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Neuroscience

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64313
Automatic Translation
1, 1,2
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

Este protocolo demuestra la microinyección de lipopolisacárido en la región ventricular cerebral en un modelo larvario de pez cebra para estudiar la respuesta neuroinflamatoria resultante y la neurotoxicidad.

Abstract

La neuroinflamación es un jugador clave en diversos trastornos neurológicos, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es de gran interés investigar y desarrollar modelos alternativos de neuroinflamación in vivo para comprender el papel de la neuroinflamación en la neurodegeneración. En este estudio, se desarrolló y validó un modelo larval de pez cebra de neuroinflamación mediado por microinyección ventricular de lipopolisacárido (LPS) para inducir una respuesta inmune y neurotoxicidad. Las líneas transgénicas de pez cebra elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se utilizaron para la cuantificación en tiempo real de la viabilidad de las neuronas cerebrales mediante imágenes fluorescentes en vivo integradas con análisis de intensidad de fluorescencia. El comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra se registró automáticamente utilizando una grabadora de seguimiento de video. Se investigó el contenido de óxido nítrico (NO) y los niveles de expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias, incluyendo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral humana α (TNF-α) para evaluar la respuesta inmune inducida por LPS en la cabeza larval del pez cebra. A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral de LPS, se observó pérdida de neuronas y deficiencia de locomoción en larvas de pez cebra. Además, la neuroinflamación inducida por LPS aumentó la liberación de NO y la expresión de ARNm de IL-6, IL-1β y TNF-α en la cabeza de larvas de pez cebra de 6 días después de la fertilización (dpf), y resultó en el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra. En este estudio, la inyección de pez cebra con LPS a una concentración de 2.5-5 mg / ml a 5 dpf se determinó como la condición óptima para este ensayo de neuroinflamación farmacológica. Este protocolo presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para la microinyección de LPS en el ventrículo cerebral para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en una larva de pez cebra, que es útil para estudiar la neuroinflamación y también podría usarse como un ensayo de detección de drogas in vivo de alto rendimiento.

Introduction

La neuroinflamación ha sido descrita como un factor antineurogénico crucial implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central (SNC)1. Después de los insultos patológicos, la neuroinflamación puede resultar en diversas consecuencias adversas, incluyendo la inhibición de la neurogénesis y la inducción de la muerte celular neuronal 2,3. En el proceso subyacente a la respuesta a la inducción de inflamación, múltiples citoquinas inflamatorias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) son secretadas en el espacio extracelular y actúan como componentes cruciales en la muerte neuronal y la supresión de la neurogénesis 4,5,6.

La microinyección de mediadores de la inflamación (como IL-1β, L-arginina y endotoxinas) en el cerebro puede causar reducción de células neuronales y neuroinflamación 7,8,9. El lipopolisacárido (LPS, Figura 1), una endotoxina patógena presente en la pared celular de las bacterias gramnegativas, puede inducir neuroinflamación, exacerbar la neurodegeneración y reducir la neurogénesis en animales10. La inyección de LPS directamente en el SNC del cerebro del ratón aumentó los niveles de óxido nítrico, citoquinas proinflamatorias y otros reguladores11. Además, la inyección estereotáxica de LPS en el entorno cerebral local puede inducir una producción excesiva de moléculas neurotóxicas, lo que resulta en una función neuronal deteriorada y el posterior desarrollo de enfermedades neurodegenerativas 10,12,13,14,15. En el campo de la neurociencia, las observaciones microscópicas vivas y temporales-curso de los procesos celulares y biológicos en organismos vivos son cruciales para comprender los mecanismos subyacentes a la patogénesis y la acción farmacológica16. Sin embargo, la imagen en vivo de modelos de ratón de neuroinflamación y neurotoxicidad está fundamentalmente limitada por la limitada profundidad de penetración óptica de la microscopía, lo que impide la imagen funcional y la observación en vivo de los procesos de desarrollo17,18,19. Por lo tanto, el desarrollo de modelos alternativos de neuroinflamación es de gran interés para facilitar el estudio del desarrollo patológico, y el mecanismo subyacente a la neuroinflamación y la neurodegeneración, mediante imágenes en vivo.

