Summary
שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.
Abstract
המעיים של בעלי חיים מיושבים על ידי מיקרובים קומנסליים, שמשפיעים על התפתחות המארח, בריאותם והתנהגותם. כימות מדויק של הקולוניזציה חיוני לחקר יחסי הגומלין המורכבים בין המארח למיקרוב הן כדי לאמת את ההרכב המיקרוביאלי והן כדי לחקור את השפעותיו. Drosophila melanogaster, בעל מגוון מיקרוביאלי מקומי נמוך וחסכוני לגידול עם הרכב מיקרוביאלי מוגדר, התגלה כאורגניזם מודל לחקר המיקרוביום של המעיים. ניתוח המיקרוביום של אורגניזם בודד דורש זיהוי של אילו מינים מיקרוביאליים נמצאים וכימות השפע המוחלט שלהם. מאמר זה מציג שיטה לניתוח של מספר רב של מיקרוביום זבוב בודד. הזבובים מוכנים בלוחות של 96 בארות, מה שמאפשר לטפל במספר רב של דגימות בבת אחת. ניתן לכמת את השפע המיקרוביאלי על ידי ציפוי של עד 96 הומוגנטים של זבובים שלמים על צלחת אגר אחת במערך של כתמים, ולאחר מכן ספירת היחידות היוצרות את המושבה (CFUs) הגדלות בכל נקודה. מערכת ציפוי זו משולבת עם פלטפורמת כימות CFU אוטומטית, המשלבת צילום של הלוחות, הבחנה של מושבות פלואורסצנטיות וספירה אוטומטית של המושבות באמצעות תוסף ImageJ. היתרונות הם ש-(1) שיטה זו רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים בין הטיפולים, (2) שיטת הציפוי הנקודתי מדויקת כמו שיטות הציפוי המסורתיות, ו-(3) תהליך הספירה האוטומטי מדויק ומהיר יותר מספירה ידנית. תהליך העבודה המוצג כאן מאפשר כימות בתפוקה גבוהה של יחידות CFU במספר רב של משכפלים וניתן ליישם אותו במערכות מחקר מיקרוביולוגיות אחרות, כולל מבחנה ומודלים אחרים של בעלי חיים קטנים.
Introduction
הקשר בין המיקרוביוטה של המעיים לבין בעלי החיים המארחים שלהם נמצא יותר ויותר בחזית המחקרים הביולוגיים1, המראים כי הרכב המתח של המיקרוביום חשוב לפיזיולוגיה של המארח 2,3,4. קצב הגילוי הוגבל על ידי גורמים מבלבלים כגון שונות טבעית גבוהה בין אינדיבידואלים ומגוון גבוה של חיידקים מתיישבים 5,6,7. זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, התגלה כמודל מבטיח בזכות המיקרוביום בעל המגוון הנמוך הטבעי שלו, קלות הטיפול והגנטיקה החזקה של המארח 8,9,10,11. זבובים יכולים להיות נקיים מחיידקים ולשייך אותם מחדש למיקרוביוטה12 מוגדרת, והוכח כי הפלורה משפיעה על התכונות הפיזיולוגיות של הזבובים13,14. הפלורה המולדת מורכבת מקבוצה מוגבלת של חיידקים שכולם ניתנים לתרבות, וקרובי משפחה של אלה הם גם אנדוגניים למעיים של יונקים, כולל לקטובצילי, פרוטאובקטריה ואנטרוקוצ'י15.
חקר השפעת המיקרוביום על תכונות הפונדקאי דורש כימות של המיקרוביום הן מבחינת המינים הקיימים והן מבחינת השפע המוחלט שלהם16. הדרכים השולטות לניתוח המיקרוביום של הזבובים הן יחידות יוצרות מושבה (CFU) ספירות17, 16S rRNA גן אמפליקון9, ו- qPCR של הגן 16S rRNA18. ניתן להשיג ספירות CFU ללא ריאגנטים יקרים, והם מאשרים את הכדאיות של תאי החיידקים19. לטכניקות 16S הכוללות qPCR יש יתרונות בכך שניתן לברר זהויות טקסונומיות של מיקרובים ללא התחשבות בדרישות הגידול שלהם או במורפולוגיות של מושבות20.
במקרה שבו ניסויים משתמשים בזבובים עם מיקרוביום מוגדר של חיידקים ידועים (זבובים גנוטוביוטיים), לספירת CFU יש יתרונות מיוחדים על פני ריצוף21. ריצוף הוא יקר, ודורש מיצוי דנ"א, הכנת ספרייה מבוססת PCR וריצוף בתפוקה גבוהה כדי להשיג שפע יחסי22. בשל העלות הגבוהה, בדרך כלל יש לבצע שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה בכמויות גדולות כדי להפחית את המחיר למדגם23. שיטות נוספות כגון qPCR נדרשות כדי להשיג שפע מוחלט16. לעומת זאת, ספירות CFU הן מהירות וזולות ונותנות את המספרים המוחלטים של תאים בני קיימא. Drosophila8 ומודלים אחרים של מיקרוביום קטן24, כולל התולעת, Caenorhabditis elegans 25,26, ודג הזברה הזחלי, Danio rerio, שגדל באופן גנוטוביוטי27, יש מגוון מוגבל של חיידקים, אשר ידועים מאפייני גדילה28. במקרים אלה, במיוחד עם בעלי חיים גנוטובוטיים, ספירת CFU יכולה להבדיל בין כל מיני החיידקים בתוך קהילות המעיים הרב-מיניות21,27,29. שיטות ספירת CFU בתפוקה גבוהה יותר ישפרו עוד יותר את העלות-תועלת והמהירות של מדידת הרכב המיקרוביום, וניתן יהיה ליישם אותן בניסויים רבים אחרים במיקרוביולוגיה.
ספירת CFUs על ידי ציפוי דילול סדרתי של תרחיף חיידקים על מדיית גידול מבוססת אגר היא שיטה סטנדרטית בכל תחום המיקרוביולוגיה. המושבות שגדלות על הלוחות נספרות ידנית. הדילולים מאפשרים לחוקר לבחור צפיפות מושבות הניתנת לספירה (למשל, ~100 יחידות יוצרות מושבה לכל צלחת), כלומר המושבות אינן גדלות זו לזו וניתן לספור אותן בפרק זמן סביר. רוב המיקרוביולוגים משתמשים למעשה באותה שיטת ספירת CFU שפותחה לפני 140 שנה במעבדתו של רוברט קוך, ועבור יישומים רבים, שיטה זו עדיין מספקת. עם זאת, מתעוררת בעיה כאשר מבקשים לכמת מספר רב של דגימות. דגימה בודדת עשויה לדרוש ציפוי של 1 עד 10 דילולים סדרתיים של הדגימה כדי לקבל יחידות CFU הניתנות לספירה, כך שניסויים הכוללים יותר מכמה עשרות דגימות הופכים למיסוי. שיטות שונות פותחו כדי להגביר את היעילות של ספירת CFU. ציפוי ספירלי אוטומטי מבטל את הצורך בדילולים סדרתיים30, מה שהופך רק צלחת אחת לנחוצה לספירת CFU אך מגדיל את הזמן לצלחת הדגימה. זיהוי דילול טורי של צלחת יחידה (SP-SDS) מאפשר הערכות CFU מפחות צלחות לכלדגימה 31. שיטות אלה מהוות שיפור בשיטת ציפוי ההתפשטות המסורתית, אך עדיין דורשות טיפול וציפוי של דגימות חיידקים בנפרד ולכן אינן אידיאליות לתפוקה גבוהה. טיפול בדגימות בלוחות 96 בארות וציפוי ספוט של אותן 96 דגימות על לוחות אגר מלבניים משפר מאוד את התפוקה של דגימות19.
מיקרוביום מורכב בדרך כלל ממספר זנים ומינים. בעוד שלעתים קרובות ניתן להבחין בין מינים על ידי מורפולוגיה של מושבות או אמצעי גדילה, ניתן להשתמש בפלואורסצנציה כדי להבחין עוד יותר בין סוגים שונים של חיידקים ותכונות הגדילה שלהם32. לדוגמה, גנוטיפים שונים של אותו המין יכולים להיות מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים שונים המקודדים גנטית. שיטות הדמיית לוחות המשלבות פלואורסצנציה מאפשרות לחוקרים לנצל את הטכניקות הגנטיות הללו במבחנים מבוססי CFU32. שילוב פלואורסצנטיות בשיטות ספירת CFU בתפוקה גבוהה ישפר עוד יותר את התועלת שלהן.
