Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء الأشعة التداخلية الذي تم إنشاؤه للحقن داخل الغدة الصعترية في الفئران لتجنب خطر الجراحة المفتوحة وتحسين دقة الحقن الأعمى عن طريق الجلد.
Abstract
يعد الحقن داخل الثعترية في نماذج الفئران تقنية مهمة لدراسة وظيفة الغدة الصعترية والمناعة ، بما في ذلك اضطرابات الخلايا التائية الوراثية والمكتسبة. وهذا يتطلب طرقا للترسب المباشر للكواشف و / أو الخلايا في الغدة الصعترية للفئران الحية. تشمل الطرق التقليدية للحقن داخل الغدة الصعترية جراحة الصدر أو الحقن الأعمى عن طريق الجلد طفيف التوغل ، وكلاهما له قيود كبيرة. جعلت أجهزة التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد الحقن عن طريق الجلد الموجهة بالصور ممكنة في الفئران ، مما أدى إلى تحسين دقة الحقن بشكل كبير لنهج الحقن عن طريق الجلد وتمكين حقن أهداف أصغر. ومع ذلك ، تعتمد الحقن الموجهة بالصور على استخدام نظام سكة حديد متكامل ، مما يجعل هذا الإجراء صارما ويستغرق وقتا طويلا. يتم تقديم طريقة فريدة وآمنة وفعالة للحقن داخل الغدة الصعترية عن طريق الجلد في الفئران هنا ، مما يلغي الاعتماد على نظام السكك الحديدية للحقن. تعتمد هذه التقنية على استخدام وحدة الموجات فوق الصوتية الدقيقة عالية الدقة لتصوير الغدة الصعترية للفأر بشكل غير جراحي. باستخدام تقنية اليد الحرة ، يمكن لأخصائي الأشعة وضع طرف إبرة مباشرة في الغدة الصعترية للفأر تحت توجيه التصوير بالموجات فوق الصوتية. يتم تنظيف الفئران وتخديرها قبل التصوير. بالنسبة لأخصائي الأشعة المتمرس الماهر في الإجراءات الموجهة بالموجات فوق الصوتية ، فإن فترة التعلم للتقنية المذكورة قصيرة جدا ، عادة في غضون جلسة واحدة. هذه الطريقة لديها معدل مراضة ووفيات منخفض للفئران وهي أسرع بكثير من التقنيات الحالية بمساعدة ميكانيكية للحقن عن طريق الجلد. يسمح للمحقق بإجراء حقن دقيقة وموثوقة عن طريق الجلد بكفاءة من الغدة الصعترية من أي حجم (بما في ذلك الأعضاء الصغيرة جدا مثل الغدة الصعترية للفئران المسنة أو التي تعاني من نقص المناعة) مع الحد الأدنى من الضغط على الحيوان. تتيح هذه الطريقة حقن الفصوص الفردية إذا رغبت في ذلك وتسهل التجارب واسعة النطاق بسبب طبيعة الإجراء الموفرة للوقت.
Introduction
تلعب الغدة الصعترية دورا أساسيا في نمو الخلايا التائية والمناعة. يؤدي نقص الخلايا التائية ، الذي يمكن أن يحدث بسبب ارتداد الغدة الصعترية ، والاضطرابات الوراثية ، والالتهابات ، وعلاجات السرطان ، من بين عوامل أخرى ، إلى ارتفاع معدل الوفيات والمراضة 1,2. لا غنى عن نماذج الفئران في كل من أبحاث المناعة الأساسية والانتقالية وقد استخدمت لعقود لدراسة بيولوجيا الغدة الصعترية وتطور الخلايا التائية ، وكذلك لتطوير علاجات لأولئك الذين يعانون من ضعف الغدة الصعترية ونقص الخلايا التائية3،4،5.
