Summary
항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.
Abstract
항암 앱타머 개발의 핵심 과제는 개발된 앱타머의 표적 단백질에 대한 선택성과 특이성을 효율적으로 결정하는 것입니다. 단일 클론 항체에 비해 몇 가지 장점으로 인해 압타머 개발은 암 연구자들 사이에서 엄청난 인기를 얻었습니다. 지수 농축 (SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 관심 단백질에 특이적인 압타머를 개발하는 가장 일반적인 방법입니다. SELEX에 이어 빠르고 효율적인 결합 분석은 식별 과정을 가속화하여 압타머의 선택성과 특이성을 확인합니다.
이 논문은 상피 세포 접착 분자(EpCAM)에 특이적인 압타머의 단계별 유세포 분석 기반 결합 분석을 설명합니다. 막횡단 당단백질 EpCAM은 대부분의 암종에서 과발현되며 암 시작, 진행 및 전이에 역할을 합니다. 따라서, 종양으로의 표적 약물 전달을 위한 귀중한 후보이다. 막 결합된 EpCAM에 대한 앱타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위해서는 EpCAM 양성 및 음성 세포가 필요하다. 추가적으로, EpCAM 결합 압타머와 유사한 길이 및 2차원(2D) 구조를 갖는 비결합 EpCAM 압타머가 요구된다. 결합 분석은 상이한 완충제 (블로킹 완충액, 세척 완충액, 인큐베이션 완충액, 및 FACS 완충액) 및 배양 단계를 포함한다.
앱타머는 세포주와 함께 배양된다. 인큐베이션 및 세척 단계에 이어서, 세포를 민감성 유동 세포분석 방법을 사용하여 평가할 것이다. 결과를 분석한 결과, EpCAM 음성 세포가 아닌 EpCAM 양성 세포에 대한 EpCAM 특이적 압타머의 결합을 보여준다. EpCAM 양성 세포에서, 이것은 비결합 압타머 대조군과 비교하여 EpCAM 압타머의 우측으로의 결합에서의 밴드 이동으로서 도시된다. EpCAM 음성 세포에서, EpCAM 결합 및 비 결합 압타머의 상응하는 밴드가 겹친다. 이것은 EpCAM 압타머의 선택성과 특이성을 입증합니다. 이 프로토콜은 EpCAM 압타머에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜은 다른 공개된 압타머에도 적용할 수 있다.
Introduction
암은 여전히 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다1. 최근 수십 년 동안 암 치료의 상당한 개선에도 불구하고 항암제 개발은 여전히 논쟁의 여지가 많은 주제입니다. 암 치료의 주류 인 화학 요법은 환자의 치료 순응도를 제한하는 심각한 부작용을 동반하기 때문입니다. 더욱이, 화학 요법으로 유발 된 암 내성은 의학적 개입의 유일한 선택으로서의 적용을 제한했다. 단클론 항체(mAbs)의 적용은 암 치료에 대한 향상된 반응을 도입했습니다2. mAb를 사용한 이유는 화학 요법의 효능을 개선하고 부작용을 최소화하는 것이 었습니다. 그러나 mAb의 관리도 도전이되었습니다. 이는 mAb 유도 면역반응뿐만 아니라 동물의존적이고 고가의 생산 비용과 어려운보관 조건 때문이었습니다3. 1990년대에 압 타머의 도입4 앱타머의 적용이 mAb와 관련된 문제를 해결할 수 있기 때문에 암 치료에 대한 새로운 희망을 불러일으켰습니다.
압타머는 특정 표적에 대해 특이적으로 생산되는 짧은 핵산 서열입니다. 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 압타머 생산에서 일반적인 방법입니다. SELEX에서 관심 단백질은 무작위 뉴클레오티드 서열 라이브러리와 함께 배양되고 일련의 반복 주기를 통해 해당 단백질에 특이적인 앱타머가 정제됩니다. 압타머는 mAb와 유사한 표적 선택성 및 특이성을 가지므로 이 분야의 약물 개발은 유망한 미래 응용 분야를 보여줍니다. 암 바이오마커에 특이적인 압타머는 단일 약물 및 암 진단 도구 5,6,7로서 적용될 수 있다. 이들의 나노 크기 구조로 인해, 이들 앱타머는 또한 종양에 특이적으로 세포독성제를 전달하는 약물 운반체로서 작용할 수 있다(8). 이것은 표적 약물 전달의 효능을 증가시키고 화학 요법과 관련된 표적 외 부작용을 감소시킵니다. 또한, 이러한 나노 의약품은 조직 침투율이 높기 때문에 심부 종양 약물 전달 및 치료에 바람직한 후보가됩니다. 압타머는 또한 뇌종양으로의 약물 전달을 개선하기 위해 혈액-뇌 장벽(BBB) 상에 발현된 수송체를 표적으로 하도록 설계될 수있다9. 이러한 앱타머의 좋은 예는 BBB를 가로지르는 약물 전달을 향상시키기 위해 트랜스페린 수용체(TfR)10을 표적화하고, 종양 세포(11)에 세포독성 약물 페이로드를 전달하는 이관능성 앱타머이다.