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo prometedor para estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración debido a su sistema inmune innato conservado evolutivamente, transparencia óptica, gran tamaño de embrague embrionario, trazabilidad genética e idoneidad para imágenes in vivo 19,20,21,22,23 . Los protocolos anteriores han inyectado directamente LPS en la yema y el ventrículo del cerebro posterior de larvas de pez cebra sin evaluación mecanicista, o simplemente han agregado LPS al agua de los peces (medio de cultivo) para inducir una respuesta inmune sistémica letal24,25,26,27. Aquí, desarrollamos un protocolo para la microinyección de LPS en los ventrículos cerebrales, para desencadenar una respuesta inmune innata o neurotoxicidad en los 5 días posteriores a la fertilización (dpf) de larvas de pez cebra. Esta respuesta se evidencia por la pérdida de células neuronales, el déficit de comportamiento locomotor, el aumento de la liberación de óxido de nitrito, la activación de la expresión génica inflamatoria y el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra a las 24 h después de la inyección.

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Protocol

Las líneas de pez cebra de tipo salvaje AB y pez cebra transgénico elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas Chinas (ICMS). La aprobación ética (UMARE-030-2017) para los experimentos con animales fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad de Macao, y el protocolo sigue las pautas institucionales de cuidado animal.

1. Cría de embriones y larvas de pez cebra

  1. Generar embriones de pez cebra (200-300 embriones por apareamiento) por apareamiento natural por pares como se informó anteriormente28.
  2. Preparar el caldo mediano de agua de huevo (E3) (60×) disolviendo 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl 2·2H 2 O, y 9,78 g de MgCl 2·6H2O enddH2Oa un volumen final de 2 L yajustar el pH a7,2 usando NaOH y HCl. Para preparar la concentración de trabajo del medio E3 (1×), diluir el material 60 veces en ddH2O. Almacenar a 28,5 °C cuando no esté en uso.
  3. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transferir los embriones de pez cebra a un plato que contenga medio E3. Criar los embriones a 28,5 °C en una incubadora y controlar su desarrollo y salud. Retire los embriones muertos y reemplace el medio E3 sucio con un medio fresco diariamente.
  4. Para experimentos de imágenes de pez cebra, use una pipeta de transferencia de plástico para recolectar embriones de 0-2 h después de la fertilización (hpf) (alrededor de 200 huevos) en aproximadamente 15 ml de medio E3 de 1× que contenga 0.003% de N-feniltiourea (PTU).
    NOTA: La PTU puede inhibir la formación de melanóforos durante la embriogénesis29. El tratamiento de embriones con PTU durante la embriogénesis puede mejorar la detección de señales en microscopía o la expresión de fluorescencia30.
  5. Mantener los embriones de pez cebra en las condiciones anteriores hasta que los embriones alcancen la etapa larvaria de desarrollo deseada.

2. Preparación para la microinyección

  1. Prepárese para la inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas (consulte la Tabla de materiales), siguiendo el protocolo de cinco pasos para la extracción del tubo capilar de vidrio (Tabla 1).
  2. Abra la punta de la aguja (capilares de vidrio de pared delgada [3.5 in] con filamento, OD 1.14 mm) al tamaño apropiado en un ángulo usando pinzas (Figura 2A).
  3. Llene la aguja con 0,1 ml de aceite mineral para asegurarse de que no haya burbujas.
  4. Retire el tapón de rosca de la aguja de acero del aparato de microinyección. Alinee el orificio de la aguja de vidrio con la aguja de acero y luego apriete la tapa de rosca. Monte el aparato de microinyección de aguja cargado en un micromanipulador (consulte la Tabla de materiales).
  5. Ajuste la posición del aparato de microinyección para que el micromanipulador pueda mover el aparato de forma flexible bajo el microscopio. Descargue un cierto volumen de aceite de parafina para hacer que la aguja de acero ingrese al tubo de vidrio capilar.
  6. Deje caer la solución inyectable (como 1× PBS o 5 mg/ml de LPS) en un portaobjetos de vidrio esterilizado con etanol al 70% y ajuste el aparato de microinyección para que la punta se inserte en la gota líquida. Cargue ~2 μL de solución inyectable en la aguja.
  7. Configure el micromanipulador (ajustes de ajuste fino de arriba, abajo, izquierda y derecha) de modo que la punta de la aguja del aparato de microinyección esté en el mismo campo de visión que las larvas con gran aumento (Figura 2B).

3. Montaje de pez cebra para microinyecciones

NOTA: El desarrollo del cerebro del pez cebra ocurre dentro de 3 dpf y madura a 5 dpf con un sistema nervioso central bien desarrollado31,32. Por lo tanto, las larvas de 5 dpf ya son adecuadas para estudiar el daño neuronal mediado por LPS, así como las respuestas conductuales e inflamatorias.

