nm) en een groen filter (Tiffen #58) (figuur 3F). GFP-positieve kolonies vertoonden een 200% hogere intensiteit dan GFP-negatief (figuur 3G).
Geautomatiseerde telling van CFU's op spotplaten met behulp van de aangepaste ImageJ plug-in Count-On-It
Foto's alleen helpen bij het tellen van kolonies (bijvoorbeeld door de gegevens op te slaan, de gegevens te delen, in te zoomen, een overlay te markeren, kleuren te scheiden, enz.). Het handmatig tellen en organiseren van de resultaten van honderden vlekken kan echter vervelend, tijdrovend en vatbaar zijn voor verschillen van mens tot mens in de uiteindelijke tellingen. Om het telproces te versnellen en de reproduceerbaarheid van tellingen te standaardiseren, werd een gespecialiseerde ImageJ-plug-in genaamd Count-On-It (Figuur 4A) ontwikkeld. Deze plug-in maakt nauwkeurige semi-geautomatiseerde telling van CFU's op agarplaten mogelijk. De gebruiker bereidt afbeeldingen voor op het tellen door ze eerst bij te snijden en recht te zetten met de extra Croptacular-plug-in. De foto's kunnen optioneel batchgewijs worden verwerkt en de drempel kan voor elke plaat worden aangepast. Met verschillende andere opties kan de gebruiker de nauwkeurigheid van het tellen van platen verhogen, waaronder het aanpassen van de lichtgolflengten (RGB-afbeeldingen), het instellen van een bereik van koloniegrootte (in pixels), het wijzigen van de maximale beeldverhouding en het aanpassen van de afmetingen van het actieve selectieraster. Count-On-It voert een tabel met resultaten uit waarbij elke plaat wordt weergegeven als een kolom met CFU-tellingen. Het genereert ook een fotobewijs met een overlay om de telresultaten visueel te documenteren en te helpen bij handmatige foutcorrectie (figuur 4B). Hoewel er fouten optreden, was de relatie bij het handmatig getelde aantal kolonies vergeleken met het aantal kolonies dat met deze plug-in werd geteld (figuur 4C), over het algemeen gelijkwaardig, met lineaire regressie tussen de handmatige en geautomatiseerde tellingen met een helling van 0,95 met een nauwkeurigheid van meer dan 90% (R2 = 0,93), hoewel de fout toenam toen het aantal kolonies de 20 overschreed.
Count-On-It kan ook worden gebruikt om fluorescerende kolonies afzonderlijk te tellen met behulp van de fluorescentiefunctie van de FluoroBox. mCherry-positieve kolonietellingen (figuur 4D) door software plug-in versus handmatig hadden een R2 van 0,92 (figuur 4E). Evenzo hadden GFP-positieve kolonies (figuur 4F) geteld met software plug-in versus handmatig een R2 van 0,90 (figuur 4G). Fluorescerende versus niet-fluorescerende kolonies kunnen binnen een enkele steekproef worden onderscheiden, en koloniegrootte en -vorm kunnen bovendien worden gebruikt om afzonderlijke subpopulaties te onderscheiden (figuur 4H-K). De fotobonnen bieden een record waarmee de gebruiker snel de nauwkeurigheid van de tellingen kan controleren en fouten handmatig kan corrigeren. In figuur 4C, E, G, I, K zijn de fotobonnen niet gebruikt om de telnauwkeurigheid te verbeteren, zodat lezers de onbewerkte uitvoer van de methode kunnen zien. Gevallen zoals in figuur 4G, waar een handmatige telling van 1 een geautomatiseerde telling van 21 opleverde, kunnen snel worden gedetecteerd met behulp van de fotobonnen. In dit geval creëerde schittering op de rand van de plaat klodders die als kolonies werden geteld. Voor elke use case moeten de optimale instellingen voor de software plug-in worden bepaald voordat de hoge doorvoer wordt geteld.
