Summary
Den nuværende protokol beskriver en interventionel radiologiprocedure, der er etableret til intrathymisk injektion i mus for at undgå risikoen for åben kirurgi og forbedre nøjagtigheden af blinde perkutane injektioner.
Abstract
Intrathymisk injektion i musemodeller er en vigtig teknik til undersøgelse af thymisk og immunfunktion, herunder genetiske og erhvervede T-celleforstyrrelser. Dette kræver metoder til direkte aflejring af reagenser og/eller celler i thymus hos levende mus. Traditionelle metoder til intrathymisk injektion omfatter thoraxkirurgi eller minimalt invasive perkutane blinde injektioner, som begge har betydelige begrænsninger. Ultrahøjfrekvente ultralydsbilleddannelsesenheder har gjort billedstyrede perkutane injektioner mulige hos mus, hvilket i høj grad forbedrer injektionsnøjagtigheden af den perkutane injektionsmetode og muliggør injektion af mindre mål. Imidlertid er billedstyrede injektioner afhængige af brugen af et integreret skinnesystem, hvilket gør dette til en stiv og tidskrævende procedure. En unik, sikker og effektiv metode til perkutane intrathymiske injektioner i mus præsenteres her, hvilket eliminerer afhængigheden af jernbanesystemet til injektioner. Teknikken er afhængig af at bruge en mikro-ultralydsenhed med høj opløsning til at afbilde musen thymus ikke-invasivt. Ved hjælp af en frihåndsteknik kan en radiolog placere en nålespids direkte i musens thymus under sonografisk vejledning. Mus rengøres og bedøves inden billeddannelse. For en erfaren radiolog, der er dygtig til ultralydsstyrede procedurer, er læringsperioden for den angivne teknik ret kort, typisk inden for en session. Metoden har en lav sygelighed og dødelighed for musene og er meget hurtigere end de nuværende mekanisk assisterede teknikker til perkutan injektion. Det giver investigator mulighed for effektivt at udføre præcise og pålidelige perkutane injektioner af thymuses af enhver størrelse (herunder meget små organer såsom thymus af ældre eller immundefekte mus) med minimal belastning på dyret. Denne metode muliggør injektion af individuelle lapper, hvis det ønskes, og letter store eksperimenter på grund af procedurens tidsbesparende karakter.
Introduction
Thymus har en væsentlig rolle i T-celleudvikling og immunitet. T-cellemangel, som blandt andet kan være forårsaget af thymisk involution, genetiske lidelser, infektioner og kræftbehandlinger, fører til høj dødelighed og sygelighed 1,2. Musemodeller er uundværlige i både grundlæggende og translationel immunologiforskning og er blevet brugt i årtier til at studere thymisk biologi og T-celleudvikling samt til at udvikle behandlinger til dem, der lider af thymisk dysfunktion og T-cellemangel 3,4,5.
En central del af thymiske undersøgelser har været intrathymisk injektion af biologiske materialer såsom celler, gener eller proteiner i musemodeller 6,7,8,9,10,11,12. Konventionelle intrathymiske injektionsmetoder bruger thorakotomi efterfulgt af intrathymisk injektion under direkte visualisering eller ved "blind" perkutan injektion i mediastinum. Den kirurgiske tilgang øger blandt andet pneumothorax-risikoen betydeligt. Desuden resulterer den forhøjede stress under denne operation i immunsuppression, hvilket potentielt kompromitterer immunologiske data13. Erfarne forskere kan efter nogen øvelse udføre den blinde injektionsteknik, men denne tilgang er mindre præcis og begrænser derfor forsøgspersoner til unge mus med en stor thymus.
