Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rask kolonidannende enhetstelling i 96-brønns plateformat påført Drosophila-mikrobiomet

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

Summary

Denne metoden kvantifiserer mikrobiell overflod ved hjelp av et 96-brønns plateformat til platekolonidannende enheter (CFUer) og påføres Drosophila-mikrobiomet i hele fluehomogenatprøver. CFU-er telles med en automatisert bildeanalyseprogramvare som tilbys her.

Abstract

Tarmene til dyr er kolonisert av kommensale mikrober, noe som påvirker vertsutvikling, helse og oppførsel. Nøyaktig kvantifisering av kolonisering er avgjørende for å studere de komplekse interaksjonene mellom vert og mikrobe både for å validere den mikrobielle sammensetningen og studere dens effekter. Drosophila melanogaster, som har et lavt innfødt mikrobielt mangfold og er økonomisk å bak med definert mikrobiell sammensetning, har dukket opp som en modellorganisme for å studere tarmmikrobiomet. Analyse av mikrobiomet til en individuell organisme krever identifisering av hvilke mikrobielle arter som er tilstede og kvantifisering av deres absolutte overflod. Denne artikkelen presenterer en metode for analyse av et stort antall individuelle fluemikrobiomer. Fluene fremstilles i plater med 96 brønner, noe som gjør det mulig å håndtere et stort antall prøver samtidig. Mikrobiell overflod kvantifiseres ved å plating opptil 96 hele fluehomogenater på en enkelt agarplate i en rekke flekker og deretter telle kolonidannende enheter (CFUer) som vokser på hvert sted. Dette pletteringssystemet er parret med en automatisert CFU-kvantifiseringsplattform, som inkorporerer fotografering av platene, differensiering av fluorescerende kolonier og automatisert telling av koloniene ved hjelp av et ImageJ-plugin. Fordelene er at (i) denne metoden er følsom nok til å oppdage forskjeller mellom behandlinger, (ii) flekkbeleggmetoden er like nøyaktig som tradisjonelle pletteringsmetoder, og (iii) den automatiserte telleprosessen er nøyaktig og raskere enn manuell telling. Arbeidsflyten som presenteres her muliggjør kvantifisering av CFU-er med høy gjennomstrømning i et stort antall replikasjoner og kan brukes på andre mikrobiologiske studiesystemer, inkludert in vitro og andre smådyrmodeller.

Introduction

Forholdet mellom tarmmikrobiota og deres dyrevert er i økende grad i forkant av biologiske studier1, som viser at belastningssammensetningen av mikrobiomet er viktig for vertsfysiologi 2,3,4. Oppdagelsestakten har vært begrenset av forstyrrende faktorer som høy naturlig interindividuell variasjon og høyt mangfold av koloniserende bakterier 5,6,7. Bananfluen, Drosophila melanogaster, har dukket opp som en lovende modell på grunn av sitt naturlig mikrobiom med lavt mangfold, enkel håndtering og robust vertsgenetikk 8,9,10,11. Fluer kan gjøres bakteriefrie og reassosieres med en definert mikrobiota12, og det er vist at floraen påvirker fluens fysiologiske egenskaper13,14. Den medfødte floraen består av et begrenset sett med bakterier som alle er dyrkbare, og nære slektninger av disse er også endogene for pattedyrets tarm, inkludert laktobaciller, proteobakterier og enterokokker15.

Å studere mikrobiomets innflytelse på vertsegenskaper krever kvantifisering av mikrobiomet når det gjelder både hvilke arter som er til stede og deres absolutte overflod16. De dominerende måtene å analysere fluemikrobiomet på er kolonidannende enhet (CFU) teller17, 16S rRNA-genamplikonsekvensering9 og qPCR av 16S rRNA-genet18. CFU-tellinger kan oppnås uten dyre reagenser, og de bekrefter levedyktigheten til bakteriecellene19. 16S-teknikkene inkludert qPCR har fordeler ved at taksonomiske identiteter til mikrober kan fastslås uten hensyn til deres vekstbehov eller kolonimorfologier20.

I tilfelle der eksperimenter bruker fluer med et definert mikrobiom av kjente bakterier (gnotobiotiske fluer), har CFU-tellinger spesielle fordeler i forhold til sekvensering21. Sekvensering er dyrt, og krever DNA-ekstraksjon, PCR-basert bibliotekforberedelse og høy gjennomstrømningssekvensering for å oppnå relative overflod22. På grunn av de høye kostnadene, må sekvenseringsmetoder med høy gjennomstrømning vanligvis utføres i bulk for å redusere prisen per prøve23. Ytterligere metoder som qPCR er nødvendig for å oppnå absolutt overflod16. I motsetning til dette er CFU-tellinger raske og billige og gir det absolutte antallet levedyktige celler. Drosophila8 og andre små mikrobiommodeller 24, inkludert ormen, Caenorhabditis elegans 25,26, og larvesebrafisken, Danio rerio, dyrket gnotobiotisk 27, har et begrenset utvalg av bakterier, som har kjente vekstegenskaper 28. I disse tilfellene, spesielt med gnotobiotiske dyr, kan CFU-telling skille alle bakteriearter i multispecies tarmsamfunn21,27,29. CFU-tellemetoder med høyere gjennomstrømning vil ytterligere forbedre kostnadseffektiviteten og hastigheten ved å måle sammensetningen av mikrobiomet og kan brukes på mange andre mikrobiologieksperimenter.

Telling av CFU ved seriell fortynning av en bakteriell suspensjon på agarbaserte vekstmedier er en standardmetode innen mikrobiologi. Koloniene som vokser på platene telles deretter manuelt. Fortynningene tillater forskeren å velge en tetthet av kolonier som er tellbar (f.eks. ~ 100 CFU per plate), noe som betyr at koloniene ikke vokser inn i hverandre og kan telles innen rimelig tid. De fleste mikrobiologer bruker i hovedsak den samme CFU-tellemetoden som ble utviklet for 140 år siden i laboratoriet til Robert Koch, og for mange applikasjoner er denne metoden fortsatt tilstrekkelig. Imidlertid oppstår et problem når man søker å kvantifisere et stort antall prøver. En enkelt prøve kan kreve plating 1 til 10 serielle fortynninger av prøven for å oppnå tellbare CFUer, slik at eksperimenter som involverer mer enn noen få dusin prøver blir beskattende. Ulike metoder er utviklet for å øke effektiviteten av CFU-opplisting. Automatisert spiralbelegg eliminerer behovet for serielle fortynninger30, noe som gjør bare en plate nødvendig for CFU-telling, men øker tiden for å plate prøven. Single plate-seriell fortynningsspotting (SP-SDS) tillater CFU-estimater fra færre plater per prøve31. Disse metodene er en forbedring i forhold til den tradisjonelle spredningsmetoden, men krever fortsatt håndtering og plating av bakterieprøver enkeltvis og er dermed ikke ideelle for høy gjennomstrømning. Håndtering av prøver i 96-brønnsplater og spotbelegging av de 96 prøvene på rektangulære agarplater forbedrer gjennomstrømningen av prøver19.

Mikrobiomer er vanligvis sammensatt av flere stammer og arter. Mens arter ofte kan preges av kolonimorfologi eller vekstmedier, kan fluorescens brukes til å skille mellom forskjellige typer bakterier og deres vekstegenskaper32. For eksempel kan forskjellige genotyper av samme art merkes med forskjellige genetisk kodede fluorescerende proteiner. Plateavbildningsmetoder som inkorporerer fluorescens tillater forskere å dra nytte av disse genetiske teknikkene i CFU-baserte analyser32. Inkorporering av fluorescens i CFU-tellemetoder med høy gjennomstrømning vil ytterligere forbedre deres nytte.

