Summary
एंटीकैंसर एपटामर विकास में एक आवश्यक कदम लक्ष्य के लिए इसके बंधन का परीक्षण करना है। हम इस बंधन का अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक-आधारित परख का प्रदर्शन करते हैं, एक नकारात्मक नियंत्रण एपटामर और कैंसर कोशिकाओं को शामिल करने के महत्व पर जोर देते हैं जो उस विशेष प्रोटीन के लिए सकारात्मक या नकारात्मक हैं।
Abstract
एंटीकैंसर एपटामर विकसित करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती लक्ष्य प्रोटीन के लिए विकसित एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता को कुशलतापूर्वक निर्धारित करना है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पर इसके कई फायदों के कारण, एपटामर विकास ने कैंसर शोधकर्ताओं के बीच भारी लोकप्रियता हासिल की है। घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास रुचि के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एपटामर विकसित करने का सबसे आम तरीका है। एसईएलईएक्स के बाद, एक त्वरित और कुशल बाध्यकारी परख पहचान की प्रक्रिया को तेज करती है, एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता की पुष्टि करती है।
यह पेपर उपकला सेलुलर आसंजन अणु (ईपीकैम) के लिए विशिष्ट एपटामर के चरण-दर-चरण प्रवाह साइटोमेट्रिक-आधारित बाध्यकारी परख की व्याख्या करता है। ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन ईपीकैम अधिकांश कार्सिनोमा में अतिरंजित होता है और कैंसर दीक्षा, प्रगति और मेटास्टेसिस में भूमिका निभाता है। इसलिए, यह ट्यूमर को लक्षित दवा वितरण के लिए एक मूल्यवान उम्मीदवार है। झिल्ली-बाध्य ईपीकैम के लिए एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, ईपीकैम-पॉजिटिव और -नकारात्मक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, EpCAM-बाइंडिंग एपटामर के समान लंबाई और 2-आयामी (2D) संरचना के साथ एक गैर-बाध्यकारी EpCAM एपटामर की आवश्यकता होती है। बाध्यकारी परख में विभिन्न बफर (ब्लॉकिंग बफर, वॉश बफर, इनक्यूबेशन बफर और एफएसीएस बफर) और इनक्यूबेशन चरण शामिल हैं।
एपटामर को सेल लाइनों के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। इनक्यूबेशन और धोने के चरणों के बाद, कोशिकाओं का मूल्यांकन एक संवेदनशील प्रवाह साइटोमेट्री परख का उपयोग करके किया जाएगा। परिणामों का विश्लेषण ईपीकैम-विशिष्ट एपटामर को ईपीकैम-पॉजिटिव कोशिकाओं से जोड़ता है, न कि ईपीकैम-नकारात्मक कोशिकाओं को। ईपीकैम-पॉजिटिव कोशिकाओं में, इसे गैर-बाध्यकारी एपटामर नियंत्रण की तुलना में दाईं ओर ईपीकैम एपटामर के बंधन में एक बैंड शिफ्ट के रूप में दर्शाया गया है। ईपीकैम-नकारात्मक कोशिकाओं में, ईपीकैम-बाइंडिंग और -नॉन-बाइंडिंग एपटामर के संबंधित बैंड ओवरलैप होते हैं। यह एपकैम एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता को प्रदर्शित करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल ईपीकैम एपटामर पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल अन्य प्रकाशित एपटामर पर लागू होता है।
Introduction
कैंसर अभीभी दुनिया भर में मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है। हाल के दशकों में कैंसर के उपचार में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूद, एंटीकैंसर दवा विकास अभी भी एक अत्यधिक बहस का विषय है। ऐसा इसलिए है क्योंकि कीमोथेरेपी, कैंसर के उपचार के मुख्य आधार के रूप में, गंभीर दुष्प्रभावों के साथ होती है जो उपचार के साथ रोगी के अनुपालन को सीमित करती है। इसके अलावा, उपचार के लिए कीमोथेरेपी-प्रेरित कैंसर प्रतिरोध ने चिकित्सा हस्तक्षेप के एकमात्र विकल्प के रूप में इसके आवेदन को प्रतिबंधित कर दिया है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) के आवेदन ने कैंसर उपचार के लिए एक बढ़ी हुई प्रतिक्रिया पेशकी। एमएबीएस का उपयोग करने का तर्क कीमोथेरेपी की प्रभावकारिता में सुधार करना और उनकी प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कम करना था। हालांकि, एमएबीएस का प्रशासन भी एक चुनौती बन गया। यह न केवल एमएबी-प्रेरित इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं के कारण था, बल्कि पशु-निर्भर और महंगी उत्पादन लागत और कठिन भंडारण स्थितियोंके कारण भी था। 1990 के दशक में एप्टामर की शुरूआतने कैंसर के उपचार में नई उम्मीदें जगाईं, क्योंकि एप्टामर का आवेदन एमएबीएस से जुड़ी चुनौतियों का समाधान कर सकता है।