Figuur 1: De kolonisatietest meet CFU's in honderden individuele vliegen met behulp van een 96-well plaatformaat. (A) Picturaal overzicht van de kolonisatietest en high-throughput kwantificeringsmethode die wordt gebruikt zoals beschreven in de protocolsectie. (B) Lactiplantibacillus plantarum (Lp) abundantie in vliegen na de kolonisatietest werd gemeten onder verschillende omstandigheden met behulp van de high-throughput CFU-kwantificeringsmethode. Vliegen werden gedurende 3 dagen in dezelfde injectieflacon bewaard en vervolgens gehomogeniseerd en verguld (ongewassen), gewassen in ethanol vóór het plateren (gewassen), zowel gewassen als elke dag overgedragen (overgebracht), dagelijks overgebracht en vervolgens op steriel voedsel bewaard voordat ze worden platgelegd (post-transfer), of bewaard in injectieflacons met alleen water gedurende 4 uur (gewist) (n = 724 vliegen totaal, 3 biologische replicaties en ~ 72 vliegen totaal per behandeling). (C) Dezelfde test als in (B) werd uitgevoerd met Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 vliegen). (D) Lp bacteriële suspensie werd bereid in PBS en vervolgens verguld om CFU's te tellen of eerst gehomogeniseerd door kraal kloppen, kraal geslagen in combinatie met een kiemvrije (GF) vlieg, of geschud op de kraalklopper zonder kralen of een vlieg (n = 236 monsterputten). (E) De levensvatbaarheid van Ai na homogenisatie werd op dezelfde manier getest als in (D) (n = 282 monsterputten). Statistische significantie voor panelen (B-E) werd berekend met behulp van een Kruskal-Wallis-test gevolgd door paarsgewijze Wilcoxon rank-sum-tests met Bonferroni's meervoudige vergelijkingscorrectie. Box geeft interkwartiel bereik. Lijn geeft de mediaan aan. Snorharen geven een totaal bereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nauwkeurigheid van spotplating 96-well platen voor high-throughput CFU kwantificering. (A) Spotplating met behulp van een 96-kanaals pipettor om 2 μL af te geven op media die zijn bereid in rechthoekige trayplaten. (B) MRS-agar groeischijf met 96 vlekken Lp kolonies. (C) Concentratie van Lp-suspensie op basis van KVE-tellingen van traditionele ronde platen (n = 24 platen) vergeleken met concentratie op basis van KVE-tellingen van spotplaten (n = 680 vlekken) serieel verdund en gerangschikt naar gemiddeld kolonietelling per vlek (~ 48 vlekken voor elke afzonderlijke verdunningsfactor voor drie replicaatplaten werden geteld). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de exacte kolonies per plek, terwijl elke kolom de gemiddelde kolonies voor die verdunning vertegenwoordigt. Horizontale stippellijn geeft de berekende CFU-telling aan van de cultuur die is verguld. Groen omlijnde punten benadrukken de traditionele ronde plaattellingen. Rood gevulde punten markeren de optimale koloniedichtheid van 11 CFU's per 2 μL-spot. Statistische significantie werd berekend met behulp van gewone eenrichtings-ANOVA waarbij het gemiddelde van elke kolom werd vergeleken met het gemiddelde van de spread plate control column met bonferroni's meervoudige vergelijkingscorrectie. Box geeft interkwartiel bereik. Lijn geeft de mediaan aan. Snorharen geven een totaal bereik. **p < 0,01. ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een fotografieplatform produceert kwantificeerbare beelden van platen met wit licht of fluorescentie. (A) Overzicht van het FluoroBox-ontwerp. (B) Foto van een spotplaat van Lp-kolonies met wit licht. (C) Intensiteitsprofiel van afzonderlijke kolonies onder wit licht in vergelijking met de intensiteit van de achtergrond (BKG) (n = 10 kolonies, stippellijn vertegenwoordigt standaarddeviatie). (D) Foto van dezelfde spotplaat als in (B), met behulp van eenkleurige groene lichten en het rode filter om te selecteren op mCherry-positieve Lp-kolonies. (E) Intensiteitsprofiel van afzonderlijke kolonies dat het verschil illustreert tussen kolonies met en zonder mCherry-emissie. (F) Foto van een spotplaat met Ai-kolonies, waarvan sommige een GFP-label hebben. (G) Intensiteitsprofiel van afzonderlijke kolonies dat het verschil illustreert tussen GFP-negatieve en GFP-positieve kolonies. E, F, G: n = 10 kolonies voor elk waarnemingspunt. Koloniediameters zijn ongeveer 1, 5 mm. Stippellijn is SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Nauwkeurige telling van spotplaten door de Count-On-It ImageJ plug-in. (A) Schermafbeelding van het installatievenster van de plug-in. (B) De plug-in genereert een ontvangstbewijs om documenten te tellen en te helpen bij het corrigeren van