Å telle CFUer manuelt blir tungvint når det er et stort antall prøver. Automatisert telling av CFUer kan utføres ved å fotografere platen og behandle bildet ved hjelp av spesialisert programvare33. Sieuwerts og medarbeidere kombinerte den forbedrede platingseffektiviteten til spot-plating med automatisert kolonitelling ved hjelp av konvensjonell digital fotografering og ImageJ-programvare19.

En høy gjennomstrømningsmetode for å skjerme fenotypene til spesifikke mikrobe- og vertsforeninger vil hjelpe studier av mikrobiomsamfunnsforsamling og virkningen på vertshelse og kondisjon. For studier av Drosophila-mikrobiomet vil en mikrobiologiplattform med høy gjennomstrømning omfatte håndtering av flueprøver i 96-brønns plateformat, fluelyse uten bakterielyse, effektiviteten av spotbelegg, muligheten til å bruke fluorescens og skille flere fluoroforer, et kontrollert lysmiljø for reproduserbar avbildning av CFU-plater og en pålitelig automatisert kolonitellingsprogramvare. Denne artikkelen beskriver en metode som er optimalisert for analyse av CFUer i gnotobiotiske fluer, som er enkel, rask og automatisert. Denne protokollen skisserer en ny arbeidsflyt som kombinerer det beste fra tidligere publiserte metoder og optimalisert for å utforske tarmmikrobiomet i Drosophila.

Protocol

1. Fly kolonisering

MERK: Denne metoden er egnet for kvantitativ analyse av fluer med et dyrkbart tarmmikrobiom ved vekstbelegg av CFUer. En detaljert protokoll for oppdrett av gnotobiotiske fluer er tidligere publisert12.

  1. Etablere stabil kolonisering av en kommensal bakterieart.
    1. Forbered en frisk bakteriekultur, pellet ved sentrifugering ved 400 x g i 3 minutter ved romtemperatur, og resuspender cellepelleten i PBS til en OD600 på 1,0. For denne protokollen ble Lactiplantibacillus plantarum (tidligere kjent som Lactobacillus plantarum) dyrket over natten til en OD600 på 2,0.
    2. Pipette 100 μL på maten i et hetteglass med flue (se materialtabell). Fordel jevnt og la væsken absorbere i 15-30 minutter.
    3. Overfør 20 bakteriefrie fluer inn i dette hetteglasset ved hjelp av standard hetteglass til hetteglassets flippeteknikk34. Hver flue vil spise omtrent like mye av bakteriedosen35. Alternativt kan bakteriefrie egg tilsettes.
    4. Overfør fluene til fersk steril mat daglig i 3 dager. Gjør alt dette i et biosikkerhetsskap og bruk steril teknikk (figur 1A-1).
  2. Før måling av CFU-belastning, overfør fluene til et hetteglass som inneholder sterilt agarvann i 4 timer for å fjerne forbigående bakterier fra tarmen. Agar-vannflaskene gir en kilde til fuktighet for fluen, men ingen ernæring for fluen eller bakteriene på overflaten. De tilberedes i samme sterile flueflasker som med vanlig mat, men inneholder bare avionisert vann og 1,5% agar.

2. Homogenisering flyr individuelt i en 96-brønns PCR-plate

  1. Forbered perle beater plater på forhånd.
    1. Hell 0,5 μm glassperler (se materialfortegnelse) på dråpemålebrettet (3D-printet ved hjelp av Supplemental Coding File 1 S1-bead-measurer.stl). Spred perlene på brettet slik at alle brønnene er fulle og jevne, og børst deretter av overflødige perler i et konisk rør for å gjenopprette dem.
    2. Plasser en halvskjørt PCR-plate (se materialtabell) opp ned på målebrettet og juster den etter brønnene ved å montere den i innrykket på målebrettet. Deretter snur du den raskt for å overføre perlene.
    3. Fjern overflødige perler fra PCR-plateoverflaten og dekk den med folie. Inspiser PCR-platen for å sikre at alle brønnene inneholder perler. Bruk en veieskje om nødvendig for å legge perler til en enkelt brønn. Hvis statisk elektrisitet får perler til å feste seg på plateoverflatene, tørk av eller spray baksiden av målebrettet og PCR-platen med 70% etanol.
    4. Dekk med aluminiumsfolie. Mange plater kan fremstilles på denne måten og deretter autoklaveres og lagres for senere bruk. Når du er klar til bruk, tilsett 100 μL PBS til hver brønn ved hjelp av 96-kanals pipettor (se materialtabell).
  2. Overflatesteriliser de mikrobekoloniserte fluene (se trinn 1) med 70% etanol før homogenisering.
    1. Bedøv fluene med 100% CO2 i 5 s. Overfør bedøvede fluer fra hetteglasset til et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av en liten trakt (figur 1A-2). I denne studien ble 25 fluer vanligvis tilsatt per rør.
    2. Spray umiddelbart ~ 1 ml 70% etanol i røret, lukk røret og bland ved inversjon i 10 s. Deretter aspirerer etanolen med en P1000-pipette, og vær forsiktig så du ikke aspirerer noen fluer. Gjenta igjen med etanol, deretter to ganger med steril PBS (figur 1A-3).
  3. Etter den siste PBS-vasken, lukk røret og, med hetten med siden ned, trykk den hardt et par ganger på benken slik at fluene går inn i hetten.
  4. Åpne røret og dispense fluer inn i brønnene ved hjelp av tang (Figur 1A-4). Plasser en flue i hver brønn (Figur 1A-5). Hold platen på is mens du laster for å holde fluene bedøvet.
  5. Forsegl platen med varmeforseglingsfolie med termisk binding (se materialfortegnelse).
    1. Fjern først eventuelle bortkommen perler som er nær brønnene, da disse kan forårsake lekkasje i folietetningen. Pass på at den kjedelige siden av folien er orientert ned på platen og den skinnende siden opp mot varmeforsegleren. Trykk varmeforsegleren (se materialtabellen) godt ned i 5 s (figur 1A-6). Brennaktig med håndapplikatoren (se Materialfortegnelse) for å feste folien.
      MERK: Dårlig forsegling er en årsak til prøvetap.
  6. Fest platen i plateristeren. Homogeniser i 5 minutter (Figur 1A-7). Spinn ned perleplaten i 30 s i en mini-plate spinner (se Materialtabell) ved 350 x g for å fjerne væske fra tetningsfolien.
  7. Fjern folien mens du holder platen for ikke å sprute dråper av fluehomogenat ut av brønnene.