एपटामर छोटे न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम हैं जो विशेष रूप से एक निश्चित लक्ष्य के लिए उत्पादित होते हैं। घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास एपटामर उत्पादन में एक सामान्य विधि है। एसईएलईएक्स में, रुचि के प्रोटीन को यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों की एक लाइब्रेरी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, और पुनरावृत्ति चक्रों की एक श्रृंखला के माध्यम से, उस प्रोटीन के लिए विशिष्ट एपटामर को शुद्ध किया जाता है। एपटामर में एमएबीएस के समान लक्ष्य चयनात्मकता और विशिष्टता है, और इसलिए इस क्षेत्र में दवा विकास आशाजनक भविष्य के अनुप्रयोगों को दर्शाता है। कैंसर बायोमार्कर के लिए विशिष्ट एपटामर को एकल दवाओं और कैंसर नैदानिक उपकरण 5,6,7 के रूप में लागू किया जा सकता है। उनकी नैनो-आकार की संरचना के कारण, ये एपटामर विशेष रूप से ट्यूमर8 में साइटोटोक्सिक एजेंटों को वितरित करने के लिए दवा वाहक के रूप में भी कार्य कर सकते हैं। यह लक्षित दवा वितरण की प्रभावकारिता को बढ़ाएगा और कीमोथेरेपी से जुड़े, ऑफ-टारगेट प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कम करेगा। इसके अलावा, इन नैनोमेडिसिन में एक उच्च ऊतक प्रवेश होता है, जो उन्हें गहरे ट्यूमर दवा वितरण और उपचार के लिए एक वांछनीय उम्मीदवार बनाता है। एपटामर को मस्तिष्क ट्यूमर 9 में दवा वितरण में सुधार के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) पर व्यक्त ट्रांसपोर्टरों को लक्षित करने के लिए भी डिज़ाइन किया जा सकताहै। इस तरह के एपटामर का एक अच्छा उदाहरण द्विक्रियाशील एपटामर हैं, जो बीबीबी में दवा वितरण को बढ़ाने के लिए ट्रांसफरिन रिसेप्टर (टीएफआर) 10 को लक्षित करते हैं, और ट्यूमर कोशिकाओं11 में साइटोटोक्सिक दवा पेलोड वितरित करते हैं।
एपटामर के सभी फायदों के बावजूद, इस क्षेत्र में दवा के विकास ने अभी तक एक विपणन, सफल एंटीकैंसर दवा का उत्पादन नहीं किया है। इसका एक कारण मानक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों की कमी हो सकती है जो क्षेत्र में शोधकर्ताओं द्वारा विश्व स्तर पर पालन की जा सकती है। इस पेपर में, सेल की सतह पर व्यक्त एक देशी प्रोटीन के लिए एपटामर बाइंडिंग का एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदर्शित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एंटीकैंसर एपटामर के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन में एक आवश्यक कदम है। परख चयनात्मकता और विशिष्टता की पुष्टि के लिए एसईएलईएक्स या प्रकाशित एपटामर अनुक्रम से एकत्र किए गए शुद्ध एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता दिखाने के लिए किया जाता है। यह प्रवाह साइटोमेट्रिक-आधारित परख एक तेज, विश्वसनीय, संवेदनशील परख है जो एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता को सटीक रूप से दिखाती है, जहां एपटामर को सेल की सतह 12,13,14 पर प्रोटीनके खिलाफ परीक्षण किया जा रहा है। इस विधि को इस पेपर15 में दिखाए गए ईपीकैम के लिए विशिष्ट एपटामर के बंधन का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। ईपीकैम, एक ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में, ट्यूमर सेल सिग्नलिंग, प्रगति, प्रवासन और मेटास्टेसिस16,17 में भूमिका निभाता है। इस एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता दिखाने के लिए, ईपीकैम-पॉजिटिव और -नकारात्मक कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। पहले से विकसित ईपीकैम विशिष्ट एपटामर, टीईपीपी (5'-जीसी जीसीजी जीटीएसी जीसी जीसी टीए एसीजी जीए जीजीटीटीजीसीजी टीसीसी जीटी -3'), और एक नकारात्मक नियंत्रण एपटामर, टीईएनएन (5'-जीसी जीसीजी टीजीसीए सीजीसी जीसी टीए एसीजी जीए टीटीसीटीटीटीटी टीसीसी जीटी -3), क्रमशः ईपीकैम-बाइंडिंग और -नॉन-बाइंडिंग एपटामरके रूप में उपयोग किया गया था। टीईपीपी और टीईएनएन दोनों के 3 'छोर को टीवाईई 665 फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किया गया था।
टीईपीपी एक द्विक्रियाशील एपटामर है जो एक छोर से ईपीकैम और दूसरे पर टीएफआर को लक्षित करता है। इसने टीईपीपी को ईपीकैम + मस्तिष्क ट्यूमर के लिए दवा वितरण के लिए एक उपयुक्त उम्मीदवार बना दिया है। अपने टीएफआर-विशिष्ट अंत का उपयोग करते हुए, टीईपी रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करता है, और ईपीकैम-विशिष्ट अंत का उपयोग करके, ट्यूमर का पता लगाता है और ट्यूमर को अपना कार्गो (जैसे, साइटोटोक्सिक ड्रग्स) पहुंचाता है। टीईएनएन की टीईपीपी के समान लंबाई और 2 डी संरचना है, लेकिन इसमें ईपीसीएएम या टीएफआर के लिए संबंध नहीं है, और इसलिए यह एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण एपटामर है। टीईपीपी और टीईएनएन का उपयोग करते हुए, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक एपटामर के बंधन का परीक्षण इस पेपर में दिखाया गया है। यह प्रोटोकॉल सेल-विशिष्ट एपटामर के विकास पर लागू होता है। यह साहित्य में उपलब्ध एपटामर अनुक्रमों के आगे पूरक और पुष्टिकरण विश्लेषण पर भी लागू होता है। प्रोटोकॉल का उपयोग एपटामर क्षेत्र में नए लोगों द्वारा भी किया जा सकता है जो अपने अनुसंधान और विकास (आर एंड डी) उद्देश्यों के लिए पहले प्रकाशित एपटामर का उपयोग करना चाहते हैं। इस पेपर में, साहित्य में उपलब्ध दो एपटामर अनुक्रमों का अध्ययन किया जाता है।
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Protocol
नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें, जिसमें एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और चश्मे शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री, अभिकर्मकों, उपकरण और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. परख के लिए आवश्यक बफर