ספירת CFUs באופן ידני הופכת מסורבלת כאשר יש מספר רב של דגימות. ספירה אוטומטית של CFUs יכולה להתבצע על ידי צילום הצלחת ועיבוד התמונה באמצעות תוכנה מיוחדת33. Sieuwerts et al. שילבו את יעילות הציפוי המשופרת של ציפוי נקודתי עם ספירת מושבות אוטומטית באמצעות צילום דיגיטלי קונבנציונלי ותוכנת ImageJ19.
שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון הפנוטיפים של מיקרובים ספציפיים ואגודות מארחות תסייע למחקרים על התכנסות קהילת המיקרוביום וההשפעה על בריאות המארח וכושרו. לצורך מחקרים במיקרוביום דרוזופילה , פלטפורמה מיקרוביולוגית בעלת תפוקה גבוהה תשלב טיפול בדגימות זבובים בפורמט של 96 לוחות, תזה של זבובים ללא תזה חיידקית, יעילות של ציפוי נקודתי, היכולת להשתמש בפלואורסצנטיות ולהבחין בין פלואורופורים מרובים, סביבת אור מבוקרת להדמיה ניתנת לשחזור של לוחות CFU, ותוכנה אוטומטית אמינה לספירת מושבות. מאמר זה מתאר שיטה הממוטבת לבדיקה של יחידות יוצרות מושבה בזבובים גנוטוביוטיים, שהיא פשוטה, מהירה ואוטומטית. פרוטוקול זה מתווה זרימת עבודה חדשנית המשלבת את מיטב השיטות שפורסמו בעבר וממוטבת לחקר מיקרוביום המעי בדרוזופילה.
Protocol
1. התיישבות זבובים
הערה: שיטה זו מתאימה לניתוח כמותי של זבובים עם מיקרוביום מעיים הניתן להתרבות על ידי ציפוי גדילה של יחידות יוצרות מושבה. פרוטוקול מפורט לגידול זבובים גנוטוביוטיים פורסם בעבר12.
- ביסוס התיישבות יציבה על ידי מין חיידקים קומנסאליים.
- הכינו תרבית חיידקים טרייה, כדור על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, והשהה את כדור התא ב- PBS ל- OD600 של 1.0. עבור פרוטוקול זה, Lactiplantibacillus plantarum (שהיה ידוע בעבר בשם לקטובצילוס פלנטרום) גודל בן לילה ל- OD600 של 2.0.
- פיפטה 100 μL על המזון בבקבוקון זבובים (ראו טבלת חומרים). מורחים באופן שווה ומניחים לנוזל להיספג למשך 15-30 דקות.
- העבירו 20 זבובים נטולי חיידקים לבקבוקון זה באמצעות הבקבוקון הסטנדרטי לבקבוקון בטכניקת היפוך34. כל זבוב יאכל כמות שווה בערך של מנת החיידקים35. לחלופין, ניתן להוסיף ביצים ללא חיידקים.
- מעבירים את הזבובים למזון סטרילי טרי מדי יום למשך 3 ימים. עשו את כל זה בארון בטיחות ביולוגית והשתמשו בטכניקה סטרילית (איור 1A-1).
- לפני מדידת עומס CFU, העבירו את הזבובים לבקבוקון המכיל מי אגר סטריליים למשך 4 שעות כדי לפנות חיידקים חולפים מהמעיים. בקבוקוני אגר-מים מספקים מקור לחות לזבוב, אך אינם מזינים את הזבוב או את החיידקים שעל פני השטח. הם מוכנים באותם בקבוקוני זבובים סטריליים כמו במזון רגיל, אך מכילים רק מים שעברו דה-יוניזציה ו-1.5% אגר.
2. הומוגניזציה של זבובים בנפרד בצלחת PCR של 96 בארות
- הכינו מראש צלחות מקציף חרוזים.
- יוצקים חרוזי זכוכית בגודל 0.5 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) על מגש מדידת החרוזים (מודפס בתלת-ממד בעזרת קובץ קידוד משלים 1 S1-bead-measurer.stl). מורחים את החרוזים על המגש כך שכל הבארות מלאות ומישוריות, ואז מצחצחים את החרוזים העודפים לתוך צינור חרוטי כדי לשחזר אותם.
- הניחו לוחית PCR חצאית למחצה (ראו טבלת חומרים) הפוכה על מגש המדידה ויישרו אותה עם הבארות על ידי התאמתה לכניסה במגש המדידה. לאחר מכן, הפוך אותו במהירות כדי להעביר את החרוזים.
- הסר חרוזים עודפים ממשטח צלחת ה- PCR וכסה אותה בנייר כסף. בדוק את צלחת ה- PCR כדי לוודא שכל הבארות מכילות חרוזים. יש להשתמש בכף מדידה אם יש צורך להוסיף חרוזים לבאר אחת. אם חשמל סטטי גורם לחרוזים להידבק על משטחי הצלחת, נגבו או רססו את גב מגש המדידה ולוח ה-PCR ב-70% אתנול.
- מכסים בנייר אלומיניום. ניתן להכין צלחות רבות בדרך זו ולאחר מכן autoclaved ומאוחסן לשימוש מאוחר יותר. כאשר הוא מוכן לשימוש, הוסף 100 μL של PBS לכל באר באמצעות פיפטור של 96 ערוצים (ראה טבלת חומרים).
- עיקור פני השטח של הזבובים המתיישבים במיקרובים (ראו שלב 1) עם 70% אתנול לפני הומוגניזציה.
- הרדימו את הזבובים עם 100% CO2 למשך 5 שניות. העבירו זבובים מורדמים מהבקבוקון לצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל באמצעות משפך קטן (איור 1A-2). במחקר זה בדרך כלל הוסיפו 25 זבובים לכל צינור.
- מיד לרסס ~ 1 מ"ל של 70% אתנול לתוך הצינור, לסגור את הצינור ומערבבים על ידי היפוך במשך 10 שניות. לאחר מכן, לשאוף אתנול עם פיפטה P1000, נזהר לא לשאוף כל זבובים. חזרו שוב על הפעולה עם אתנול, ואז פעמיים עם PBS סטרילי (איור 1A-3).
- לאחר שטיפת ה-PBS האחרונה, סגרו את הצינור, וכשצד הכובע כלפי מטה, הקישו עליו בחוזקה כמה פעמים על הספסל כדי שהזבובים ייכנסו לכובע.
- פתחו את הצינור ושפכו זבובים לתוך הבארות באמצעות מלקחיים (איור 1A-4). הניחו זבוב אחד בכל באר (איור 1A-5). שמרו את הצלחת על הקרח בזמן ההעמסה כדי לשמור על הזבובים מורמים.
- אטמו את הצלחת באמצעות רדיד אלומיניום לאיטום חום של Thermal Bond (ראו טבלת חומרים).
- ראשית, הסר את כל החרוזים התועים הקרובים לבארות מכיוון שאלה עלולים לגרום לדליפה באטם נייר הכסף. ודאו שהצד העמום של נייר הכסף מכוון כלפי מטה על הצלחת והצד המבריק כלפי מעלה לכיוון אוטם החום. לחצו את איטום החום (ראו טבלת חומרים) כלפי מטה בחוזקה במשך 5 שניות (איור 1A-6). יש לשרוף באמצעות המוליך הידני (ראו טבלת חומרים) כדי לאבטח את נייר הכסף.
הערה: איטום לקוי הוא הגורם לאובדן דגימה.
- ראשית, הסר את כל החרוזים התועים הקרובים לבארות מכיוון שאלה עלולים לגרום לדליפה באטם נייר הכסף. ודאו שהצד העמום של נייר הכסף מכוון כלפי מטה על הצלחת והצד המבריק כלפי מעלה לכיוון אוטם החום. לחצו את איטום החום (ראו טבלת חומרים) כלפי מטה בחוזקה במשך 5 שניות (איור 1A-6). יש לשרוף באמצעות המוליך הידני (ראו טבלת חומרים) כדי לאבטח את נייר הכסף.
- אבטחו את הצלחת בשייקר הצלחת. הומוגניות למשך 5 דקות (איור 1A-7). סובבו את לוחית החרוזים במשך 30 שניות בספינר של צלחת קטנה (ראו טבלת חומרים) בגודל 350 x גרם כדי להסיר נוזלים מנייר האיטום.
- הסר את נייר הכסף תוך החזקת הצלחת כדי לא להתיז טיפות של זבוב הומוגני מתוך הבארות.