fouten. Inzet: Overlay met het aantal kolonies geteld voor elke spotregio; de gele omtrek geeft aan dat een enkele kolonie werd geteld en rood dat meerdere kolonies werden geteld. (C) Grafiek met het aantal kolonies dat handmatig is geteld in vergelijking met het aantal kolonies dat is geteld met behulp van de plug-in (geautomatiseerd) wanneer een witlichtbeeld werd gebruikt, waarbij elk punt op de grafiek een enkele vlek vertegenwoordigt die handmatig of automatisch wordt geteld (helling van fit = 0,95, cyaanlijn; 1:1-lijn is rood gestippeld; R2 = 0,93, Pearson's correlatiecoëfficiënt, p < 0,0001). (D) Afbeelding van fotobon van de plug-in wanneer mCherry-positieve kolonies werden geselecteerd met behulp van de fluorescentiefunctie van de fotodoos. (E) Grafiek met het aantal mCherry-positieve kolonies dat handmatig is geteld in vergelijking met de geautomatiseerde methode wanneer rode fluorescentie werd gebruikt (helling van fit = 1,1, cyaanlijn; 1:1-lijn is rood gestippeld; R2 = 0,92, Pearson's correlatiecoëfficiënt, p < 0,0001). Merk op dat uitschieters en fouten niet zijn gecorrigeerd met behulp van de analysebonnen voor E, G, I, K. (F) Afbeelding van fotobonnen van de plug-in wanneer GFP-positieve kolonies werden geselecteerd met behulp van de groene fluorescentiefunctie van het fotovak en het selecteren van het groene kanaal met de plug-in. (G) Grafiek met het aantal GFP-positieve kolonies dat handmatig is geteld in vergelijking met de geautomatiseerde methode wanneer groene fluorescentieverlichting werd gebruikt (helling van fit = 1,1, cyaanlijn; 1:1-lijn is rood gestippeld; R2 = 0,90, Pearson correlatiecoëfficiënt, p < 0,0001). (H) mCherry-positieve kolonies geselecteerd uit gemengde koloniemorfologieën met behulp van een hoge fluorescentiedrempel in de plug-in. (I) Grafiek met het aantal mCherry-positieve kolonies dat handmatig is geteld in vergelijking met de geautomatiseerde methode wanneer rode fluorescentieverlichting werd gebruikt (helling van fit = 0,99; R2 = 0,91, Pearson's correlatiecoëfficiënt, p < 0,0001). (J) mCherry-negatieve kolonies geselecteerd uit gemengde koloniemorfologieën met behulp van een lage fluorescentiedrempel. (K) Grafiek met het aantal mCherry-negatieve kolonies dat handmatig is geteld in vergelijking met de geautomatiseerde methode toen de intensiteitsdrempel werd ingesteld om niet-fluorescerende kolonies te selecteren (helling van fit = 1,1; R2 = 0,85, Pearson's correlatiecoëfficiënt, p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: FluoroBox montage-instructies. Dit bestand leidt de lezer stap voor stap door de constructie van de gecontroleerde verlichtingsbox die in de video wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: FluoroBox acryl lasergesneden. Dit bestand biedt een gesneden sjabloon om de acrylstukken voor de gecontroleerde verlichtingsdoos laser te snijden. Het bestand kan worden verzonden naar een lasergesneden acrylleverancier. Zie de tabel met materialen voor de leverancier die in dit protocol wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Software-instructies. Dit bestand leidt de lezer stap voor stap door de installatie en het gebruik van de Croptacular en Count-On-It software die bij dit protocol wordt geleverd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental Coding File 1: 3D-printcode voor kraalmeetlade (S1-bead-measurer.stl). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental Coding File 2: Rechthoekige plaat foto-bijsnijder ImageJ plugin (Croptacular_.ijm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental Coding File 3: Ronde plaat foto-bijsnijderplug-in (Circus_.ijm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental Coding File 4: Rechthoekige plaat 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De hier gepresenteerde gedetailleerde technieken maken een >100-voudige toename mogelijk van het aantal monsters dat kan worden geëvalueerd in een CFU-telexperiment. Deze techniek bevordert bestaande methoden voor microbioomexperimenten in Drosophila 12,35,36 door het 96-well plaatformaat te gebruiken om individuele vliegen te testen. Verder past het een efficiëntere spotplating methode19,31 toe en een geautomatiseerde workflow met een fotografie- en kolonietelplatform. Het belang van deze methode voor Drosophila is om experimenten te standaardiseren naar het 96-well plaatformaat, wat de gelijktijdige verwerking van een groot aantal biologische replicaties met automatisering mogelijk maakt om high-throughput kwantificering van CFU's te bereiken.