- इस प्रयोग के लिए आवश्यक बफर तैयार करें - एपटामर फोल्डिंग, ब्लॉकिंग बफर (बीबी), वॉश बफर (डब्ल्यूबी), और बाइंडिंग बफर (बीआईबी) (तालिका 1) के लिए आवश्यक एसईएलईएक्स बफर - प्रयोग के दिन ताजा और उन्हें बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: प्रत्येक एपटामर को एक अद्वितीय फोल्डिंग स्थिति की आवश्यकता होती है। इसमें एसईएलईएक्स बफर और फोल्डिंग तापमान की स्थिति शामिल है। एपटामर10 का वर्णन करने वाले मूल पेपर से विधियों को पूरी तरह से दोहराने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। इस प्रयोग में, सभी बफर को डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) में तैयार किया जाता है। प्रत्येक प्रयोग में आवश्यक बफर मात्रा सेल लाइनों की संख्या, प्रतिकृति की संख्या और परीक्षण किए जाने वाले एपटामर सांद्रता की संख्या पर निर्भर करती है।
| सामग्री | वॉल्यूम आवश्यक है | ||
| मद | एकाग्रता | ||
| SELEX बफर | MgCl2 | 5 mM | 50 μL प्रति नमूना + 10% पाइपिंग त्रुटि |
| बफर ब्लॉक करना | MgCl2 | 5 mM | 500 μL प्रति सेल लाइन |
| बीएसए ए | 1 mg/mL | ||
| टीआरएनए बी | 0.1 मिलीग्राम / | ||
| FBS c | 10% (v/v) | ||
| वॉश बफर | MgCl2 | 5 mM | पहले धोने के लिए 1 एमएल + 100 μL प्रति परीक्षण नमूना + 10% पाइपिंग त्रुटि |
| बाइंडिंग बफर | MgCl2 | 5 mM | 50 μL प्रति नमूना + 10% पाइपिंग त्रुटि |
| बीएसए | 2 मिलीग्राम / | ||
| टीआरएनए | 0.2 मिलीग्राम / | ||
| FBS | 20% (v/v) | ||
तालिका 1: बाध्यकारी परख के लिए आवश्यक बफर। एक बोवाइन सीरम एल्बुमिन, बीट्रांसफर राइबोन्यूक्लिक एसिड, सीभ्रूण बोवाइन सीरम।
2. एपटामर की तैयारी
नोट: परख में उपयोग किए जाने वाले एपटामर को प्रतिदीप्ति रिपोर्टर अणु के साथ टैग किया जाता है, और इसलिए उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
- प्रयोग से पहले, पाइरोजेन- और आरएनएस-मुक्त अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके परीक्षण और नियंत्रण एपटामर का 100 μM स्टॉक (स्टॉक ए) तैयार करें (चित्रा 1)।
नोट: दीर्घकालिक संरक्षण के लिए, स्टॉक ए को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में रखा जाना चाहिए। - एसईएलईएक्स बफर (तालिका 1) का उपयोग करके स्टॉक ए को पतला करके एपटामर की कार्यशील एकाग्रता के रूप में स्टॉक बी तैयार करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, स्टॉक बी तैयार करने के लिए स्टॉक ए को 1,000 एनएम स्टॉक में पतला करें (चित्रा 1)।
- एपटामर को 3-आयामी (3 डी) संरचना के गठन के लिए तैयार करने के लिए, 250 μL ट्यूब में, फोल्डिंग के लिए एपटामर की आवश्यक मात्रा और एकाग्रता तैयार करने के लिए एसईएलईएक्स बफर के साथ स्टॉक बी को पतला करें।
नोट: मुड़े हुए एपटामर कोशिकाओं की एक समान मात्रा के संपर्क में होंगे। इसलिए, फोल्डिंग के लिए सेट किए गए एपटामर की एकाग्रता वांछित अंतिम एकाग्रता की तुलना में 2 गुना अधिक केंद्रित होनी चाहिए। आवश्यक मात्रा और सांद्रता की गणना करने के लिए समीकरण (1) का उपयोग करें। पिपेटिंग त्रुटि के लिए अतिरिक्त 10% मात्रा पर विचार करना याद रखें।
एकाग्रतास्टॉक A × वॉल्यूमस्टॉक A = एकाग्रतास्टॉक B × वॉल्यूमस्टॉक B (1)
चित्र 1: एपटामर की तैयारी में चरणों को दर्शाने वाला आरेख। 1स्टॉक 1 को दीर्घकालिक संरक्षण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। 2 काम करने की सांद्रता एसईएलईएक्स बफर में तैयार की जाती है और संग्रहीत नहीं की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. कैंसर कोशिकाओं का रखरखाव
नोट: अध्ययन शुरू होने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं अपनी प्रारंभिक मार्ग संख्या पर हैं, उनकी विशिष्ट रूपात्मक विशेषताएं दिखाती हैं, और माइकोप्लाज्मा मुक्त हैं। एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, सेल लाइनें जो रुचि के प्रोटीन के उच्च, मध्यम और निम्न / नकारात्मक एक्सप्रेसर हैं, आदर्श रूप से आवश्यक हैं।
- उपयुक्त संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके, टी 75 कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को बीज दें। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में उगाएं।
नोट: इस अध्ययन में, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (पूर्ण माध्यम) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) का उपयोग किया गया था। - जब कोशिकाएं ~ 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो उन्हें एक नए फ्लास्क में पारित करें जिसमें ताजा पूर्ण माध्यम होता है।
नोट: ब्याज के प्रोटीन और सेल लाइन के आधार पर, 80% कंफ्लुएंसी बाध्यकारी परख के लिए एक उपयुक्त सेल आबादी प्रदान कर सकती है। इस प्रयोग में सेल लाइनों के लिए, एमडीए-एमबी -231 और एचईके 293 टी, 80% कंफ्लुएंसी उपयुक्त है। इस स्तर पर, धारा 4, बाध्यकारी परख पर आगे बढ़ें। हमेशा रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करें, उस प्रोटीन के लिए विशिष्ट एमएबीएस का उपयोग करें।