3. דילול סדרתי של הומוגנט זבוב ותצפית על צלחות CFU
- הניחו ארבעה לוחות גידול מלבניים של MRS agar (ראו טבלת חומרים) בארון הביו-בטיחותי והסירו את המכסים שלהם. בפרוטוקול זה, MRS אגר שימש לצמיחה של L. plantarum. השאירו את הצלחות האלה להתייבש לפחות 10 דקות (20 דקות אם הם שפכו טרי או קר מהאחסון).
הערה: אם הצלחות רטובות, הטיפות מצלחת 96 הבאר יפעלו יחד ויהרסו את הספירות. - הכן שלוש צלחות דילול על ידי הוספת 100 μL של PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות באמצעות פיפטור של 96 ערוצים. טען מתלה של קצוות P20 על הפייפטטור בעל 96 התעלות.
- בצע דילול של 1:10 על-ידי שאיפה של 11.1 μL של הומוגנט מלוח הדגימה שהוכן בסעיף 2 (איור 1A-8). הקפידו לשאוב מאמצע הבארות ולא מתחתית הבארות מכיוון שהזבוב הומוגני וחרוזי הזכוכית יסתמו את הפיפטות. החרוזים שוקעים, וחלקיקי הזבוב צפים, ומותירים את השכבה האמצעית צלולה ברובה.
- יש לחלק את ה-11.1 μL לתוך צלחת הדילול הראשונה, שכבר מכילה 100 μL של PBS סטרילי לכל באר. שמור את צלחת הדילול על שייקר הצלחת במשך 10 שניות ב 600 סל"ד. מערבבים שוב על ידי צנרת למעלה ולמטה במשך חמישה מחזורים. העבר 11.1 μL מצלחת הדילול הראשונה לצלחת הדילול השנייה, וחזור על שלבי הערבוב עבור שני לוחות הדילול הבאים.
- בצע ציפוי סדרת דילול כמתואר להלן.
- אחזר את לוחות הצמיחה מארון הבטיחות הביולוגית.
- החל מהלוח המדולל ביותר, יש לזהות 2 μL מכל באר על לוחות האגר באמצעות פיפטור 96 בארות (איור 1A-9).
- מורידים את ראש הפיפטור באיטיות על הצלחת, נזהרים לא לדקור לתוך האגר. בחן את הצלחת בקפידה וודא שכל הכתמים חולקו; אם לא, הוסף ידנית 2 μL למיקום המתאים. בדוק כי כתמים נוזליים במהירות לספוג לתוך אגר ולא לרוץ יחד.
- אם הכתמים רצים יחד, יבשו סט חדש של צלחות אגר טריות לתקופה ארוכה יותר ובצעו שוב את התצפית. אם ישנם סוגי צלחות מרובים (למשל, במדיה שונה או עם אנטיביוטיקה), אתר גם אותם. הוציאו את כל התמיסה שנותרה בחזרה לצלחת הדילול והמשיכו לריכוז הגבוה הבא.
הערה: בעת איתור דילולים, יש לערבב את הדילול הבא חמש פעמים כדי להבטיח שתכולת קצות הפיפטה תנוקה מהדילול הקודם. ניתן לאחסן את לוחות הדילול >8 שעות ב-4 מעלות צלזיוס מבלי להשפיע על ספירת המושבה35.
- חזור על תהליך הציפוי כמתואר בשלב 3.5 עבור לוחות הדילול הנותרים, תוך התקדמות מהמדולל ביותר למרוכז ביותר עד לצלחת עם ההומוגנט המקורי.
- כאשר כל הנוזל נספג באגר, הפוך את הלוחות והנח אותם באינקובטור (איור 1A-10). עבור Lactiplantibacillus ו Acetobacter מ Drosophila, הטמפרטורה האופטימלית היא 30 °C (75 °F) על מדיה MRS. דגירה עד שהמושבות הגיעו לגודל אופטימלי: המושבות גדולות מספיק כדי לראות אותן בבירור, אך לא כה גדולות עד שהן מתמזגות או מפריעות זו לצמיחתה של זו (ראו את התוצאות המייצגות לכימות הגודל האופטימלי).
הערה: תנאי הגידול האופטימליים תלויים בזן ויש לקבוע אותם באופן אמפירי. עבור Lactiplantibacillus מדרוזופילה, זמן הדגירה האופטימלי הוא 26 שעות עד 30 שעות על אגר MRS. עבור אצטובקטר מדרוזופילה, זמן הדגירה האופטימלי הוא 30 שעות עד 48 שעות ב-MRS, תלוי בזן. - לאחר הדגירה, אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך עד שיהיו מוכנות לספירה.
4. כימות של CFUs
- כימות CFUs על ידי צילום הלוחות ולאחר מכן ספירת המושבות באמצעות תוכנה אוטומטית, כמפורט להלן. אם הצלחות אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, תחילה אפשרו להן להגיע לטמפרטורת החדר כך שלא יהיה עיבוי על הצלחות, מה שמייצר בוהק.
- ארגן את הלוחות ברצף לוגי ושמור אותם בסדר זה בזמן הצילום - כך קל יותר לתת שמות לקבצים. כוון את כל הלוחות כך ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה עבור כל הלוחות. מומלץ לתייג את פינת A1 במזהה ייחודי כדי להבטיח שלא יהיה ערבוב של התמונות. ערמו כל סדרת דילול לפי הסדר.
- הסירו את מכסה הצלחת והניחו את הצלחת על הבמה עם כיוון A1 בפינה הנכונה. עיצובים כלולים עבור תיבת הצילום של הצלחת (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2), הממוטבת לצילום לוחות מגש אלה וכוללת אפשרויות תאורה וסינון לתמונות מושבות פלואורסצנטיות.
- דמיינו את הלוחות. השתמש במצלמה (ראה טבלת חומרים) עם הגדרות ידניות כדי להשיג רמת חשיפה עקבית בין צלחות. מומלץ להגדיר אורך מוקד ארוך כדי למזער עיוות פרספקטיבה. צלם את התמונה באמצעות תריס מרוחק כדי למזער את הטשטוש כתוצאה מרעידת המצלמה.
- העבר את התמונות למחשב ושנה את שמותיהן, כולל שם הניסוי, סוג המדיה, גורם הדילול וכל פרט רלוונטי אחר. מערכות הפעלה מסוימות (ראה טבלת חומרים) כוללות תכונת שינוי שם אצווה שימושית ב-Finder על-ידי לחיצה ימנית על מבחר קבצים.
5. ספירת מושבות אוטומטית באמצעות חבילת Count-On-It (קובץ משלים 3)
- חתוך את התמונות באמצעות תוסף Croptacular שסופק (קובץ קידוד משלים 2) עבור ImageJ. תוסף זה מסייע לחלק את התמונה למערך מסודר של אזורי משנה (לדוגמה, 8 x 12 עבור לוח של 96 בארות). אזורי המשנה ייספרו בנפרד.
הערה: תוסף נפרד לספירת לוחות עגולים הנקרא Circus מתואר בקובץ הקידוד המשלים 3 Circus_.ijm.- ארגנו את התמונות שיעובדו לכימות בתיקייה. בחר שמות קבצים המבדילים בין הלוחות, מכיוון ששמות קבצים אלה הופכים לכותרות עמודות עבור כל קבוצת ספירות . בתוך תיקיה זו, צור תיקיות משנה בשם "חתוך" ו "קבלות" .
- הפעל את Croptacular ולחץ על אישור כדי להתחיל לחתוך.
הערה: הגדרות ברירת המחדל מוצגות ובדרך כלל מספיקות. בהתאם לרזולוציה של התמונה, התאורה, גודל הספוט וכו ', זה יכול להיות מועיל כדי להתאים את הפרמטרים הבסיס. - אם התמונה כבר ישרה, פשוט לחץ על רווח. אחרת, יישר את התמונה על-ידי ציור קו לאורך קצה שאמור להפוך לאופקי. ציירו מחדש את הקו כמה פעמים שצריך אם התמונה עדיין לא נראית מיושרת.
- לאחר מכן, צייר תיבת גבול של האזור שעבורו יש לבצע ספירה. התאם את הגודל והפרופורציה עד שכל הכתמים יהיו בתוך התאים שלהם. גרור את הסמן אל מחוץ לתיבת הגבול כדי לרענן את הרשת. כאשר הרשת נראית טוב, לחץ על רווח.
- ודא שהתמונה הבאה תסתובב באופן אוטומטי לאותה זווית כמו התמונה הראשונה; התוסף מניח שכל התמונות מיושרות אותו דבר. אם זה מדויק, לחץ על רווח כדי להמשיך. אחרת, יישרו את התמונה כמו קודם. הרשת גם מזכירה את אותו מיקום כמו התמונה הקודמת; התאם במידת הצורך ולאחר מכן הקש על רווח.
