Summary
El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.
Abstract
La inyección intratímica en modelos de ratón es una técnica importante para estudiar la función tímica e inmune, incluidos los trastornos genéticos y adquiridos de células T. Esto requiere métodos para la deposición directa de reactivos y / o células en el timo de ratones vivos. Los métodos tradicionales de inyección intratímica incluyen cirugía torácica o inyecciones percutáneas ciegas mínimamente invasivas, las cuales tienen limitaciones significativas. Los dispositivos de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta han hecho posibles las inyecciones percutáneas guiadas por imágenes en ratones, mejorando en gran medida la precisión de la inyección del enfoque de inyección percutánea y permitiendo la inyección de objetivos más pequeños. Sin embargo, las inyecciones guiadas por imágenes dependen de la utilización de un sistema ferroviario integrado, lo que lo convierte en un procedimiento rígido y lento. Aquí se presenta un método único, seguro y eficiente para inyecciones intratímicas percutáneas en ratones, eliminando la dependencia del sistema de rieles para las inyecciones. La técnica se basa en el uso de una unidad de micro-ultrasonido de alta resolución para obtener imágenes del timo del ratón de forma no invasiva. Usando una técnica de mano alzada, un radiólogo puede colocar una punta de aguja directamente en el timo del ratón bajo guía ecográfica. Los ratones se limpian y anestesian antes de la obtención de imágenes. Para un radiólogo experimentado experto en procedimientos guiados por ultrasonido, el período de aprendizaje para la técnica indicada es bastante corto, generalmente dentro de una sesión. El método tiene una baja tasa de morbilidad y mortalidad para los ratones y es mucho más rápido que las técnicas actuales asistidas mecánicamente para la inyección percutánea. Permite al investigador realizar de manera eficiente inyecciones percutáneas precisas y confiables de timos de cualquier tamaño (incluidos órganos muy pequeños como el timo de ratones envejecidos o inmunodeficientes) con un estrés mínimo en el animal. Este método permite la inyección de lóbulos individuales si se desea y facilita experimentos a gran escala debido a la naturaleza de ahorro de tiempo del procedimiento.
Introduction
El timo tiene un papel esencial en el desarrollo de las células T y la inmunidad. La deficiencia de células T, que puede ser causada por la involución tímica, trastornos genéticos, infecciones y tratamientos contra el cáncer, entre otros factores, conduce a una alta mortalidad y morbilidad 1,2. Los modelos de ratón son indispensables en la investigación de inmunología básica y traslacional y se han utilizado durante décadas para estudiar la biología tímica y el desarrollo de células T, así como para desarrollar tratamientos para aquellos que sufren de disfunción tímica y deficiencia de células T 3,4,5.
Una parte central de las investigaciones tímicas ha sido la inyección intratímica de materiales biológicos como células, genes o proteínas en modelos de ratón 6,7,8,9,10,11,12. Los métodos convencionales de inyección intratímica utilizan toracotomía seguida de inyección intratímica bajo visualización directa o inyección percutánea "ciega" en el mediastino. El abordaje quirúrgico aumenta significativamente el riesgo de neumotórax, entre otros. Además, el estrés elevado durante esta cirugía resulta en inmunosupresión, comprometiendo potencialmente los datos inmunológicos13. Los investigadores experimentados, después de algo de práctica, pueden realizar la técnica de inyección ciega, pero este enfoque es menos preciso y, por lo tanto, limita a los sujetos experimentales a ratones jóvenes con un timo grande.
La utilización de la guía ecográfica ha sido introducida como una alternativa precisa y mínimamente invasiva a los enfoques tradicionales de inyección intratímica14. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo cuando se utiliza el sistema ferroviario integrado en lugar de la técnica de mano alzada. La realización de inyecciones con el soporte de inyección requiere una cuidadosa optimización de imágenes y posicionamiento del transductor con la ayuda de los diversos accesorios, como el soporte y el soporte del transductor, el sistema de posicionamiento X, Y y Z, así como un funcionamiento competente de los controles de micromanipulación y las extensiones del sistema de rieles. Una técnica alternativa simple, la inyección tímica guiada por ultrasonido, se presenta aquí realizada por un radiólogo utilizando un enfoque a mano alzada15, que es una alternativa mínimamente invasiva rápida y precisa a los métodos descritos anteriormente. Es importante destacar que el enfoque actual se puede realizar con cualquier sistema de imágenes de ultrasonido de alta resolución sin necesidad de un soporte de inyección y un sistema de riel integrado. Es especialmente útil para estudios que requieren la inyección de un gran número de ratones11, para experimentos que involucran la inyección de ambos lóbulos tímicos, o para la inyección precisa de timos pequeños en ratones envejecidos, irradiados o inmunocomprometidos12.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal en el Centro para el Descubrimiento y la Innovación (protocolo IACUC 290). Para el presente estudio, ratones C57BL/6 (hembra, 4-6 semanas de edad), ratones C57BL/6 (hembra, 6 meses de edad), ratones hembra J:NU, ratones hembra NOD scid gamma (NSG) y B6; Se utilizaron ratones CAG-luc, -GFP como modelo de ratón joven, modelo de ratón envejecido, modelo de desnudo atímico, modelo inmunodeficiente y fuente de células de bioluminiscencia, respectivamente. Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). Este procedimiento generalmente requerirá dos personas (una para permanecer estéril mientras realiza las inyecciones y otra para manejar a los ratones).
1. Preparación de animales
- Inducir la anestesia en los ratones usando 3% -4% de gas isoflurano y mantener la anestesia usando 1% -3% de gas isoflurano administrado a través de un cono nasal y vaporizador calibrado con precisión (ver Tabla de materiales).
- Confirme la profundidad/inconsciencia anestésica apropiada por falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.
- Retire el pelaje del área anterior del pecho de los ratones aplicando una capa delgada de crema depilatoria durante menos de 1 minuto. Use una toalla de papel húmeda para eliminar la crema completamente junto con el pelaje suelto.
NOTA: La aplicación de demasiada crema hará que la piel del área del pecho se inflame. - Coloque un ratón a la vez, en decúbito supino, en la plataforma calentada de la estación de imágenes de ultrasonido de animales pequeños (consulte la Tabla de materiales) con el cono de la nariz en su lugar (Figura 1).
- Asegure el ratón al escenario con cinta adhesiva médica en la parte posterior y las extremidades anteriores (Figura 1).
- Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar el secado de la córnea.
- Desinfecte la piel de la parte superior del tórax sin pelaje con un aplicador de gluconato de clorhexidina (consulte la Tabla de materiales).
2. Preparación de la máquina de ultrasonido y campo estéril
- Active la sonda lineal de frecuencia más alta disponible, normalmente la sonda con la resolución espacial más alta para el tamaño del animal que se está fotografiando. Active la sonda tocando el botón correspondiente después de la pantalla de inicio.
NOTA: Para esta aplicación con ratones, la sonda utilizada está diseñada específicamente para su uso con ratones y ratas pequeñas (consulte la Tabla de materiales). - Optimice la configuración de ultrasonido para imágenes e inyección siguiendo los pasos a continuación.
- Ajuste la profundidad del campo de visión a un tamaño apropiado para el animal objetivo ajustando los controles deslizantes orientados verticalmente en el lado derecho de la pantalla (Figura 2). El ajuste de profundidad máxima será típicamente de aproximadamente 6-8 mm para ratones jóvenes.
- Ajuste la ganancia de escala de grises deslizando el botón a lo largo de la barra horizontal en la parte inferior de la pantalla (Figura 2). El objetivo es comenzar con una imagen que sea ligeramente más oscura que una apariencia "gris" típica.
- Ajuste la zona focal (flecha azul a la derecha de la pantalla, Figura 2) al nivel anticipado del timo. Para ratones jóvenes, esto será alrededor de una profundidad de 4 mm.
- Si desea capturar imágenes, pruebe la funcionalidad de los botones de almacenamiento de imagen y de clip de almacenamiento para asegurarse de que las imágenes se puedan guardar adecuadamente durante todo el procedimiento. Para ello, pulse el botón Guardar clip en la parte inferior derecha de la pantalla o pulse el botón Inmovilizar y, a continuación, pulse Guardar imagen (Figura 2).
- Aplique una pequeña cantidad (~1 ml) de gel de ultrasonido a la superficie del transductor (consulte la Tabla de materiales) mientras está en posición vertical, ya sea descansando en el soporte de la máquina de ultrasonido o en las manos de un asistente.
- Prepare un pequeño campo estéril junto a la plataforma calentada. El posicionamiento óptimo para esto suele ser entre la plataforma y la máquina de ultrasonido.
- Vacíe estos artículos en el campo estéril: una cubierta de sonda estéril, una banda elástica, guantes estériles y gel de ultrasonido estéril (consulte la Tabla de materiales).
- Con el campo estéril configurado y los artículos en su lugar, póngase los guantes estériles.
- Coloque con cuidado la cubierta estéril de la sonda sobre el transductor de ultrasonido (así como sobre el gel que se colocó inicialmente en la sonda). Mantenga la esterilidad y toque solo la cubierta estéril, nada más. Deslice la banda elástica estéril sobre la cubierta estéril de la sonda para mantenerla en su lugar.
NOTA: Los focos de aire, independientemente del tamaño, pueden interferir con las imágenes de ultrasonido. Por lo tanto, es esencial aplicar el gel de ultrasonido entre el transductor y la cubierta de la sonda estéril, y en la parte superior de la cubierta de la sonda para garantizar una interfaz libre de aire entre la sonda de ultrasonido y el animal. - Coloque una cantidad moderada (2-3 ml) de gel de ultrasonido estéril en el transductor.
NOTA: El usuario ahora está listo para crear una imagen de un mouse anestesiado.
3. Obtención de imágenes y localización del timo
- Mientras mantiene la esterilidad, coloque la sonda de ultrasonido con tapa de gel verticalmente en la parte desinfectada de la pared torácica anterior del ratón para obtener imágenes iniciales.
- Tómese un momento para mirar la imagen de ultrasonido y optimizarla aún más. Vuelva al paso 2.2 y ajuste para obtener una apariencia similar a la de la Figura 3.
- Escanee el pecho anterior del ratón en un plano transversal. Realice esto sosteniendo el transductor verticalmente y moviéndolo hacia arriba y hacia abajo desde el cuello hasta el abdomen en un movimiento similar a un pincel o "barrido".
NOTA: El corazón será la estructura más reconocible en el pecho debido a su movimiento rápido y apariencia "calibrada". Una vez localizado el corazón, este se puede utilizar como punto de referencia para adquirir una imagen del timo. - Con el corazón centrado en el campo de visión, barre el transductor ligeramente hacia el cuello. Justo superior al corazón, generalmente se encuentra el timo.
- Visualice el timo como una estructura bilobulada, piramidal, hipoecoica ("oscura" o "negra" que aparece en la pantalla) que está centrada en la línea media, anterior a la aorta y posterior al esternón (Figura 3A).
- Tome nota de las dos estructuras negras emparejadas redondas (es decir, "hipoecoicas") a cada lado de la parte superior del pecho.
NOTA: Estas son las venas cavas bilaterales. La aorta es una estructura hipoecoica curvilínea similar en la línea media entre las dos venas cavas. Estos son fácilmente reconocibles por su movimiento pulsátil.
4. Inyección del timo
- Si es necesario, aplique más gel de ultrasonido estéril (2-3 ml) al transductor.
NOTA: Una cantidad relativamente grande de gel estéril en el transductor (en comparación con el tamaño del tórax del ratón) actuará como una "almohadilla de gel" alrededor de la pared torácica del ratón. Esto reducirá el número de artefactos de ultrasonido producidos por aire dentro del campo de visión. - Usando la sonda de ultrasonido, localice la porción más ancha del timo, que generalmente es el sitio objetivo ideal para la inyección. Anticipe una trayectoria horizontal de la aguja en la ubicación elegida.
- Tenga en cuenta dónde se encuentran los vasos sanguíneos principales (SVC y aorta) en este sitio. Evite estos durante la inyección.
- Los vasos sanguíneos serán estructuras hipoecoicas y pulsátiles, como se describe en el paso 3.7. Si no está seguro, utilice el modo Doppler color para verificar el flujo dentro de los vasos (Figura 4A). Active el modo Doppler color tocando el botón Color en la pantalla.
- Si se anticipa que uno de los vasos sanguíneos principales (o el corazón) estará a lo largo de la trayectoria esperada de la aguja, elija una nueva área objetivo o encuentre un enfoque / trayectoria diferente.
- Sostenga el transductor en una mano y una aguja de insulina de 30 G (consulte la Tabla de materiales) con 10 μL de inyección en la otra.
NOTA: La inyección variará según el diseño experimental. El presente estudio utilizó solución salina tamponada con fosfato, azul de tripano o D-luciferina (0,1 μg/10 μL). - Para comenzar el proceso de inyección, mueva el transductor lateralmente para que el timo esté descentrado en el campo de visión del ultrasonido. Asegúrese de que el otro lado del campo de visión consista principalmente en gel de ultrasonido y nada más.
- Coloque la punta de la aguja en el gel debajo del transductor y mueva lentamente la aguja hasta que se visualice adyacente a la superficie de la piel (Figura 4B).
- Mientras toma imágenes continuamente de la aguja bajo ultrasonido, inserte la aguja en la glándula del timo con una trayectoria percutánea, lejos de los vasos sanguíneos.
- Use una trayectoria horizontal de "timo cruzado" para colocar la punta de la aguja en el lóbulo tímico contralateral al sitio de entrada. Esto explica la posible fuga a lo largo del tracto de la aguja (Figura 5A).
- Una vez que la punta de la aguja esté dentro de la porción deseada del timo, inyecte rápidamente el contenido (como 10 μL de azul de tripano o D-luciferina, 0,1 μg/10 μL) de la jeringa de 30 G mientras usa la visualización ecográfica.
- Para estabilizar la jeringa durante la inserción e inyección de la aguja, sostenga la jeringa entre el pulgar y el tercer dedo y controle el émbolo de la jeringa con el dedo índice.
- Retire la aguja después de que se haya depositado todo el contenido.
5. Seguimiento de los animales después de la inyección
- Transfiera al animal a una jaula vacía y observe hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
NOTA: Se espera que la recuperación completa de la anestesia ocurra dentro de los 2 minutos. - Controle al animal durante 10 minutos adicionales para detectar signos de angustia, dificultad para respirar o sangrado.
NOTA: No se espera dolor después de la inyección, y generalmente no hay necesidad de analgesia posterior a la inyección. - Una vez completamente recuperado y después de un período de observación posterior a la inyección sin incidentes, devolver el animal inyectado a la compañía de otros animales.
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Representative Results
La implementación exitosa de esta técnica se basa en algunos pasos clave a seguir. En primer lugar, se debe garantizar una identificación fiable de la propia glándula del timo. En ratones jóvenes, esto es sencillo debido al gran tamaño de la glándula (Figura 3A). En ratones más viejos o ratones inmunodeficientes, puede ser más desafiante; sin embargo, todavía es muy factible con equipos de ultrasonido modernos (Figura 3B, C). En segundo lugar, es de vital importancia establecer la trayectoria de la aguja para que se visualice continuamente durante el avance de la punta de la aguja a través de las capas de la pared torácica y hacia el timo. Una inyección exitosa tendrá la aguja completamente visualizada mientras se está avanzando. Esto asegura al operador que la aguja no ha atravesado una estructura crítica, como el corazón, la aorta o una de las venas cavas inferiores (Figura 4). Esto también se aplica a la inyección en sí. La punta de la aguja siempre debe visualizarse en su ubicación objetivo durante la inyección para que se confirme la deposición intratímica (Figura 5).
Existen algunos escollos menores que, si se reconocen, pueden mitigarse con relativa facilidad. Al asegurar el ratón al escenario y al cono de la nariz, el tórax del ratón debe ser lo más neutro posible (es decir, sin una rotación significativa hacia la izquierda o hacia la derecha). Si hay demasiada rotación del tórax, el "ángulo de aproximación" correcto de la aguja puede no ser fácilmente alcanzable. Además, si el ratón no está asegurado en su lugar lo suficientemente apretado, puede moverse o deslizarse al intentar avanzar la aguja, distorsionando la anatomía y dificultando la visualización. Sin embargo, con la técnica y la preparación adecuadas, se puede lograr una inyección intratímica exitosa con consistencia, confiabilidad y reproducibilidad.
Una vez que se completa la inyección, hay varias maneras de confirmar la ubicación intratímica de la inyección. El presente estudio utilizó luciferina como inyección en ratones transgénicos con luciferasa. Estos pueden evaluarse inmediatamente después de la inyección con imágenes de bioluminiscencia, confirmando la ubicación correcta de la inyección sin sacrificar al animal (Figura 6A). Esta técnica tiene la ventaja adicional de que las células marcadas con luciferina inyectada se pueden visualizar en múltiples puntos de tiempo, lo que garantiza la persistencia de la actividad en el timo. Alternativamente, se puede inyectar azul de tripano como marcador visual del sitio de inyección, y la precisión de la inyección se puede confirmar ex vivo con necropsia16 (Figura 6B).
Figura 1: Ratón anestesiado colocado en la etapa de imagen para ecografía del timo. Una hembra de ratón C57BL/6 de 6 semanas de edad con un tórax depilado fue anestesiada y transferida a la estación de imágenes. El ratón está en posición supina, con las patas extendidas aseguradas por cinta adhesiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de la máquina de ultrasonido. Imagen del panel de control de la máquina de ultrasonido (pantalla táctil). Los principales ajustes de los ajustes para optimizar la imagen serán ajustar la profundidad (flecha roja), la zona focal (marcada en amarillo) y las ganancias (asterisco rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes ecográficas del timo en ratones jóvenes e inmunodeficientes inmunocompetentes. (A) Ratón joven inmunocompetente (C57BL/6, hembra, 4 semanas de edad, n = 5). La vista ecográfica transversal muestra los lóbulos derecho e izquierdo del timo (asteriscos). (B) Ratón envejecido inmunocompetente (C57BL/6, hembra, 6 meses de edad, n = 5). El timo (asterisco) es más pequeño pero mantiene su ubicación típica y forma piramidal. (C) Ratón joven inmunodeficiente (NOD scid gamma, hembra, 4 semanas de edad, n = 5). Tenga en cuenta el tamaño mucho más pequeño del timo (asterisco) en comparación con el ratón joven normal. (D) Ratón desnudo atímico (hembra, 8 semanas de edad, n = 1). Hay una ausencia total de tejido tímico. Cabe destacar que la línea vertical oscura (hipoecoica) en el centro de la imagen (asterisco) es un artefacto de sombra del esternón, sin tejido tímico verdadero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Preparación para la inyección . (A) La imagen Doppler color del tórax anterior demuestra la relación del timo con los vasos mediastínicos. El centro inferior es el arco aórtico (flecha roja), y los vasos redondeados a cada lado son las venas cavas superiores derecha e izquierda (puntas de flecha amarillas). La sangre que fluye hacia la sonda de imágenes está codificada en rojo, y la sangre que fluye lejos del transductor está codificada en azul. (B) Colocación de la aguja desde antes del avance hacia el tórax desde un enfoque del lado izquierdo. La punta de la aguja (flecha amarilla) debe estar alineada con el transductor de ultrasonido y la punta a nivel de la porción media del timo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Técnica de inyección . (A) Colocación de la aguja para la inyección del lóbulo tímico derecho de un ratón joven inmunocompetente. La punta de la aguja (flecha amarilla) está en la porción central del lóbulo derecho. (B) Imagen posterior a la inyección del lóbulo derecho que muestra una colección de líquido oscuro (hipoecoico) y pequeñas burbujas de aire brillantes (ecogénicas) en el lugar de la inyección (línea roja discontinua). La flecha amarilla indica la punta de la aguja. (C) Colocación de la aguja (flecha amarilla en la punta de la aguja) para la inyección del lóbulo tímico izquierdo de un ratón joven inmunocompetente. (D) Colocación de la aguja (flecha amarilla) para la inyección del lóbulo derecho de un ratón joven inmunocompetente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Verificación de exactitud in vivo y ex vivo. (A) Inyección de D-luciferina (0,1 μg/10 μL) en el timo de un ratón transgénico con luciferasa de 8 semanas de edad, seguida de 1 s de imágenes de bioluminiscencia in vivo utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo (n = 3). El código de colores muestra la radiancia total de bioluminiscencia (fotones·s−1·cm−2·esteradian−1) como lo indica la barra de color de la derecha. (B) El timo de dos ratones C57BL/6 de 5 semanas de edad se inyectó con azul de tripano, y la precisión de la inyección se demostró mediante necropsia (n = 3). Panel superior: Superficie dorsal de un timo inyectado teñido con Trypan Blue in situ. Panel inferior: Superficie ventral de un timo teñido de azul de tripano ex situ después de la inyección del lóbulo izquierdo. Reproducido con permiso de Tuckett et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Una inyección a mano alzada guiada por ultrasonido es una técnica altamente precisa para administrar materiales de estudio al timo de una manera eficiente y aséptica. Después de la esterilización inicial de la piel en el lugar de la inyección, la esterilidad se mantiene durante el procedimiento debido al uso de guantes estériles, cubiertas de sonda de ultrasonido estériles y gel de ultrasonido estéril. En contraste con el abordaje percutáneo ciego 10,17 o confiando en incisiones quirúrgicas para la visualización directa del timo18,19, que son los métodos comúnmente utilizados para las inyecciones intratímicas en ratones, el uso de la guía de ultrasonido a mano alzada combina un alto grado de seguridad y rapidez con una tremenda precisión del procedimiento. La realización de inyecciones guiadas por ultrasonido utilizando la plataforma de riel14 ofrece un nivel similar de seguridad y precisión, pero este enfoque engorroso generalmente toma al menos 5 minutos por inyección desde el momento en que el ratón ha sido anestesiado y colocado en la plataforma de imágenes, en comparación con la técnica de mano alzada que hace posible que un experto complete las inyecciones en alrededor de 20-30 s por ratón15.
La experiencia y la capacitación significativas son requisitos previos para lograr un alto nivel de competencia en todos los diversos métodos para la inyección intratímica, incluida la técnica de inyección a mano alzada guiada por ultrasonido. Sin embargo, un radiólogo con experiencia clínica en procedimientos guiados por ultrasonido puede llegar a ser competente en la inyección intratímica de ratones dentro de una sesión de práctica de 1 hora.
La flexibilidad del método de inyección a mano alzada permite al investigador inyectar un lóbulo tímico, ambos lóbulos tímicos en una sola pasada de inyección o ambos lóbulos tímicos en dos inyecciones separadas, dependiendo de las necesidades experimentales específicas del estudio. Cabe destacar que la inyección de lóbulos tímicos individuales con placebo versus material de estudio se puede utilizar como una estrategia para reducir el número de sujetos del estudio necesarios mediante el uso del lóbulo inyectado con placebo como control interno. Por el contrario, la configuración rígida del sistema de riel integrado permite la inyección en un lóbulo tímico por período de inyección. La inyección de un segundo lóbulo requeriría desmontar el accesorio del soporte de la jeringa, instalarlo en el reverso del ratón y ajustar cuidadosamente los controles de micromanipulación hasta que la trayectoria de la aguja sea correcta antes de que pueda continuar la siguiente inyección. Estos problemas aumentan sustancialmente la exposición a la anestesia y el tiempo necesario para completar el experimento.
Una ventaja única del método intratímico de ultrasonido a mano alzada en comparación con el procedimiento de inyección intratímica ciega es la relativa facilidad de inyectar con precisión timos pequeños, como los timos de ratones más viejos (6 meses o más), que son mucho más pequeños en tamaño que los de ratones más jóvenes (4-10 semanas de edad). Esta ventaja, combinada con la facilidad de ampliación, permite a los inmunólogos realizar estudios basados en inyecciones intratímicas en una amplia gama de modelos preclínicos de ratón.
En conclusión, las observaciones proporcionan amplia evidencia que respalda la técnica de mano alzada para inyecciones seguras, rápidas y precisas dirigidas a lóbulos tímicos individuales. Este método mínimamente invasivo, por lo tanto, representa una opción altamente eficiente y precisa para la investigación del timo, facilitando las investigaciones preclínicas a gran escala en ratones con timos que van desde grandes hasta extremadamente pequeños.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Raymond H. Thornton por su perspicaz y completo trabajo inicial sobre esta técnica. Este estudio fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (NCI 1R37CA250661-01A1), la Asociación de Investigación de Leucemia Infantil, la Escuela de Medicina Hackensack Meridian y la Fundación HUMC / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