3. Seriell fortynning av fluehomogenat og spotting på CFU-plater

  1. Plasser fire rektangulære MRS-agarvekstplater (se materialtabell) i biosikkerhetsskapet og fjern lokkene. I denne protokollen ble MRS-agar brukt til vekst av L. plantarum. La disse platene tørke i minst 10 minutter (20 min hvis de er nypøst eller kalde fra lagring).
    MERK: Hvis platene er våte, vil dråpene fra 96-brønnsplaten løpe sammen og ødelegge tellingene.
  2. Forbered tre fortynningsplater ved å tilsette 100 μL PBS til hver brønn i en steril 96-brønnsplate ved hjelp av en 96-kanals pipettor. Legg et stativ med P20-spisser på 96-kanals pipetoren.
  3. Lag en 1:10 fortynning ved å aspirere 11,1 μL homogenat fra prøveplaten fremstilt i seksjon 2 (figur 1A-8). Pass på å tegne fra midten av brønnene i stedet for bunnen av brønnene fordi fluehomogenatet og glassperlene vil tette pipettene. Perlene synker, og fluepartiklene flyter, slik at mellomlaget stort sett er klart.
  4. Dispenser 11,1 μL i den første fortynningsplaten, som allerede inneholder 100 μL steril PBS per brønn. Hold fortynningsplaten på plateskakeren i 10 s ved 600 o / min. Bland igjen ved pipettering opp og ned i fem sykluser. Overfør 11,1 μL fra den første fortynningsplaten til den andre fortynningsplaten, og gjenta blandetrinnene for de neste to fortynningsplatene.
  5. Utfør fortynningsserien plating som beskrevet nedenfor.
    1. Hent vekstplatene fra biosikkerhetsskapet.
    2. Begynn med den mest fortynnede platen, spot 2 μL fra hver brønn på agarplatene ved hjelp av pipettoren med 96 brønner (figur 1A-9).
      1. Senk pipettorhodet sakte på platen, pass på at du ikke stikker inn i agaren. Undersøk platen nøye og sørg for at alle flekkene er dispensert; hvis ikke, legg manuelt 2 μL til riktig posisjon. Kontroller at de flytende flekkene raskt suger inn i agar og ikke løper sammen.
      2. Hvis flekkene løper sammen, tørk et nytt sett med ferske agarplater i en lengre periode og gjør om spottingen. Hvis det er flere platetyper (for eksempel forskjellige medier eller med antibiotika), må du også oppdage dem. Dispenser eventuell gjenværende oppløsning tilbake i fortynningsplaten og fortsett til neste høyere konsentrasjon.
        MERK: Når du oppdager fortynninger, blander du neste fortynning fem ganger for å sikre at innholdet i pipettespissene fjernes fra forrige fortynning. Fortynningsplatene kan lagres >8 timer ved 4 °C uten å påvirke kolonitellingene35.
  6. Gjenta pletteringsprosessen som beskrevet i trinn 3.5 for de gjenværende fortynningsplatene, og gå fra mest fortynnet til mest konsentrert til platen med det opprinnelige homogenatet.
  7. Når all væsken er absorbert i agaren, snu platene og legg dem i inkubatoren (figur 1A-10). For Lactiplantibacillus og Acetobacter fra Drosophila er optimal temperatur 30 °C på MRS-medier. Inkuber til koloniene har nådd optimal størrelse: koloniene er store nok til å se dem tydelig, men ikke så store at de smelter sammen eller forstyrrer hverandres vekst (se de representative resultatene for kvantifisering av optimal størrelse).
    MERK: Optimale vekstforhold er belastningsavhengige og må bestemmes empirisk. For Lactiplantibacillus fra Drosophila er den optimale inkubasjonstiden 26 timer til 30 timer på MRS agar. For Acetobacter fra Drosophila er den optimale inkubasjonstiden 30 timer til 48 timer på MRS, avhengig av belastningen.
  8. Etter inkubering, oppbevar platene ved 4 °C om nødvendig til de er klare for telling.

4. Kvantifisering av CFUer

  1. Kvantifiser CFU-er ved å fotografere platene og deretter telle koloniene ved hjelp av automatisert programvare, som beskrevet nedenfor. Hvis platene ble lagret ved 4 °C, må du først la dem nå romtemperatur slik at det ikke er kondens på platene, noe som gir gjenskinn.
  2. Organiser platene i en logisk rekkefølge og hold dem i den rekkefølgen mens du fotograferer - det gjør det lettere å navngi filene. Orienter alle platene slik at A1 er i øvre venstre hjørne for alle platene. Det anbefales å merke A1-hjørnet med en unik ID for å sikre at bildene ikke blandes. Stable hver fortynningsserie i rekkefølge.
  3. Fjern platelokket og legg platen på scenen med A1 orientert i riktig hjørne. Design er inkludert for platefotoboksen (Supplemental File 1, Supplemental File 2), som er optimalisert for fotografering av disse skuffplatene og inkluderer belysnings- og filteralternativer for å avbilde fluorescerende kolonier.
  4. Se for deg platene. Bruk kameraet (se Materialfortegnelse) med manuelle innstillinger for å oppnå et konsistent eksponeringsnivå mellom platene. En lang brennviddeinnstilling anbefales for å minimere perspektivforvrengning. Ta bildet ved hjelp av en ekstern lukker for å minimere uskarphet fra kamerarystelser.
  5. Overfør bildene til en datamaskin og gi dem nytt navn, inkludert eksperimentnavnet, medietypen, fortynningsfaktoren og andre relevante detaljer. Noen operativsystemer (se Materialfortegnelse) har en nyttig batch-omdøpingsfunksjon i Finder ved å høyreklikke på et utvalg av filer.

5. Automatisert kolonitelling ved hjelp av Count-On-It-pakken (tilleggsfil 3)

  1. Beskjær bildene ved hjelp av den medfølgende Croptacular plugin (Supplemental Coding File 2) for ImageJ. Dette pluginet bidrar til å dele bildet i et ordnet utvalg av underregioner (f.eks. 8 x 12 for en 96-brønnplate). Underregionene telles individuelt.
    MERK: En egen plugin for telling av sirkulære plater kalt Circus er beskrevet i Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.
    1. Organiser bildene som skal behandles for kvantifisering, i en mappe. Velg filnavn som skiller platene, da disse filnavnene blir kolonnetitler for hvert sett med tellinger . I denne mappen lager du undermapper med navnet "beskåret" og "kvitteringer" .
    2. Start Croptacular, og klikk OK for å starte beskjæringen.
      MERK: Standardinnstillingene vises og er vanligvis tilstrekkelige. Avhengig av oppløsningen på bildet, belysningen, spotstørrelsen osv., Kan det være nyttig å justere basisparametrene.
    3. Hvis bildet allerede er rett, trykker du bare på Space. Ellers retter du bildet ved å tegne en linje langs en kant som skal bli horisontal. Tegn linjen på nytt så mange ganger som nødvendig hvis bildet fortsatt ikke vises rettet.
    4. Deretter tegner du en grenseboks for området som det skal telles for. Juster størrelsen og proporsjonen til alle flekkene er i cellene. Dra markøren utenfor grenseboksen for å oppdatere rutenettet. Når rutenettet ser bra ut, trykker du MELLOMROM.
    5. Forsikre deg om at neste bilde automatisk roterer til samme vinkel som det første; plugin antar at alle bildene er justert det samme. Hvis dette er riktig, trykker du på MELLOMROM for å fortsette. Ellers retter du bildet som før. Rutenettet husker også samme posisjon som forrige bilde; juster om nødvendig, og trykk deretter MELLOMROM.
  2. List opp koloniene på platene ved hjelp av den medfølgende Count-On-It: Gridiron-plugin-modulen for ImageJ (Supplemental Coding File 4). Detaljerte instruksjoner for installasjon og bruk av plugin er inkludert i tilleggsfil 3.
    1. Start count-on-it > gridiron. Bruk de samme rutenettinnstillingene som med Croptacular. Brukere kan gruppere en hel mappe, analysere et enkelt bilde eller starte fra gjeldende bilde.
    2. Angi terskelen basert på en øvre og en lavere pikselintensitetsverdi. Gjør terskelen så streng som mulig mens du fortsatt velger alle koloniene. Ideelt sett vil det være noe mellomrom mellom de valgte koloniene, men programvaren er i stand til å segmentere blobene til en viss grad. Klikk OK i dialogboksen "Handling kreves" når terskelen er tilfredsstillende .
    3. For å inspisere resultatene, zoom inn og se nærmere på kolonitellingene. Hvis du klikker på avbryt, avbrytes pluginet. Klikk OK for å fortsette.
    4. På det første bildet må du sørge for at alternativet er gitt for å fortsette eller gå tilbake til oppsettmenyen, for eksempel for å endre minimum kolonistørrelse. For å fortsette med batchprosessen, klikk OK. Velg deretter en mappe for å beholde kvitterings- og resultattabellen. Bruk mappen "kvitteringer" eller opprett en ny mappe.
    5. Etter det første bildet vil de neste bildene som standard ha samme terskel som de forrige innstillingene. Klikk OK for å bruke disse innstillingene eller justere innstillingene. Hvis bildene er konsistente og innstillingen er nøyaktig , klikker du OK i dialogboksen "Handling kreves".
      MERK: Når alle bildene i batchen er fullført, lagres resultattabellen automatisk i samme mappe som kvitteringene.
    6. Se gjennom tellekvitteringene som produseres av programvaren, og korriger eventuelle tellefeil manuelt. ImageJ-plugin-modulen er statistisk nøyaktig, men det oppstår feil. Bevis kvitteringene for å undersøke uteliggere og identifisere feiltellinger. Programvaren lagrer CFU-dataene som en .csv fil i samme mappe som kvitteringene.
  3. Analyser dataene ved hjelp av den foretrukne programvaren.