Het 96-well platform laat zien dat een verhoogde frequentie van overdracht en het "opruimen" van voorbijgaande bacteriën een significante vermindering van zowel de gemiddelde abundantie als de variatie tussen monsters veroorzaakt (figuur 1B, C), wat de strengheid van dit verbeterde protocol aantoont. Een beperking van co-housing vliegen is de horizontale overdracht van bacteriën tussen vliegen. Een voorgestelde oplossing is om vliegen individueel te houden in een 96-well plaatformaat, zoals de Whole Animal Feeding Flat38.
Hoewel een significante vermindering van de bacteriële belasting niet werd waargenomen wanneer vliegen in ethanol werden gewassen, waren deze vliegen slechts 3 dagen in de aanwezigheid van externe bacteriën gehouden. Huisvesting voor langere tijdsperioden zou een grotere bacteriële belasting kunnen toestaan om39 te accumuleren. Daarom wordt wassen in ethanol nog steeds aanbevolen.
Het overbrengen van vliegen naar de 96-well plaat is de kritieke eerste stap voor het opzetten van de workflow (figuur 1A). Zodra de vliegen zijn gewassen, worden ze één voor één in de putten verdeeld. Een plaatdiagram is in dit stadium handig om te noteren welke omstandigheden in elke put aanwezig zijn en eventuele notities toe te voegen zoals "vlieg is verloren gegaan". Homogenisatie is een andere cruciale stap met enkele belangrijke kanttekeningen. Bacteriën overleven het homogenisatieproces in de aanwezigheid van een vlieg (figuur 1D, E), en vermoedelijk is dit principe ook waar wanneer de bacteriën zich in de darm van de vlieg bevinden. Bacteriën worden echter ook gedood wanneer ze alleen in kraalklopperplaten worden gehomogeniseerd, wat aantoont dat de homogenisatie de bacteriële cellen in bepaalde omstandigheden kan doden, een beperking die belangrijk kan zijn als men bijvoorbeeld ontlede darmen homogeniseert. Met name het verlies van CFU's bij het homogeniseren is afhankelijk van het aantal CFU's in het monster en het verlies is minimaal wanneer ~ 105 CFU's per put worden gebruikt. Verder behoud van CFU's kan worden bereikt door halverwege de homogenisatie te stoppen en de plaat op ijs af te koelen.
Homogenisatie werd gedurende 5 minuten uitgevoerd in dit protocol op basis van controle-experimenten waarbij een bekend aantal CFU's werden gemengd met een kiemvrije vlieg, en dit werkte empirisch voor vliegenbacteriën. Minder kloppen zorgde ervoor dat grotere vliegdelen aanwezig waren, wat het pipetteren verstoort, terwijl aanzienlijk langere homogenisatietijden van ~ 10 minuten CFU-tellingen variabeler maakten. Het kleinere volume en de schuine vorm van conische plaatputten werden waargenomen om de efficiëntie van het kraal kloppen te verminderen in vergelijking met cilindrische buizen van 2 ml. Er zijn veel variaties op deze algemene benadering mogelijk, waaronder welke bacteriestammen, welke kralen kloppende container, welke kralen en welk vliegengenotype worden gebruikt. Individuele gebruikerscases moeten positieve controles gebruiken om hun aanpak vast te stellen.
De spotplatingmethode werd op een specifieke manier toegepast: 1:2 verdunningen van L. plantarum WF in PBS werden gespot op MRS-platen en geïncubeerd bij 30 °C gedurende 2 dagen (kortere incubatietijden kunnen worden geïmplementeerd om kleinere koloniegroottes te genereren). De methode vereist enige investering vooraf in apparatuur, voornamelijk de kraalklopper en de 96-kanaals pipettor (figuur 2A), die nodig is voor zowel de verdunningsserie als de spotplating. Er zijn echter minder dure opties beschikbaar, waaronder een 96-well plaatreplicator met sleufpennen. De verdunningsreeks is een kritieke stap die de nauwkeurigheid van de CFU-telresultaten beïnvloedt. In termen van faalmodi is het mogelijk om de pipetpunten te verstoppen met vliegende delen of glazen kralen en voor de pipetpunten om niet goed af te sluiten op de pipettor of om een andere reden te falen. Al deze problemen leiden tot ondertelling van de aangetaste putten en moeten worden gecontroleerd. Adequate menging bij elke stap van de verdunningsreeks is ook cruciaal. Elke verdunning moet grondig worden gemengd door de plaat op een platenschudder te leggen of door 15-20 keer op en neer te pipetteren, wat ook dient om de uiteinden te spoelen. Door te spotten van de meest verdunde tot minst verdunde plaat, kunnen de tips worden hergebruikt voor de hele verdunningsreeks. Met 1:2 verdunningen is het tellen nauwkeurig over een bereik van 2-25 kolonies, verspreid over een orde van grootte (figuur 2C). Daarom besparen 1:10 verdunningen tijd en materialen. Een andere variabele waarvan kan worden geprofiteerd, is de incubatietijd, die kan worden aangepast om kleinere kolonies te produceren en zo het bereik van aftelbare plekken te vergroten door het samenvoegen van aangrenzende kolonies te voorkomen.
Een kwaliteitsfoto van de plaat is essentieel omdat het de onbewerkte brongegevens worden waaruit de CFU's worden geanalyseerd en voor onbepaalde tijd kunnen worden gearchiveerd. De FluoroBox is ontworpen om foto's van de platen te produceren met een uniforme lichtintensiteit, waardoor verblinding op het agaroppervlak wordt geminimaliseerd. Bovendien is het ontwerp in staat om selectief fluorescerende kolonies te fotograferen met behulp van led-lampen in één kleur en gekleurde fotofilters (figuur 3A). De constructie van een opstelling zoals de FluoroBox, met gecontroleerde verlichting en camera-instellingen, kan de reproduceerbaarheid van CFU-beelden aanzienlijk vergroten, wat belangrijk is voor geautomatiseerde analyse. Koloniemorfologieën, fluorescentie-intensiteit en de effecten van tijd of dichtheid op koloniegroei zijn slechts enkele van de eigenschappen die kunnen worden geanalyseerd met behulp van de foto's. De fotodoos kan worden gebouwd zonder de kleurfilters en eenkleurige lichten als er geen fluorescerende bacteriën worden gebruikt, waardoor de kosten en complexiteit worden verminderd. Verschillende excitatielampen en emissiefilters kunnen worden vervangen door de hier aanbevolen als een andere fluorofoor door een laboratorium wordt gebruikt. Een camera die via WiFi met een app op een tablet is aangesloten, is handig voor zowel de geautomatiseerde sluiterfunctie om schudden te voorkomen als voor het gemak van gegevensoverdracht. Afbeeldingen kunnen worden overgebracht naar de tablet en vervolgens naar een laptop met behulp van draadloze software voor bestandsoverdracht. Aanbevolen camera's met deze mogelijkheden worden aangegeven in de materiaaltabel.
Count-On-It is een plug-in geschreven in ImageJ. De geautomatiseerde CFU-telsoftware segmenteert het plaatbeeld in een uniform raster met 96 putten, telt de kolonies in elke rastercel en batcht de resultaten in een eenvoudige spreadsheet. Omdat er altijd variatie is in de positie van het spotraster op de plaat en in de foto, moet de gebruiker het raster handmatig aanpassen aan de foto met behulp van de Croptacular plug-in. Dit helpt ook om gebieden in de buurt van de plaatrand uit te sluiten, die verblinding hebben. Het instellen van de drempel is de sleutel tot het verkrijgen van de meest nauwkeurige CFU-telling van de afbeelding. Als de drempel te hoog wordt gesteld, zullen de kolonies fuseren; als de drempel te laag wordt gesteld, worden de kolonies uitgesloten. Zodra de drempel is ingesteld, past de macro gaussiaanse onscherpte toe om de randen te verzachten en aliasing te verminderen, verdeelt het stroomgebiedfilter overlappende kolonies en worden de blobs geteld met behulp van analysedeeltjes.