- מנה את המושבות על הלוחות באמצעות התוסף Count-On-It: Gridiron עבור ImageJ (קובץ קידוד משלים 4). הוראות מפורטות להתקנה ולשימוש בתוסף כלולות בקובץ משלים 3.
- הפעל ספירה על זה > Gridiron. השתמש באותן הגדרות רשת כמו עם Croptacular. משתמשים יכולים לבצע אצווה של תיקייה שלמה, לנתח תמונה בודדת או להתחיל מהתמונה הנוכחית.
- קבעו את הסף בהתבסס על ערך עוצמת פיקסלים עליון ותחתון. הפוך את הסף למחמיר ככל האפשר תוך בחירת כל המושבות. באופן אידיאלי, יהיה קצת רווח בין המושבות שנבחרו, אבל התוכנה מסוגלת לפלח את הכתמים במידה מסוימת. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח "נדרשת פעולה" כאשר הסף משביע רצון .
- כדי לבדוק את התוצאות, התקרב והתבונן מקרוב יותר בספירת המושבה. לחיצה על ביטול תבטל את התוסף. לחץ על אישור כדי להמשיך.
- בתמונה הראשונה, ודא שניתנת האפשרות להמשיך או לחזור לתפריט ההגדרות, לדוגמה, כדי לשנות את גודל המושבה המינימלי. כדי להמשיך בתהליך האצווה, לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תיקיה כדי לשמור על טבלת הקבלות והתוצאות. השתמש בתיקיית "קבלות" או צור תיקיה חדשה.
- לאחר התמונה הראשונה, ברירת המחדל של התמונות הבאות תהיה באותו סף כמו ההגדרות הקודמות. לחץ על אישור כדי להשתמש בהגדרות אלה או להתאים את ההגדרות. אם התמונות עקביות וההגדרה מדויקת, לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח "נדרשת פעולה".
הערה: לאחר השלמת כל התמונות באצווה, טבלת התוצאות נשמרת באופן אוטומטי באותה תיקייה שבה נשמרות הקבלות. - סקור את קבלות הספירה המיוצרות על-ידי התוכנה ותקן באופן ידני שגיאות ספירה. התוסף ImageJ מדויק סטטיסטית, אך מתרחשות שגיאות. הוכחת הקבלות כדי לבחון חריגות ולזהות טעויות בחשבונות. התוכנה שומרת את נתוני CFU כקובץ .csv באותה תיקיה כמו הקבלות.
- נתח את הנתונים באמצעות התוכנה המועדפת על המשתמש.
Representative Results
ספירה של CFUs במאות זבובים בודדים בפורמט לוח 96 באר באמצעות בדיקת קולוניזציה
כדי להבין את ההרכב של מיקרוביום זבובים בודדים רבים, יחידות ה-CFU נמדדו באמצעות הפרוטוקול הנלווה, שאיפשר לזהות את המינים הקיימים, את אחוז הזבובים שהתיישבו ואת השפע המוחלט של חיידקים בכל זבוב. הסיבות לשונות הגדולה הנצפית מאדם לאדם בהרכב המיקרוביום אינן מובנות היטב, וכימות ההתפלגות הסטטיסטית של הקולוניזציה יכול לעזור לחקור את השונות הזו36,37. כדי להשיג מספר משמעותי של שכפולים ביולוגיים, פותח צינור בעל תפוקה גבוהה לכימות שפע המיקרובים בזבובים בודדים רבים באמצעות ספירות CFU (איור 1A).
הכימות הסופי של יחידות יוצרות מושבה יכול להיות מושפע מאופן הטיפול בזבובים לפני הניתוח, לדוגמה, גורמים הכוללים עיקור פני השטח, זמן מאז צריכת החיידקים ופינוי חיידקים חולפים מהמעיים. ראשית, תוך התמקדות בזן החיידקים Drosophila commensal L. plantarum (Lp; ראו זן Lp WF ב- Obadia et al.36), הזבובים הוזנו במינון של ~105 יחידות יוצרות מושבה של Lp והוחזקו בקבוצות של 25 זבובים לבקבוקון. הזבובים האלה הוחזקו באותו בקבוקון במשך 3 ימים או הועברו מדי יום (הועברו) למזון טרי וסטרילי (איור 1B). זבובים שלא הועברו נשטפו אז באתנול כדי להסיר חיידקים על פני השטח (שנשטפו) או לא נשטפו (לא שטוף). השטיפה הביאה לירידה לא משמעותית בסך יחידות ה-CFU שנמדדו (איור 1B), מה שמצביע על כך שבתנאי החיסון המבוקרים האלה, פני השטח של הזבובים לא מיושבים באופן משמעותי על-ידי חיידקים תוך 3 ימים. קבוצות הזבובים האחרות הועברו מדי יום כדי להפחית את הצטברות החיידקים מצמיחה על מזון (Transferred); בנוסף, קבוצה הועברה למזון טרי במשך 4 שעות לפני הדגימה (Post-Transferred), או שהם הוכנסו לבקבוקונים עם מי אגר סטריליים בלבד למשך 4 שעות (Cleared) כדי לאפשר לחיידקים שנבלעו באופן חולף להתנקות מהמעיים. כל אחד מהצעדים הללו כדי לספק מדידת קולוניזציה מחמירה יותר הביא לירידה מובהקת סטטיסטית בשפע של יחידות CFU בזבובים, למעט שטיפת פני השטח באתנול. העברה למזון סטרילי (לאחר העברה) או אגר-מים (ניקוי) במשך 4 שעות לפני המדידה יצרה השפעות שלא ניתן להבחין ביניהן, מה שמעיד על כך שהעברה לתנאים סטריליים 4 שעות לפני המדידה מפחיתה את עומס החיידקים. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם הפרשנות שלפיה חלק מחיידקי המעיים במעיים הזבובים הם בני חלוף, בעוד שאחרים קשורים ביציבותרבה יותר ל-35. השפע של Lp נע בין 1 x 104.3 CFUs / זבוב בזבובים מנוקים ל 1 x 104.9 CFUs בזבובים לא שטופים (n = 724 זבובים).
לאחר מכן, אותה בדיקה נערכה באמצעות Acetobacter indonesiensis (Ai), חיידק גראם-שלילי שמאכלס את מעי הזבובים (איור 1C; ראו זן Ai SB003 ב-Obadia et al.36)). בדומה לזבובים מיושבים ב-Lp, עיקור פני השטח הביא לירידה לא משמעותית ב-CFU. כמו כן, העברה יומית למזון סטרילי הפחיתה משמעותית את עומס החיידקים, והעברה לתנאים סטריליים במשך 4 שעות לפני ההומוגניזציה הביאה להפחתה נוספת בעומס החיידקים. שפע ה-Ai נע בין 1 x 10 4.7 יחידות יוצרות מושבה לזבובים מסוקים ל-1 x 105.0 יחידות CFU בזבובים הלא שטופים (n = 528 זבובים). לפיכך, כימות מדויק של חיידקי המעיים תלוי בתדירות ההעברה, כולל ביום ההעברה. להסרת העומס החיידקי החיצוני על ידי שטיפה באתנול הייתה השפעה לא משמעותית, אך ניתן לראות השפעות משמעותיות יותר על זנים שונים של חיידקים או תנאי תרבית שונים. גורמים אלה צריכים להיות מבוקרים באופן ניסיוני.