Representative Results

Oppregning av CFUer i hundrevis av individuelle fluer i 96-brønns plateformat ved hjelp av koloniseringsanalyse
For å forstå sammensetningen av mange individuelle fluemikrobiomer ble CFU målt ved hjelp av den medfølgende protokollen, som gjorde det mulig å identifisere arten som var tilstede, prosentandelen fluer kolonisert og den absolutte overflod av bakterier i hver flue. Årsakene til den store observerte individuelle variasjonen i mikrobiomsammensetningen er dårlig forstått, og kvantifisering av den statistiske fordelingen av kolonisering kan bidra til å studere denne variasjonen36,37. For å oppnå et betydelig antall biologiske replikasjoner ble det utviklet en høykapasitetsrørledning for kvantifisering av mikrobeforekomst i mange individuelle fluer ved hjelp av CFU-tellinger (figur 1A).

Den endelige kvantifiseringen av CFU kan påvirkes av hvordan fluer håndteres før analyse, for eksempel faktorer som overflatesterilisering, tid siden forbruk av bakterier og clearance av forbigående bakterier fra tarmen. For det første, med fokus på Drosophila commensal bakterieart L. plantarum (Lp; se Lp stamme WF i Obadia et al.36), ble fluer matet en dose på ~ 105 CFU av Lp og holdt i grupper på 25 fluer per hetteglass. Disse fluene ble enten oppbevart i samme hetteglass i 3 dager eller overført daglig (overført) til fersk, steril mat (figur 1B). Uoverførte fluer ble deretter enten vasket i etanol for å fjerne overflatebakterier (vasket) eller ikke vasket (uvasket). Vasking ga en ikke-signifikant reduksjon i de totale CFU-ene som ble målt (figur 1B), noe som indikerer at flueoverflaten ikke blir signifikant kolonisert av bakterier på 3 dager. De andre gruppene av fluer ble overført hver dag for å redusere akkumulering av bakterier fra vekst på mat (Overført); I tillegg ble en gruppe overført til fersk mat i 4 timer før prøvetaking (Post-Transferred), eller de ble satt i hetteglass med bare sterilt agarvann i 4 timer (ryddet) for å tillate forbigående inntatt mikrober å fjerne fra tarmen. Hvert av disse trinnene for å gi strengere koloniseringsmåling ga en statistisk signifikant reduksjon i overflod av CFU i fluene, med unntak av overflatevask i etanol. Overføring til steril mat (etteroverføring) eller agarvann (ryddet) i 4 timer før måling ga uutslettelige effekter, noe som indikerer at overføring til sterile forhold 4 timer før måling reduserer bakteriebelastningen. Dette resultatet er i samsvar med tolkningen om at noen tarmbakterier i fluetarmen er forbigående, mens andre er mer stabilt assosiert35. Forekomsten av Lp varierte fra 1 x 10 4,3 CFU/flue i klarerte fluer til 1 x 104,9 CFU i de uvaskede fluene (n = 724 fluer).

Deretter ble den samme analysen utført ved hjelp av Acetobacter indonesiensis (Ai), en gramnegativ bakterie som koloniserer fluetarmen (figur 1C; se stamme Ai SB003 i Obadia et al.36). Som med Lp-koloniserte fluer ga overflatesterilisering en ikke-signifikant reduksjon i CFU. På samme måte reduserte daglig overføring til steril mat bakteriell belastning betydelig, og overføring til sterile forhold i 4 timer før homogenisering ga en ytterligere reduksjon i bakteriell belastning. Forekomsten av Ai varierte fra 1 x 104,7 CFUer/flue i klarerte fluer til 1 x 105,0 CFU i de uvaskede fluene (n = 528 fluer). Dermed avhenger nøyaktig kvantifisering av tarmbakterier av overføringsfrekvensen, inkludert på overføringsdagen. Fjerning av ekstern bakteriebelastning ved vask i etanol hadde en ikke-signifikant effekt, men mer signifikante effekter kan observeres for forskjellige bakteriestammer eller forskjellige kulturforhold. Disse faktorene bør kontrolleres eksperimentelt.

Den potensielle effekten av homogeniseringsmetoden på CFU-tellinger ble også testet. Fluene ble homogenisert ved hjelp av en perleslår med 0,5 μm glassperler i 100 μL PBS, noe som kunne redusere levedyktigheten til bakterieceller. Først ble en suspensjon av Lp-bakterier fra kultur fremstilt i PBS og deretter belagt for å telle CFU som en positiv kontroll. Den samme kulturen ble plassert i perleslagerplaten og (i) homogenisert med perler, (ii) homogenisert med perler og en bakteriefri flue, eller (iii) homogenisert i PBS uten perler (figur 1D). Homogenisering i perler når en flue var tilstede, påvirket ikke signifikant overflod av levedyktige celler i oppløsning, mens homogenisering av bakterier i fravær av en flue drepte et betydelig antall bakterieceller. Homogenisering i PBS uten perler reduserte også antall levedyktige celler betydelig. Tilsvarende ble Ai levedyktighet bevart når homogenisert i nærvær av en flue, mens homogenisering uten flue reduserte antall levedyktige celler i oppløsning (figur 1E). Disse resultatene indikerer at fluevevet beskytter bakteriene mot å bli ødelagt av perlene under homogenisering. Forsøkene i figur 1D og figur 1E ble imidlertid utført med mer enn 108 CFUer per brønn. I praksis ble brønner med ~106 celler per brønn eller mindre funnet å vise lite celletap når perler ble brukt uten flue. Kjøling av platen på is halvveis gjennom perleslag forbedrer også cellens levedyktighet. Betydningen av disse resultatene er at leserne bør være oppmerksomme på disse potensielle problemene og utforme passende kontroller for deres spesifikke brukstilfelle.