4. बाध्यकारी परख
नोट: चित्रा 2 अनुयायी कोशिकाओं में बाध्यकारी परख में आवश्यक चरणों को सारांशित करता है।
- द्वितीय श्रेणी के जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्रत्येक फ्लास्क की कोशिकाओं को ट्यूबों में निम्नानुसार एकत्र करें:
- फ्लास्क में मीडिया को इकट्ठा करें और छोड़ दें, पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें, इसे कोशिकाओं पर फैलाएं, और फिर, पीबीएस को इकट्ठा करें और त्याग दें। ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने वाले मीडिया के सभी निशान ों को हटाने के लिए इस चरण को दो बार दोहराएं। प्रत्येक फ्लास्क में ट्रिप्सिन/ईडीटीए का 1 एमएल 0.25% जोड़ें और 37 डिग्रीसेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- कोशिकाओं में पूर्ण माध्यम का 1 एमएल जोड़ें, और एकल-सेल निलंबन बनाने के लिए कोशिकाओं को ऊपर और नीचे करें। कोशिकाओं को एक उपयुक्त ट्यूब में डालें और 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: गैर-अनुयायी कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को एक ट्यूब, सेंट्रीफ्यूज (200 × ग्राम, 5 मिनट) में इकट्ठा करें, और चरण 4.1.3 पर आगे बढ़ें। - सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और कोशिकाओं को 1 एमएल ताजा माध्यम में पुन: निलंबित करें। ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, ट्रिपैन ब्लू के साथ सेल निलंबन की एक निश्चित मात्रा को पतला करके। हेमोसाइटोमीटर और कवर ग्लास के बीच मिश्रण के ~ 15 μL वितरित करें। समीकरण (2) का उपयोग करके, पहले वर्णित18 के रूप में कोशिकाओं की गणना करें:
(2)
नोट: सेल निलंबन की न्यूनतम संभव मात्रा का उपयोग करें और कमजोर पड़ने वाले कारक पर ध्यान दें। उदाहरण के लिए, सेल सस्पेंशन और 0.04% ट्रिपैन ब्लू के बराबर वॉल्यूम को मिलाने से 2 का कमजोर पड़ने वाला कारक मिलता है। आगे बढ़ने से पहले अधिकांश अनुयायी सेल लाइनों के लिए ~ 90% की उच्च व्यवहार्यता (जीवित कोशिकाएं / कुल कोशिकाएं × 100) सुनिश्चित करें। मृत कोशिकाएं गैर-विशेष रूप से एप्टामर लेती हैं और परिणामों को बदल देतीहैं। अन्य सेल गिनती तकनीकों का उपयोग करना संभव है, जैसे कि सेल काउंटर का उपयोग करना। - कोशिकाओं की आवश्यक संख्या एकत्र करें, प्रति परीक्षण नमूने में 10 × 104 कोशिकाएं सुनिश्चित करें। पाइपिंग त्रुटि के लिए अतिरिक्त 10% मात्रा पर विचार करें।
नोट: प्रयोगों और प्रतिकृतियों के बीच हमेशा एक ही सेल गिनती रखना महत्वपूर्ण है। - एंजाइमेटिक डिटेचमेंट के बाद कोशिका झिल्ली पर रुचि के प्रोटीन के स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: यह इनक्यूबेशन अवधि रुचि के प्रोटीन के अनुसार भिन्न हो सकती है।
- इस 2 घंटे के दौरान इनक्यूबेशन:
- सेंट्रीफ्यूज का तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। टीआरएनए और एपटामर के स्टॉक को कमरे के तापमान पर या बर्फ पर पिघलने के लिए छोड़ दें। प्रतिदीप्ति रिपोर्टर अणु की रक्षा के लिए, एपटामर ट्यूबों को प्रकाश से बचाएं।
नोट: टीआरएनए की भूमिका न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध करना है। - SELEX बफर, BB, WB, और BiB तैयार करें (अनुभाग 1 देखें), उन सभी को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। थर्मोसाइक्लर मशीन को एक खाली चक्र पर सेट करें। बर्फ पर एक 96-अच्छी तरह से काली प्लेट और प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब रखें।
नोट: थर्मोसाइक्लर को एक खाली चक्र पर सेट करना शीतलन और हीटिंग सिस्टम तैयार करता है और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करने में मदद करता है।
- सेंट्रीफ्यूज का तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। टीआरएनए और एपटामर के स्टॉक को कमरे के तापमान पर या बर्फ पर पिघलने के लिए छोड़ दें। प्रतिदीप्ति रिपोर्टर अणु की रक्षा के लिए, एपटामर ट्यूबों को प्रकाश से बचाएं।
- 2 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और बीबी के 500 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आंतरायिक मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- इस 30 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान, एपटामर फोल्डिंग निम्नानुसार करें:
- एपटामर की 2x सांद्रता बनाएं (अनुभाग 2 देखें), और फिर आवश्यक फोल्डिंग स्थितियों के अनुसार थर्मोसाइक्लर मशीन में एपटामर को मिलाएं और इनक्यूबेट करें। इस EpCAM एपटामर के लिए, 95 °C, 5 मिनट की निम्नलिखित तह स्थितियों का उपयोग करें, इसके बाद 22 °C, 10 मिनट, और 37 °C, 15 मिनट।
नोट: हमेशा एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें (यानी, एपटामर के बिना SELEX बफर)।
- एपटामर की 2x सांद्रता बनाएं (अनुभाग 2 देखें), और फिर आवश्यक फोल्डिंग स्थितियों के अनुसार थर्मोसाइक्लर मशीन में एपटामर को मिलाएं और इनक्यूबेट करें। इस EpCAM एपटामर के लिए, 95 °C, 5 मिनट की निम्नलिखित तह स्थितियों का उपयोग करें, इसके बाद 22 °C, 10 मिनट, और 37 °C, 15 मिनट।