נבדקה גם ההשפעה הפוטנציאלית של שיטת ההומוגניזציה על ספירות CFU. הזבובים עברו הומוגניות באמצעות מקציף חרוזים עם חרוזי זכוכית של 0.5 מיקרומטר ב-100 μL של PBS, מה שיכול היה להפחית את הכדאיות של תאי חיידקים. ראשית, ההשעיה של חיידקי Lp מתרבית הוכנה ב- PBS ולאחר מכן צופה כדי לספור CFUs כבקרה חיובית. אותה תרבית הוכנסה לתוך צלחת מקציף החרוזים ו-(i) הומוגנית עם חרוזים, (ii) הומוגנית עם חרוזים וזבוב נטול חיידקים, או (iii) הומוגנית ב-PBS ללא חרוזים (איור 1D). הומוגניזציה בחרוזים כאשר זבוב היה נוכח לא השפיעה באופן משמעותי על שפע התאים בני קיימא בתמיסה, ואילו ההומוגניזציה של חיידקים בהיעדר זבוב הרגה מספר משמעותי של תאי חיידקים. הומוגניזציה ב- PBS ללא חרוזים גם הפחיתה באופן משמעותי את מספר התאים בני קיימא. באופן דומה, הכדאיות של הבינה המלאכותית נשמרה כאשר הומוגניזציה בנוכחות זבוב, בעוד שהומוגניות ללא זבוב הפחיתה את מספר התאים בני הקיימא בתמיסה (איור 1E). תוצאות אלה מצביעות על כך שרקמת הזבוב מגנה על החיידקים מפני הרס על ידי החרוזים במהלך הומוגניזציה. עם זאת, הניסויים באיור 1D ובאיור 1E בוצעו עם יותר מ-10 8 יחידות יוצרות מושבה לכל באר. בפועל, בארות עם ~106 תאים לבאר או פחות נמצאו מראות אובדן תאים קטן כאשר נעשה שימוש בחרוזים ללא זבוב. קירור הצלחת על קרח באמצע הכאת החרוזים משפר גם את כדאיות התא. המשמעות של תוצאות אלה היא שהקוראים צריכים להיות מודעים לסוגיות פוטנציאליות אלה ולתכנן בקרות מתאימות למקרה השימוש הספציפי שלהם.
דיוק של לוחות 96 בארות בציפוי נקודתי לכימות CFU בתפוקה גבוהה
מכיוון שהמטרה היא למדוד את שפע ה-CFU עבור מאות עד אלפי זבובים בודדים, שיטות הציפוי המסורתיות הן עתירות זמן וחומר. ציפוי נקודתי הוא שיטה יעילה ויעילה לצמיחה וספירה שלCFU 19,31. שיטת הציפוי הנקודתי משתמשת בפיפטור בעל 96 ערוצים כדי לחלק 2 μL של תרחיף חיידקים על מדיה שהוכנה בלוחות מגש מלבניים (איור 2A). כל נקודה מייצגת את העומס החיידקי של דגימה בודדת, כך שניתן לנתח 96 זבובים באמצעות צלחת אחת (איור 2B). הדיוק של ציפוי נקודתי הושווה לציפוי מסורתי על ידי חיסון לוחות גדילה באמצעות אותו תרחיף OD 0.0001 בדיוק של Lp עבור שתי השיטות. המתלה היה מדולל פי שניים באופן סדרתי חמש פעמים ב-PBS. כהשוואה ראש בראש, 50 μL של inoculum היה מפוזר על לוחות עגולים בודדים, או 2 μL כתמים נעשו על לוחות MRS מלבניים. לאחר מכן דגרו הלוחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד שניתן היה לספור את המושבות. ספירות ה-CFU שהתקבלו עבור כל דילול שימשו לחישוב הריכוז המקורי של המתלה והושוו (איור 2C). לוחות עגולים עם 50-500 CFUs נספרו כבקרה. לא נצפה הבדל משמעותי בין התפוקה הגבוהה לבין שיטות הציפוי העגול המסורתיות.
מכיוון שצפיפות המושבות יכולה להשפיע על גדילתן וכימותן, נבדקה ההשפעה של צפיפות CFU על הספירה הסופית. כתמים עם 2 עד 25 מושבות לכל נקודה לא הראו הבדל בספירה הסופית בהשוואה לשיטת הלוחות העגולים המסורתית (איור 2C). כתמים עם ממוצע של 35 מושבות הניבו תוצאות שהיו מעט נמוכות יותר מלוחות התפשטות הבקרה (איור 2C; p = 0.0017). בחינה מדוקדקת של תצלומי הכתמים הבודדים העלתה כי הטיה זו נבעה ממושבות החופפות בכתמים צפופים. מדידות המבוססות על כתמים עם ממוצע של 11 מושבות לנקודה הביאו לריכוזים הקרובים ביותר לאלה המבוססים על לוחות ההתפשטות (איור 2C; לוחות פריסה: ממוצע = 1 x 104.4 יחידות יוצרות מושבה; SD = 0.086 לעומת נקודות עם 11 מושבות ממוצעות: ממוצע = 1 x 104.4 יחידות יוצרות מושבה; SD = 0.12, p = 0.42, מבחן t של וולש).
הפקת תמונות באיכות גבוהה לכימות באמצעות פלטפורמת צילום מיוחדת עם אור לבן או פלואורסצנציה
ציפוי נקודתי בתפוקה גבוהה מייצר באופן טבעי מספר רב של אזורי מטרה, אותם יש לספור במדויק. ניתן להשתמש בתצלומים איכותיים כדי לתעד את הנתונים ולהקל על ספירת יחידות הכספים. פלטפורמת צילום חזקה ופשוטה פותחה תוך שימוש בחומרים זמינים מסחרית (איור 3A). מצלמה דיגיטלית חוברה לתושבת מעל תיבת אור שנבנתה בהתאמה אישית, שנקראה FluoroBox, והופנתה ישירות כלפי מטה, בניצב למרכז הצלחת. מסנן פליטה צבעוני הוצב באופן אופציונלי מול העדשה באמצעות מחוון מסנן. מגן אור מנע התלקחות של העדשה על ידי חסימת אור ישיר מפסי ה-LED שמתחת. פסי לד האירו את הצלחת מהצדדים, ולא מלמעלה, כדי למנוע בוהק על הצלחת. בנוסף לאור הלבן, נוריות LED כחולות וירוקות בצבע יחיד שימשו להבערת חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים, בהתאמה. הצלחת הוחזקה במקומה על ידי מחזיק צלחת במגירה, והמגירה הייתה מצוידת במחווני מגירה כדי להקל על הכנסת הצלחת. עיצובים מלאים זמינים בקובץ משלים 1 ובקובץ משלים 2.
תמונה של לוחית ספוט של מושבות Lp צולמה באמצעות נוריות LED של אור לבן ומצלמה דיגיטלית כדי לסייע בספירת מושבות ובהבחנה בין צבעים ומורפולוגיות שונות (איור 3B). כדי לאמת שעוצמת התאורה הייתה אחידה, עוצמת הרקע של האגר נמדדה באזורים שונים של תצלום צלחת (איור 3C). כדי להדגים שניתן להבחין בבירור בין המושבות לבין הרקע, נמדדה העוצמה בקוטר של 10 מושבות שונות בחלקים שונים של הלוח ונמצאה גבוהה בכ-300% מהרקע (איור 3C). הצלחת חוסנה ב-Lp עם פלסמיד המבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry, כמו גם ב-Lp כלשהו שלא הכיל את הפלסמיד, כך שהמושבות היו חיוביות ל-mCherry או ל-mCherry-שליליות. כדי להבחין בין שני סוגי המושבות האלה, הצלחת צולמה באמצעות אותה מצלמה עם אור LED ירוק (515-525 ננומטר) ומסנן אדום (Tiffen #29), מה שגרם למושבות חיוביות ל-mCherry לפלואורסצ'ס (איור 3D). ההבדל בעוצמה בין mCherry-positive ל-mCherry-negative כומת על ידי מדידת העוצמה על פני מדגם של מושבות (n = 10 מושבות). מושבות mCherry-חיוביות היו בעוצמה גבוהה ב-~1,000% מאשר mCherry-negative (איור 3E). מושבות של בינה מלאכותית המבטאות GFP ומושבות של בינה מלאכותית שאינן מבטאות פלואורסצנטיות צולמו באמצעות נורות LED כחולות (465-475 ננומטר) ומסנן ירוק (Tiffen #58) (איור 3F). מושבות חיוביות ל-GFP הראו עוצמה גבוהה יותר ב-200% מזו של GFP-negative (איור 3G).