كان الجزء المركزي من تحقيقات الغدة الصعترية هو الحقن داخل الغدة الصعترية للمواد البيولوجية مثل الخلايا أو الجينات أو البروتينات في نماذج الفئران6،7،8،9،10،11،12. تستخدم طرق الحقن التقليدية داخل الغدة الصعترية بضع الصدر متبوعا بالحقن داخل الثعترية تحت التصور المباشر أو عن طريق الحقن "الأعمى" عن طريق الجلد في المنصف. النهج الجراحي يزيد بشكل كبير من خطر استرواح الصدر، من بين أمور أخرى. علاوة على ذلك ، يؤدي الإجهاد المرتفع أثناء هذه الجراحة إلى كبت المناعة ، مما قد يضر بالبيانات المناعية13. يمكن للباحثين ذوي الخبرة ، بعد بعض الممارسة ، إجراء تقنية الحقن الأعمى ، ولكن هذا النهج أقل دقة ، وبالتالي ، يقصر الموضوعات التجريبية على الفئران الشابة ذات الغدة الصعترية الكبيرة.
تم تقديم استخدام إرشادات الموجات فوق الصوتية كبديل دقيق وطفيف التوغل لنهج الحقن التقليدي داخل الثعترية14. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء يستغرق وقتا طويلا للغاية عند استخدام نظام السكك الحديدية المتكامل بدلا من تقنية اليد الحرة. يتطلب إجراء الحقن باستخدام حامل الحقن تحسينا دقيقا للتصوير وتحديد موضع محول الطاقة بمساعدة الملحقات المختلفة مثل حامل وحامل محول الطاقة ، ونظام تحديد المواقع X و Y و Z ، بالإضافة إلى التشغيل المتقن لأدوات التحكم في التلاعب الدقيق وتمديدات نظام السكك الحديدية. يتم تقديم تقنية بديلة بسيطة ، حقن الغدة الصعترية الموجهة بالموجات فوق الصوتية ، هنا من قبل أخصائي الأشعة باستخدام نهج اليد الحرة15 ، وهو بديل سريع ودقيق طفيف التوغل للطرق الموصوفة أعلاه. الأهم من ذلك ، يمكن تنفيذ النهج الحالي مع أي نظام تصوير بالموجات فوق الصوتية عالي الدقة دون الحاجة إلى حامل حقن ونظام سكة حديد متكامل. إنه مفيد بشكل خاص للدراسات التي تتطلب حقن أعداد كبيرة من الفئران11 ، أو للتجارب التي تنطوي على حقن كل من فصوص الغدة الصعترية ، أو للحقن الدقيق للزعترات الصغيرة في الفئران المسنة أو المشععة أو التي تعاني من نقص المناعة12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإرشادات رعاية الحيوان في مركز الاكتشاف والابتكار (بروتوكول IACUC 290). بالنسبة للدراسة الحالية ، C57BL / 6 فئران (أنثى ، 4-6 أسابيع) ، C57BL / 6 فئران (أنثى ، 6 أشهر من العمر) ، J: NU إناث الفئران ، أنثى الفئران NOD scid gamma (NSG) ، و B6 ؛ تم استخدام فئران CAG-luc و -GFP كنموذج للفأر الصغير ، ونموذج الفأر المسن ، ونموذج عارية athymic ، ونموذج نقص المناعة ، ومصدر خلية التلألؤ الحيوي ، على التوالي. تم الحصول على الفئران من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). سيتطلب هذا الإجراء عادة شخصين (أحدهما ليظل معقما أثناء إجراء الحقن والآخر للتعامل مع الفئران).
1. إعداد الحيوانات
- تحفيز التخدير في الفئران باستخدام 3٪ -4٪ غاز إيزوفلوران والحفاظ على التخدير باستخدام 1٪ -3٪ غاز إيزوفلوران يتم إعطاؤه عبر مخروط الأنف والمبخر المعايرة بدقة (انظر جدول المواد).
- تأكد من عمق التخدير المناسب / فقدان الوعي عن طريق عدم الاستجابة لقرصة المخلب الخلفي.
- إزالة الفراء من منطقة الصدر الأمامية للفئران عن طريق تطبيق طبقة رقيقة من كريم مزيل الشعر لمدة تقل عن 1 دقيقة. استخدم منشفة ورقية مبللة لإزالة الكريم تماما مع الفراء السائب.
ملاحظة: سيؤدي وضع الكثير من الكريم إلى التهاب جلد منطقة الصدر. - ضع فأرا واحدا في كل مرة ، مستلقا ، على المنصة الساخنة لمحطة التصوير بالموجات فوق الصوتية للحيوانات الصغيرة (انظر جدول المواد) مع مخروط الأنف في مكانه (الشكل 1).
- ثبت الماوس على المسرح بشريط لاصق طبي في الخلف والأطراف الأمامية (الشكل 1).
- ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
- تطهير جلد الصدر العلوي الخالي من الفراء باستخدام قضيب غلوكونات الكلورهيكسيدين (انظر جدول المواد).
2. إعداد آلة الموجات فوق الصوتية والمجال المعقم
- قم بتنشيط المسبار الخطي المتاح بأعلى تردد ، وعادة ما يكون المسبار بأعلى دقة مكانية لحجم الحيوان الذي يتم تصويره. قم بتنشيط المسبار من خلال النقر على الزر المقابل بعد شاشة بدء التشغيل.
ملاحظة: بالنسبة لهذا التطبيق مع الفئران ، تم تصميم المسبار المستخدم خصيصا للاستخدام مع الفئران والجرذان الصغيرة (انظر جدول المواد). - قم بتحسين إعدادات الموجات فوق الصوتية للتصوير والحقن باتباع الخطوات أدناه.
- اضبط عمق مجال الرؤية على حجم مناسب للحيوان المستهدف عن طريق ضبط المنزلقات الموجهة رأسيا على الجانب الأيمن من الشاشة (الشكل 2). عادة ما يكون إعداد العمق الأقصى حوالي 6-8 مم للفئران الصغيرة.
- اضبط كسب التدرج الرمادي عن طريق تحريك الزر على طول الشريط الأفقي أسفل الشاشة (الشكل 2). الهدف هو البدء بصورة أغمق قليلا من المظهر "الرمادي" النموذجي.
- اضبط المنطقة البؤرية (السهم الأزرق على يمين الشاشة ، الشكل 2) على المستوى المتوقع للغدة الصعترية. بالنسبة للفئران الصغيرة ، سيكون هذا على عمق 4 مم.
- إذا كان التقاط الصورة مطلوبا ، فاختبر وظيفة صورة المتجر وأزرار مقطع المتجر لضمان إمكانية حفظ الصور بشكل مناسب طوال الإجراء. قم بذلك عن طريق النقر فوق حفظ مقطع زر في أسفل يمين الشاشة أو عن طريق الضغط على تجميد زر ، ثم الضغط على حفظ الصورة (الشكل 2).
- ضع كمية صغيرة (~ 1 مل) من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح محول الطاقة (انظر جدول المواد) بينما يكون في وضع مستقيم ، إما في حامل جهاز الموجات فوق الصوتية أو في يد مساعد.
- قم بإعداد حقل معقم صغير بجوار المنصة الساخنة. عادة ما يكون الوضع الأمثل لهذا بين المنصة وجهاز الموجات فوق الصوتية.
- أفرغ هذه العناصر في الحقل المعقم: غطاء مسبار معقم ، وشريط مطاطي ، وقفازات معقمة ، وهلام معقم بالموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد).
- مع إعداد الحقل المعقم والعناصر في مكانها ، ارتد القفازات المعقمة.
- ضع غطاء المسبار المعقم بعناية فوق محول الموجات فوق الصوتية (وكذلك فوق الجل الذي تم وضعه في البداية على المسبار). الحفاظ على العقم ولمس الغطاء المعقم فقط ، لا شيء آخر. حرك الشريط المطاطي المعقم فوق غطاء المسبار المعقم لإبقائه في مكانه.
ملاحظة: يمكن أن تتداخل بؤر الهواء ، بغض النظر عن حجمها ، مع التصوير بالموجات فوق الصوتية. وبالتالي ، من الضروري تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية بين محول الطاقة وغطاء المسبار المعقم ، وأعلى غطاء المسبار لضمان واجهة خالية من الهواء بين مسبار الموجات فوق الصوتية والحيوان. - ضع كمية معتدلة (2-3 مل) من جل الموجات فوق الصوتية المعقم على الترجام.
ملاحظة: المستخدم جاهز الآن لتصوير ماوس مخدر.
3. تصوير وتحديد موقع الغدة الصعترية
- مع الحفاظ على العقم ، ضع مسبار الموجات فوق الصوتية المغطى بالهلام عموديا على الجزء المطهر من جدار الصدر الأمامي للماوس للتصوير الأولي.
- خذ لحظة لإلقاء نظرة على صورة الموجات فوق الصوتية وتحسينها بشكل أكبر. ارجع إلى الخطوة 2.2 واضبط للحصول على مظهر مشابه لمظهر الشكل 3.
- امسح الصدر الأمامي للماوس في مستوى عرضي. قم بذلك عن طريق إمساك محول الطاقة عموديا وتحريكه لأعلى ولأسفل من الرقبة إلى البطن بحركة تشبه فرشاة الرسم أو "كاسحة".
ملاحظة: سيكون القلب هو الهيكل الأكثر تميزا في الصدر بسبب حركته السريعة ومظهره "الحجرة". بمجرد توطين القلب ، يمكن استخدام هذا كنقطة مرجعية للحصول على صورة للغدة الصعترية. - مع تمركز القلب في مجال الرؤية ، امسح الترجام قليلا نحو الرقبة. فقط متفوقة على القلب ، وعادة ما تصادف الغدة الصعترية.
- تصور الغدة الصعترية على أنها بنية ثنائية ، هرمية ، ناقصة الصدى ("داكنة" أو "سوداء" تظهر على الشاشة) تتمركز في خط الوسط ، أمام الشريان الأورطي وخلف القص (الشكل 3 أ).
- قم بتدوين الهيكلين الأسودين الدائريين (أي "ناقص الصدى") على جانبي الجزء العلوي من الصدر.
ملاحظة: هذه هي الوريد الأجوف الثنائي. الشريان الأورطي هو بنية مماثلة لنقص الصدى المنحني في خط الوسط بين الوريدين الأجوفين. يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال حركتها النابضة.
4. حقن الغدة الصعترية
- إذا لزم الأمر ، ضع المزيد من جل الموجات فوق الصوتية المعقم (2-3 مل) على محول الطاقة.
ملاحظة: كمية كبيرة نسبيا من الجل المعقم على محول الطاقة (مقارنة بحجم صدر الفأر) ستكون بمثابة "وسادة هلام" حول جدار صدر الماوس. سيؤدي ذلك إلى تقليل عدد القطع الأثرية بالموجات فوق الصوتية التي يتم إجراؤها عن طريق الجو داخل مجال الرؤية. - باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية ، حدد موقع أوسع جزء من الغدة الصعترية ، والذي عادة ما يكون الموقع المستهدف المثالي للحقن. توقع مسار إبرة أفقي في الموقع المختار.
- لاحظ أين توجد الأوعية الدموية الرئيسية (SVCs والشريان الأورطي) في هذا الموقع. تجنب هذه أثناء الحقن.
- ستكون الأوعية الدموية هياكل نابضة بناقصة الصدى ، كما هو موضح في الخطوة 3.7. إذا لم تكن متأكدا ، فاستخدم وضع دوبلر الملون للتحقق من التدفق داخل الأوعية (الشكل 4 أ). قم بتنشيط وضع دوبلر الملون من خلال النقر على زر اللون على الشاشة.
- إذا كان من المتوقع أن يكون أحد الأوعية الدموية الرئيسية (أو القلب) على طول مسار الإبرة المتوقع ، فاختر منطقة مستهدفة جديدة أو ابحث عن نهج / مسار مختلف.
- امسك محول الطاقة بيد واحدة وإبرة أنسولين 30 جم (انظر جدول المواد) مع 10 ميكرولتر من الحقن في اليد الأخرى.
ملاحظة: سيختلف الحقن بناء على التصميم التجريبي. استخدمت الدراسة الحالية محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو تريبان أزرق أو د-لوسيفيرين (0.1 ميكروغرام / 10 ميكرولتر). - لبدء عملية الحقن ، حرك محول الطاقة بشكل جانبي بحيث تكون الغدة الصعترية خارج المركز في مجال رؤية الموجات فوق الصوتية. تأكد من أن الجانب الآخر من مجال الرؤية يتكون في الغالب من هلام الموجات فوق الصوتية ولا شيء آخر.
- ضع طرف الإبرة في الجل تحت الترجام وحرك الإبرة ببطء حتى يتم تصورها بجوار سطح الجلد (الشكل 4 ب).
- أثناء التصوير المستمر للإبرة تحت الموجات فوق الصوتية ، أدخل الإبرة في الغدة الصعترية بمسار عن طريق الجلد ، بعيدا عن الأوعية الدموية.
- استخدم مسارا أفقيا "عبر الغدة الصعترية" لوضع طرف الإبرة في الفص الصعترية مقابل موقع الدخول. هذا يفسر التسرب المحتمل على طول قناة الإبرة (الشكل 5 أ).
- بمجرد أن يكون طرف الإبرة داخل الجزء المطلوب من الغدة الصعترية ، قم بحقن المحتويات بسرعة (مثل 10 ميكرولتر من التربان الأزرق أو D-luciferin ، 0.1 ميكروغرام / 10 ميكرولتر) من حقنة 30 جم أثناء استخدام التصور بالموجات فوق الصوتية.
- لتثبيت المحقنة أثناء إدخال الإبرة وحقنها ، أمسك المحقنة بين الإبهام والإصبع الثالث وتحكم في مكبس المحقنة بإصبع السبابة.
- قم بإزالة الإبرة بعد إيداع جميع المحتويات.
5. مراقبة ما بعد الحقن للحيوانات
- نقل الحيوان إلى قفص فارغ ومراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
ملاحظة: من المتوقع أن يحدث الشفاء التام من التخدير في غضون 2 دقيقة. - راقب الحيوان لمدة 10 دقائق إضافية بحثا عن علامات الضيق أو صعوبة التنفس أو النزيف.
ملاحظة: ألم ما بعد الحقن غير متوقع ، وعادة لا توجد حاجة لتسكين ما بعد الحقن. - بمجرد الشفاء التام وبعد فترة مراقبة هادئة بعد الحقن ، أعد الحيوان المحقون إلى صحبة الحيوانات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعتمد التنفيذ الناجح لهذه التقنية على بعض الخطوات الرئيسية التي يجب اتباعها. أولا ، يجب ضمان تحديد موثوق للغدة الصعترية نفسها. في الفئران الصغيرة ، يكون هذا واضحا بسبب الحجم الكبير للغدة (الشكل 3 أ). في الفئران الأكبر سنا أو الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، يمكن أن يكون الأمر أكثر صعوبة. ومع ذلك ، فإنه لا يزال ممكنا للغاية مع معدات الموجات فوق الصوتية الحديثة (الشكل 3B ، C). ثانيا ، من المهم للغاية ضبط مسار الإبرة بحيث يتم تصورها باستمرار أثناء تقدم طرف الإبرة عبر طبقات جدار الصدر إلى الغدة الصعترية. الحقن الناجح سيكون له تصور الإبرة بالكامل أثناء تقدمها. هذا يؤكد للمشغل أن الإبرة لم تجتاز بنية حرجة ، مثل القلب أو الشريان الأورطي أو أحد الوريد الأجوف السفلي (الشكل 4). وهذا ينطبق أيضا على الحقن نفسه. يجب دائما تصور طرف الإبرة في موقعه المستهدف أثناء الحقن حتى يتم تأكيد الترسيب داخل الغدة الصعترية (الشكل 5).
توجد بعض المزالق البسيطة التي ، إذا تم التعرف عليها ، يمكن تخفيفها بسهولة نسبية. عند تثبيت الماوس في المرحلة ومخروط الأنف ، يجب أن يكون صدر الفأر محايدا قدر الإمكان (أي بدون دوران كبير لليسار أو اليمين). إذا كان هناك الكثير من دوران الصدر ، فقد لا يمكن تحقيق "زاوية الاقتراب" الصحيحة للإبرة بسهولة. أيضا ، إذا لم يتم تثبيت الماوس في مكانه بإحكام كاف ، فقد يتحرك أو ينزلق عند محاولة دفع الإبرة ، مما يؤدي إلى تشويه التشريح وجعل التصور صعبا. ومع ذلك ، مع التقنية والتحضير المناسبين ، يمكن تحقيق حقن داخل الغدة الصعترية بنجاح مع الاتساق والموثوقية والتكاثر.
بمجرد اكتمال الحقن ، هناك طرق متعددة لتأكيد موقع الحقن داخل الطعم. استخدمت الدراسة الحالية لوسيفيرين كحقن في الفئران المعدلة وراثيا لوسيفيراز. يمكن بعد ذلك تقييمها مباشرة بعد الحقن باستخدام التصوير الحيوي ، مما يؤكد الموقع الصحيح للحقن دون التضحية بالحيوان (الشكل 6 أ). تتمتع هذه التقنية بميزة إضافية تتمثل في أنه يمكن تصوير الخلايا المحقونة الموسومة باللوسيفرين في نقاط زمنية متعددة ، مما يضمن استمرار النشاط في الغدة الصعترية. بدلا من ذلك ، يمكن حقن التريبان الأزرق كعلامة مرئية لموقع الحقن ، ويمكن بعد ذلك تأكيد دقة الحقن خارج الجسم الحي باستخدام التشريح16 (الشكل 6 ب).
الشكل 1: فأر مخدر تم وضعه في مرحلة التصوير للتصوير بالموجات فوق الصوتية للغدة الصعترية. تم تخدير أنثى فأرة C57BL / 6 تبلغ من العمر 6 أسابيع مع صدر منزوع الشعر ونقلها إلى محطة التصوير. الماوس في وضع ضعيف ، مع تأمين الأرجل الممدودة بواسطة شريط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: إعدادات آلة الموجات فوق الصوتية. صورة لوحة تحكم آلة الموجات فوق الصوتية (شاشة تعمل باللمس). ستكون التعديلات الرئيسية للإعدادات لتحسين التصوير هي ضبط العمق (السهم الأحمر) والمنطقة البؤرية (محاطة بدائرة باللون الأصفر) والمكاسب (العلامة النجمية الحمراء). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التصوير بالموجات فوق الصوتية للغدة الصعترية في الفئران الشابة والمسنة ذات الكفاءة المناعية ونقص المناعة. (أ) فأر صغير ذو كفاءة مناعية (C57BL / 6 ، أنثى ، 4 أسابيع من العمر ، ن = 5). يظهر العرض العرضي بالموجات فوق الصوتية الفصين الأيمن والأيسر للغدة الصعترية (العلامات النجمية). (ب) فأر مسن مؤهل للمناعة (C57BL / 6 ، أنثى ، 6 أشهر ، ن = 5). الغدة الصعترية (النجمة) أصغر ولكنها تحافظ على موقعها النموذجي وشكلها الهرمي. (ج) فأر صغير يعاني من نقص المناعة (NOD scid gamma ، أنثى ، عمرها 4 أسابيع ، ن = 5). لاحظ الحجم الأصغر بكثير للغدة الصعترية (النجمة) مقارنة بالفأر الصغير العادي. (د) فأر عاري أثيمي (أنثى ، عمرها 8 أسابيع ، ن = 1). هناك غياب تام للأنسجة الصعترية. تجدر الإشارة إلى أن الخط الرأسي الداكن (ناقص الصدى) في منتصف الصورة (علامة النجمة) هو قطعة أثرية مظللة من القص ، مع عدم وجود نسيج زعترة حقيقي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: التحضير للحقن . (أ) توضح صورة دوبلر الملونة للصدر الأمامي علاقة الغدة الصعترية بالأوعية المنصفية. المركز السفلي هو قوس الأبهر (السهم الأحمر) ، والأوعية المستديرة على كلا الجانبين هي الوريد الأجوف الأيمن والأيسر (رؤوس الأسهم الصفراء). يتم ترميز الدم المتدفق نحو مسبار التصوير باللون الأحمر ، ويتم تشفير الدم المتدفق بعيدا عن محول الطاقة باللون الأزرق. (ب) وضع إبرة من قبل التقدم إلى الصدر من الجانب الأيسر. يجب أن يتماشى طرف الإبرة (السهم الأصفر) مع محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية ومستوى الطرف مع الجزء الأوسط من الغدة الصعترية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تقنية الحقن . (أ) وضع إبرة لحقن الفص الصعتري الأيمن لفأر صغير كفء مناعي. يقع طرف الإبرة (السهم الأصفر) في الجزء المركزي من الفص الأيمن. (ب) صورة ما بعد الحقن للفص الأيمن تظهر مجموعة من السوائل الداكنة (ناقصة الصدى) وفقاعات الهواء الصغيرة الساطعة (الصدى) في موقع الحقن (خط أحمر متقطع). يشير السهم الأصفر إلى طرف الإبرة. (ج) وضع إبرة (سهم أصفر عند طرف الإبرة) لحقن الفص الصعترية الأيسر لفأر صغير مؤهل للمناعة. (د) وضع إبرة (سهم أصفر) لحقن الفص الأيمن لفأر صغير مؤهل للمناعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التحقق من الدقة في الجسم الحي وخارج الجسم الحي. (أ) حقن D-luciferin (0.1 ميكروغرام / 10 ميكرولتر) في الغدة الصعترية لفأر لوسيفيراز المعدل وراثيا البالغ من العمر 8 أسابيع متبوعا ب 1 ثانية من تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي باستخدام نظام تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي (ن = 3). يظهر الترميز اللوني إجمالي إشعاع التلألؤ الحيوي (الفوتونات · s − 1 · سم − 2 · استراديان − 1) كما هو موضح في شريط الألوان على اليمين. (ب) تم حقن الغدة الصعترية لفأرين C57BL / 6 يبلغان من العمر 5 أسابيع بالتريبان الأزرق ، وتم إثبات دقة الحقن عن طريق التشريح (ن = 3). اللوحة العلوية: السطح الظهري لتيموس تريبان المحقون باللون الأزرق في الموقع. اللوحة السفلية: السطح البطني للغدة الصعترية الملون باللون الأزرق Trypan خارج الموقع بعد حقن الفص الأيسر. مستنسخة بإذن من Tuckett et al.1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحقن اليدوي الموجه بالموجات فوق الصوتية هو تقنية دقيقة للغاية لتوصيل مواد الدراسة إلى الغدة الصعترية بطريقة فعالة ومعقمة. بعد التعقيم الأولي للجلد في موقع الحقن ، يتم الحفاظ على العقم أثناء الإجراء بسبب استخدام قفازات معقمة وأغطية مسبار الموجات فوق الصوتية المعقمة وهلام الموجات فوق الصوتية المعقم. على عكس النهج الأعمى عن طريق الجلد10،17 أو الاعتماد على الشقوق الجراحية للتصور المباشر للغدة الصعترية18،19 ، وهي الطرق الشائعة الاستخدام للحقن داخل الغدة الصعترية في الفئران ، فإن استخدام التوجيه بالموجات فوق الصوتية اليدوية يجمع بين درجة عالية من الأمان والسرعة مع دقة هائلة في الإجراء. يوفر إجراء الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية باستخدام منصة السكك الحديدية14 مستوى مماثلا من الأمان والدقة ، ولكن هذا النهج المرهق يستغرق عادة 5 دقائق على الأقل لكل حقنة من لحظة تخدير الفأر ووضعه على منصة التصوير ، مقارنة بتقنية اليد الحرة التي تجعل من الممكن للخبير إكمال الحقن في حوالي 20-30 ثانية لكل فأر15.
تعد الخبرة والتدريب الكبيران من المتطلبات الأساسية لتحقيق مستوى عال من الكفاءة في جميع الطرق المختلفة للحقن داخل الغدة الصعترية ، بما في ذلك تقنية الحقن الحر الموجه بالموجات فوق الصوتية. ومع ذلك ، يمكن لأخصائي الأشعة الذي يتمتع بخبرة سريرية في الإجراءات الموجهة بالموجات فوق الصوتية أن يصبح بارعا في الحقن داخل الغدة الصعترية للفئران خلال جلسة تدريب لمدة 1 ساعة.
تسمح مرونة طريقة الحقن الحر للباحث بحقن فص زعترة واحد ، أو فصوص الغدة الصعترية في مسار حقن واحد ، أو كلا فصوص الغدة الصعترية في حقنتين منفصلتين ، اعتمادا على الاحتياجات التجريبية المحددة للدراسة. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام حقن فصوص الغدة الصعترية الفردية مع الدواء الوهمي مقابل مواد الدراسة كاستراتيجية لتقليل عدد موضوعات الدراسة اللازمة باستخدام الفص المحقون بالغفل كعنصر تحكم داخلي. على النقيض من ذلك ، يسمح الإعداد الصلب لنظام السكك الحديدية المتكامل بالحقن في فص زعترة واحد لكل فترة حقن. يتطلب حقن الفص الثاني فك ملحق حامل المحقنة ، وتثبيته على الجانب الخلفي من الماوس ، وضبط عناصر التحكم في المعالجة الدقيقة بعناية حتى يتم تصحيح مسار الإبرة قبل أن يستمر الحقن التالي. تزيد هذه المشكلات بشكل كبير من التعرض للتخدير والوقت اللازم لإكمال التجربة.
الميزة الفريدة لطريقة الموجات فوق الصوتية الحرة داخل الثعترية عند مقارنتها بإجراء الحقن الأعمى داخل الثعترية هي السهولة النسبية لحقن الغدة الصعترية الصغيرة بدقة مثل الغدة الصعترية للفئران الأكبر سنا (6 أشهر أو أكبر) ، والتي تكون أصغر حجما بكثير من تلك الموجودة في الفئران الأصغر سنا (4-10 أسابيع من العمر). هذه الميزة ، جنبا إلى جنب مع سهولة التوسع ، تسمح لعلماء المناعة بإجراء دراسات قائمة على الحقن داخل الثعترية في مجموعة واسعة من نماذج الفئران قبل السريرية.
في الختام ، توفر الملاحظات أدلة وافرة تدعم تقنية اليد الحرة للحقن الآمنة والسريعة والدقيقة التي تستهدف فصوص الغدة الصعترية الفردية. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة طفيفة التوغل تمثل خيارا عالي الكفاءة والدقة لأبحاث الغدة الصعترية ، مما يسهل إجراء تحقيقات قبل سريرية واسعة النطاق في الفئران ذات الغدة الصعترية التي تتراوح من كبيرة إلى صغيرة للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر ريموند ثورنتون على عمله المبكر الثاقب والشامل في هذه التقنية. تم تمويل هذه الدراسة من خلال دعم المنح من المعهد الوطني للسرطان (NCI 1R37CA250661-01A1) ، وجمعية أبحاث سرطان الدم للأطفال ، وكلية هاكنساك ميريديان للطب ، ومؤسسة HUMC / معالجة سرطان الأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