Nøyaktighet av punktbelegg 96-brønnsplater for CFU-kvantifisering med høy gjennomstrømning
Siden målet er å måle CFU-overflod for hundrevis til tusenvis av individuelle fluer, er tradisjonelle spredningsmetoder uoverkommelig tids- og materialkrevende. Spot plating er en effektiv og effektiv metode for CFU vekst og oppregning19,31. Flekkbeleggmetoden bruker en 96-kanals pipettor til å dispensere 2 μL bakteriesuspensjon på medier fremstilt i rektangulære brettplater (figur 2A). Hvert sted representerer bakteriebelastningen av en enkelt prøve, så 96 fluer kan analyseres med en enkelt plate (figur 2B). Nøyaktigheten av flekkbelegg ble sammenlignet med tradisjonell plettering ved å inokulere vekstplater ved å bruke nøyaktig samme 0,0001 OD-suspensjon av Lp for begge metodene. Suspensjonen ble todoblet serielt fortynnet fem ganger i PBS. Som en head-to-head sammenligning ble 50 μL av inokulum spredt på individuelle runde plater, eller 2 μL flekker ble laget på rektangulære MRS-plater. Platene ble deretter inkubert ved 30 °C til koloniene var tellbare. De resulterende CFU-tellingene for hver fortynning ble brukt til å beregne den opprinnelige konsentrasjonen av suspensjonen og sammenlignet (figur 2C). Runde plater med 50-500 CFUer ble regnet som kontrollen. Ingen signifikant forskjell ble observert mellom høy gjennomstrømning og tradisjonelle runde plating metoder.

Siden tettheten av kolonier kan påvirke deres vekst og kvantifisering, ble effekten av CFU-tetthet på endelige tellinger testet. Flekker med 2 til 25 kolonier per flekk viste ingen forskjell i endelig telling sammenlignet med den tradisjonelle runde platemetoden (figur 2C). Flekker med gjennomsnittlig 35 kolonier ga resultater som skjevt litt lavere enn kontrollspredningsplatene (figur 2C; p = 0,0017). Nøye undersøkelse av fotografiene av enkelte flekker indikerte at denne skjevheten skyldtes kolonier som overlappet i tette flekker. Målinger basert på flekker med gjennomsnittlig 11 kolonier per flekk resulterte i konsentrasjoner nærmest de som er basert på spredningsplatene (figur 2C; Spredningsplater: gjennomsnitt = 1 x 104,4 CFUer; SD = 0,086 vs. flekker med 11 gjennomsnittlige kolonier: gjennomsnitt = 1 x 104,4 CFUer; SD = 0,12, p = 0,42, Welchs t-test).

Generering av bilder av høy kvalitet for kvantifisering ved hjelp av en spesialisert fotograferingsplattform med enten hvitt lys eller fluorescens
Spot-plating med høy gjennomstrømning genererer naturlig nok et stort antall målområder, som må telles nøyaktig. Kvalitetsfotografier kan brukes til å dokumentere dataene og for å lette tellingen av CFUer. En robust og oversiktlig fotoplattform ble utviklet med kommersielt tilgjengelige materialer (figur 3A). Et digitalt kamera ble festet til en brakett på toppen av en spesialkonstruert lysboks, kalt FluoroBox, og ble pekt rett ned, vinkelrett på midten av platen. Et farget utslippsfilter ble eventuelt plassert foran objektivet ved hjelp av en filterglidebryter. Et lysskjold forhindret linsebluss ved å blokkere direkte lys fra LED-stripene nedenfor. LED-striper opplyste platen fra sidene, i stedet for over, for å forhindre gjenskinn på platen. I tillegg til hvitt lys ble ensfargede blå og grønne lysdioder brukt til å opphisse henholdsvis grønne og røde fluorescerende proteiner. Platen ble holdt på plass av en plateholder på skuffen, og skuffen var utstyrt med skuffeglidebrytere for å gjøre det enkelt å sette inn platen. Komplette design er tilgjengelige i Tilleggsfil 1 og Tilleggsfil 2.

Et bilde av en spotplate av Lp-kolonier ble tatt ved hjelp av hvite lysdioder og et digitalt kamera for å hjelpe til med å telle kolonier og skille mellom forskjellige farger og morfologier (figur 3B). For å validere at lysintensiteten var jevn, ble bakgrunnsintensiteten til agar målt over forskjellige regioner i et platefotografi (figur 3C). For å demonstrere at koloniene tydelig kan skilles fra bakgrunnen, ble intensiteten over diameteren på 10 forskjellige kolonier på forskjellige deler av platen målt og funnet å være omtrent ~ 300% høyere enn bakgrunnen (figur 3C). Platen ble inokulert med Lp med et mCherry fluorescerende proteinuttrykkende plasmid, samt noen Lp som ikke inneholdt plasmidet, så koloniene var enten mCherry-positive eller mCherry-negative. For å skille disse to typene kolonier ble platen fotografert med samme kamera med grønt LED-lys (515-525 nm) og et rødt filter (Tiffen #29), noe som fikk mCherry-positive kolonier til å fluorisere (figur 3D). Forskjellen i intensitet mellom mCherry-positiv og mCherry-negativ ble kvantifisert ved å måle intensiteten over et utvalg av kolonier (n = 10 kolonier). mCherry-positive kolonier var ~1000 % høyere intensitet enn mCherry-negative (figur 3E). Kolonier av Ai som uttrykker GFP og kolonier av Ai som ikke uttrykker fluorescens ble fotografert med blå LED-lys (465-475 nm) og et grønt filter (Tiffen # 58) (figur 3F). GFP-positive kolonier viste 200% høyere intensitet enn GFP-negative (figur 3G).

Automatisert telling av CFU-er på spotplater ved hjelp av den tilpassede ImageJ-plugin-modulen Count-On-It
Bilder alene hjelper til med å telle kolonier (f.eks. ved å lagre dataene, dele dataene, zoome inn, merke et overlegg, skille farger osv.). Imidlertid kan handlingen med å manuelt telle og organisere resultatene av hundrevis av steder være kjedelig, tidkrevende og utsatt for menneskelige forskjeller i endelige tellinger. For å fremskynde telleprosessen og standardisere reproduserbarheten av teller, ble det utviklet en spesialisert ImageJ-plugin kalt Count-On-It (figur 4A). Denne plugin-modulen muliggjør nøyaktig halvautomatisk telling av CFU-er på agarplater. Brukeren forbereder bilder for telling ved først å beskjære og rette dem ved hjelp av den ekstra Croptacular-plugin-modulen. Bildene kan eventuelt batchbehandles, og terskelen kan justeres for hver plate. Flere andre alternativer lar brukeren øke nøyaktigheten av platetelling, inkludert justering av lysbølgelengder (RGB-bilder), innstilling av et område med kolonistørrelse (i piksler), endring av maksimalt størrelsesforhold og tilpasning av dimensjonene til det aktive markeringsrutenettet. Count-On-It sender ut en resultattabell der hver plate representeres som en kolonne med CFU-tellinger. Det genererer også en fotokvittering som viser et overlegg for å visuelt dokumentere telleresultatene og hjelpe til med manuell feilkorreksjon (figur 4B). Mens feil oppstår, når antall kolonier telt manuelt ble sammenlignet med antall kolonier telt ved hjelp av denne plugin-modulen (figur 4C), var forholdet generelt ekvivalent, med lineær regresjon mellom manuelle og automatiserte tellinger som viste en skråning på 0,95 med over 90% nøyaktighet (R2 = 0,93), selv om feilen økte når antall kolonier oversteg 20.