ספירה אוטומטית של יחידות יוצרות כספים על לוחות ספוט באמצעות התוסף המותאם אישית ImageJ Count-On-It
תמונות לבדן מסייעות בספירת מושבות (למשל, על ידי אחסון הנתונים, שיתוף הנתונים, התקרבות, סימון שכבת-על, הפרדת צבעים וכו'). עם זאת, הפעולה של ספירה ידנית וארגון התוצאות של מאות נקודות יכולה להיות מייגעת, גוזלת זמן ונוטה להבדלים בין אדם לאדם בספירות הסופיות. כדי להאיץ את תהליך הספירה ולתקנן את יכולת השחזור של ספירות, פותח תוסף ImageJ מיוחד בשם Count-On-It (איור 4A). תוסף זה מאפשר ספירה חצי אוטומטית מדויקת של יחידות יוצרות מושבה בלוחות אגר. המשתמש מכין תמונות לספירה על-ידי חיתוך ויישורן תחילה באמצעות התוסף Croptacular הנוסף. ניתן לעבד את התמונות באצווה, וניתן להתאים את הסף לכל צלחת. מספר אפשרויות אחרות מאפשרות למשתמש להגדיל את הדיוק של ספירת הלוחות, כולל התאמת אורכי גל האור (תמונות RGB), קביעת טווח של גודל מושבה (בפיקסלים), שינוי יחס הגובה-רוחב המרבי והתאמה אישית של מידות רשת הבחירה הפעילה. Count-On-It מפיק טבלת תוצאות כאשר כל לוח מיוצג כעמודה של ספירות CFU. היא גם יוצרת קבלה על תמונה המציגה שכבת-על כדי לתעד באופן חזותי את תוצאות הספירה שלה ולסייע בתיקון שגיאות ידני (איור 4B). אמנם מתרחשות שגיאות, אך כאשר מספר המושבות שנספרו באופן ידני הושווה למספר המושבות שנספרו באמצעות תוסף זה (איור 4C), הקשר היה בדרך כלל שווה ערך, כאשר רגרסיה ליניארית בין הספירה הידנית לספירה האוטומטית הראתה שיפוע של 0.95 עם דיוק של יותר מ-90% (R2 = 0.93), אם כי השגיאה גדלה כאשר מספר המושבות עלה על 20.
ניתן להשתמש ב- Count-On-It גם כדי לספור בנפרד מושבות פלואורסצנטיות באמצעות תכונת הפלואורסצנציה של FluoroBox. ספירות מושבות חיוביות mCherry (איור 4D) לפי תוסף תוכנה לעומת ידניות היו בעלות R2 של 0.92 (איור 4E). באופן דומה, מושבות חיוביות ל-GFP (איור 4F) שנספרו עם תוסף תוכנה לעומת ידניות היו בעלות R2 של 0.90 (איור 4G). ניתן להבחין בין מושבות פלואורסצנטיות לעומת מושבות שאינן פלואורסצנטיות במדגם יחיד, וניתן להשתמש בגודל ובצורה של מושבות כדי להבחין בין תת-אוכלוסיות נפרדות (איור 4H-K). קבלות התמונות מספקות רשומה המאפשרת למשתמש לבדוק במהירות את דיוק הספירות ולתקן שגיאות באופן ידני. באיור 4C,E,G,I,K, קבלות התמונות לא שימשו לשיפור דיוק הספירה, כך שהקוראים יוכלו לראות את הפלט הגולמי של השיטה. מקרים כמו באיור 4G, שבו ספירה ידנית של 1 הניבה ספירה אוטומטית של 21, ניתן לזהות במהירות באמצעות קבלות התמונות. במקרה זה, בוהק בקצה הצלחת יצר כתמים שנספרו כמושבות. עבור כל מקרה שימוש, יש לקבוע את ההגדרות האופטימליות עבור תוסף התוכנה לפני ספירת תפוקה גבוהה.
איור 1: מבחן הקולוניזציה מודד יחידות CFU במאות זבובים בודדים באמצעות תבנית של לוח 96 בארות. (A) סקירה ציורית של בדיקת הקולוניזציה ושיטת הכימות בתפוקה גבוהה המשמשת כמתואר בסעיף הפרוטוקול. (B) Lactiplantibacillus plantarum (Lp) שפע בזבובים לאחר בדיקת ההתיישבות נמדד בתנאים משתנים באמצעות שיטת כימות CFU בתפוקה גבוהה. זבובים הוחזקו באותו בקבוקון במשך 3 ימים ולאחר מכן הומוגניים ומצופים (לא שטוף), נשטפו באתנול לפני הציפוי (נשטפו), שניהם נשטפו והועברו כל יום (הועברו), הועברו מדי יום ואז נשמרו על מזון סטרילי לפני הציפוי (לאחר ההעברה), או נשמרו בבקבוקונים עם מים בלבד במשך 4 שעות (Cleared) (n = 724 זבובים בסך הכל, 3 שכפולים ביולוגיים ו~ 72 זבובים בסך הכל לכל טיפול). (C) אותה בדיקה כמו ב-(B) נערכה באמצעות Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 זבובים). (D) תרחיף חיידקי Lp הוכן ב-PBS ולאחר מכן מצופה לספירת יחידות CFU או הומוגני תחילה על ידי הכאת חרוזים, מוכה חרוזים בשילוב עם זבוב ללא חיידקים (GF), או מזועזע על מקציף החרוזים ללא חרוזים או זבוב (n = 236 בארות דגימה). (E) כדאיות הבינה המלאכותית לאחר הומוגניזציה נבדקה באותו אופן כמו ב-(D) (n = 282 בארות דגימה). המובהקות הסטטיסטית של לוחות (B-E) חושבה באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס ואחריו מבחני סכום הדירוג של וילקוקסון עם תיקון ההשוואות המרובות של בונפרוני. תיבה נותנת טווח בין קוורטי. קו מציין חציון. שפם נותן טווח כולל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דיוק של לוחות 96 בארות בציפוי נקודתי לכימות CFU בתפוקה גבוהה. (A) ציפוי נקודתי באמצעות פיפטור של 96 ערוצים כדי לחלק 2 μL על מדיה שהוכנה בלוחות מגש מלבניים. (B) צלחת גידול MRS-agar עם 96 כתמים של מושבות Lp . (C) ריכוז תרחיף Lp המבוסס על ספירות CFU מלוחות עגולים מסורתיים (n = 24 לוחות) בהשוואה לריכוז המבוסס על ספירות CFU מלוחות ספוט (n = 680 כתמים) בדילול סדרתי ומסודר לפי ספירת מושבות ממוצעת לכל נקודה (נספרו ~ 48 נקודות עבור כל גורם דילול יחיד עבור שלושה לוחות משוכפלים). כל נקודת נתונים מייצגת את המושבות המדויקות לכל נקודה, בעוד שכל עמודה מייצגת את המושבות הממוצעות עבור דילול זה. קו מקווקו אופקי מציין את ספירת CFU המחושבת של התרבית שצופה. נקודות המסומנות בירוק מדגישות את ספירת הלוחות העגולים המסורתית. נקודות מלאות באדום מדגישות את צפיפות המושבה האופטימלית של 11 יחידות יוצרות מושבה לכל נקודה של 2 μL. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות ANOVA חד-כיווני רגיל המשווה את הממוצע של כל עמודה מול הממוצע של עמודת הבקרה של לוח ההתפשטות עם תיקון ההשוואות המרובות של Bonferroni. תיבה נותנת טווח בין קוורטי. קו מציין חציון. שפם נותן טווח כולל. **עמ' < 0.01. ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פלטפורמת צילום מפיקה תמונות הניתנות לכימות של לוחות באמצעות אור לבן או פלואורסצנציה . (A) סקירה כללית של עיצוב FluoroBox. (B) תמונה של לוחית ספוט של מושבות Lp באמצעות אור לבן. (C) פרופיל העוצמה של מושבות בודדות תחת אור לבן בהשוואה לעוצמת הרקע (BKG) (n = 10 מושבות, קו מקווקו מייצג סטיית תקן). (D) תמונה של אותה לוחית ספוט כמו ב-(B), תוך שימוש באורות ירוקים בצבע יחיד ובמסנן האדום כדי לבחור מושבות Lp חיוביות ל-mCherry. (E) פרופיל עוצמה של מושבות בודדות הממחיש את ההבדל בין מושבות עם ובלי פליטת mCherry. (F) תמונה של לוחית ספוט המכילה מושבות בינה מלאכותית , שלחלקן יש תווית GFP. (G) פרופיל עוצמה של מושבות בודדות הממחיש את ההבדל בין מושבות שליליות ל-GFP-חיוביות. E, F, G: n = 10 מושבות לכל חלקה. קוטר המושבה הוא כ 1.5 מ"מ. קו מקווקו הוא SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ספירה