- 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज (500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस), सतह पर तैरने वाला हटा दें, 1 एमएल डब्ल्यूबी जोड़ें, और कोशिकाओं को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें (500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और बीआईबी की उपयुक्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- पिपेट 50 μL पुन: निलंबित कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे, 96-अच्छी तरह से काली प्लेट के प्रत्येक कुएं में डाल देता है। रुचि के प्रोटीन के आंतरिककरण को रोकने के लिए कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
- पिपेट 50 μL एपटामर को 50 μL कोशिकाओं की मात्रा पर, मिश्रण करते हैं, और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करते हैं। प्लेट को 500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर डब्ल्यूबी और सेंट्रीफ्यूज में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें। वॉश स्टेप (4.7) 2x को दोहराएं और फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए WB के 100 μL में पुन: निलंबित करें।
नोट: एपटामर और कोशिकाओं के बीच बातचीत के आरेख के लिए चित्रा 3 देखें।
(2)
चित्रा 2: एपटामर-प्रोटीन-बाइंडिंग परख करने में चरणों को दर्शाने वाला एक आरेख। संक्षेप: SELEX = EXponential संवर्धन द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास; बीबी = बफर को ब्लॉक करना; डब्ल्यूबी = वॉश बफर; बीआईबी = बाइंडिंग बफर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एपटामर बाइंडिंग परख करने के लिए आवश्यक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और एपटामर को दिखाने वाला एक आरेख। संक्षिप्त नाम: ईपीकैम = उपकला सेलुलर आसंजन अणु। यह आंकड़ा Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
5. फ्लो साइटोमेट्री और डेटा विश्लेषण
नोट: प्रवाह साइटोमीटर को चालू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि शट-डाउन समाधान, सफाई समाधान और शीथ द्रव (0.9% NaCl) के लिए झिल्ली फ़िल्टर इकाइयों में कोई "बुलबुले" नहीं हैं। कैप्सूल में बुलबुले होने पर "खून बह रहा है" बुलबुले। सुनिश्चित करें कि अपशिष्ट कंटेनर खाली है, और अल्ट्राप्योर पानी में शीथ द्रव, पानी और 1% ब्लीच के कंटेनर भरे हुए हैं।
- प्रवाह साइटोमीटर और फिर कंप्यूटर चालू करें।
नोट: यहां बताए गए प्रवाह साइटोमीटर को चलाने का विवरण वीडियो में प्रदर्शित मशीन और सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट है ( सामग्री की तालिका देखें)। अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए उचित प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी। - फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें, प्रोग्राम में लॉग इन करें, और साइटोमीटर टैब के तहत, फ्लूडिक्स स्टार्ट अप चलाएं।
- एक नया प्रयोग बनाने के लिए, प्रयोग टैब के तहत, नया फ़ोल्डर क्लिक करें और फ़ोल्डर/प्रयोग को उचित रूप से नाम दें.
- हाइलाइट करने के लिए नए फ़ोल्डर पर क्लिक करें, फिर प्रयोग टैब के तहत फिर से, नया प्रयोग क्लिक करें और प्रयोग को उचित रूप से नाम दें।
- पहला नमूना / नमूना जोड़ने के लिए, प्रयोग टैब के तहत, नया नमूना क्लिक करें और इस नमूने को उचित रूप से नाम दें (सेल लाइन / नियंत्रण नमूना / प्रयोग नमूने का नाम)।
- एक ट्यूब नमूना जोड़ने के लिए, नमूना (समूह) हाइलाइट करें और प्रयोग टैब के तहत, नई ट्यूब क्लिक करें। ट्यूबों और नाम की उचित संख्या जोड़ें।
- आवश्यक ग्राफ़ तैयार करने के लिए, कार्यपत्रक टैब के अंतर्गत, एक नया कार्यपत्रक खोलें. एक बार नई कार्यपत्रक विंडो पॉप अप होने के बाद, कार्यपत्रक स्क्रीन का उपयोग करके निम्नलिखित खोलें (नाम खोजने के लिए लोगो / चित्रों में माउस घुमाएं):
- रुचि की आबादी का चयन करने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) बनाम साइड स्कैटर (एससीसी) का एक डॉट ब्लॉट ग्राफ तैयार करें। एक आगे और साइड स्कैटर घनत्व प्लॉट में रुचि की आबादी (पी 1) की पहचान और चयन करके पहले गेट को परिभाषित करें। मलबे को बाहर करें, जो सबसे कम फॉरवर्ड स्कैटर सिग्नल के साथ आबादी का गठन करता है।
नोट: एफएससी पैरामीटर उनके आकार के आधार पर कोशिकाओं या घटनाओं का पता लगाता है और एससीसी उन्हें उनके ग्रैन्यूलैरिटी20 के आधार पर भेदभाव करता है। - एकल-सेल आबादी का चयन करने के लिए एफएससी-क्षेत्र (एफएससी-ए) बनाम एफएससी-ऊंचाई (एफएससी-एच) का एक डॉट ब्लॉट ग्राफ तैयार करें। डबल सेल आबादी को छोड़कर दूसरे गेट को परिभाषित करें, क्योंकि डबल कोशिकाएं परिणामों और निष्कर्षों को काफी प्रभावित करती हैं। एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए घनत्व भूखंडों का उपयोग करके डबल्स को बाहर करें, जहां समान आकार की कोशिकाएं एक समान क्षेत्र और ऊंचाई दिखाती हैं। इसलिए, सिंगल्स तिरछे रूप से समूहित हो जाते हैं और डबल्स से अलग हो जाते हैं।