Anvendelsen af ultralydsvejledning er blevet introduceret som et præcist og minimalt invasivt alternativ til traditionelle intrathymiske injektionsmetoder14. Denne procedure er imidlertid meget tidskrævende, når man bruger det integrerede skinnesystem i stedet for frihåndsteknikken. Udførelse af injektioner med injektionsbeslaget kræver omhyggelig billedoptimering og positionering af transduceren ved hjælp af de forskellige vedhæftede filer såsom transducerstativet og -holderen, X-, Y- og Z-positioneringssystemet samt dygtig betjening af mikromanipulationskontrollerne og skinnesystemudvidelserne. En simpel alternativ teknik, ultralydstyret thymisk injektion, præsenteres her udført af en radiolog ved hjælp af en frihåndstilgang15, som både er et hurtigt og præcist minimalt invasivt alternativ til de ovenfor beskrevne metoder. Det er vigtigt, at den nuværende tilgang kan udføres med ethvert ultralydsbilleddannelsessystem med høj opløsning uden behov for en injektionsmontering og integreret skinnesystem. Det er især nyttigt til undersøgelser, der kræver injektion af et stort antal mus11, til forsøg, der involverer injektion af begge thymiske lapper, eller til nøjagtig injektion af små thymuser i ældre, bestrålede eller immunkompromitterede mus12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjer for dyrepleje på Center for Discovery and Innovation (IACUC protokol 290). Til denne undersøgelse, C57BL/6 mus (hun, 4-6 uger gamle), C57BL/6 mus (hunmus, 6 måneder gamle), J:NU hunmus, NOD scid gamma (NSG) hunmus og B6; CAG-luc, -GFP-mus blev brugt som henholdsvis ung musemodel, alderen musemodel, athymisk nøgenmodel, immunomangelfuld model og bioluminescenscellekilde. Musene blev hentet fra en kommerciel kilde (se Materialetabel). Denne procedure vil typisk kræve to personer (en til at forblive steril, mens injektionerne udføres, og en anden til at håndtere musene).
1. Tilberedning af dyr
- Inducer anæstesi hos musene ved hjælp af 3% -4% isoflurangas og oprethold anæstesi ved hjælp af 1% -3% isoflurangas administreret via en næsekegle og præcisionskalibreret fordamper (se Materialetabel).
- Bekræft den passende bedøvelsesdybde/bevidstløshed ved ikke at reagere på bagpoteklemmen.
- Fjern pelsen fra musenes forreste brystområde ved at påføre et tyndt lag hårfjerningscreme i mindre end 1 min. Brug et vådt køkkenrulle til at fjerne cremen helt sammen med den løse pels.
BEMÆRK: Påføring af for meget creme vil resultere i, at brystområdets hud bliver betændt. - Placer en mus ad gangen, liggende, på den opvarmede platform på ultralydsbilledstationen til små dyr (se Materialetabel) med næsekeglen på plads (figur 1).
- Fastgør musen til scenen med medicinsk tape ved bag- og forben (figur 1).
- Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre hornhindetørring.
- Desinficer den pelsfri øvre thoraxhud ved hjælp af en chlorhexidingluconatapplikator (se Materialetabel).
2. Forberedelse af ultralydsmaskinen og sterilfeltet
- Aktiver den højeste tilgængelige lineære sonde, typisk sonden med den højeste rumlige opløsning for størrelsen på det dyr, der afbildes. Aktivér sonden ved at trykke på den tilsvarende knap efter startskærmen.
BEMÆRK: Til denne anvendelse med mus er den anvendte sonde designet specielt til brug med mus og små rotter (se Materialetabel). - Optimer ultralydsindstillingerne til billeddannelse og injektion ved at følge nedenstående trin.
- Synsfeltets dybde justeres til en passende størrelse for måldyret ved at justere de lodret orienterede skydere i højre side af skærmen (figur 2). Den maksimale dybdeindstilling vil typisk være omkring 6-8 mm for unge mus.
- Juster gråtoneforstærkningen ved at skubbe knappen langs den vandrette bjælke nederst på skærmen (figur 2). Målet er at starte med et billede, der bare er lidt mørkere end et typisk "gråt" udseende.
- Juster fokuszonen (blå pil til højre på skærmen, figur 2) til det forventede niveau af thymus. For unge mus vil dette være omkring en dybde på 4 mm.
- Hvis billedoptagelse ønskes, skal du teste funktionaliteten af butiksbilledet og gemme klipknapperne for at sikre, at billederne kan gemmes korrekt under hele proceduren. Udfør dette ved at trykke på knappen Gem klip nederst til højre på skærmen eller ved at trykke på knappen Frys og derefter trykke på Gem billede (Figur 2).