압타머의 모든 장점에도 불구하고 이 분야의 약물 개발은 아직 시판되고 성공적인 항암제를 산출하지 못했습니다. 그 이유 중 하나는 해당 분야의 연구자들이 전 세계적으로 따를 수 있는 표준적이고 재현 가능한 방법이 부족하기 때문일 수 있습니다. 이 논문에서는 세포 표면에 발현된 천연 단백질에 결합하는 앱타머의 단계별 프로토콜을 시연합니다. 이 프로토콜은 항암 앱타머의 전임상 평가에서 전제 조건 단계입니다. 분석법은 선택성 및 특이성의 확인을 위해 SELEX 또는 공개된 압타머 서열로부터 수집된 정제된 압타머의 선택성 및 특이성을 보여주기 위해 수행된다. 이 유세포 분석 기반 분석은 압타머의 선택성과 특이성을 정확하게 보여주는 빠르고 신뢰할 수 있으며 민감한 분석이며, 여기서 압타머는 세포 표면12,13,14의 단백질에 대해 테스트됩니다. 이 방법은 이 논문15에 나타낸 EpCAM에 특이적인 압타머의 결합을 사용하여 입증된다. 막횡단 당단백질인 EpCAM은 종양 세포 신호 전달, 진행, 이동 및 전이에 역할을 합니다16,17. 이 압타머의 선택성 및 특이성을 보여주기 위해, EpCAM 양성 및 음성 암세포가 사용되었다. 이전에 개발된 EpCAM 특이적 압타머인 TEPP (5'-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3') 및 음성 대조군 압타머인 TENN (5'-GC GCG TGCA CGC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), 각각10개의 EpCAM 결합 및 비결합 압타머를 사용하였다. TEPP 및 TENN 모두의 3' 말단은 TYE665 형광단으로 표지되었다.
TEPP는 한쪽 끝에서 EpCAM을 표적으로 하고 다른 쪽 끝에서 TfR을 표적으로 하는 이중 기능 압타머입니다. 이로 인해 TEPP는 EpCAM+ 뇌종양에 대한 약물 전달에 적합한 후보가 되었습니다. TEPP는 TfR 특이적 말단을 사용하여 혈액-뇌 장벽을 횡단하고 EpCAM 특이적 말단을 사용하여 종양을 찾아 화물(예: 세포독성 약물)을 종양에 전달합니다. TENN은 TEPP와 유사한 길이 및 2D 구조를 갖지만 EpCAM 또는 TfR에 대한 친화력이 없으므로 적합한 음성 대조군 압타머입니다. TEPP 및 TENN을 사용하여 유세포 분석을 사용하여 표적 단백질에 대한 압타머의 결합을 테스트하는 것이 이 논문에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 세포 특이적 압타머의 개발에 적용됩니다. 또한 문헌에서 이용 가능한 압타머 서열의 추가 보완 및 확인 분석에도 적용 가능하다. 이 프로토콜은 또한 이전에 발표 된 압타머를 연구 개발 (R & D) 목적으로 사용하려는 압타머 분야를 처음 접하는 사람들도 사용할 수 있습니다. 이 논문에서는 문헌에서 이용 가능한 두 가지 압타머 서열을 연구합니다.
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Protocol
알림: 실험을 시작하기 전에 실험실 코트, 장갑 및 고글을 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 분석에 필요한 완충액
- 본 실험에 필요한 완충액인 압타머 폴딩에 필요한 SELEX 완충액, 블로킹 완충액(BB), 세척 완충액(WB) 및 결합 완충액(BiB)(표 1))을 실험 당일에 신선하게 준비하여 얼음 위 또는 4°C에 보관한다.