नोट: एफएससी सेल आकार के लगभग आनुपातिक है। वोल्टेज दालों को एफएससी-एच, सिग्नल की तीव्रता, एफएससी-चौड़ाई जो सेल आकार और सिग्नल की अवधि को दर्शाता है, और एफएससी-ए, जो एच × डब्ल्यू है। इसलिए, सिंगल्स के लिए गेटिंग डबल्स के कारण एच, डब्ल्यू और ए के बीच असमानताओं का पता लगाने पर आधारित है। - रुचि के फ्लोरोफोरे के खिलाफ घटनाओं की संख्या का एक हिस्टोग्राम तैयार करें।
- रुचि की आबादी का चयन करने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) बनाम साइड स्कैटर (एससीसी) का एक डॉट ब्लॉट ग्राफ तैयार करें। एक आगे और साइड स्कैटर घनत्व प्लॉट में रुचि की आबादी (पी 1) की पहचान और चयन करके पहले गेट को परिभाषित करें। मलबे को बाहर करें, जो सबसे कम फॉरवर्ड स्कैटर सिग्नल के साथ आबादी का गठन करता है।
- फ्लो साइटोमेट्री शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि वोल्टेज मापदंडों को समायोजित करने के लिए नमूना अधिग्रहण, निरीक्षक और साइटोमीटर को नियंत्रित करने के लिए अधिग्रहण डैशबोर्ड, साथ ही सभी ग्राफ़ के साथ वर्कशीट खुली है।
नोट: विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में 10 × 104 सेल निलंबन के कम से कम 100 μL की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से कम व्यवहार्यता के मामले में, व्यवहार्य सेल आबादी21,22 का चयन करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला किया जा सकता है। - पहला नमूना चलाने के लिए, स्क्रीन के बाईं ओर सुनिश्चित करें कि ट्यूब को इंगित करने वाला तीर हरा है। यदि यह तीर हरा नहीं है, तो इसे हरा बनाने के लिए तीर पर क्लिक करें।
- पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने को 96-वेल ब्लैक प्लेट से फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें। अनुपचारित, बिना दाग वाले नियंत्रण नमूने को कम गति पर चलाएं।
- अधिग्रहण डैशबोर्ड पर, रिकॉर्ड करने के लिए घटनाओं की उपयुक्त संख्या चुनें (30,000), प्रवाह दर को कम में बदलें, और डेटा प्राप्त करें पर क्लिक करें।
- एफएससी और एससीसी मापदंडों के लिए वोल्टेज समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि सेल की आबादी डॉट प्लॉट के भीतर केंद्रीकृत है और कोई भी कोशिका रुचि की कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए ग्राफ के किसी भी अक्ष को नहीं छू रही है।
- नमूने का तेजी से विश्लेषण करने के लिए अधिग्रहण की गति को मध्यम या उच्च तक बढ़ाएं लेकिन 200 से अधिक घटनाओं / उसके बाद, रिकॉर्ड डेटा क्लिक करें।
- पी 1 (चित्रा 4 ए) और एकल-कोशिका आबादी (चित्रा 4 बी) के लिए गेटिंग निष्पादित करें। प्रयुक्त फ्लोरोक्रोम के खिलाफ घटनाओं के हिस्टोग्राम का निर्माण करें और डेटा (इस मामले में एलोफिकोसायनिन (एपीसी) के आधार पर पी 1 का चयन करें (चित्रा 4 सी)।
- वोल्टेज को समायोजित करने, डेटा को गेट करने और रिकॉर्ड करने के बाद, नमूना निकालें और अगला ट्यूब पर क्लिक करें।
- अगला नमूना डालें, और सभी नियंत्रण और परीक्षण नमूने (चित्रा 3) के लिए रिकॉर्डिंग डेटा दोहराएं।
- एक बार सभी डेटा एकत्र हो जाने के बाद, 50% ब्लीच, एफएसीएस कुल्ला और अल्ट्राप्योर पानी की तीन ट्यूबों को चलाकर प्रवाह साइटोमीटर को धो लें, प्रत्येक को उच्च प्रवाह दर पर 5 मिनट के लिए।
- फिर, साइटोमीटर ड्रॉपडाउन मेनू से, Fluidics Shut डाउन क्लिक करें।
- सॉफ़्टवेयर को बंद करने और मशीन और कंप्यूटर को बंद करने से पहले, परिणामों को .fcs फ़ाइलों के रूप में USB ड्राइव पर निर्यात करें ताकि उन्हें स्थानांतरित और विश्लेषण किया जा सके, निम्नानुसार:
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, विश्लेषण को संभालने के लिए एक नया दस्तावेज़ और विंडो बनाने के लिए नया बटन दबाएं। नमूना फ़ाइलों को नई विंडो में खींचें।
- बिना दाग वाले नमूने को खोलने के लिए डबल-क्लिक करें। पी 1 आबादी चुनें, एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए ग्राफ बनाने के लिए पी 1 आबादी पर डबल-क्लिक करें, और एकल-सेल आबादी को गेट करें।
- इस्तेमाल किए गए फ्लोरोक्रोम के खिलाफ घटनाओं का हिस्टोग्राम बनाने के लिए गेटेड एकल कोशिकाओं पर डबल-क्लिक करें।
- मूल विंडो में, पी 1 और एकल कोशिकाओं का चयन करें और उन्हें सभी नमूनों में खींचें ताकि सभी नमूनों में अब एक ही गेटिंग हो।
- लेआउट विंडो खोलने के लिए लेआउट संपादक बटन पर क्लिक करें। एक ओवरले हिस्टोग्राम बनाने के लिए एक दूसरे पर दो नमूने (नियंत्रण और परीक्षण) खींचें।
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Representative Results