  1. Inyecte las larvas de pez cebra dentro de aproximadamente 30 minutos de alcanzar la etapa de interés, para mantener la consistencia del tiempo de inyección.
  2. Para anestesiar las larvas de pez cebra, combine tricaine con agua limpia del tanque de peces (concentración final de 0.02% p/v tricaína).
  3. Derretir una solución de agarosa al 2% enddH2Ousando un microondas. Vierta la agarosa fundida en un plato de plástico. El plato de plástico recubierto de agarosa al 2% se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  4. Use una pipeta de transferencia de plástico para transportar las larvas anestesiadas al centro del plato de plástico recubierto de agarosa al 2%. Oriente las larvas montadas con el cerebro hacia arriba para el acceso de la aguja.

4. Inyección del ventrículo cerebral

  1. Ajuste el aumento del microscopio para que la estructura ventricular cerebral del pez cebra se muestre claramente en el campo de visión (Figura 2B).
  2. Coloque la aguja cuidadosamente por encima del tectum cerebral (Figura 2C).
  3. Perfore la piel del cerebro del pez cebra con la punta de la aguja lentamente usando el micromanipulador.
  4. Presione el pedal para expulsar 1 nL de 1x PBS o diferentes concentraciones de LPS (1.0, 2.5 y 5.0 mg/mL) (consulte la Tabla de materiales). Las imágenes exitosas de inyección de ventrículo en las que se inyectó ventrículo cerebral con 1 nL de colorante azul de Evans al 1% (diluido en PBS) se muestran como ejemplo (Figura 2D). Transfiera las larvas al medio E3 limpio inmediatamente después de la inyección. Después de 24 h, recolecte las larvas para obtener imágenes microscópicas, ensayos de comportamiento locomotor y determinación de otros indicadores.

5. Imágenes

  1. Prepare una solución de agarosa baja en fusión al 1,5% en medio E3 y caliéntela en un microondas para formar un líquido transparente.
  2. Use una pipeta de transferencia de plástico limpio para transportar las larvas a un portaobjetos de vidrio y elimine la mayor cantidad de agua posible.
  3. Use una pipeta de transferencia de plástico para agregar una gota de agarosa baja en fusión al 1.5% a las larvas.
    NOTA: Enfríe la agarosa de bajo punto de fusión en la pipeta durante un tiempo antes de agregarla para no dañar las larvas.
  4. Use una aguja de jeringa de 1 ml para orientar las larvas. Espere hasta que la agarosa se enfríe y se solidifique antes de comenzar a tomar imágenes.
  5. Observe y fotografíe la región neuronal en todo el cerebro del pez cebra Tg(ETvmat2:EGFP) y Tg(elavl3:mCherry), así como el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra Tg(mpo:EGFP) bajo un microscopio estéreo de fluorescencia (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Los ajustes del microscopio de fluorescencia utilizados para obtener imágenes se muestran a continuación. Tg(ETvmat2:EGFP) cerebro de pez cebra (longitud de onda de excitación: 450-490 nm, longitud de onda de emisión: 500-550 nm, aumento visual: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cerebro de pez cebra (longitud de onda de excitación: 541-551 nm, longitud de onda de emisión: 590 nm, aumento visual: 100x); Tg(mpo:EFGP) cerebro de pez cebra (longitud de onda de excitación: 450-490 nm, longitud de onda de emisión: 500-550 nm, aumento visual: 63x).
  6. Mida y analice la intensidad de fluorescencia y la longitud de la región de la neurona Ra en el pez cebra Tg (ETvmat2: EGFP) y la intensidad de fluorescencia de las neuronas cerebrales del pez cebra Tg (elavl3: mCherry) utilizando el software ImageJ. Cuente manualmente los neutrófilos en la región cerebral del pez cebra Tg(mpo: EFGP).