מדויקת של לוחות ספוט באמצעות התוסף Count-On-It ImageJ. (א) צילום מסך של חלון ההתקנה של התוסף. (ב) התוסף מפיק קבלה לספירת מסמכים ולסיוע בתיקון שגיאות. כניסה: כיסוי עם מספר המושבות שנספרו עבור כל אזור נקודה; קווי המתאר הצהובים מציינים כי נספרה מושבה אחת ואדום כי מספר מושבות נספרו. (C) תרשים המציג את מספר המושבות שנספרו באופן ידני בהשוואה למספר המושבות שנספרו באמצעות התוסף (אוטומטי) כאשר נעשה שימוש בתמונת אור לבן, כאשר כל נקודה בגרף מייצגת נקודה בודדת שנספרה באופן ידני או אוטומטי (שיפוע התאמה = 0.95, קו ציאן; קו 1:1 מנוקד באדום; R2 = 0.93, מקדם המתאם של פירסון, p < 0.0001). (D) תמונת קבלת תמונה מהתוסף כאשר נבחרו מושבות חיוביות ל-mCherry באמצעות תכונת הפלואורסצנציה של תיבת התמונה. (E) עלילה המציגה את מספר המושבות החיוביות mCherry שנספרו ידנית בהשוואה לשיטה אוטומטית כאשר נעשה שימוש בפלואורסצנטיות אדומה (שיפוע התאמה = 1.1, קו ציאן; קו 1:1 מנוקד באדום; R2 = 0.92, מקדם המתאם של פירסון, p < 0.0001). שים לב כי חריגות ושגיאות לא תוקנו באמצעות קבלות הניתוח עבור E,G,I,K. (F) תמונת קבלת תמונה מהתוסף כאשר מושבות חיוביות ל-GFP נבחרו באמצעות תכונת הפלואורסצנציה הירוקה של תיבת התמונה ובחירת הערוץ הירוק עם התוסף. (G) עלילה המציגה את מספר המושבות החיוביות ל-GFP שנספרו ידנית בהשוואה לשיטה אוטומטית כאשר נעשה שימוש בתאורת פלואורסצנציה ירוקה (שיפוע התאמה = 1.1, קו ציאן; קו 1:1 מנוקד באדום; R2 = 0.90, מקדם פירסון של מתאם, p < 0.0001). (H) מושבות חיוביות mCherry שנבחרו מתוך מורפולוגיות מושבות מעורבות באמצעות סף פלואורסצנטי גבוה בתוסף. (I) עלילה המציגה את מספר המושבות החיוביות ל-mCherry שנספרו ידנית בהשוואה לשיטה אוטומטית כאשר נעשה שימוש בתאורת פלואורסצנציה אדומה (שיפוע התאמה = 0.99; R2 = 0.91, מקדם המתאם של פירסון, p < 0.0001). (J) מושבות שליליות mCherry שנבחרו מתוך מורפולוגיות מושבות מעורבות באמצעות סף פלואורסצנטי נמוך. (K) עלילה המציגה את מספר המושבות השליליות של mCherry שנספרו ידנית בהשוואה לשיטה אוטומטית כאשר סף העוצמה נקבע לבחירת מושבות שאינן פלואורסצנטיות (שיפוע התאמה = 1.1; R2 = 0.85, מקדם המתאם של פירסון, p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים 1: הוראות הרכבה של FluoroBox. קובץ זה מדריך את הקורא צעד אחר צעד בבניית תיבת התאורה המבוקרת המשמשת בסרטון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: חיתוך לייזר אקרילי FluoroBox. קובץ זה מספק תבנית חיתוך לחיתוך לייזר של חתיכות האקריל עבור תיבת התאורה המבוקרת. ניתן לשלוח את הקובץ לספק אקריליק חתוך בלייזר. עיין בטבלת החומרים עבור הספק המשמש בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: הוראות תוכנה. קובץ זה מדריך את הקורא שלב אחר שלב בהתקנה ובשימוש בתוכנת Croptacular ו- Count-On-It המסופקת עם פרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 1: קוד הדפסה תלת-ממדי למגש מדידת חרוזים (S1-bead-measurer.stl). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 2: צלחת מלבנית חיתוך תמונה ImageJ תוסף (Croptacular_.ijm). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 3: תוסף חיתוך תמונה עגול ( Circus_.ijm). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 4: צלחת מלבנית 96 תוסף מונה ספוט (Gridiron_.ijm). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הטכניקות המפורטות המוצגות כאן מאפשרות גידול של פי >100 במספר הדגימות שניתן להעריך בניסוי ספירת CFU. טכניקה זו מקדמת שיטות קיימות לניסויים במיקרוביום בדרוזופילה 12,35,36 על ידי שימוש בפורמט של צלחת 96 בארות כדי לבחון זבובים בודדים. יתר על כן, הוא מיישם שיטת ציפוי ספוטיעילה יותר 19,31 וזרימת עבודה אוטומטית עם פלטפורמת צילום וספירת מושבות. המשמעות של שיטה זו עבור Drosophila היא סטנדרטיזציה של ניסויים לפורמט לוח 96 באר, המאפשר טיפול בו זמנית של מספר רב של שכפולים ביולוגיים עם אוטומציה כדי להשיג כימות תפוקה גבוהה של CFUs.
פלטפורמת 96 הקידוחים מראה שתדירות מוגברת של העברה ו"ניקוי" של חיידקים חולפים גורמת להפחתה משמעותית הן בשפע הממוצע והן בשונות בין הדגימות (איור 1B,C), מה שמדגים את ההקפדה של פרוטוקול משופר זה. מגבלה אחת של שיכון משותף של זבובים היא העברה אופקית של חיידקים בין זבובים. הפתרון המוצע הוא לשמור על זבובים בנפרד בפורמט של 96 בארות, כגון כל האכלת בעלי חיים שטוחה38.
למרות שלא נצפתה ירידה משמעותית בעומס החיידקים כאשר זבובים נשטפו באתנול, זבובים אלה נשמרו רק בנוכחות חיידקים חיצוניים במשך 3 ימים. דיור לפרקי זמן ארוכים יותר יכול לאפשר עומס חיידקים גדול יותר לצבור39. לכן, כביסה באתנול עדיין מומלץ.
העברת זבובים לתוך לוח 96 בארות היא הצעד הראשון הקריטי להגדרת זרימת העבודה (איור 1A). לאחר שהזבובים נשטפים, הם מופצים לבארות בזה אחר זה. תרשים לוחות שימושי בשלב זה כדי לציין אילו תנאים קיימים בכל באר ולהוסיף הערות כגון "הזבוב אבד". הומוגניזציה היא צעד קריטי נוסף עם כמה אזהרות חשובות. חיידקים שורדים את תהליך ההומוגניזציה כשהם נמצאים בנוכחות זבוב (איור 1D,E), וככל הנראה העיקרון הזה נכון גם כשהחיידקים נמצאים בתוך המעיים של הזבוב. עם זאת, חיידקים מומתים גם כאשר הם הומוגניים בצלחות מקציף חרוזים בלבד, מה שמוכיח כי ההומוגניזציה יכולה להרוג את תאי החיידקים בנסיבות מסוימות, מגבלה שעשויה להיות חשובה אם מדובר בהומוגניות של מעיים מנותחים, למשל. יש לציין כי אובדן יחידות ה-CFU בעת הומוגניזציה תלוי במספר יחידות ה-CFU במדגם, וההפסד הוא מינימלי כאשר משתמשים ב~105 יחידות יוצרות מושבה לכל באר. ניתן להשיג שימור נוסף של יחידות יוצרות מושבה על ידי עצירת הומוגניזציה באמצע הדרך וקירור הצלחת על קרח.
הומוגניזציה בוצעה במשך 5 דקות בפרוטוקול זה בהתבסס על ניסויי בקרה שבהם מספר ידוע של יחידות יוצרות מושבה עורבבו עם זבוב נטול חיידקים, וזה עבד באופן אמפירי עבור חיידקי זבובים. פחות מכות גרמו לנוכחות חלקי זבוב גדולים יותר, מה שמפריע לפיפטות, בעוד שזמני הומוגניזציה ארוכים משמעותית של ~ 10 דקות הפכו את ספירת ה- CFU למשתנה יותר. הנפח הקטן יותר והצורה הזוויתית של בארות צלחת חרוטית נצפו כדי להפחית את היעילות של מכות חרוזים בהשוואה צינורות גליליים 2 מ"ל. וריאציות רבות על גישה כללית זו אפשריות, כולל אילו זני חיידקים, איזה מיכל מכות חרוזים, אילו חרוזים, ואיזה גנוטיפ זבוב משמשים. מקרי משתמש בודדים צריכים להשתמש בפקדים חיוביים כדי לבסס את הגישה שלהם.