Count-On-It kan også brukes til å telle fluorescerende kolonier separat ved hjelp av fluorescensfunksjonen til FluoroBox. mCherry-positive kolonitellinger (figur 4D) etter programvareplugin versus manuell hadde en R2 på 0,92 (figur 4E). Tilsvarende hadde GFP-positive kolonier (figur 4F) telt med programvareplugg versus manuell en R2 på 0,90 (figur 4G). Fluorescerende versus ikke-fluorescerende kolonier kan skilles i en enkelt prøve, og kolonistørrelse og form kan i tillegg brukes til å skille separate underpopulasjoner (figur 4H-K). Bildekvitteringene gir en oppføring som lar brukeren raskt sjekke nøyaktigheten av tellingene og manuelt rette feil. I figur 4C, E, G, I, K har fotokvitteringene ikke blitt brukt til å forbedre tellenøyaktigheten slik at leserne kan se råutgangen av metoden. Tilfeller som i figur 4G, der en manuell telling på 1 ga en automatisk telling på 21, kan raskt oppdages ved hjelp av bildekvitteringene. I dette tilfellet skapte blending på kanten av platen klumper som ble regnet som kolonier. For hvert brukstilfelle må de optimale innstillingene for programvareplugin-modulen bestemmes før høy gjennomstrømningstelling.

Figure 1
Figur 1: Koloniseringsanalysen måler CFUer i hundrevis av individuelle fluer ved hjelp av et 96-brønns plateformat. (A) Bildeoversikt over koloniseringsanalysen og kvantifiseringsmetoden med høy gjennomstrømning som brukes som beskrevet i protokolldelen. (B) Lactiplantibacillus plantarum (Lp) overflod hos fluer etter koloniseringsanalysen ble målt under varierende forhold ved bruk av CFU-kvantifiseringsmetoden med høy gjennomstrømning. Fluer ble holdt i samme hetteglass i 3 dager og deretter homogenisert og belagt (uvasket), vasket i etanol før plating (vasket), både vasket og overført hver dag (overført), overført daglig deretter holdt på steril mat før plating (Post-Transferred), eller holdt i hetteglass med bare vann i 4 timer (ryddet) (n = 724 fluer totalt, 3 biologiske replikasjoner og ~ 72 fluer totalt per behandling). (C) Samme analyse som i (B) ble utført ved bruk av Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 fluer). (D) Lp bakteriell suspensjon ble fremstilt i PBS og deretter belagt for å telle CFU eller først homogenisert ved perleslag, perle-slått i kombinasjon med en bakteriefri (GF) flue, eller ristet på perle beater uten perler eller en flue (n = 236 prøvebrønner). (E) Ai levedyktighet etter homogenisering ble testet på samme måte som i (D) (n = 282 prøvebrønner). Statistisk signifikans for paneler (B-E) ble beregnet ved hjelp av en Kruskal-Wallis-test etterfulgt av parvise Wilcoxon rank-sum-tester med Bonferronis multiple sammenligningskorreksjon. Boksen gir interkvartil rekkevidde. Linje indikerer median. Whiskers gir total rekkevidde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Nøyaktighet av punktbelegg 96-brønnsplater for CFU-kvantifisering med høy gjennomstrømning. (A) Flekkbelegg ved bruk av en 96-kanals pipettor for å dispensere 2 μL på medier fremstilt i rektangulære skuffplater. (B) MRS-agar vekstplate med 96 flekker av Lp-kolonier . (C) Konsentrasjon av Lp-suspensjon basert på CFU-tellinger fra tradisjonelle runde plater (n = 24 plater) sammenlignet med konsentrasjon basert på CFU-tellinger fra spotplater (n = 680 flekker) serielt fortynnet og ordnet etter gjennomsnittlig koloniantall per spot (~48 flekker for hver enkelt fortynningsfaktor for tre replikasjonsplater ble talt). Hvert datapunkt representerer de nøyaktige koloniene per sted, mens hver kolonne representerer de gjennomsnittlige koloniene for den fortynningen. Horisontal stiplet linje indikerer det beregnede CFU-tallet for kulturen som ble belagt. Grønne skisserte punkter fremhever de tradisjonelle runde tallerkentellingene. Rødfylte punkter fremhever den optimale kolonitettheten på 11 CFU per 2 μL spot. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av vanlig enveis ANOVA som sammenlignet gjennomsnittet av hver kolonne mot gjennomsnittet av spredningsplatekontrollkolonnen med Bonferronis multiple sammenligningskorreksjon. Boksen gir interkvartil rekkevidde. Linje indikerer median. Whiskers gir total rekkevidde. **p < 0,01. ns = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: En fotograferingsplattform produserer kvantifiserbare bilder av plater ved hjelp av hvitt lys eller fluorescens . (A) Oversikt over FluoroBox-designet. (B) Bilde av en flekkplate av Lp-kolonier med hvitt lys. (C) Intensitetsprofil for enkeltkolonier under hvitt lys sammenlignet med intensiteten i bakgrunnen (BKG) (n = 10 kolonier, stiplet linje representerer standardavvik). (D) Bilde av samme spotplate som i (B), ved hjelp av ensfargede grønne lys og det røde filteret for å velge for mCherry-positive Lp-kolonier . (E) Intensitetsprofil for enkeltkolonier som illustrerer forskjellen mellom kolonier med og uten mCherry-utslipp. (F) Foto av en spotplate som inneholder Ai-kolonier , hvorav noen har en GFP-etikett. (G) Intensitetsprofil for enkeltkolonier som illustrerer forskjellen mellom GFP-negative og GFP-positive kolonier. E, F, G: n = 10 kolonier for hver tomt. Kolonidiametere er ca. 1,5 mm. Stiplet linje er SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Nøyaktig telling av spotplater med Count-On-It ImageJ-plugin-modulen. (A) Skjermbilde av vinduet for oppsett av plugin-modulen. (B) Plugin-modulen genererer en kvittering for å dokumentere telling og hjelpe til med feilretting. Innfelt: Overlegg med antall kolonier telt for hver spotregion; Det gule omrisset indikerer at en enkelt koloni ble talt og rødt at flere kolonier ble talt. (C) Plott som viser antall kolonier som telles manuelt sammenlignet med antall kolonier som telles ved hjelp av plugin-modulen (automatisert) når et hvitt lysbilde ble brukt, der hvert punkt på grafen representerer et enkelt punkt telt manuelt eller automatisk (helling av passform = 0,95, cyan linje; 1: 1 linje er stiplet rød; R2 = 0,93, Pearsons korrelasjonskoeffisient, p < 0,0001). (D) Fotokvitteringsbilde fra plugin-modulen når mCherry-positive kolonier ble valgt ved hjelp av fluorescensfunksjonen til fotoboksen. (E) Plot som viser antall mCherry-positive kolonier telt ved hjelp av manuell sammenlignet med automatisert metode når rød fluorescens ble brukt (helling av passform = 1,1, cyan linje; 1: 1 linje er prikket rød; R2 = 0,92, Pearsons korrelasjonskoeffisient, p < 0,0001). Merk at uteliggere og feil ikke er rettet ved bruk av analysekvitteringene for E,G,I,K. (F) Fotokvitteringsbilde fra plugin-modulen når GFP-positive kolonier ble valgt ved hjelp av den grønne fluorescensfunksjonen i fotoboksen og valg av den grønne kanalen med plugin-modulen. (G) Plott som viser antall GFP-positive kolonier som telles ved hjelp av manuell sammenlignet med automatisert metode når grønn fluorescensbelysning ble brukt (helling av passform = 1,1, cyanlinje; 1: 1-linjen er prikket rød; R2 = 0,90, Pearson-korrelasjonskoeffisient, p < 0,0001). (H) mCherry-positive kolonier valgt fra blandede kolonimorfologier ved bruk av en høy fluorescensterskel i plugin-modulen. (I) Plott som viser antall mCherry-positive kolonier telt ved hjelp av manuell sammenlignet med automatisert metode når rød fluorescensbelysning ble brukt (helling av passform = 0,99; R2 = 0,91, Pearsons korrelasjonskoeffisient, p < 0,0001). (J) mCherry-negative kolonier valgt fra blandede kolonimorfologier ved bruk av lav fluorescensterskel. (K) Plott som viser antall mCherry-negative kolonier telt ved hjelp av manuell sammenlignet med automatisert metode når intensitetsgrensen ble satt til å velge ikke-fluorescerende kolonier (helling av passform = 1,1; R2 = 0,85, Pearsons korrelasjonskoeffisient, p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1: Monteringsanvisning for FluoroBox. Denne filen leder leseren trinn for trinn gjennom konstruksjonen av den kontrollerte belysningsboksen som brukes i videoen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: FluoroBox akryl laserkutt. Denne filen gir en kuttmal for å laserkutte akrylbitene for den kontrollerte belysningsboksen. Filen kan sendes til en laserskåret akrylleverandør. Se materialfortegnelsen for leverandøren som brukes i denne protokollen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Instruksjoner for programvaren. Denne filen leder leseren trinn for trinn gjennom installasjon og bruk av Croptacular og Count-On-It-programvaren som følger med denne protokollen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 1: 3D-utskriftskode for perlemålebrett (S1-bead-measurer.stl). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 2: Rektangulær platefotobeskjærer ImageJ-plugin (Croptacular_.ijm). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende koding Fil 3: Rundplate foto cropper plugin (Circus_.ijm). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 4: Rektangulær plate 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