- Påfør en lille mængde (~ 1 ml) ultralydsgel på transduceroverfladen (se Materialetabel), mens den er oprejst, enten hvilende i ultralydsmaskinholderen eller i hænderne på en assistent.
- Forbered et lille sterilt felt ved siden af den opvarmede platform. Den optimale positionering til dette er normalt mellem platformen og ultralydsmaskinen.
- Tøm disse genstande på det sterile felt: et sterilt sondedæksel, elastik, sterile handsker og steril ultralydsgel (se Materialetabel).
- Når det sterile felt er sat op, og genstande på plads, skal du tage de sterile handsker på.
- Placer forsigtigt det sterile sondedæksel over ultralydstransduceren (såvel som over gelen, der oprindeligt blev anbragt på sonden). Oprethold sterilitet og rør kun ved det sterile dæksel, intet andet. Skub det sterile gummibånd over det sterile sondedæksel for at holde det på plads.
BEMÆRK: Air foci, uanset størrelse, kan forstyrre ultralydsbilleddannelse. Derfor er det vigtigt at anvende ultralydgelen mellem transduceren og sterilt sondedæksel og oven på sondedækslet for at sikre en luftfri grænseflade mellem ultralydssonden og dyret. - Anbring en moderat mængde (2-3 ml) steril ultralydsgel på transduceren.
BEMÆRK: Brugeren er nu klar til at afbilde en bedøvet mus.
3. Billeddannelse og lokalisering af thymus
- Mens du opretholder sterilitet, skal du placere ultralydssonden lodret på den desinficerede del af musens forreste brystvæg til indledende billeddannelse.
- Brug et øjeblik på at se på ultralydsbilledet og optimere det yderligere. Gå tilbage til trin 2.2, og juster for at få et udseende, der ligner det i figur 3.
- Scan musens forreste bryst i et tværgående plan. Udfør dette ved at holde transduceren lodret og bevæge den op og ned fra halsen til maven i en pensellignende eller "fejende" bevægelse.
BEMÆRK: Hjertet vil være den mest genkendelige struktur i brystet på grund af dets hurtige bevægelse og "kammer" udseende. Når hjertet er lokaliseret, kan dette bruges som et referencepunkt for at erhverve et billede af thymus. - Med hjertet centreret i synsfeltet skal du feje transduceren lidt mod nakken. Bare bedre end hjertet, er thymus normalt stødt på.
- Visualiser thymus som en bilobed, pyramideformet, hypoechoisk ("mørk" eller "sort", der vises på skærmen) struktur, der er centreret i midterlinjen, anterior til aorta og bageste til brystbenet (figur 3A).
- Noter de to runde parrede sorte (dvs. "hypoechoiske") strukturer på hver side af det øvre bryst.
BEMÆRK: Dette er den bilaterale venae cavae. Aorta er en lignende krøllet hypoechoisk struktur i midterlinjen mellem de to venae cavae. Disse er let genkendelige ved deres pulserende bevægelse.
4. Injektion af thymus
- Påfør om nødvendigt mere (2-3 ml) steril ultralydsgel på transduceren.
BEMÆRK: En relativt stor mængde steril gel på transduceren (sammenlignet med størrelsen på musens thorax) vil fungere som en "gelpude" omkring musens brystvæg. Dette vil reducere antallet af ultralydartefakter fremstillet af luft inden for synsfeltet. - Brug ultralydssonden til at lokalisere den bredeste del af thymus, som normalt er det ideelle målsted for injektion. Forvent en vandret nålebane på det valgte sted.
- Bemærk, hvor de store blodkar (SVC'er og aorta) er placeret på dette sted. Undgå disse under injektionen.
- Blodkarrene vil være hypoechoiske, pulsatile strukturer, som beskrevet i trin 3.7. Hvis du er usikker, skal du bruge farvedopplertilstanden til at kontrollere, om der er flow i beholderne (figur 4A). Aktivér farvedopplertilstanden ved at trykke på knappen Farve på skærmen.
- Hvis et af de store blodkar (eller hjertet) forventes at være langs den forventede nålebane, skal du vælge et nyt målområde eller finde en anden tilgang / bane.
- Hold transduceren i den ene hånd og en 30 G insulinnål (se Materialetabel) med 10 μL injektion i den anden.
BEMÆRK: Injektionen varierer afhængigt af det eksperimentelle design. Denne undersøgelse anvendte fosfatbufferet saltvand, trypanblå eller D-luciferin (0,1 μg/10 μL). - For at starte injektionsprocessen skal du flytte transduceren sideværts, så thymus er off-center i ultralydsfeltet. Sørg for, at den anden side af synsfeltet består af for det meste ultralydsgel og intet andet.
- Placer spidsen af nålen i gelen under transduceren, og flyt langsomt nålen, indtil den visualiseres ved siden af hudoverfladen (figur 4B).
- Mens du kontinuerligt billeddanner nålen under ultralyd, skal du indsætte nålen i thymuskirtlen med en perkutan bane væk fra blodkar.
- Brug en "cross thymus" vandret bane til at placere nålespidsen i den thymiske lap i modsætning til indgangsstedet. Dette tegner sig for potentiel lækage langs nålekanalen (figur 5A).
- Når nålespidsen er inde i den ønskede del af thymusen, injiceres hurtigt indholdet (såsom 10 μL trypanblå eller D-luciferin, 0,1 μg/10 μL) fra 30 G-sprøjten, mens du bruger sonografisk visualisering.
- For at stabilisere sprøjten under nåleindsættelse og injektion skal du holde sprøjten mellem tommelfingeren og den tredje finger og styre sprøjtestemplet med pegefingeren.
- Fjern nålen, når alt indholdet er deponeret.
5. Overvågning af dyr efter injektion
- Overfør dyret til et tomt bur og observer, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
BEMÆRK: Fuld genopretning fra anæstesi forventes at forekomme inden for 2 min. - Overvåg dyret i yderligere 10 minutter for tegn på nød, besværet vejrtrækning eller blødning.
BEMÆRK: Smerter efter injektion forventes ikke, og der er typisk ikke behov for analgesi efter injektion. - Når det er kommet sig helt og efter en begivenhedsløs observationsperiode efter injektionen, returneres det injicerede dyr til selskab med andre dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede implementering af denne teknik afhænger af et par vigtige trin, der skal følges. For det første skal der sikres pålidelig identifikation af selve thymuskirtlen. Hos unge mus er dette ligetil på grund af kirtlens store størrelse (figur 3A). Hos ældre mus eller immundefekte mus kan det være mere udfordrende; det er dog stadig meget muligt med moderne ultralydsudstyr (figur 3B, C). For det andet er det kritisk vigtigt at indstille nålebanen, så den vil blive visualiseret kontinuerligt under udviklingen af nålespidsen gennem brystvægslagene og ind i thymus. En vellykket injektion vil få nålen visualiseret helt, mens den bliver avanceret. Dette forsikrer operatøren om, at nålen ikke har krydset en kritisk struktur, såsom hjertet, aorta eller en af de ringere venae cavae (figur 4). Dette gælder også for selve injektionen. Nålespidsen skal altid visualiseres på målstedet under injektionen, så den intrathymiske aflejring bekræftes (figur 5).
Der findes nogle mindre faldgruber, som, hvis de anerkendes, kan afbødes relativt let. Når musen fastgøres til scenen og næsekeglen, skal musens brystkasse gøres så neutral som muligt (dvs. uden signifikant venstre- eller højrerotation). Hvis der er for meget rotation af brystkassen, er den korrekte "tilgangsvinkel" af nålen muligvis ikke let opnåelig. Hvis musen ikke er fastgjort på plads tæt nok, kan den også bevæge sig eller glide, når den forsøger at fremme nålen, forvrænge anatomien og gøre visualisering vanskelig. Men med korrekt teknik og forberedelse kan en vellykket intrathymisk injektion opnås med konsistens, pålidelighed og reproducerbarhed.
Når injektionen er afsluttet, er der flere måder at bekræfte injektionens intrathymiske placering på. Den nuværende undersøgelse anvendte luciferin som et injektionsmiddel i luciferase transgene mus. Disse kan derefter evalueres umiddelbart efter injektionen med bioluminescensbilleddannelse, hvilket bekræfter injektionens korrekte placering uden at ofre dyret (figur 6A). Denne teknik har den ekstra fordel, at injicerede luciferin-mærkede celler kan afbildes på flere tidspunkter, hvilket sikrer persistensen af aktivitet i thymus. Alternativt kan trypan blue injiceres som en visuel markør for injektionsstedet, og injektionsnøjagtigheden kan derefter bekræftes ex vivo med obduktion16 (figur 6B).
Figur 1: Anæstetiseret mus placeret på billeddannelsesstadiet til ultralyd af thymus. En 6 uger gammel kvindelig C57BL/6 mus med et depileret bryst blev bedøvet og overført til billeddannelsesstationen. Musen er i liggende stilling, med de udstrakte ben fastgjort med tape. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ultralydsmaskineindstillinger. Billede af ultralydsmaskinens kontrolpanel (berøringsskærm). De vigtigste justeringer af indstillingerne for at optimere billeddannelsen vil være justering af dybden (rød pil), fokuszonen (cirklet i gul) og gevinsterne (rød stjerne). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ultralydsbilleddannelse af thymus hos immunkompetente og immundefekte unge og ældre mus. (A) Immunkompetent ung mus (C57BL/6, hun, 4 uger gammel, n = 5). Den tværgående sonografiske visning viser thymusens højre og venstre lobes (stjerner). (B) Immunkompetent ældre mus (C57BL/6, hun, 6 måneder gammel, n = 5). Thymus (stjerne) er mindre, men bevarer sin typiske placering og pyramideform. (C) Immundefekt ung mus (NOD scid gamma, hun, 4 uger gammel, n = 5). Bemærk den meget mindre størrelse af thymus (stjerne) sammenlignet med den normale unge mus. (D) Attymisk nøgen mus (hun, 8 uger gammel, n = 1). Der er et fuldstændigt fravær af thymisk væv. Bemærk, at den mørke (hypoechoiske) lodrette linje i midten af billedet (stjerne) er en skyggende artefakt fra brystbenet uden ægte thymisk væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Forberedelse til injektion . (A) Farvedopplerbillede af den forreste brystkasse viser thymusens forhold til de mediastinale kar. Det nederste centrum er aortabuen (rød pil), og de afrundede kar på begge sider er højre og venstre overlegne venae cavae (gule pilespidser). Blod, der strømmer mod billeddannelsessonden, er kodet i rødt, og blod, der strømmer væk fra transduceren, er kodet i blåt. (B) Nåleplacering fra før avancement i brystet fra en venstresidet tilgang. Nålespidsen (gul pil) skal være på linje med ultralydstransduceren og spidsniveauet med den midterste del af thymus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Injektionsteknik . (A) Nåleplacering til injektion af højre thymiske lap af en immunkompetent ung mus. Nålespidsen (gul pil) er i den centrale del af højre lap. (B) Billede efter injektion af højre lap, der viser en samling mørke (hypoechoiske) væsker og små lyse (ekkogene) luftbobler på injektionsstedet (stiplet rød linje). Den gule pil angiver nålespidsen. (C) Nåleplacering (gul pil ved nålespidsen) til injektion af venstre thymiske lap af en immunkompetent ung mus. (D) Nåleplacering (gul pil) til injektion af højre lap af en immunkompetent ung mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: In vivo og ex vivo verifikation af nøjagtighed. (A) Injektion af D-luciferin (0,1 μg/10 μL) i thymus af en 8 uger gammel luciferase transgen mus efterfulgt af 1 s in vivo bioluminescensbilleddannelse ved hjælp af et in vivo bioluminescensbilleddannelsessystem (n = 3). Farvekodningen viser den samlede bioluminescensudstråling (fotoner·s-1·cm−2·steradian−1) som angivet med farvebjælken til højre. (B) Thymus fra to 5 uger gamle C57BL/6-mus blev injiceret med trypanblå, og injektionsnøjagtigheden blev påvist ved obduktion (n = 3). Toppanel: Dorsal overflade af en Trypan Blue-farvet injiceret thymus in situ. Bundpanel: Ventral overflade af en Trypan Blue-farvet thymus ex situ efter injektion af venstre lap. Gengivet med tilladelse fra Tuckett et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ultralydstyret frihåndsinjektion er en meget nøjagtig teknik til levering af studiematerialer til thymus på en effektiv og aseptisk måde. Efter den indledende sterilisering af huden på injektionsstedet opretholdes steriliteten under proceduren på grund af brugen af sterile handsker, sterile ultralydssondedæksler og steril ultralydsgel. I modsætning til den blinde perkutane tilgang 10,17 eller afhængig af kirurgiske snit til direkte visualisering af thymus18,19, som er de almindeligt anvendte metoder til intrathymiske injektioner hos mus, kombinerer brug af frihånds ultralydsvejledning en høj grad af sikkerhed og hurtighed med enorm præcision af proceduren. Udførelse af ultralydsstyrede injektioner ved hjælp af skinneplatformen14 giver et lignende niveau af sikkerhed og nøjagtighed, men denne besværlige tilgang tager typisk mindst 5 minutter pr. injektion fra det øjeblik, musen er blevet bedøvet og placeret på billedplatformen sammenlignet med frihåndsteknikken, der gør det muligt for en ekspert at gennemføre injektioner i omkring 20-30 s pr. Mus15.
Betydelig erfaring og træning er forudsætninger for at opnå et højt færdighedsniveau i alle de forskellige metoder til intrathymisk injektion, herunder ultralydstyret frihåndsinjektionsteknik. Imidlertid kan en radiolog med klinisk erfaring i ultralydsstyrede procedurer blive dygtig til intrathymisk injektion af mus inden for en 1 times øvelsessession.
Fleksibiliteten i frihåndsinjektionsmetoden gør det muligt for investigator at injicere enten en thymisk lap, begge thymiske lapper i et injektionspas eller begge thymiske lapper i to separate injektioner afhængigt af undersøgelsens specifikke eksperimentelle behov. Det skal bemærkes, at injektion af individuelle thymiske lober med placebo versus undersøgelsesmateriale kan bruges som en strategi til at reducere antallet af forsøgspersoner, der er nødvendige ved at bruge den placeboinjicerede lap som en intern kontrol. I modsætning hertil tillader den stive opsætning af det integrerede skinnesystem injektion i en thymisk lap pr. Injektionsperiode. Injektion af en anden lap ville kræve afmontering af sprøjteholderens fastgørelse, installation på bagsiden af musen og omhyggeligt justering af mikromanipulationskontrollerne, indtil nålens bane er korrekt, før den næste injektion kan fortsætte. Disse problemer øger anæstesieksponeringen betydeligt og den tid, der er nødvendig for at gennemføre eksperimentet.
En unik fordel ved den frie hånd ultralyd intrathymiske metode sammenlignet med den blinde intrathymiske injektionsprocedure er den relative lethed ved nøjagtigt at injicere små thymuses såsom thymuses af ældre mus (6 måneder eller ældre), som er meget mindre i størrelse end hos yngre mus (4-10 uger gamle). Denne fordel kombineret med den lette opskalering gør det muligt for immunologer at udføre intrathymiske injektionsbaserede undersøgelser i en lang række prækliniske musemodeller.
Afslutningsvis giver observationerne rigelig dokumentation, der understøtter frihåndsteknikken til sikre, hurtige og præcise injektioner rettet mod individuelle thymiske lapper. Denne minimalt invasive metode repræsenterer derfor en yderst effektiv og præcis mulighed for thymusforskning, hvilket letter storskala prækliniske undersøgelser hos mus med thymuses, der spænder fra store til ekstremt små.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Raymond H. Thornton for hans indsigtsfulde og omfattende tidlige arbejde med denne teknik. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children's Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine og HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