नई दवा की खोज और विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू दवा उम्मीदवार की चयनात्मकता और विशिष्टता का आश्वासन दे रहा है। इसका मतलब यह है कि दवा उम्मीदवार को विभिन्न कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने में सक्षम होना चाहिए और केवल रुचि (चयनात्मकता) की सेल आबादी को प्रभावित करना चाहिए। चयनात्मकता का अध्ययन सेल लाइनों का उपयोग करके किया जाता है जो रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के संदर्भ में भिन्न होते हैं। इस अध्ययन में, एमडीए-एमबी -231 और एचईके 293 टी सेल लाइनों को ईपीकैम-पॉजिटिव और -नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में चुना गया था। विशिष्टता एक और निर्धारक है जो दिखाता है कि रुचि का प्रोटीन केवल एक दवा उम्मीदवार का जवाब देता है। यहां, एक ईपीकैम गैर-बाध्यकारी एपटामर, टीईएनएन का उपयोग करके, यह दिखाया गया था कि केवल टीईपीपी ईपीकैम से जुड़ा हुआ है। एपकैम-पॉजिटिव कोशिकाओं (एमडीए-एमबी -231) में, टीईपीपी और टीईएनएन के साथ इलाज की गई कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले हिस्टोग्राम को ओवरले करने से पता चलता है कि टीईपीपी-उपचारित कोशिकाओं को टीईएनएन-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में दाईं ओर स्थानांतरित कर दिया जाता है। यह एपटामर, टीईपीपी के प्रोटीन, ईपीकैम (चित्रा 4 डी) के बंधन को दर्शाता है। नकारात्मक नियंत्रण एचईके 293 टी कोशिकाओं में, टीईपीपी और टीईएनएन के हिस्टोग्राम को ओवरले करना किसी भी बदलाव को प्रतिबिंबित नहीं करता है (चित्रा 4 ई)। इसका मतलब यह है कि ईपीकैम-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में, टीईपीपी अपने रिसेप्टर से जुड़ा हुआ एपकैम एपटामर के रूप में, और इसके अलावा, ईपीकैम-नकारात्मक कोशिकाओं में कोई बंधन नहीं देखा गया था। ये परिणाम विकसित एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता की पुष्टि करते हैं।
चित्रा 4: गेटिंग और हिस्टोग्राम कोशिकाओं को एपटामर से बांधने को दर्शाते हैं। (ए) कोशिकाओं की आबादी का चयन, (बी) एकल कोशिकाएं, और (सी) एपटामर (200 एनएम) से जुड़ी कोशिकाओं का हिस्टोग्राम। (डी) ईपीसीएएम + एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं और (ई) ईपीसीएएम- एचईके 293 टी कोशिकाओं में एक गैर-ईपीसीएएम-बाइंडिंग एपटामर (टीईएनएन) बनाम ईपीकैम एपटामर (टीईपीपी) के बंधन की तुलना की जाती है। संक्षेप: ईपीकैम = उपकला सेलुलर आसंजन अणु; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एपीसी = एलोफिकोसायनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
नए एपटामर विकसित करने के साथ महत्वपूर्ण चुनौती मानक दिशानिर्देशों की कमी है जो इस प्रक्रिया के विभिन्न चरणों पर लागू होती है। मैककेग एट अल ने हाल ही में कुछ संबंधित चुनौतियों का प्रदर्शन किया है, जो प्रकाशनों में डेटा की अस्पष्ट प्रस्तुतियों और अनुसंधान को दोहराने में विफलता का कारण बनता है। उन्होंने एपटामर19 को चिह्नित करने में विचार के लिए आवश्यक मौलिक दिशानिर्देशों का प्रस्ताव दिया। एक एपटामर बाइंडिंग परख एपटामर23 की स्क्रीनिंग और / या विशेषता में एक महत्वपूर्ण कदम है, जिसका व्यापक रूप से क्षेत्र में शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है। चूंकि चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए कोई एकल दिशानिर्देश मौजूद नहीं है, इसलिए एक प्रवाह साइटोमेट्री विधि, जिसका उपयोग आमतौर पर एपटामर-प्रोटीन बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, साथ के वीडियो प्रोटोकॉल में प्रदर्शित किया जाता है।
कई तरीके हैं जो एपटामर और उसके लक्ष्य की बातचीत को मापते हैं। फ्लो साइटोमेट्री इन तरीकों में से एक है। अन्य उदाहरणों में प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, सतह प्लास्मोन अनुनाद, केशिका वैद्युतकणसंचलन और आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री24 शामिल हैं। सही विधि का चयन एपटामर के आवेदन पर निर्भर करता है। हालांकि, यह जानना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक विधि की अपनी सीमाएं हैं, और यह कि छोटे अणु एपटामर24 के लक्षण वर्णन के लिए कई परखों का आवेदन अधिक फायदेमंद है। यहां वर्णित विधि के कई फायदे हैं। यह सबसे विश्वसनीय, सटीक और सटीक तरीकों में से एक है, और तेजी से और लागत प्रभावी भी है। एपटामर बाइंडिंग के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण को एपटामर विकास के विभिन्न चरणों में लागू किया जा सकता है, जिसमें उम्मीदवार स्क्रीनिंग, ट्रंकेशन और अनुकूलन, लक्षण वर्णन और सत्यापन शामिल हैं।
फ्लोरेसेंस लेबलिंग के साथ, लक्ष्य के आंतरिक प्रतिदीप्ति को लेबल या उपयोग करने या एपटामर24 को लेबल करने के विकल्प हैं। लेखकों के अनुभव में, लेबल किए गए एपटामर का उपयोग करना विश्वसनीय और स्थापित करने में आसान है। एपटामर को किसी भी छोर (3' या 5') 25 पर फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किया जा सकता है; हालांकि, कम गुआनिन के साथ अंत अधिक अनुकूल है, क्योंकि गुआनिन प्रतिदीप्ति और इसकी पहचान को बुझा सकताहै। इस विधि का एक नुकसान यह है कि एपटामर को फ्लोरोफोरे पर टैग किया जाना चाहिए। इसके अलावा, हालांकि यह विधि विशिष्ट प्रोटीन के लिए एपटामर के बंधन को दर्शाती है, यह इंटरैक्शन साइट के स्थान को प्रदर्शित नहीं करती है। इसलिए, आगे के अध्ययन, जैसे कि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, एपटामर-प्रोटीन इंटरैक्शन स्थान25 की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