6. Determinación de marcadores de expresión génica

  1. A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral LPS, proceder con la determinación de los marcadores de expresión génica. Para ello, anestesia las larvas de pez cebra con tricaína al 0,02% (como se menciona en el paso 3.2).
  2. Use dos jeringas de 1 ml para separar las porciones de la cabeza de las larvas (40 larvas por grupo) sin las regiones del ojo y el saco vitelino (Figura 2E).
  3. Extraer ARN de las porciones de la cabeza larvaria.
    1. Para la extracción de ARN, homogeneice la porción de la cabeza con 200 μL de reactivo de extracción de ARN (consulte la Tabla de materiales) utilizando un molinillo de tejidos (consulte la Tabla de materiales) a una velocidad de rotación de 11,000 rpm durante 5 s.
    2. Realizar la extracción de ARN utilizando el método cloroformo-isopropanol. Para ello, agregue 40 μL de cloroformo, agite los tubos vigorosamente e incubarlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    3. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo (aproximadamente 100 μL) y agregue 100 μL de isopropanol. Incubar durante 10 min y luego centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retire el sobrenadante.
    4. Agregue 200 μL de etanol al 75% para lavar el pellet de ARN. Vortex las muestras brevemente y luego centrifugar a 7500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave de nuevo el pellet de ARN.
    5. Seque al aire el pellet de ARN durante 5-10 minutos, luego agregue 30 μL de agua libre de RNasa para disolver el pellet de ARN. Compruebe la pureza (relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm) y la integridad del ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolumen (consulte la Tabla de materiales).
  4. Sintetizar ADNc a partir del ARN extraído en el paso 6.3, utilizando transcriptasa inversa con cebadores aleatorios (ver Tabla de materiales).
    1. Agregue 1 μL de cebadores aleatorios, 1 μL de dNTP, 1 μg de ARN y agua destilada (volumen total a 12 μL) a un tubo libre de nucleasa. Calentar la mezcla a 65 °C durante 5 min y enfriar rápidamente en hielo.
    2. Agregue 1 μL de DTT 0.1 M, 1 μL de inhibidor de RNasa, 4 μL de tampón de primera cadena 5× y 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV (volumen total: 20 μL) al tubo. Mezclar suavemente e incubar el tubo a 25 °C durante 2 min, seguido de 42 °C durante 50 min. Inactivar la reacción calentando a 70 °C durante 15 min.
  5. Realizar PCR en tiempo real en un sistema de qPCR (ver Tabla de materiales) utilizando un kit RT-qPCR disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) para determinar la expresión de los genes diana (IL-1β, IL-6 y TNF-α). La mezcla de reacción (20 μL) contenía 10 μL de verde SYBR, 0,4 μL de colorante de referencia ROX, 0,8 μL de cada uno de los cebadores directos e inversos, 6 μL deddH2Oy 2 μL de ADNc plantilla (1 μg). Realizar amplificación por PCR en las condiciones: 95 °C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 34 s, y con una etapa de disociación de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s y 95 °C durante 15 s.
  6. Normalizar los niveles de ARNm de los genes diana a los de un gen de mantenimiento, el factor de elongación 1 α (Ef1α). Calcular los niveles de expresión para cada gen diana mediante el método 2−ΔΔCT33. Las secuencias de cebadores de cada gen se describen en la Tabla 2.
  7. Para la determinación del óxido nítrico, homogeneizar la porción de la cabeza (obtenida en el paso 6.2) en 100 μL de PBS frío utilizando un molinillo de tejido. Centrifugar el PBS resultante y la suspensión de la porción de cabeza a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoja los lisados y realice el ensayo de concentración de nitritos34 utilizando un kit disponible comercialmente (ver Tabla de materiales).

7. Ensayo de comportamiento de locomotora de pez cebra

  1. A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral LPS, transfiera las larvas de pez cebra a los pocillos de una microplaca cuadrada de 96 pocillos individualmente. Añadir 300 μL de medio E3 a cada pocillo e incubar las larvas durante 4 h para aclimatarse a la placa de ensayo.
  2. Transfiera la microplaca cargada de larvas a la caja de seguimiento del pez cebra (consulte la Tabla de materiales). Encienda la fuente de luz y luego incube las larvas en la caja de prueba durante 30 minutos para aclimatar el ambiente.
  3. Monitoree y registre el comportamiento del pez cebra utilizando un sistema automatizado de seguimiento de video. Registre 12 sesiones (5 min cada una, total 1 h) para cada pez cebra. Defina la distancia total (consiste en distancias inactivas, pequeñas y grandes) como la distancia (en mm) que cada pez movió durante un período de seguimiento de 60 minutos.

8. Análisis estadístico

  1. Realice análisis estadísticos utilizando software de análisis estándar (consulte la Tabla de materiales).
  2. Realizar análisis estadísticos de las diferencias entre dos grupos utilizando ANOVA unidireccional ordinario. Calcule el coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la fuerza de las correlaciones. El p < 0,05 se consideró significativo en todos los análisis.

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Representative Results

El flujo de trabajo descrito aquí presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en larvas de pez cebra. En este protocolo descrito, se inyectaron 5 dpf de pez cebra con LPS (Figura 1) en ventrículos cerebrales utilizando un microinyector (Figura 2A-C). La inyección exitosa en el sitio del ventrículo cerebral se verificó utilizando tinción azul de Evans al 1% (Figura 2D). La cabeza del pez cebra se separó de sus ojos y cuerpo utilizando jeringas (Figura 2E) para excluir cualquier influencia de la expresión de citoquinas inflamatorias y la liberación de óxido nítrico en el cuerpo del pez cebra en la determinación de neuroinflamación y neurotoxicidad en el cerebro.

El mismo volumen de PBS (como LPS) se inyectó en el área ventricular del cerebro del pez cebra como un control operado simuladamente. No se observaron diferencias significativas entre los grupos control y operados de forma simulada en las neuronas, en particular especialmente del grupo anterior de núcleos de rafe (Ra) (Figura 3A-C), densidad integrada de fluorescencia de las neuronas cerebrales (Figura 3D, E), la distancia total de movimiento del pez cebra (Figura 4A, B), producción de NO y expresión de ARNm de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (Figura 4A-D), y reclutamiento de neutrófilos en el cerebro larval del pez cebra (Figura 6A, B). Estos resultados demostraron que la microinyección adecuada no causa ninguna neurotoxicidad y neuroinflamación en el pez cebra.

Después del tratamiento durante 24 h, la inyección ventricular cerebral de LPS indujo neurotoxicidad en el pez cebra. LPS (1-5 mg / ml) indujo una pérdida significativa de neuronas Ra en el cerebro de Tg (ETvmat2: GFP) larva de pez cebra en comparación con los grupos control y simulado (Figura 3A-C). La línea transgénica elav13:mCherry zebrafish delinea las células neuronales con la proteína fluorescente roja nuclear35. Como se muestra en la Figura 3D, E, 2.5-5 mg / ml LPS condujo a cambios significativos en la densidad integrada de fluorescencia de las neuronas cerebrales en esta línea larval de pez cebra. Sin embargo, el grupo de inyección de LPS de 1 mg / ml no mostró ningún efecto sobre la densidad integrada de fluorescencia de las neuronas cerebrales en comparación con los grupos control y simulado. Además, 5 mg/ml de LPS indujeron una deficiencia de locomoción (Figura 4A) y disminuyeron la distancia total de movimiento del pez cebra durante un período de seguimiento de 60 minutos (Figura 4B). Los resultados demostraron que 1-2.5 mg / ml LPS podría inducir la pérdida de neuronas, pero no una deficiencia significativa de locomoción.

Además, la inyección ventricular cerebral de LPS también puede activar la respuesta inflamatoria en el cerebro del pez cebra. La producción de NO (Figura 5A) y la expresión de ARNm de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (Figura 5B-D) en la cabeza de larvas de pez cebra aumentaron con el tratamiento con LPS de 2,5-5 mg/ml en comparación con la expresión en los grupos control y simulado. Después de una inyección de LPS de 1-5 mg/ml, se observó el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro larval del pez cebra (Figura 6A), lo que resultó en un aumento significativo en el número de neutrófilos en la región cerebral del pez cebra Tg(mpo:EGFP) (Figura 6B).

Paso Tiempo de funcionamiento (seg) Nivel de calor Acción
T1 L> H80-89 P1L005
T2 1.6-3 H00
T3 L> H00 P2L001c
T4 3 H00 FRESCO
T5 0 H00

Tabla 1: Protocolo de cinco pasos para la extracción de tubos capilares de vidrio.

Nombre de la cartilla Secuencia
IL-1β hacia adelante 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3'
IL-1β inversa 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3'
IL-6 hacia adelante 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3'
IL-6 reverso 5'-TCTTTCCCTCTTTTCCTCCTG-3'
TNF-α adelante 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3'
TNF-α inversa 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3'
Ef1α hacia adelante 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3'
Ef1α inversa 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3'

Tabla 2: Cartillas utilizadas en qPCR en tiempo real.

Figure 1
Figura 1: Estructura general del lipopolisacárido (LPS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración de microinyección, postura corporal y posición del pez cebra, y separación de la porción de la cabeza. (A) Selección de aguja de vidrio: use una pinza para cortar la punta de una aguja previamente tirada bajo el microscopio, para obtener una aguja con una abertura similar a la que se muestra en la figura. (B) Ajustar la distancia focal del microscopio para que el área ventricular cerebral de las larvas de pez cebra se pueda observar a gran aumento (delineado en negro). Los círculos azul claro indican el lugar de la inyección. (C) Las larvas montadas deben estar orientadas con el cerebro hacia arriba para el acceso a la aguja (tectum cerebral indicado por un círculo rojo). (D) Demostración de inyección ventricular exitosa con azul de Evans en larvas de pez cebra cerebrales. (E) Porción de la cabeza del pez cebra sin las regiones del ojo y del saco vitelino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La inyección ventricular cerebral de LPS extirpa las neuronas después de 24 h en larvas de pez cebra. (A) (Arriba) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de vmat2:GFP después del tratamiento con diferentes concentraciones de LPS (los corchetes rojos indican neuronas de los núcleos del rafe [Ra]; barra de escala = 265,2 μm). (Abajo) La región neuronal Ra se amplió para mejorar la visualización morfológica. (B,C) Intensidad media de fluorescencia y longitud de la región neuronal Ra en larvas de pez cebra vmat2:GFP. (D,E) Morfología representativa (barra de escala = 265,2 μm) e intensidad media de fluorescencia de las neuronas cerebrales del pez cebra Tg(elavl3:mCherry). Los datos se expresan como un porcentaje del grupo de control. *P < 0,05 y **P < 0,01 versus grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La inyección ventricular cerebral de LPS induce deficiencia de locomoción después de 24 h en larvas de pez cebra. (A) Patrones representativos de trazas de locomoción del pez cebra. En el mapa de seguimiento digital, el movimiento de alta velocidad está representado por líneas rojas (> 6,6 mm/s); el movimiento de velocidad media se representa mediante líneas verdes (3,3-6,6 mm/s); El movimiento a baja velocidad se representa con líneas negras (< 3,3 mm/s). (B) Análisis cuantitativo de la distancia total promedio recorrida por el pez cebra en 60 min. *P < 0,05 versus grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La inyección ventricular cerebral de LPS aumenta los mediadores proinflamatorios. (A) Los niveles de óxido nítrico se midieron utilizando el reactivo de Griess. (B-D) Los niveles de expresión génica de interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α) en la cabeza del pez cebra se investigaron mediante qPCR. *P < 0,05 y **P < 0,01 versus grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La microinyección ventricular cerebral LPS conduce al reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra después de 24 h. (A) Migración de neutrófilos (área dentro del círculo rojo) a la cabeza de las larvas después de la inyección ventricular cerebral LPS (barra de escala = 851.1 μm). (B) El número de neutrófilos en las cabezas de larvas después de la inyección ventricular cerebral LPS. *P < 0,05 y **P < 0,01 versus grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Datos brutos Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Una cantidad creciente de datos epidemiológicos y experimentales implican infecciones bacterianas y virales crónicas como posibles factores de riesgo para enfermedades neurodegenerativas36. La infección desencadena la activación de procesos inflamatorios y respuestas inmunes del huésped37. Incluso si la respuesta actúa como un mecanismo de defensa, la inflamación sobreactivada es perjudicial para la neurogénesis, y el ambiente inflamatorio no permite la supervivencia de las neuronas recién nacidas38. Como resultado, causa daño a las funciones neuronales del huésped y la viabilidad. Estudios indican que la inflamación juega un papel significativo en la fisiopatología de la neurodegeneración39.

Como endotoxina patógena frecuentemente estudiada, LPS ha sido implicado en la inhibición de la neurogénesis y la neurodegeneración. La activación de LPS de los procesos inflamatorios perjudica significativamente la neurogénesis, parcialmente a través de la producción de NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β40. Un creciente cuerpo de evidencia demuestra que LPS causa déficits de comportamiento y pérdida neuronal, e influye en la progresión de la neurogénesis cuando se inyecta centralmente en modelos de roedores neurodegenerativos10,38. Los modelos de pez cebra se han utilizado ampliamente como modelos experimentales alternativos para estudiar las respuestas inmunes41 y detectar nuevos fármacos antiinflamatorios. Los sistemas inmunes innatos y adaptativos del pez cebra son similares a los de los mamíferos42. Además, algunos estudios han identificado varias citoquinas inflamatorias y receptores presentes en mamíferos en el SNC del pez cebra43. Estudios anteriores sugieren que sumergir embriones/larvas de pez cebra en LPS o inyectar LPS en la yema de larvas de pez cebra puede inducir la respuesta inmune y aumentar los factores proinflamatorios asociados con la inflamación44,45. Sin embargo, el efecto específico de LPS en el tejido nervioso del pez cebra y en la inducción de neuroinflamación, aún no se conoce.