שיטת הציפוי הנקודתי הופעלה באופן ספציפי: דילולים של 1:2 של L. plantarum WF ב- PBS זוהו על לוחות MRS והודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים (ניתן ליישם זמני דגירה קצרים יותר כדי ליצור גדלי מושבות קטנים יותר). השיטה דורשת השקעה מסוימת מראש בציוד, בעיקר מקציף החרוזים והפיפטור בעל 96 הערוצים (איור 2A), הנחוץ הן לסדרת הדילול והן לציפוי הנקודתי. עם זאת, קיימות אפשרויות זולות יותר, כולל משכפל לוחות 96 באר עם פינים מחורצים. סדרת הדילול היא שלב קריטי המשפיע על הדיוק של תוצאות ספירת CFU. מבחינת מצבי כשל, ניתן לסתום את קצות הפיפטה עם חלקי זבוב או חרוזי זכוכית ועל קצות הפיפטה לא לאטום כראוי על הפיפטור או להיכשל מסיבה אחרת. כל הבעיות הללו גורמות למספר חסר של הבארות המושפעות ויש לעקוב אחריהן. ערבוב הולם בכל שלב בסדרת הדילול הוא גם חיוני. כל דילול צריך להיות מעורבב ביסודיות או על ידי הנחת הצלחת על שייקר צלחת או על ידי pipetting למעלה ולמטה 15-20 פעמים, אשר משמש גם לשטוף את הקצוות. על ידי איתור מהצלחת המדוללת ביותר לצלחת המדוללת ביותר, ניתן לעשות שימוש חוזר בקצוות עבור כל סדרת הדילול. עם דילולים של 1:2, הספירה מדויקת על פני טווח של 2-25 מושבות, המשתרעות על סדר גודל (איור 2C). לכן, דילולים של 1:10 חוסכים זמן וחומרים. משתנה נוסף שניתן לנצל הוא זמן הדגירה, אשר ניתן להתאים כדי לייצר מושבות קטנות יותר, ובכך להגדיל את טווח הנקודות הניתנות לספירה על ידי מניעת מיזוג של מושבות סמוכות.
תמונה איכותית של הצלחת היא חיונית מכיוון שהיא הופכת לנתוני המקור הגולמיים שמהם מנותחים ה- CFUs וניתן לאחסן אותם בארכיון ללא הגבלת זמן. ה- FluoroBox נועד להפיק תמונות של הלוחות בעוצמת אור אחידה, הממזערת את הבוהק על משטח האגר. בנוסף, העיצוב מסוגל לצלם באופן סלקטיבי מושבות פלואורסצנטיות באמצעות נורות LED בצבע יחיד ומסנני תמונות צבעוניים (איור 3A). בניית מערך כמו FluoroBox, עם הגדרות תאורה ומצלמה מבוקרות, יכולה להגדיל מאוד את יכולת השחזור של תמונות CFU, החשובות לניתוח אוטומטי. מורפולוגיות של מושבות, עוצמת פלואורסצנטיות והשפעות הזמן או הצפיפות על צמיחת המושבה הן רק כמה מהתכונות שניתן לנתח באמצעות התצלומים. ניתן לבנות את תיבת התמונות ללא מסנני הצבע ונורות בצבע יחיד אם לא נעשה שימוש בחיידקים פלואורסצנטיים, מה שמפחית את העלות והמורכבות. אורות עירור ומסנני פליטה שונים יכולים להיות מוחלפים לאלה המומלצים כאן אם פלואורופור אחר משמש מעבדה. מצלמה המחוברת לטאבלט באמצעות WiFi באמצעות אפליקציה שימושית הן עבור תכונת התריס האוטומטי למניעת רעידות והן עבור העברת נתונים קלה. ניתן להעביר תמונות לטאבלט ולאחר מכן למחשב נייד באמצעות תוכנת העברת קבצים אלחוטית. מצלמות מומלצות עם יכולות אלה מצוינות בטבלת החומרים.
Count-On-It הוא תוסף שנכתב ב-ImageJ. תוכנת ספירת CFU האוטומטית מפלחת את תמונת הלוח לרשת אחידה של 96 בארות, סופרת את המושבות בכל תא רשת ומאצוות את התוצאות לגיליון אלקטרוני פשוט. מכיוון שתמיד יש שונות במיקום של רשת הספוט על הצלחת ובתמונה, על המשתמש להתאים ידנית את הרשת לתמונה באמצעות התוסף Croptacular. זה גם עוזר לא לכלול אזורים ליד קצה הצלחת, אשר יש בוהק. קביעת הסף היא המפתח לקבלת ספירת CFU המדויקת ביותר מהתמונה. אם הסף נקבע גבוה מדי, המושבות יתמזגו; אם הסף נקבע נמוך מדי, המושבות לא ייכללו. לאחר קביעת הסף, המאקרו מחיל טשטוש גאוס כדי לרכך את הקצוות ולהקטין את הכינוי, מסנן קו פרשת המים מחלק מושבות חופפות, והכתמים נספרים באמצעות חלקיקי ניתוח.
לפעמים, צפיפות המושבות גבוהה מדי במקום מסוים. Count-On-It מספק דרך להתמודד עם זה. כדי להעריך את מספר המושבות בתא רשת עם מושבות ממוזגות חלקית, ראשית השטח הממוצע של גוש עגול מכל הלוח נלקח כממוצע C. לאחר מכן, השטח של כתם A 1 מחולק בשטח הממוצע של כתם עגול A1/Cממוצע. מספר זה מעוגל למספר השלם הקרוב ביותר, וזהו האומדן עבור מספר המושבות הנמצאות בכתם. פונקציה זו היא אחת הסיבות לכך שהסף יכול להשפיע על תוצאות הספירה: שטח המושבה הממוצע היחסי לעומת אזור הכתמים הממוזג יהיה שונה בהתאם לאופן שבו הסף השפיע על כתמים ממוזגים.
לשיטות המוצגות יש מספר מגבלות. אלה כוללים את הצורך בציוד להוצאת מדיה נוזלית במדויק מלוחות 96 באר. ציוד זה, או פיפטור 96 ערוצים או כלי פין משכפל מחורץ, יכול לעלות אלפי דולרים להשיג. קיימות חלופות זולות יותר אך הן פחות מדויקות. ספירה אוטומטית באמצעות Count-On-It מציגה גם כמה מגבלות. לדוגמה, אם שני סוגי מושבות באוכלוסייה מעורבת היו מופרדים על סמך גודל בלבד, ספירת כתמים לא תוכל להקצות מושבות לסוג הנכון. במקרה זה, כתמים עם כתמים יהיה צורך לחסל מן הספירות. הבחנה נוספת של מושבות על בסיס מורפולוגיה תהיה הרחבה רבת ערך של השיטה שאינה מיושמת כיום. השימוש במדיה סלקטיבית הכוללת חומרים מזינים ספציפיים לזן ואנטיביוטיקה מפשט את הצורך בניתוח תמונה מורכב.
קיום ניסויים של זבוב הפירות בלוחות של 96 בארות מכפיל את מספר הדגימות והתנאים שניתן לבדוק בניסוי יחיד ויכול להקל על מסכי תפוקה גבוהה בפנוטיפים של קשר דרוזופילה-חיידקים. אנו מדמיינים שניתן להרחיב שיטה זו על ידי שימוש במדיה סלקטיבית כדי להבדיל בין זני חיידקים רבים בתערובות מורכבות. השיטה אינה מוגבלת לחקר המיקרוביום של הזבוב. כימות של יחידות יוצרות מושבה נפוץ ביישומים רבים של מיקרוביולוגיה, החל מספירות קוליפורמים במי שתייה וכלה בזיהוי פתוגנים. מערכת ציפוי CFU המוצגת כאן מאפשרת מסכים בתפוקה גבוהה, כמו גם רכישה, עיבוד, אחסון ואספקה אוטומטיים של תוצאות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ד"ר קרווין קייסי הואנג, ד"ר אנדרס ארנדה-דיאז, טד קופר וחברי מעבדת לודינגטון נתנו מידע חשוב על פיתוח פרוטוקול זה. המימון ניתן על ידי מענק NSF IOS 2032985, מענק NIH DP5OD017851, מענק של מכון קרנגי בקנדה והקדש של מכון קרנגי למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead beating and spot plating | |||
| Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
| Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
| Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
| Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
| Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
| MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
| Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
| TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
| Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
| Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
| Photobox construction | |||
| ¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
| ¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
| ¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
| 1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
| 22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
| 22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
| 4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
| 4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
| 6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
| 6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
| 8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
| Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
| Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
| Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
| Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
| Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
| Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
| Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
| Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
| Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
| SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
| Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
| Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
| Software | |||
| ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
| MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
| Unix | BSD | N/A | 64 bit |
| Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
- Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740 (2021).
- D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892 (2018).
- Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398 (2020).
- Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272 (2011).
- Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710 (2018).
- Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
- Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219 (2016).
- Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
- Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
- Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
- Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
- Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
- Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
- Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
- Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
- Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
- Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
- Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
- Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
- Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109 (2017).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
- Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
- Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163 (2017).
- Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
- Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).