इस परख को करते समय कुछ महत्वपूर्ण नोट्स पर विचार किया जाना है। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक एपटामर में हैंडलिंग और फोल्डिंग के लिए विशिष्ट आवश्यकताएं हैं। इसमें पुनर्गठन और कमजोर पड़ने वाले बफर और तह की स्थिति का विकल्प शामिल है। लियोफिलाइज्ड एपटामर का पुनर्गठन शुद्ध बाँझ पाइरोजेन- और आरएनएस-मुक्त अल्ट्राप्योर पानी में होता है। यह न्यूक्लियोटाइड के आसपास आयनों की एकाग्रता को कम करने के लिए है। आयन एकाग्रता एप्टामर की 2 डी संरचनाओं के गठन और उनके आत्मीयता और स्थिरता को अत्यधिक प्रभावित करती है। इसलिए, एपटामर स्टॉक के आगे पुनर्गठन के लिए, अन्य बफर और धातु धनिक समाधानों, जैसे एमजीसीएल2 25,27 की सही तैयारी में सावधानी बरतनी चाहिए। धातु के धनिक समाधान की इष्टतम एकाग्रता अभी तक एपटामर के नकारात्मक चार्ज को ढालती है, अपने लक्ष्य के साथ एपटामर की बातचीत को बाधित नहीं करती है।
इसके अलावा, क्योंकि एपटामर में एक गैर-विशिष्ट, ऑफ-टारगेट बाइंडिंग की क्षमता होती है, इसलिए ब्लॉकिंग बफर का अनुप्रयोग बाध्यकारी परख में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए बीएसए के अलावा, जो आमतौर पर एंटीबॉडी के लिए उपयोग किया जाता है, सैल्मन शुक्राणु डीएनए या टीआरएनए भी यहां आवश्यक है। यह मिश्रण सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध करता है। यह अवरुद्ध चरण विशेष रूप से कैंसर कोशिकाओं के प्रति एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि तटस्थ और सकारात्मक रूप से चार्ज सामान्य कोशिकाओं की तुलना में उनके नकारात्मक चार्जहैं। इसके अलावा, एपटामर की 3 डी फोल्डिंग तापमान जैसे अन्य कारकों पर निर्भर है। एपटामर के 3 डी गठन को प्रभावित करने वाली स्थितियों के महत्व, जिसमें ट्यूब की पसंद और पीसीआर चरणों की अवधि शामिल है, की समीक्षा की गई है। इसके अलावा, लक्ष्य के साथ एपटामर के इनक्यूबेशन समय को हर विशिष्ट एपटामर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। तापमान इनक्यूबेशन भी अत्यधिक महत्वपूर्ण है। 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान का रखरखाव सेल सतह प्रोटीन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जिसे आसानी से आंतरिक किया जा सकता है, जैसे कि ईपीकैम25।
इस परख में अन्य महत्वपूर्ण कारक उचित नियंत्रण का अनुप्रयोग है। कैंसर कोशिकाएं जो या तो लक्ष्य प्रोटीन को व्यक्त करती हैं या व्यक्त नहीं करती हैं, उनका उपयोग एपटामर की चयनात्मकता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाना चाहिए। प्रत्येक प्रयोग में, रुचि के एपटामर के अलावा, एपटामर की विशिष्टता दिखाने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण एपटामर (एक यादृच्छिक अनुक्रम या एक स्क्रैम्बल्ड अनुक्रम) की आवश्यकता होती है। आदर्श रूप से, इस नियंत्रण में न्यूक्लियोटाइड की समान लंबाई होनी चाहिए और एपटामर के समान तह से गुजरना चाहिए। इस प्रयोग में, एक नकारात्मक नियंत्रण (TENN), TEPP के समान संरचना के साथ एक एपटामर का उपयोग किया गया था, जिसे EpCAM के साथ कम बाध्यकारी संबंध दिखाया गया था,10 का उपयोग किया गया था।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक गुणात्मक परख है और आगे बाध्यकारी आत्मीयता के मात्रात्मक मूल्यांकन और पृथक्करण स्थिरांक (केडी) 29,30,31 के निर्धारण के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, तकनीकी और जैविक प्रतिकृति का उपयोग करके परिणामों की प्रजनन क्षमता दिखाना महत्वपूर्ण है। इसे प्राप्त करने के लिए, इस परख को ठीक से करने के लिए प्रमुख निर्धारकों पर विचार करना अत्यधिक महत्वपूर्ण है। इसमें माइकोप्लाज्मा-मुक्त कोशिकाओं की कम पारित संख्या का उपयोग करना शामिल हो सकता है, लेकिन सीमित नहीं है, जो उनकी इष्टतम स्थितियों में ठीक से उगाए जाते हैं, प्रत्येक प्रतिकृति में एपटामर के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की निरंतर संख्या का उपयोग करना, उचित तापमान और फोल्डिंग स्थितियों का अनुप्रयोग, एपटामर और नियंत्रण दोनों के लिए समान प्रयोगात्मक स्थितियों को बनाए रखना, अनुकूलित एपटामर-सेल एक्सपोजर समय और तापमान का उपयोग करके, पर्यावरणीय प्रकाश के लिए एपटामर के न्यूनतम जोखिम को बनाए रखना, कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस का तापमान बनाए रखना, जिसमें सेंट्रीफ्यूज, 96-वेल प्लेट और फ्लो साइटोमेट्री ट्यूबों को प्रीकूलिंग करना और बफर को सटीक रूप से तैयार करना शामिल है, जिसमें यथासंभव दावा की गई सांद्रता के करीब आयनिक एकाग्रता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक मानसिक और शारीरिक स्वास्थ्य और नैदानिक अनुवाद संस्थान (इम्पैक्ट) सीड फंडिंग, डीकिन विश्वविद्यालय में "अल्फ्रेड डीकिन पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फैलोशिप" कार्यक्रम और "ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति" को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
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