De detaljerte teknikkene som presenteres her, muliggjør en > 100 ganger økning i antall prøver som kan evalueres i et CFU-tellingseksperiment. Denne teknikken fremmer eksisterende metoder for mikrobiomeksperimenter i Drosophila 12,35,36 ved å bruke 96-brønns plateformat for å analysere individuelle fluer. Videre bruker den en mer effektiv spotbeleggmetode19,31 og en automatisert arbeidsflyt med en fotograferings- og kolonitellingsplattform. Betydningen av denne metoden for Drosophila er å standardisere eksperimenter til 96-brønns plateformat, noe som muliggjør samtidig håndtering av et stort antall biologiske replikasjoner med automatisering for å oppnå kvantifisering av CFUer med høy gjennomstrømning.

Plattformen med 96 brønner viser at økt overføringsfrekvens og "clearing" av forbigående bakterier forårsaker en betydelig reduksjon i både gjennomsnittlig overflod og variasjon mellom prøver (figur 1B, C), noe som viser strengheten til denne forbedrede protokollen. En begrensning av co-housing fluer er den horisontale overføringen av bakterier mellom fluer. En foreslått løsning er å holde fluer individuelt i et 96-brønns plateformat, for eksempel Whole Animal Feeding Flat38.

Selv om en signifikant reduksjon i bakteriebelastning ikke ble observert når fluer ble vasket i etanol, hadde disse fluene bare blitt holdt i nærvær av eksterne bakterier i 3 dager. Boliger i lengre tidsperioder kan tillate en større bakteriebelastning å akkumulere39. Derfor anbefales det fortsatt å vaske i etanol.

Overføring av fluer til 96-brønnsplaten er det kritiske første trinnet for å sette opp arbeidsflyten (figur 1A). Når fluene er vasket, fordeles de i brønnene en om gangen. Et platediagram er nyttig på dette stadiet for å merke hvilke forhold som er tilstede i hver brønn og legge til notater som "flue gikk tapt". Homogenisering er et annet kritisk skritt med noen viktige forbehold. Bakterier overlever homogeniseringsprosessen når de er i nærvær av en flue (figur 1D, E), og antagelig er dette prinsippet også sant når bakteriene er inne i fluens tarm. Imidlertid blir bakterier også drept når de homogeniseres i perleslagplater alene, noe som viser at homogeniseringen kan drepe bakteriecellene under visse omstendigheter, en begrensning som kan være viktig hvis man for eksempel homogeniserer dissekert tarm. Spesielt er tapet av CFUer ved homogenisering avhengig av antall CFUer i prøven, og tapet er minimalt når ~ 105 CFU per brønn brukes. Ytterligere bevaring av CFU kan oppnås ved å stoppe homogenisering halvveis og kjøle platen på is.

Homogenisering ble utført i 5 minutter i denne protokollen basert på kontrolleksperimenter der et kjent antall CFUer ble blandet med en bakteriefri flue, og dette fungerte empirisk for fluebakterier. Mindre juling førte til at større fluedeler var til stede, noe som forstyrrer pipettering, mens betydelig lengre homogeniseringstider på ~ 10 minutter gjorde CFU-tellingene mer variable. Det mindre volumet og den vinklede formen på koniske platebrønner ble observert for å redusere effektiviteten av dråpeslag sammenlignet med sylindriske 2 ml rør. Mange variasjoner på denne generelle tilnærmingen er mulige, inkludert hvilke bakteriestammer, hvilken perle som slår beholder, hvilke perler og hvilken fluegenotype som brukes. Individuelle brukersaker må bruke positive kontroller for å etablere sin tilnærming.

Flekkbeleggmetoden ble brukt på en bestemt måte: 1: 2 fortynninger av L. plantarum WF i PBS ble oppdaget på MRS-plater og inkubert ved 30 ° C i 2 dager (kortere inkubasjonstider kan implementeres for å generere mindre kolonistørrelser). Metoden krever noen forhåndsinvesteringer i utstyr, først og fremst dråpetelleren og 96-kanals pipettoren (figur 2A), som er nødvendig for både fortynningsserien og flekkbelegget. Imidlertid er billigere alternativer tilgjengelige, inkludert en 96-brønns platereplikator med spaltede pinner. Fortynningsserien er et kritisk trinn som påvirker nøyaktigheten av CFU-telleresultatene. Når det gjelder feilmodus, er det mulig å tette pipettespissene med fluedeler eller glassperler og at pipettespissene ikke tetter seg ordentlig på pipettoren eller mislykkes av en eller annen grunn. Alle disse problemene resulterer i undertelling av de berørte brønnene og bør overvåkes. Tilstrekkelig blanding på hvert trinn i fortynningsserien er også avgjørende. Hver fortynning skal blandes grundig enten ved å sette platen på en platerister eller ved pipettering opp og ned 15-20 ganger, som også tjener til å skylle spissene. Ved å spotte fra den mest fortynnede til minst fortynnede platen, kan spissene gjenbrukes for hele fortynningsserien. Med 1:2 fortynninger er tellingen nøyaktig over et område på 2-25 kolonier, som spenner over en størrelsesorden (figur 2C). Derfor sparer 1:10 fortynninger tid og materialer. En annen variabel som kan utnyttes er inkubasjonstid, som kan justeres for å produsere mindre kolonier og dermed øke rekkevidden av tellbare flekker ved å forhindre sammenslåing av tilstøtende kolonier.