Soms is de dichtheid van kolonies op een bepaalde plek te hoog. Count-On-It biedt een manier om hiermee om te gaan. Om het aantal kolonies in een rastercel met gedeeltelijk samengevoegde kolonies te schatten, wordt eerst de gemiddelde oppervlakte van een cirkelvormige klodder van de hele plaat genomen als Cavg. Vervolgens wordt de oppervlakte van blob A1 gedeeld door de gemiddelde oppervlakte van een cirkelvormige blob A1/Cgem. Dit getal wordt afgerond op het dichtstbijzijnde gehele getal, en dat is de schatting voor hoeveel kolonies zich in een blob bevinden. Deze functie is een van de redenen waarom de drempel de telresultaten kan beïnvloeden: het relatieve gemiddelde koloniegebied versus een samengevoegd blobgebied zal verschillen, afhankelijk van hoe de drempel samengevoegde klodders beïnvloedde.
De gepresenteerde methoden hebben verschillende beperkingen. Deze omvatten de noodzaak voor apparatuur om vloeibare media nauwkeurig af te geven van 96-well platen. Deze apparatuur, een 96-kanaals pipettor of een sleuf replicator pin tool, kan duizenden dollars kosten om te verkrijgen. Goedkopere alternatieven bestaan, maar zijn minder nauwkeurig. Geautomatiseerd tellen via Count-On-It brengt ook enkele beperkingen met zich mee. Als bijvoorbeeld twee kolonietypen in een gemengde populatie zouden worden afgebakend op basis van alleen de grootte, zou blobteling niet in staat zijn om kolonies aan het juiste type toe te wijzen. In dit geval zouden vlekken met klodders moeten worden verwijderd uit tellingen. Verdere differentiatie van kolonies op basis van morfologie zou een waardevolle uitbreiding zijn van de methode die momenteel niet wordt geïmplementeerd. Het gebruik van selectieve media, waaronder stamspecifieke voedingsstoffen en antibiotica, vereenvoudigt de noodzaak van complexe beeldanalyse.
Het onderhouden van fruitvliegexperimenten in platen met 96 putten vermenigvuldigt het aantal monsters en omstandigheden dat in één experiment kan worden getest en kan high-throughput schermen in Drosophila-bacterie associatiefenotypen vergemakkelijken. We stellen ons voor dat deze methode kan worden uitgebreid door selectieve media te gebruiken om veel bacteriestammen in complexe mengsels te onderscheiden. De methode is niet beperkt tot de studie van het vliegmicrobioom. Kwantificering van CFU's komt vaak voor in veel toepassingen van de microbiologie, van colibacteriën in drinkwater tot de identificatie van pathogenen. Het hier gepresenteerde CFU-platingsysteem maakt schermen met hoge doorvoer mogelijk, evenals geautomatiseerde acquisitie, verwerking, opslag en levering van resultaten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper en leden van het Ludington lab gaven waardevolle input over de ontwikkeling van dit protocol. Financiering werd verstrekt door NSF IOS-subsidie 2032985, NIH-subsidie DP5OD017851, een Carnegie Institution of Canada-subsidie en de Endowment van het Carnegie Institute for Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead beating and spot plating | |||
| Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
| Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
| Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
| Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
| Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
| MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
| Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
| TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
| Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
| Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
| Photobox construction | |||
| ¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
| ¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
| ¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
| 1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
| 22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
| 22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
| 4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
| 4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
| 6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
| 6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
| 8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
| Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
| Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
| Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
| Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
| Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
| Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
| Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
| Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
| Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
| SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
| Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
| Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
| Software | |||
| ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
| MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
| Unix | BSD | N/A | 64 bit |
| Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
- Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740 (2021).
- D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892 (2018).
- Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398 (2020).
- Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272 (2011).
- Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710 (2018).
- Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
- Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219 (2016).
- Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
- Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
- Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
- Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
- Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
- Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
- Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
- Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
- Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
- Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
- Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
- Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
- Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109 (2017).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
- Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
- Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163 (2017).
- Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
- Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).