Aunque los modelos de roedores tienen muchas ventajas sobre otros modelos animales, sus limitaciones en términos de imágenes in vivo en tiempo real y detección de drogas son obvias. La imagen in vivo es ampliamente utilizada para investigar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso y los cambios patológicos en el cerebro como una herramienta poderosa y no invasiva46,47. Debido a la transparencia óptica de los embriones y larvas de pez cebra, son muy adecuados para experimentos de imágenes en vivo de observación cerebral48,49. En particular, el pequeño tamaño del pez cebra y su capacidad para producir miles de embriones significan que se puede realizar un cribado de drogas de alto rendimiento utilizando embriones o larvas de pez cebra50,51. Además, con los avances en ciencia y tecnología, las microinyecciones robóticas pueden administrarse de manera precisa y efectiva, y pueden usarse para inyectar grandes cantidades de embriones o larvas52,53. La aplicación del sistema de inyección microrobótica a la investigación neuronal, para la inyección oportuna de materiales en un gran número de embriones o larvas, facilitará la detección a gran escala de biomoléculas y compuestos farmacológicos.

En este estudio, el pez cebra a 5 dpf fue inyectado con LPS a una concentración de 2.5-5 mg / ml; Esto se determinó como la condición óptima para el desarrollo del modelo de neuroinflamación. Hasta donde sabemos, esta metodología no ha sido descrita en la literatura. En consecuencia, la microinyección ventricular cerebral de LPS en larvas de pez cebra fue capaz de causar pérdida de neuronas y deficiencia de locomoción. Además, nuestros resultados demostraron que la neuroinflamación inducida por LPS aumenta los niveles de mediadores proinflamatorios como NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β, y conduce al reclutamiento de neutrófilos en el cerebro larval del pez cebra a las 24 h después de la inyección. En otros modelos animales, la inyección de LPS también puede promover el desarrollo de inflamación y causar alteraciones neuropatológicas en el cerebro13,54. Los resultados de este estudio amplían nuestra comprensión de las vías neuroinflamatorias. En este método, debe tenerse en cuenta que la apertura de las agujas para microinyección no debe ser demasiado grande para evitar el daño cerebral causado por la operación mecánica, y se debe aplicar una cantidad razonable de fuerza para evitar dañar las larvas. Además, es importante separar la cabeza de los ojos y el cuerpo del pez cebra para la determinación de factores inflamatorios y óxido nítrico, ya que esto ayudará a obtener resultados direccionales que reflejen específicamente la neuroinflamación inducida por la inyección ventricular cerebral LPS.

Una ligera desventaja de este método es que, debido al pequeño tamaño de las larvas de pez cebra, las cantidades de biomoléculas como el ARNm total obtenidas por homogeneización y extracción son menores que las del modelo de ratón. Sin embargo, el pez cebra puede desovar con frecuencia con varios cientos de huevos cada semana. El aumento del número de larvas de pez cebra utilizadas en cada grupo puede proporcionar cantidades suficientes de biomoléculas extraídas para diferentes ensayos bioquímicos. En conclusión, este método induce neurotoxicidad y una respuesta inmune en el cerebro larvario del pez cebra. Debido a la transparencia del pez cebra, los cambios en el cerebro larval vivo del pez cebra se pueden comprender mejor a través de imágenes in vivo . La técnica descrita aquí es una excelente herramienta para evaluar rápida y eficientemente posibles fármacos antineuroinflamatorios.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (FDCT) de la RAE de Macao (Ref. FDCT0058/2019/A1 y 0016/2019/AKP), Comité de Investigación, Universidad de Macao (MYRG2020-00183-ICMS y CPG2022-00023-ICMS), y Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81803398).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

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Neurociencia Número 186 Cerebro microinyección de ventrículo pez cebra lipopolisacárido neuroinflamación neurotoxicidad
Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad
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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

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