Et kvalitetsbilde av platen er viktig, da det blir de rå kildedataene som CFUene analyseres fra og kan arkiveres på ubestemt tid. FluoroBox er designet for å produsere bilder av platene med jevn lysintensitet, noe som minimerer blending på agaroverflaten. I tillegg er designet i stand til selektivt å fotografere fluorescerende kolonier ved hjelp av ensfargede LED-lys og fargede fotofiltre (figur 3A). Konstruksjonen av et oppsett som FluoroBox, med kontrollert belysning og kamerainnstillinger, kan i stor grad øke reproduserbarheten av CFU-bilder, noe som er viktig for automatisert analyse. Kolonimorfologier, fluorescensintensitet og effekten av tid eller tetthet på kolonivekst er bare noen av egenskapene som kan analyseres ved hjelp av fotografiene. Fotoboksen kan konstrueres uten fargefiltre og ensfargede lys hvis det ikke brukes fluorescerende bakterier, noe som reduserer kostnadene og kompleksiteten. Ulike eksitasjonslys og utslippsfiltre kan erstattes av de som anbefales her hvis en annen fluorofor brukes av et laboratorium. Et kamera som er koblet til et nettbrett via WiFi ved hjelp av en app, er nyttig både for den automatiserte lukkerfunksjonen for å forhindre risting og for enkel dataoverføring. Bilder kan overføres til nettbrettet og deretter til en bærbar datamaskin ved hjelp av trådløs filoverføringsprogramvare. Anbefalte kameraer med disse funksjonene er angitt i materialtabellen.

Count-On-It er en plug-in skrevet i ImageJ. Den automatiserte CFU-telleprogramvaren segmenterer platebildet i et ensartet rutenett med 96 brønner, teller koloniene i hver rutenettcelle og grupperer resultatene i et enkelt regneark. Siden det alltid er variasjon i plasseringen av punktgitteret på platen og på bildet, må brukeren manuelt tilpasse rutenettet til bildet ved hjelp av Croptacular-plugin-modulen. Dette bidrar også til å utelukke områder nær platekanten, som har gjenskinn. Innstilling av terskelen er nøkkelen til å få det mest nøyaktige CFU-antallet fra bildet. Hvis terskelen settes for høyt, vil koloniene slå seg sammen; Dersom terskelen settes for lavt, vil koloniene bli ekskludert. Når terskelen er angitt, bruker makroen gaussisk uskarphet for å myke kantene og redusere aliasing, vannskillefilteret deler overlappende kolonier, og klumpene telles ved hjelp av analysepartikler.

Noen ganger er tettheten av kolonier for høy på et bestemt sted. Count-On-It gir en måte å håndtere dette på. For å estimere antall kolonier i en gittercelle med delvis sammenslåtte kolonier, blir først det gjennomsnittlige arealet av en sirkulær blob fra hele platen tatt som Cavg. Deretter deles arealet av blob A 1 med det gjennomsnittlige arealet av en sirkulær blob A1 / Cavg. Dette tallet avrundes til nærmeste heltall, og det er estimatet for hvor mange kolonier som er i en blob. Denne funksjonen er en grunn til at terskelen kan påvirke telleresultatene: Det relative gjennomsnittlige koloniområdet versus et sammenslått blobområde vil være forskjellig avhengig av hvordan terskelen påvirket sammenslåtte blobs.

Metodene som presenteres har flere begrensninger. Disse inkluderer behovet for utstyr for å dispensere flytende medier nøyaktig fra 96-brønnplater. Dette utstyret, enten en 96-kanals pipettor eller et spaltet replikatorpinneverktøy, kan koste tusenvis av dollar å få tak i. Billigere alternativer finnes, men er mindre nøyaktige. Automatisert telling via Count-On-It presenterer også noen begrensninger. For eksempel, hvis to kolonityper i en blandet populasjon ble avgrenset basert på størrelse alene, ville blob telling ikke kunne tildele kolonier til riktig type. I dette tilfellet må flekker med blobs elimineres fra teller. Ytterligere differensiering av kolonier basert på morfologi vil være en verdifull forlengelse av metoden som i dag ikke er implementert. Bruk av selektive medier, inkludert stammespesifikke næringsstoffer og antibiotika, forenkler behovet for kompleks bildeanalyse.

Vedlikehold av bananflueeksperimenter i 96-brønnsplater multipliserer antall prøver og forhold som kan testes i et enkelt eksperiment, og kan lette høykapasitetsskjermer i Drosophila-bakterieforeningsfenotyper. Vi ser for oss at denne metoden kan utvides ved å bruke selektive medier for å differensiere mange bakteriestammer i komplekse blandinger. Metoden er ikke begrenset til studiet av fluemikrobiomet. Kvantifisering av CFU er vanlig i mange anvendelser av mikrobiologi, fra koliforme teller i drikkevann til identifisering av patogener. CFU-platingsystemet som presenteres her, muliggjør skjermer med høy gjennomstrømning, samt automatisert anskaffelse, behandling, lagring og levering av resultater.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper og medlemmer av Ludington-laboratoriet ga verdifulle innspill til utviklingen av denne protokollen. Finansiering ble gitt av NSF IOS-tilskudd 2032985, NIH-tilskudd DP5OD017851, et Carnegie Institution of Canada-stipend og Carnegie Institute for Science's Endowment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials Genesee 32-121 autoclavable
Fly vial stoppers Genesee 59-201 autoclavable
Hand Applicator 3M 3M PA1
Heat Sealer Eppendorf 5390
Mini-Beadbeater 96 BioSpec 1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm BioSpec  11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner Labnet LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor Mettler Toledo 30296705 Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural USA scientific 1402-9220 Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil 4titude 4ti-0591 Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile SPL Life Sciences 31001 For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2) Amazon ASIN: B07BP1WR3H To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut  Amazon UPC: 799862376780 AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3) Amazon ASIN: B003QZSZY4 For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer Amazon UPC: 611982484599 Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft Superbrightleds.com WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 Superbrightleds.com WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 Superbrightleds.com SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-1 
6” drawer handle Amazon ASIN: B07Z331P99 Any drawer handle should work.
6” Drawer slides Btibpse UPC: 712243424979 Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) Amazon ASIN: B00HYLZB98 Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) Amazon ASIN: B07KX9T7NF To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue SCIGRIP Ean: 7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long  Superbrightleds.com CT-B04-10
Camera L-Bracket WLPREOE, Vikerer, Unbranded ASIN: B09X46YKQZ The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. 1894C002 The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters Superbrightleds.com STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters Superbrightleds.com STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters  Superbrightleds.com STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits Black & Decker ‎BDCDD12PK Brand not important. 
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte Rustoleum 331182 Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls Big Blue Saw www.bigbluesaw.com Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera 
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt  Superbrightleds.com LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. DMC-ZS100K Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch ASIN: B07417F21D Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes BAZIC Products Alliance Rubber 26649 Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 Superbrightleds.com CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 Superbrightleds.com RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm  Tiffen 72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm Tiffen 7258
Software
ImageJ64 https://imagej.net/downloads N/A Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX Apple N/A Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix BSD N/A 64 bit
Windows Microsoft N/A 64 bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
  3. Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  5. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  6. Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740 (2021).
  7. D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892 (2018).
  8. Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398 (2020).
  9. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272 (2011).
  10. Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710 (2018).
  11. Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
  12. Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219 (2016).
  13. Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
  14. Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
  15. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  16. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  17. Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
  18. Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  19. Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
  20. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  21. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
  22. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  23. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
  24. Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
  28. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
  29. Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109 (2017).
  30. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
  31. Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
  32. Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163 (2017).
  33. Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
  34. Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
  35. Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
  36. Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
  37. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  38. Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  39. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).

Tags

Biologi utgave 191
Rask kolonidannende enhetstelling i 96-brønns plateformat påført <em>Drosophila-mikrobiomet</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast… More

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (191), e64298, doi:10.3791/64298 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter