Summary
Настоящий протокол описывает интервенционную радиологическую процедуру, установленную для внутриутимической инъекции мышам, чтобы избежать риска открытой операции и повысить точность слепых чрескожных инъекций.
Abstract
Интратермическая инъекция в мышиные модели является важным методом изучения тимической и иммунной функции, включая генетические и приобретенные Т-клеточные расстройства. Для этого требуются методы прямого осаждения реагентов и/или клеток в тимус живых мышей. Традиционные методы интратимических инъекций включают торакальную хирургию или минимально инвазивные чрескожные слепые инъекции, оба из которых имеют значительные ограничения. Сверхвысокочастотные ультразвуковые устройства визуализации сделали возможными чрескожные инъекции с визуальным контролем у мышей, значительно повысив точность инъекций чрескожного инъекционного подхода и позволив впрыскивать меньшие мишени. Тем не менее, инъекции с визуальным управлением полагаются на использование интегрированной железнодорожной системы, что делает эту процедуру жесткой и трудоемкой. Здесь представлен уникальный, безопасный и эффективный метод чрескожных внутриутомных инъекций у мышей, исключающий зависимость от рельсовой системы для инъекций. Метод основан на использовании микрозвукового блока высокого разрешения для неинвазивного изображения тимуса мыши. Используя технику свободной руки, радиолог может поместить кончик иглы непосредственно в тимус мыши под сонографическим руководством. Мышей очищают и анестезируют перед визуализацией. Для опытного радиолога, специалиста по ультразвуковым процедурам, период обучения заявленной методике довольно короткий, как правило, в течение одного сеанса. Метод имеет низкий уровень заболеваемости и смертности для мышей и намного быстрее, чем современные методы механической помощи для чрескожной инъекции. Это позволяет исследователю эффективно выполнять точные и надежные чрескожные инъекции тимуса любого размера (включая очень маленькие органы, такие как тимус пожилых или иммунодефицитных мышей) с минимальной нагрузкой на животное. Этот метод позволяет при желании вводить отдельные доли и облегчает крупномасштабные эксперименты благодаря экономящему времени характеру процедуры.
Introduction
Тимус играет важную роль в развитии Т-клеток и иммунитета. Дефицит Т-клеток, который может быть вызван инволюцией тимуса, генетическими нарушениями, инфекциями и лечением рака, среди других факторов, приводит к высокой смертности и заболеваемости 1,2. Мышиные модели незаменимы как в фундаментальных, так и в трансляционных иммунологических исследованиях и используются в течение десятилетий для изучения биологии тимуса и развития Т-клеток, а также для разработки методов лечения для тех, кто страдает от дисфункции тимуса и дефицита Т-клеток 3,4,5.
Центральной частью исследований тимуса была внутритиремическая инъекция биологических материалов, таких как клетки, гены или белки в мышиных моделях 6,7,8,9,10,11,12. Обычные методы интратимических инъекций используют торакотомию с последующей внутриутимической инъекцией под прямой визуализацией или «слепой» чрескожной инъекцией в средостение. Хирургический подход значительно увеличивает риск пневмоторакса, среди прочих. Кроме того, повышенный стресс во время этой операции приводит к иммуносупрессии, что потенциально ставит под угрозу иммунологические данные13. Опытные исследователи, после некоторой практики, могут выполнить технику слепой инъекции, но такой подход менее точен и, следовательно, ограничивает подопытных молодыми мышами с большим тимусом.
Использование ультразвукового наведения было введено в качестве точной и минимально инвазивной альтернативы традиционным интратермическим инъекционным подходам14. Однако эта процедура очень трудоемка при использовании интегрированной рельсовой системы вместо техники свободной руки. Выполнение инъекций с помощью инжекторного крепления требует тщательной оптимизации изображения и позиционирования датчика с помощью различных приспособлений, таких как стойка и крепление преобразователя, система позиционирования X, Y и Z, а также умелое управление микроманипуляторами и расширения рельсовой системы. Здесь представлена простая альтернативная методика, ультразвуковая инъекция тимуса, выполняемая рентгенологом с использованием подхода15 от руки, который является одновременно быстрой и точной минимально инвазивной альтернативой вышеописанным методам. Важно отметить, что нынешний подход может быть выполнен с любой системой ультразвуковой визуализации высокого разрешения без необходимости установки для инъекций и интегрированной рельсовой системы. Он особенно полезен для исследований, требующих инъекции большого числа мышей11, для экспериментов, включающих инъекцию обеих долей тимуса, или для точной инъекции небольших тимусов у пожилых, облученных или иммунокомпрометированных мышей12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными в Центре открытий и инноваций (протокол IACUC 290). Для настоящего исследования мыши C57BL/6 (самки, 4-6 недель), мыши C57BL/6 (самка, 6 месяцев), самки мышей J:NU, самки мышей NOD scid gamma (NSG) и B6; Мыши CAG-luc, -GFP использовались в качестве модели молодой мыши, модели стареющей мыши, атимической модели обнаженной натуры, иммунодефицитной модели и источника биолюминесцентных клеток соответственно. Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Эта процедура обычно требует двух человек (один должен оставаться стерильным во время выполнения инъекций, а другой - для обработки мышей).
1. Подготовка животных
- Индуцировать анестезию у мышей с использованием 3%-4% изофлуранового газа и поддерживать анестезию с использованием 1%-3% изофлуранового газа, вводимого через носовой конус и точно откалиброванный испаритель (см. Таблицу материалов).
- Подтвердите соответствующую анестезирующую глубину/бессознательность невосприимчивостью к защемлению задней лапы.
- Удалите мех из передней части грудной клетки мышей, нанеся тонкий слой крема для депиляции менее чем на 1 минуту. Используйте влажное бумажное полотенце, чтобы полностью удалить крем вместе с рыхлым мехом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение слишком большого количества крема приведет к воспалению кожи в области груди. - Поместите по одной мыши за раз, лежа на спине, на нагретой платформе станции ультразвуковой визуализации мелких животных (см. Таблицу материалов) с носовым конусом на месте (рисунок 1).
- Закрепите мышь на сцене с помощью медицинской клейкой ленты на задней и передней конечностях (рисунок 1).
- Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Продезинфицируйте кожу верхней части грудной клетки без меха с помощью аппликатора хлоргексидина глюконата (см. Таблицу материалов).
2. Подготовка ультразвукового аппарата и стерильного поля
- Активируйте самый высокочастотный линейный зонд, как правило, зонд с самым высоким пространственным разрешением для размера изображения животного. Активируйте зонд, нажав соответствующую кнопку после экрана запуска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого применения с мышами используемый зонд разработан специально для использования с мышами и маленькими крысами (см. Таблицу материалов). - Оптимизируйте настройки ультразвука для визуализации и инъекций, выполнив следующие действия.
- Отрегулируйте глубину поля зрения до размера, соответствующего целевому животному, отрегулировав вертикально ориентированные ползунки в правой части экрана (рисунок 2). Максимальная установка глубины обычно составляет около 6-8 мм для молодых мышей.
- Отрегулируйте усиление оттенков серого, переместив кнопку вдоль горизонтальной полосы в нижней части экрана (рисунок 2). Цель состоит в том, чтобы начать с изображения, которое немного темнее, чем типичный «серый» внешний вид.
- Отрегулируйте фокусную зону (синяя стрелка справа от экрана, рисунок 2) до ожидаемого уровня тимуса. Для молодых мышей это будет около 4 мм глубины.
- Если требуется захват изображения, проверьте функциональность кнопок «Сохранить изображение » и «Сохранить клип », чтобы убедиться, что изображения могут быть надлежащим образом сохранены на протяжении всей процедуры. Выполните это, нажав кнопку Save Clip (Сохранить клип) в правом нижнем углу экрана или нажав кнопку Freeze (Заморозить ), а затем нажав Save Image (рисунок 2).
- Нанесите небольшое количество (~1 мл) ультразвукового геля на поверхность преобразователя (см. Таблицу материалов), пока он находится в вертикальном положении, либо в держателе ультразвукового аппарата, либо в руках помощника.
- Подготовьте небольшое стерильное поле рядом с отапливаемой платформой. Оптимальное позиционирование для этого обычно находится между платформой и ультразвуковым аппаратом.
- Опорожните эти предметы на стерильное поле: стерильную крышку зонда, резинку, стерильные перчатки и стерильный ультразвуковой гель (см. Таблицу материалов).
- Установив стерильное поле и поставив предметы на место, наденьте стерильные перчатки.
- Осторожно поместите стерильную крышку зонда на ультразвуковой преобразователь (а также на гель, который изначально был помещен на зонд). Сохраняйте стерильность и прикасайтесь только к стерильному чехлу, больше ничего. Сдвиньте стерильную резинку на стерильную крышку зонда, чтобы удержать ее на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушные очаги, независимо от размера, могут мешать ультразвуковой визуализации. Следовательно, важно наносить ультразвуковой гель между датчиком и стерильной крышкой зонда, а также поверх крышки зонда, чтобы обеспечить безвоздушный интерфейс между ультразвуковым зондом и животным. - Поместите умеренное количество (2-3 мл) стерильного ультразвукового геля на датчик.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь пользователь готов к созданию изображения анестезированной мыши.
3. Визуализация и определение местоположения тимуса
- Сохраняя стерильность, поместите ультразвуковой гелеобразный зонд вертикально на продезинфицированную часть передней грудной стенки мыши для первоначальной визуализации.
- Найдите минутку, чтобы посмотреть на ультразвуковое изображение и оптимизировать его дальше. Вернитесь к шагу 2.2 и настройте его, чтобы получить внешний вид, аналогичный тому, который показан на рисунке 3.
- Сканируйте переднюю грудную клетку мыши в поперечной плоскости. Выполните это, удерживая датчик вертикально и перемещая его вверх и вниз от шеи к животу кистью или «размашистым» движением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце будет самой узнаваемой структурой в грудной клетке благодаря ее быстрому движению и «камерному» виду. Как только сердце локализовано, это может быть использовано в качестве ориентира для получения изображения тимуса. - С сердцем, сосредоточенным в поле зрения, проведите датчик немного к шее. Просто превосходя сердце, тимус обычно встречается.
- Визуализируйте тимус как двулопастную, пирамидальную, гипоэховую («темную» или «черную», появляющуюся на экране) структуру, которая центрирована по средней линии, передней к аорте и задней части грудины (рисунок 3А).
- Обратите внимание на две круглые парные черные (то есть «гипоэхогенные») структуры по обе стороны верхней части груди.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это двусторонние venae cavae. Аорта представляет собой аналогичную криволинейную гипоэховую структуру в средней линии между двумя венами. Их легко узнать по пульсирующим движениям.
4. Инъекция тимуса
- При необходимости нанесите на датчик больше (2-3 мл) стерильного ультразвукового геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно большое количество стерильного геля на преобразователе (по сравнению с размером грудной клетки мыши) будет действовать как «гелевая прокладка» вокруг грудной стенки мыши. Это уменьшит количество ультразвуковых артефактов, сделанных воздухом в поле зрения. - Используя ультразвуковой зонд, найдите самую широкую часть тимуса, которая обычно является идеальным целевым местом для инъекции. Предугадывайте горизонтальную траекторию иглы в выбранном месте.
- Обратите внимание, где основные кровеносные сосуды (SVC и aorta) расположены в этом месте. Избегайте их во время инъекции.
- Кровеносные сосуды будут гипоэхогенными, пульсирующими структурами, как описано в шаге 3.7. Если вы не уверены, используйте цветовой доплеровский режим для проверки потока внутри сосудов (рисунок 4A). Активируйте цветовой доплеровский режим, нажав кнопку «Цвет» на экране.
- Если ожидается, что один из основных кровеносных сосудов (или сердце) будет находиться вдоль ожидаемой траектории иглы, выберите новую целевую область или найдите другой подход / траекторию.
- Держите датчик в одной руке и иглу инсулина 30 г (см. Таблицу материалов) с 10 мкл инъекционного введения в другой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция будет варьироваться в зависимости от экспериментальной конструкции. В настоящем исследовании использовали фосфатно-буферный физиологический раствор, трипан синий или D-люциферин (0,1 мкг/10 мкл). - Чтобы начать процесс инъекции, переместите преобразователь в боковом направлении так, чтобы тимус находился вне центра в ультразвуковом поле зрения. Убедитесь, что другая сторона поля зрения состоит в основном из ультразвукового геля и ничего больше.
- Поместите кончик иглы в гель под датчик и медленно перемещайте иглу, пока она не будет визуализирована рядом с поверхностью кожи (рисунок 4B).
- При непрерывной визуализации иглы под ультразвуком вставьте иглу в вилочковую железу с чрескожной траекторией, вдали от кровеносных сосудов.
- Используйте горизонтальную траекторию «поперечного тимуса», чтобы поместить кончик иглы в глоток тимуса, противоположный месту входа. Это объясняет потенциальную утечку вдоль игольчатого тракта (рисунок 5А).
- Как только кончик иглы окажется внутри желаемой части тимуса, быстро введите содержимое (например, 10 мкл трипан-синего или D-люциферина, 0,1 мкг/10 мкл) из шприца 30 г с использованием сонографической визуализации.
- Чтобы стабилизировать шприц во время введения и инъекции иглы, держите шприц между большим и третьим пальцами и управляйте плунжером шприца указательным пальцем.
- Извлеките иглу после того, как все содержимое будет отложено.
5. Постинъекционный мониторинг животных
- Переведите животное в пустую клетку и наблюдайте, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полное восстановление после анестезии ожидается в течение 2 минут. - Наблюдайте за животным в течение дополнительных 10 минут на наличие признаков дистресса, затрудненного дыхания или кровотечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Боль после инъекции не ожидается, и, как правило, нет необходимости в послеинъекционной анальгезии. - После полного выздоровления и после периода наблюдения после инъекции верните введенное животное в компанию других животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная реализация этого метода зависит от нескольких ключевых шагов, которые необходимо выполнить. Во-первых, должна быть обеспечена достоверная идентификация самой вилочковой железы. У молодых мышей это просто из-за большого размера железы (рисунок 3A). У старых мышей или иммунодефицитных мышей это может быть более сложной задачей; тем не менее, это все еще очень осуществимо с современным ультразвуковым оборудованием (рисунок 3B, C). Во-вторых, критически важно установить траекторию иглы, чтобы она визуализировалась непрерывно во время продвижения кончика иглы через слои грудной стенки и в тимус. Успешная инъекция будет полностью визуализировать иглу, пока она продвигается. Это гарантирует оператору, что игла не прошла критическую структуру, такую как сердце, аорта или одна из нижних вен (рисунок 4). Это касается и самой инъекции. Кончик иглы всегда должен быть визуализирован в его целевом месте во время инъекции, чтобы подтвердилось внутриутимическое отложение (рисунок 5).
Существуют некоторые незначительные подводные камни, которые, если их признать, можно относительно легко смягчить. При закреплении мыши на стадии и носовом конусе грудную клетку мыши необходимо сделать максимально нейтральной (т.е. без значительного поворота влево или вправо). Если происходит слишком большое вращение грудной клетки, правильный «угол приближения» иглы может быть нелегко достижим. Кроме того, если мышь не закреплена на месте достаточно плотно, она может двигаться или скользить при попытке продвинуть иглу, искажая анатомию и затрудняя визуализацию. Однако при правильной технике и подготовке успешная внутриутимическая инъекция может быть достигнута с последовательностью, надежностью и воспроизводимостью.
Как только инъекция завершена, существует несколько способов подтверждения внутриутимического местоположения инъекции. Настоящее исследование использовало люциферин в качестве инъекции в трансгенных мышей люциферазы. Затем они могут быть оценены сразу после инъекции с помощью биолюминесцентной визуализации, подтверждающей правильное местоположение инъекции без ущерба для животного (рисунок 6А). Этот метод имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что введенные клетки, помеченные люциферином, могут быть визуализированы в нескольких временных точках, обеспечивая сохранение активности в тимусе. Альтернативно, трипан синий может быть введен в качестве визуального маркера места инъекции, и точность инъекции затем может быть подтверждена ex vivo с помощью некропсии16 (фиг.6B).
Рисунок 1: Анестезированная мышь, расположенная на стадии визуализации для ультрасонографии тимуса. 6-недельная самка мыши C57BL/6 с депилированной грудной клеткой была анестезирована и переведена на станцию визуализации. Мышь находится в положении лежа, с вытянутыми ногами, закрепленными скотчем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройки ультразвукового аппарата. Изображение панели управления ультразвукового аппарата (сенсорный экран). Основными корректировками настроек для оптимизации изображения будут регулировка глубины (красная стрелка), фокусной зоны (обведена желтым цветом) и усиления (красная звездочка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ультразвуковая визуализация тимуса у иммунокомпетентных и иммунодефицитных молодых и пожилых мышей. (А) Иммунокомпетентная молодая мышь (C57BL/6, самка, 4 недели, n = 5). На поперечном сонографическом виде показаны правая и левая доли тимуса (звездочки). (B) Иммунокомпетентная мышь пожилого возраста (C57BL/6, самка, 6 месяцев, n = 5). Тимус (звездочка) меньше, но сохраняет свое типичное расположение и пирамидальную форму. (C) Иммунодефицитная молодая мышь (NOD scid gamma, самка, 4 недели, n = 5). Обратите внимание на гораздо меньший размер тимуса (звездочки) по сравнению с обычной молодой мышью. (D) Атимическая обнаженная мышь (самка, 8 недель, n = 1). Наблюдается полное отсутствие ткани тимуса. Следует отметить, что темная (гипоэховая) вертикальная линия в середине изображения (звездочка) представляет собой затеняющий артефакт из грудины, без истинной ткани тимуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Подготовка к инъекции. (А) Цветное допплеровское изображение передней грудной клетки демонстрирует связь тимуса с сосудами средостения. Нижний центр представляет собой дугу аорты (красная стрелка), а округлые сосуды с обеих сторон являются правыми и левыми верхними венами (желтые наконечники стрел). Кровь, текущая к зонду визуализации, кодируется красным цветом, а кровь, вытекающая из датчика, кодируется синим. (B) Установка иглы до продвижения в грудную клетку с левостороннего подхода. Кончик иглы (желтая стрелка) должен быть на одной линии с ультразвуковым преобразователем, а кончик на уровне со средней частью тимуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Техника инъекций. (А) Установка иглы для инъекции правой доли тимуса иммунокомпетентной молодой мыши. Кончик иглы (желтая стрелка) находится в центральной части правой доли. (B) Изображение правой доли после инъекции, показывающее скопление темной (гипоэхогенной) жидкости и небольших ярких (эхогенных) пузырьков воздуха в месте инъекции (пунктирная красная линия). Желтая стрелка указывает на кончик иглы. (C) Размещение иглы (желтая стрелка на кончике иглы) для инъекции левой доли тимуса иммунокомпетентной молодой мыши. (D) Размещение иглы (желтая стрелка) для инъекции правой доли иммунокомпетентной молодой мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Проверка точности in vivo и ex vivo . (A) Инъекция D-люциферина (0,1 мкг/10 мкл) в тимус 8-недельной трансгенной мыши люциферазы с последующей 1 с биолюминесцентной визуализацией in vivo с использованием системы визуализации биолюминесценции in vivo (n = 3). Цветовое кодирование показывает общее бидолюминесцентное сияние (фотоны·с−1·см−2·стерадиан−1), как указано цветовой полосой справа. (B) Тимус двум 5-недельным мышам C57BL/6 вводили трипан-синий, и точность инъекции была продемонстрирована некропсией (n = 3). Верхняя панель: Дорсальная поверхность трипана Окрашенного синего цвета впрыскиваемого тимуса in situ. Нижняя панель: Вентральная поверхность трипана Окрашенного синим тимуса ex situ после инъекции левой доли. Воспроизводится с разрешения Tuckett et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ультразвуковая инъекция в свободную руку является высокоточным методом доставки учебных материалов к тимусу эффективным и асептическим способом. После первоначальной стерилизации кожи в месте инъекции стерильность сохраняется во время процедуры благодаря использованию стерильных перчаток, стерильных ультразвуковых зондовых чехлов и стерильного ультразвукового геля. В отличие от слепого чрескожного подхода10,17 или использования хирургических разрезов для прямой визуализации тимуса18,19, которые являются широко используемыми методами для внутриутимических инъекций у мышей, использование ультразвукового наведения от руки сочетает в себе высокую степень безопасности и быстроты с огромной точностью процедуры. Проведение ультразвуковых инъекций с использованием рельсовой платформы14 обеспечивает аналогичный уровень безопасности и точности, но этот громоздкий подход обычно занимает не менее 5 минут на инъекцию с момента обезболивания мыши и позиционирования на платформе визуализации по сравнению с техникой свободной руки, которая позволяет эксперту выполнять инъекции примерно за 20-30 с на мышь15.
Значительный опыт и подготовка являются предпосылками для достижения высокого уровня владения всеми различными методами внутриутимической инъекции, включая технику инъекций со стороны свободной руки под ультразвуковым управлением. Тем не менее, радиолог с клиническим опытом в ультразвуковых процедурах может стать опытным в внутритяговой инъекции мышей в течение 1-часовой практики.
Гибкость метода инъекции свободной рукой позволяет исследователю вводить либо одну долю тимуса, обе доли тимуса за один проход инъекции, либо обе доли тимуса в двух отдельных инъекциях, в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей исследования. Следует отметить, что инъекция отдельных долей тимуса плацебо по сравнению с учебным материалом может быть использована в качестве стратегии для сокращения числа испытуемых, необходимых для использования доли, введенной плацебо, в качестве внутреннего контроля. Напротив, жесткая установка интегрированной рельсовой системы позволяет вводить в одну тимическую долю за период инъекции. Инъекция второй доли потребует демонтажа крепления держателя шприца, установки его на обратную сторону мыши и тщательной регулировки микроманипуляторных элементов управления до тех пор, пока траектория иглы не будет правильной, прежде чем следующая инъекция может продолжиться. Эти проблемы существенно увеличивают воздействие анестезии и время, необходимое для завершения эксперимента.
Уникальным преимуществом внематричного ультразвукового интратимического метода по сравнению с слепой процедурой интратимической инъекции является относительная легкость точного введения небольших тимусов, таких как тимусы пожилых мышей (6 месяцев и старше), которые намного меньше по размеру, чем у молодых мышей (4-10 недель). Это преимущество в сочетании с простотой масштабирования позволяет иммунологам проводить исследования на основе внутриутимических инъекций в широком диапазоне доклинических моделей мышей.
В заключение, наблюдения предоставляют достаточно доказательств, подтверждающих технику свободной руки для безопасных, быстрых и точных инъекций, нацеленных на отдельные доли тимуса. Таким образом, этот минимально инвазивный метод представляет собой высокоэффективный и точный вариант исследования тимуса, облегчая крупномасштабные доклинические исследования на мышах с тимусами, варьирующимися от больших до чрезвычайно маленьких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют каких-либо конфликтов интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Раймонда Х. Торнтона за его проницательную и всестороннюю раннюю работу над этой техникой. Это исследование финансировалось грантовой поддержкой Национального института рака (NCI 1R37CA250661-01A1), Ассоциации исследований лейкемии у детей, Медицинской школы Hackensack Meridian и Фонда HUMC / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