참고: 각 압타머에는 고유한 접힘 조건이 필요합니다. 여기에는 SELEX 버퍼 및 폴딩 온도 조건이 포함됩니다. 압타머(10)를 기술하는 원본 논문으로부터의 방법들을 완전히 복제하도록 주의해야 한다. 이 실험에서 모든 완충액은 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서 준비됩니다. 각 실험에 필요한 완충액 부피는 테스트되는 세포주 수, 반복 횟수 및 앱타머 농도 수에 따라 다릅니다.
| 재료 | 필요한 용량 | ||
| 항목 | 농도 | ||
| 셀렉스 버퍼 | 마그네슘 2 | 5 밀리미터 | 샘플당 50 μL + 10% 피펫팅 오류 |
| 블로킹 버퍼 | 마그네슘 2 | 5 밀리미터 | 세포주당 500 μL |
| BSA a | 1 밀리그램 / 밀리람베르트 | ||
| tRNA b | 0.1 밀리그램 / 밀리람베르트 | ||
| 증권 시세 표시기 | 10% (V/V) | ||
| 워시 버퍼 | 마그네슘 2 | 5 밀리미터 | 첫 번째 세척 시 1mL + 테스트 샘플당 100μL + 10% 피펫팅 오류 |
| 바인딩 버퍼 | 마그네슘 2 | 5 밀리미터 | 샘플당 50 μL + 10% 피펫팅 오류 |
| 증권 시세 표시기 | 2 밀리그램 / 밀리리터 | ||
| tRNA | 0.2 밀리그램 / 밀리람베르트 | ||
| 증권 시세 표시기 | 20% (V/V) | ||
표 1: 결합 분석에 필요한 완충액. ᅡ 소 혈청 알부민, b전달 리보 핵산, c태아 소 혈청.
2. 압타머의 제조
참고: 분석에 사용된 압타머에는 형광 리포터 분자가 태그되어 있으므로 빛으로부터 보호하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
- 실험에 앞서 발열원 및 RNase가 없는 초순수를 사용하여 100μM 스톡(스톡 A)의 테스트 및 대조 압타머를 준비합니다(그림 1).
알림: 장기 보존을 위해 스톡 A는 -20°C의 냉동실에 보관해야 합니다. - SELEX 완충액을 사용하여 원료 A를 희석하여 압타머의 작동 농도로서 원료 B를 준비합니다(표 1). 이 프로토콜을 따르려면 재고 A를 1,000nM 재고로 희석하여 재고 B를 준비합니다(그림 1).
- 압타머가 3차원(3D) 구조의 형성을 준비할 수 있도록 250μL 튜브에서 스톡 B를 SELEX 버퍼로 희석하여 폴딩에 필요한 압타머의 부피와 농도를 준비합니다.
알림: 접힌 압타머는 동일한 부피의 세포에 노출됩니다. 따라서 폴딩을 위해 설정된 압타머의 농도는 원하는 최종 농도보다 2배 더 농축되어야 합니다. 방정식 (1)을 사용하여 필요한 부피와 농도를 계산하십시오. 피펫팅 오류에 대해 추가로 10% 부피를 고려해야 합니다.
농축 스톡 A × 볼륨 스톡A = 농축 스톡 B × 볼륨 스톡 B (1)
그림 1: 압타머 준비 단계를 보여주는 다이어그램. 1 스톡 1은 장기 보존을 위해 -20°C에서 보관됩니다. 2 작업 농도는 SELEX 완충액에서 준비되며 저장되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 암세포의 유지
참고: 연구를 시작하기 전에 세포가 초기 계대 수에 있는지, 전형적인 형태학적 특징을 보여주는지, 마이코플라스마가 없는지 확인하십시오. 앱타머의 선택성과 특이성을 테스트하려면 관심 단백질의 고, 중간 및 낮음/음성 발현자인 세포주가 이상적으로 필요합니다.
- 적절한 배양 조건을 사용하여 T75 배양 플라스크에 세포를 시드합니다. 37 ° C의 5 % CO2 가습 인큐베이터에서 성장시킵니다.
참고: 이 연구에서는 10% 태아 소 혈청(완전 배지)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)를 사용했습니다. - 세포가 ~ 80 % 컨플루언스에 도달하면 신선한 완전 배지가 들어있는 새 플라스크로 통과시킵니다.
참고: 관심 단백질과 세포주에 따라 80% 컨플루언시는 결합 분석에 적합한 세포 집단을 제공할 수 있습니다. 본 실험에서 세포주의 경우, MDA-MB-231 및 HEK 293T, 80% 컨플루언시가 적합하다. 이 단계에서 섹션 4, 결합 분석으로 진행하십시오. 항상 해당 단백질에 특이적인 mAb를 사용하여 관심 단백질의 발현을 확인하십시오.
4. 결합 분석
참고: 그림 2 는 부착 세포의 결합 분석에 필요한 단계를 요약한 것입니다.
- 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 다음과 같이 튜브에 각 플라스크의 셀을 수집합니다.
- 플라스크에서 배지를 수집 및 폐기하고 PBS 2mL를 추가하여 세포 전체에 뿌린 다음 PBS를 수집하여 버립니다. 이 단계를 두 번 더 반복하여 트립신을 비활성화할 수 있는 모든 배지를 제거합니다. 각 플라스크에 0.25%의 트립신/EDTA 1mL를 넣고 37o C에서5-10분 동안 배양합니다. 현미경으로 세포의 분리를 시각화합니다.
- 1mL의 완전 배지를 세포에 추가하고 세포를 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포를 적절한 튜브에 피펫팅하고 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
참고: 부착되지 않은 세포의 경우 튜브, 원심분리기(200× g, 5분)에 세포를 수집하고 4.1.3단계로 진행합니다. - 상청액을 버리고 세포를 1mL의 새로운 배지에 재현탁시킨다. 일정 부피의 세포 현탁액을 트리판 블루로 희석하여 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수합니다. ~15μL의 혼합물을 혈구계와 커버 유리 사이에 분배합니다. 방정식 (2)를 사용하여 앞서 설명한18과 같이 셀을 계산합니다.
(2)
알림: 가능한 최소 부피의 세포 현탁액을 사용하고 희석 계수를 기록해 두십시오. 예를 들어, 동일한 부피의 세포 현탁액과 0.04% 트리판 블루를 혼합하면 희석 계수가 2가 됩니다. 진행하기 전에 대부분의 부착 세포주에 대해 ~90%의 높은 생존력(살아있는 세포/총 세포 × 100개)을 보장합니다. 죽은 세포는 비특이적으로 압타머를 흡수하고 결과를 변경합니다19. 세포 계수기를 사용하는 것과 같은 다른 세포 계수 기술을 사용할 수 있습니다. - 필요한 수의 세포를 수집하여 테스트 샘플 당 10 개 ×10 개의 4 개의 세포가 있는지 확인하십시오. 파이펫팅 오류에 대해 10%의 추가 부피를 고려하십시오.
참고: 실험과 반복실험 사이에 항상 동일한 셀 수를 유지하는 것이 중요합니다. - 세포를 37°C에서 2시간 동안 배양하여 효소 분리 후 세포막에서 관심 단백질이 안정화될 수 있도록 합니다.
참고: 이 잠복기는 관심 단백질에 따라 다를 수 있습니다.
- 이 2 시간 배양 기간 동안 :
- 원심분리기의 온도를 4°C로 설정합니다. tRNA와 압타머 스톡을 실온이나 얼음에 방치하여 해동합니다. 형광 리포터 분자를 보호하려면 압타머 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
참고: tRNA의 역할은 핵산 결합 부위를 차단하는 것입니다. - SELEX 완충액, BB, WB 및 BiB(섹션 1 참조)를 준비하고 모두 얼음 위 또는 4°C에 보관합니다. 열순환기 기계를 빈 주기로 설정합니다. 96웰 블랙 플레이트와 유세포 분석 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
알림: 열순환기를 빈 주기로 설정하면 냉각 및 가열 시스템이 준비되고 보다 재현 가능한 결과를 생성하는 데 도움이 됩니다.
- 원심분리기의 온도를 4°C로 설정합니다. tRNA와 압타머 스톡을 실온이나 얼음에 방치하여 해동합니다. 형광 리포터 분자를 보호하려면 압타머 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
- 2시간 배양 후 세포를 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 500 μL의 BB에 재현탁시킨다. 간헐적 혼합과 함께 세포를 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 이 30분 배양 동안 다음과 같이 압타머 폴딩을 수행합니다.
- 압타머의 2x 농도를 구성하고(섹션 2 참조), 필요한 접힘 조건에 따라 열순환기 기계에서 압타머를 혼합하고 배양합니다. 이 EpCAM 압타머의 경우 95 °C, 5 분, 22 °C, 10 분 및 37 °C, 15 분의 다음 접힘 조건을 사용하십시오.
알림: 항상 음성 대조군(즉, 압타머가 없는 SELEX 완충액)을 포함하십시오.
- 압타머의 2x 농도를 구성하고(섹션 2 참조), 필요한 접힘 조건에 따라 열순환기 기계에서 압타머를 혼합하고 배양합니다. 이 EpCAM 압타머의 경우 95 °C, 5 분, 22 °C, 10 분 및 37 °C, 15 분의 다음 접힘 조건을 사용하십시오.
- 30분 배양 후, 세포를 원심분리하고(500 × g, 5분, 4°C), 상청액을 제거하고, 1 mL의 WB를 첨가하고, 세포를 다시 원심분리한다(500 × g, 5분, 4°C). 상청액을 제거하고 세포를 적절한 부피의 BiB에 재현탁시킨다.
- 재현탁된 세포 50μL를 얼음처럼 차가운 96-웰 블랙 플레이트의 각 웰에 피펫팅한다. 관심 단백질의 내재화를 억제하기 위해 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 압타머 50 μL를 50 μL 부피의 세포 상에 피펫팅하고, 혼합하고, 4°C의 암흑 속에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 500 × g, 5분, 4°C에서 원심분리하고, 상청액을 조심스럽게 제거한다.
- 펠릿을 WB에 조심스럽게 재현탁하고 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 세척 단계 (4.7)를 2x 반복하고 유동 세포분석 분석을 위해 100 μL의 WB에 재현탁시킨다.
참고: 압타머와 세포 간의 상호 작용 다이어그램은 그림 3 을 참조하십시오.
(2)
그림 2: 앱타머-단백질 결합 분석을 수행하는 단계를 보여주는 다이어그램. 약어 : SELEX = 기하 급수적 인 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화; BB = 블로킹 버퍼; WB = 세척 완충액; BiB = 결합 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 앱타머 결합 분석을 수행하는 데 필요한 다양한 유형의 세포 및 앱타머를 보여주는 다이어그램. 약어 : EpCAM = 상피 세포 접착 분자. 이 그림은 Biorender.com 사용하여 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 유세포 분석 및 데이터 분석
알림: 유세포분석기를 켜기 전에 멤브레인 필터 장치에 셧다운 용액, 세척액 및 외피액(0.9% NaCl)에 대한 "기포"가 없는지 확인하십시오. 캡슐에 거품이 있으면 "블리드 아웃"거품이 발생합니다. 폐기물 용기가 비어 있고 초순수에 외피 액, 물 및 1% 표백제가 담긴 용기가 가득 차 있는지 확인하십시오.
- 유세포 분석기를 켠 다음 컴퓨터를 켭니다.
알림: 여기에 설명된 유세포분석기 실행에 대한 자세한 내용은 비디오에 설명된 기계 및 소프트웨어에 따라 다릅니다( 재료 표 참조). 다른 소프트웨어를 사용하려면 적절한 교육이 필요합니다. - 유세포 분석 소프트웨어를 열고 프로그램에 로그인 한 다음 세포 분석기 탭에서 Fluidics Start를 실행하십시오.
- 새 실험을 만들려면 실험 탭에서 새 폴더를 클릭하고 폴더/실험의 이름을 적절하게 지정합니다.
- 강조 표시할 새 폴더를 클릭한 다음 실험 탭에서 다시 새 실험을 클릭하고 실험 이름을 적절하게 지정합니다.
- 첫 번째 샘플/표본을 추가하려면 실험 탭에서 새 표본을 클릭하고 이 표본의 이름을 적절하게 지정합니다(세포주/대조 샘플/실험 샘플 이름).
- 튜브 샘플을 추가하려면 표본(그룹)을 강조 표시하고 실험 탭에서 새 튜브를 클릭합니다. 적절한 수의 튜브와 이름을 추가하십시오.
- 필요한 그래프를 준비하려면 워크시트 탭에서 새 워크시트 를 엽니다. 새 워크 시트 창이 나타나면 워크 시트 화면을 사용하여 다음을 엽니 다 (로고/그림 위로 마우스를 가져가 이름을 찾습니다).
- 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SCC)의 도트 블롯 그래프를 준비하여 관심 모집단을 선택합니다. 순방향 및 측면 산점도 밀도 플롯에서 관심 모집단(P1)을 식별하고 선택하여 첫 번째 게이트를 정의합니다. 가장 낮은 전방 산란 신호를 가진 집단을 구성하는 파편을 제외합니다.
참고: FSC 매개변수는 크기에 따라 셀 또는 이벤트를 감지하고 SCC는 세분성20에 따라 셀 또는 이벤트를 구별합니다. - 단일 세포 집단을 선택하기 위해 FSC 면적(FSC-A) 대 FSC 높이(FSC-H)의 도트 블롯 그래프를 준비합니다. 이중항 세포 집단을 제외하여 두 번째 게이트를 정의하면 이중항 세포가 결과와 결론에 상당한 영향을 미치므로 두 번째 게이트를 정의합니다. 동일한 크기의 셀이 유사한 면적과 높이를 나타내는 FSC-H 대 FSC-A 밀도 플롯을 사용하여 이중선을 제외합니다. 따라서 싱글렛은 대각선으로 클러스터링되고 더블릿에서 분리됩니다.
참고: FSC는 셀 크기에 대략 비례합니다. 전압 펄스는 신호의 강도인 FSC-H, 셀 크기 및 신호의 지속 시간을 반영하는 FSC 폭 및 H ×W인 FSC-A로 정의됩니다. 더블릿은 이중 너비와 면적 값을 갖습니다. 따라서 싱글렛에 대한 게이팅은 더블릿으로 인한 H, W 및 A 간의 불균형 감지를 기반으로 합니다. - 관심있는 형광단에 대한 사건 수의 히스토그램 을 준비하십시오.
- 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SCC)의 도트 블롯 그래프를 준비하여 관심 모집단을 선택합니다. 순방향 및 측면 산점도 밀도 플롯에서 관심 모집단(P1)을 식별하고 선택하여 첫 번째 게이트를 정의합니다. 가장 낮은 전방 산란 신호를 가진 집단을 구성하는 파편을 제외합니다.
- 유세포분석을 시작하기 전에 전압 파라미터를 조정하기 위해 샘플 수집, 검사기 및 세포분석기를 제어하기 위한 수집 대시보드와 모든 그래프가 있는 워크시트가 열려 있는지 확인하십시오.
참고: 분석을 수행하려면 유세포분석 튜브에 있는 최소 10 × 104 세포 현탁액 중 최소 100μL가 필요합니다. 특히 생존율이 낮은 경우, 프로피듐 요오드화물 염색을 수행하여 생존 가능한 세포 집단21,22를 선택할 수 있습니다. - 첫 번째 샘플을 실행하려면 화면 왼쪽에서 튜브를 가리키는 화살표가 녹색인지 확인합니다. 이 화살표가 녹색이 아닌 경우 화살표를 클릭하여 녹색으로 만듭니다.
- 피펫을 사용하여 각 샘플을 96웰 블랙 플레이트에서 유세포분석 튜브로 옮깁니다. 처리되지 않고 염색되지 않은 대조 샘플을 저속으로 실행합니다.
- 획득 대시보드에서 기록할 적절한 이벤트 수(30,000개)를 선택하고 유량 을 낮음으로 변경한 다음 데이터 수집을 클릭합니다.
- FSC 및 SCC 매개 변수의 전압을 조정합니다. 세포 집단이 점도표 내에 집중되어 있고 관심 있는 세포가 손실되지 않도록 그래프의 어느 축에도 닿지 않도록 합니다.
- 수집 속도를 중간 또는 높음으로 높여 샘플을 더 빠르게 분석하되 초당 200개 이벤트를 초과하지 않도록 합니다. 그런 다음 데이터 기록을 클릭합니다.
- P1(그림 4A) 및 단일 세포 집단(그림 4B)에 대해 게이팅을 수행합니다. 사용된 형광 색소에 대한 이벤트 히스토그램을 구성하고 데이터(이 경우 알로피코시아닌(APC))를 기반으로 P1을 선택합니다(그림 4C).
- 전압을 조정하고 데이터를 게이팅하고 기록한 후 샘플을 꺼내고 Next Tube를 클릭합니다.
- 다음 샘플을 삽입하고 모든 제어 및 테스트 샘플에 대해 기록 데이터를 반복합니다(그림 3).
- 모든 데이터가 수집되면 50% 표백제, FACS 헹굼 및 초순수로 구성된 3개의 튜브를 각각 높은 유속으로 5분 동안 실행하여 유세포분석기를 세척합니다.
- 그런 다음 세포분석기 드롭다운 메뉴에서 유체 시스템 종료를 클릭합니다.
- 소프트웨어를 닫고 기기와 컴퓨터를 끄기 전에 다음과 같이 결과를 .fcs 파일로 USB 드라이브로 내보내 전송 및 분석합니다.
- 분석 소프트웨어에서 NEW 버튼을 눌러 분석을 처리할 새 문서와 창을 생성합니다. 샘플 파일을 새 창으로 끕니다.
- 두 번 클릭하여 염색되지 않은 샘플을 엽니다. P1 모집단을 선택하고 P1 모집단을 두 번 클릭하여 FSC-H 대 FSC-A 그래프를 만들고 단일 셀 모집단을 게이트합니다.
- 제어된 단일 셀을 두 번 클릭하여 사용된 형광 색소에 대한 이벤트의 히스토그램을 만듭니다.
- 원래 창에서 P1 및 단일 셀을 선택하고 모든 샘플로 드래그하여 모든 샘플 에 동일한 게이팅이 포함되도록 합니다.
- 레이아웃 편집기 버튼을 클릭하여 레이아웃 창을 엽니다. 두 샘플(제어 및 테스트)을 서로 드래그하여 오버레이 히스토그램을 만듭니다.
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Representative Results
신약 발견 및 개발의 중요한 측면은 약물 후보의 선택성과 특이성을 보장하는 것입니다. 이는 약물 후보가 서로 다른 세포를 구별할 수 있어야 하며 관심 세포 집단(선택성)에만 영향을 미칠 수 있어야 함을 의미합니다. 선택성은 관심있는 단백질의 발현 측면에서 다른 세포주를 사용하여 연구됩니다. 본 연구에서, MDA-MB-231 및 HEK 293T 세포주를 EpCAM 양성 및 음성 세포로서 선택하였다. 특이성은 관심 단백질이 단일 약물 후보에만 반응한다는 것을 보여주는 또 다른 결정 요인입니다. 여기서, EpCAM 비결합 압타머인 TENN을 사용하여, TEPP만이 EpCAM에 부착되는 것을 나타내었다. EpCAM 양성 세포(MDA-MB-231)에서, TEPP 및 TENN으로 처리된 세포를 나타내는 히스토그램을 오버레이하면 TEPP-처리된 세포가 TENN-처리된 세포에 비해 오른쪽으로 이동함을 알 수 있다. 이것은 관심있는 단백질 인 EpCAM에 대한 압타머 TEPP의 결합을 보여줍니다 (그림 4D). 음성 대조군 HEK 293T 세포에서 TEPP 및 TENN의 히스토그램을 오버레이하는 것은 어떠한 이동도 반영하지 않습니다(그림 4E). 이는 EpCAM 발현 세포에서 TEPP가 그의 수용체에 부착된 EpCAM 앱타머로서, 더욱이 EpCAM 음성 세포에서 결합이 관찰되지 않았음을 의미한다. 이러한 결과는 개발된 압타머의 선택성과 특이성을 확인시켜준다.
그림 4: 압타머에 대한 세포의 결합을 보여주는 게이팅 및 히스토그램. (A) 세포 집단, (B) 단일 세포, 및 (C) 앱타머에 부착된 세포의 히스토그램(200 nM)을 선택한다. (D) EpCAM+ MDA-MB-231 세포 및 (E) EpCAM-HEK 293T 세포에서 EpCAM 앱타머 (TEPP) 대 비-EpCAM 결합 앱타머 (TENN)의 결합을 비교한다. 약어 : EpCAM = 상피 세포 접착 분자; FSC-A = 전방 산란 피크 영역; SSC-A = 측면 산란 피크 면적; FSC-H = 전방 산란 피크 높이; APC = 알로피코시아닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
새로운 압타머 개발의 주요 과제는 이 프로세스의 여러 단계에 적용되는 표준 지침이 없다는 것입니다. McKeague et al.은 최근 출판물에서 데이터의 불분명 한 표현과 연구 복제 실패로 이어지는 관련 문제 중 일부를 보여주었습니다. 그들은 압타머19를 특성화할 때 고려해야 할 기본 지침을 제안했습니다. 압타머 결합 분석은 해당 분야의 연구자들이 널리 사용하는 압타머23을 스크리닝 및/또는 특성화하는 데 중요한 단계입니다. 단계별 프로토콜을 표시하기 위한 단일 지침이 없기 때문에 앱타머-단백질 결합을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 유세포분석 방법이 첨부된 비디오 프로토콜에서 시연됩니다.
압타머와 그 표적의 상호 작용을 측정하는 몇 가지 방법이 있습니다. 유세포 분석은 이러한 방법 중 하나입니다. 다른 예는 형광 편광, 표면 플라즈몬 공명, 모세관 전기영동, 및 등온 적정 열량측정법(24)을 포함한다. 올바른 방법을 선택하는 것은 압타머의 적용에 달려 있습니다. 그러나, 각각의 방법은 그 한계를 가지며, 몇몇 분석법의 적용이 소분자 압타머24의 특성화에 더 유익하다는 것을 아는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 신뢰할 수 있고 정확하며 정확한 방법 중 하나이며 빠르고 비용 효율적입니다. 압타머 결합의 유세포 분석은 후보 스크리닝, 절단 및 최적화, 특성화 및 검증을 포함한 압타머 개발의 다양한 단계에 적용될 수 있습니다.
형광 표지를 사용하면 표적의 고유 형광을 표지 또는 사용하거나 압타머24를 표지 할 수 있습니다. 저자의 경험에 따르면 라벨이 부착된 압타머를 사용하는 것은 신뢰할 수 있고 설정하기 쉽습니다. 압타머는 임의의 말단(3' 또는 5')25에서 형광단으로 표지될 수 있습니다. 그러나, 구아닌이 적은 끝은 구아닌이 형광과 그 검출을 소멸시킬 수 있기 때문에 더 유리하다26. 이 방법의 단점은 압타머가 형광단에 태그되어야 한다는 것입니다. 또한, 이 방법은 특정 단백질에 대한 압타머의 결합을 반영하지만, 상호작용 부위의 위치를 표시하지는 않는다. 따라서, 압타머-단백질 상호작용 위치(25)를 확인하기 위해 형광 현미경과 같은 추가 연구가 필요할 수 있다.
이 분석을 수행하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 참고 사항이 있습니다. 각 압타머에는 취급 및 접기에 대한 특정 요구 사항이 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에는 재구성 및 희석 완충액의 선택과 접힘 조건이 포함됩니다. 동결건조된 압타머의 재구성은 정제된 멸균 발열원 및 RNase가 없는 초순수에서 발생합니다. 이것은 뉴클레오티드 주변의 이온 농도를 최소화하기위한 것입니다. 이온 농도는 압타머의 2D 구조 형성과 친화력 및 안정성에 큰 영향을 미칩니다. 따라서, 압타머 스톡의 추가 재구성을 위해,MgCl225,27과 같은 다른 완충액 및 금속 양이온 용액의 올바른 제조에 주의를 기울여야 한다. 금속 양이온 용액의 최적 농도는 압타머의 음전하를 차폐하면서도 압타머와 그 표적의 상호작용을 저해하지 않는다.
또한, 압타머는 비특이적, 비표적 결합에 대한 잠재력을 갖기 때문에, 차단 완충액의 적용은 결합 분석에서 중요한 역할을 한다. 항체에 일반적으로 사용되는 음전하를 띤 BSA 외에도 연어 정자 DNA 또는 tRNA도 여기에 필요합니다. 이 혼합물은 양전하를 띤 단백질과 핵산 결합 부위를 차단합니다. 이 차단 단계는 암세포에 대한 앱타머의 선택성 및 특이성에 특히 중요한데, 이는 중성 및 양전하를 띤 정상 세포에 비해 음전하를 띠기 때문이다(28). 또한 압타머의 3D 폴딩은 온도와 같은 다른 요인에 따라 달라집니다. 튜브 선택 및 PCR 단계의 지속 기간을 포함하여 압타머의 3D 형성에 영향을 미치는 조건의 중요성이 검토되었습니다25. 또한, 표적을 갖는 압타머의 배양 시간은 모든 특정 압타머에 대해 최적화되어야 한다. 배양 온도 또한 매우 중요합니다. 4°C의 온도 유지는 EpCAM25와 같이 쉽게 내재화될 수 있는 세포 표면 단백질에 특히 중요합니다.
이 분석의 또 다른 중요한 요소는 적절한 통제의 적용입니다. 표적 단백질을 발현하거나 발현하지 않는 암세포는 앱타머의 선택성을 평가하기 위해 사용되어야 한다. 각 실험에서, 관심있는 압타머 이외에, 압타머의 특이성을 보여주기 위해 음성 대조군 압타머 (무작위 서열 또는 스크램블 된 서열)가 필요하다. 이상적으로,이 대조군은 유사한 길이의 뉴클레오티드를 가져야하며 압타머와 유사한 폴딩을 거쳐야합니다. 본 실험에서는 EpCAM과의 낮은 결합력을 갖는 것으로 나타난 TEKP와 유사한 구조를 갖는 압타머인 음성대조군(TENN)을10을 사용하였다.
여기에 제시된 프로토콜은 정성 분석이며 결합 친화도의 정량적 평가 및 해리 상수 (Kd) 29,30,31의 결정에 추가로 사용될 수 있습니다. 그러나 기술 및 생물학적 복제를 사용하여 결과의 재현성을 보여주는 것이 중요합니다. 이를 달성하기 위해서는 이 분석을 적절하게 수행하기 위한 주요 결정 요인을 고려하는 것이 매우 중요합니다. 여기에는 최적의 조건에서 적절하게 성장한 마이코플라즈마가 없는 세포의 낮은 계대 수를 사용하는 것, 각 복제에서 앱타머에 노출될 일정한 수의 세포를 사용하는 것, 적절한 온도 및 접힘 조건의 적용, 앱타머와 대조군 모두에 대해 유사한 실험 조건을 유지하는 것이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않습니다. 압타머의 환경 빛에 대한 최소 노출을 유지하고, 최적화된 압타머-세포 노출 시간 및 온도를 사용하고, 원심분리기, 96웰 플레이트 및 유세포분석 튜브를 예냉하는 것을 포함하는 세포에 대해 4°C의 온도를 유지하고, 가능한 한 주장된 농도에 가까운 이온 농도로 완충액을 정확하게 준비합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 정신 및 신체 건강 및 임상 번역 연구소 (IMPACT) SEED 기금, 디킨 대학의 "Alfred Deakin 박사후 연구 펠로우십"프로그램 및 "호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금"을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
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