Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Hjärnan ventrikulära mikroinjektioner av lipopolysackarid i larv zebrafisk för att bedöma neuroinflammation och neurotoxicitet

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64313

Summary

Detta protokoll visar mikroinjektionen av lipopolysackarid i hjärnans ventrikulära region i en zebrafisklarvmodell för att studera det resulterande neuroinflammatoriska svaret och neurotoxiciteten.

Abstract

Neuroinflammation är en nyckelspelare i olika neurologiska sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Därför är det av stort intresse att forska och utveckla alternativa in vivo neuroinflammationsmodeller för att förstå neuroinflammationens roll i neurodegeneration. I denna studie utvecklades och validerades en larvzebrafiskmodell av neuroinflammation medierad genom ventrikulär mikroinjektion av lipopolysackarid (LPS) för att inducera ett immunsvar och neurotoxicitet. De transgena zebrafisklinjerna elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP och mpo: EGFP användes för kvantifiering i realtid av hjärnans neuronlivskraft genom fluorescens levande avbildning integrerad med fluorescensintensitetsanalys. Det lokomotoriska beteendet hos zebrafisklarver registrerades automatiskt med hjälp av en videospårningsinspelare. Innehållet av kväveoxid (NO) och mRNA-uttrycksnivåerna av inflammatoriska cytokiner inklusive interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) och human tumörnekrosfaktor α (TNF-α) undersöktes för att bedöma det LPS-inducerade immunsvaret i larvzebrafiskhuvudet. Vid 24 timmar efter hjärnans ventrikulära injektion av LPS observerades förlust av neuroner och rörelsebrist hos zebrafisklarver. Dessutom ökade LPS-inducerad neuroinflammation NO-frisättning och mRNA-uttrycket av IL-6, IL-1β och TNF-α i huvudet på 6 dagar efter befruktning (dpf) zebrafisklarver och resulterade i rekrytering av neutrofiler i zebrafiskhjärnan. I denna studie bestämdes injektion av zebrafisk med LPS i en koncentration av 2,5-5 mg/ml vid 5 dpf som det optimala tillståndet för denna farmakologiska neuroinflammationsanalys. Detta protokoll presenterar en ny, snabb och effektiv metod för hjärnkammarmikroinjektion av LPS för att inducera LPS-medierad neuroinflammation och neurotoxicitet i en zebrafisklarv, vilket är användbart för att studera neuroinflammation och kan också användas som en högkvalitativ in vivo-läkemedelsscreeninganalys.

Introduction

Neuroinflammation har beskrivits som en avgörande anti-neurogen faktor som är involverad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS)1. Efter patologiska förolämpningar kan neuroinflammation leda till olika negativa konsekvenser, inklusive hämning av neurogenes och induktion av neuronal celldöd 2,3. I processen som ligger till grund för svaret på inflammationsinduktion utsöndras flera inflammatoriska cytokiner (såsom TNF-α, IL-1β och IL-6) i det extracellulära utrymmet och fungerar som avgörande komponenter i neurondöd och undertryckande av neurogenes 4,5,6.

Mikroinjektion av inflammationsmediatorer (såsom IL-1β, L-arginin och endotoxiner) i hjärnan kan orsaka neuronal cellreduktion och neuroinflammation 7,8,9. Lipopolysackarid (LPS, figur 1), ett patogent endotoxin som finns i cellväggen hos gramnegativa bakterier, kan inducera neuroinflammation, förvärra neurodegeneration och minska neurogenes hos djur10. LPS-injektion direkt i CNS i mushjärnan ökade nivåerna av kväveoxid, proinflammatoriska cytokiner och andra regulatorer11. Dessutom kan stereotaxisk injektion av LPS i den lokala hjärnmiljön inducera överdriven produktion av neurotoxiska molekyler, vilket resulterar i nedsatt neuronal funktion och efterföljande utveckling av neurodegenerativa sjukdomar 10,12,13,14,15. Inom neurovetenskap är levande och tidsförloppsmikroskopiska observationer av cellulära och biologiska processer i levande organismer avgörande för att förstå mekanismerna bakom patogenes och farmakologisk verkan16. Levande avbildning av musmodeller av neuroinflammation och neurotoxicitet begränsas emellertid i grunden av mikroskopins begränsade optiska penetrationsdjup, vilket utesluter funktionell avbildning och levande observation av utvecklingsprocesser17,18,19. Därför är utvecklingen av alternativa neuroinflammationsmodeller av stort intresse för att underlätta studien av patologisk utveckling och mekanismen bakom neuroinflammation och neurodegeneration genom levande avbildning.

Zebrafisk (Danio rerio) har framstått som en lovande modell för att studera neuroinflammation och neurodegeneration på grund av dess evolutionärt bevarade medfödda immunsystem, optisk transparens, stor embryokopplingsstorlek, genetisk dragbarhet och lämplighet för in vivo-avbildning 19,20,21,22,23 . Tidigare protokoll har antingen injicerat LPS direkt i äggulan och bakhjärnan hos larvzebrafisk utan mekanistisk bedömning, eller helt enkelt tillsatt LPS till fiskvatten (odlingsmedium) för att inducera ett dödligt systemiskt immunsvar24,25,26,27. Häri utvecklade vi ett protokoll för mikroinjektion av LPS i hjärnventriklarna, för att utlösa ett medfött immunsvar eller neurotoxicitet under 5 dagar efter befruktning (dpf) zebrafisklarver. Detta svar framgår av neuronal cellförlust, lokomotoriskt beteendeunderskott, ökad nitritoxidfrisättning, aktivering av inflammatoriskt genuttryck och rekrytering av neutrofiler i zebrafiskhjärnan vid 24 timmar efter injektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AB zebrafisk av vild typ och transgena zebrafisklinjer elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP och mpo: EGFP erhölls från Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS). Etiskt godkännande (UMARE-030-2017) för djurförsöken beviljades av Animal Research Ethics Committee, University of Macau, och protokollet följer riktlinjerna för institutionell djurvård.

1. Zebrafiskembryo och larvhållning

  1. Generera zebrafiskembryon (200-300 embryon per parning) genom naturlig parvis parning som tidigare rapporterats28.
  2. Förbered äggvatten (E3) medium lager (60×) genom att lösa 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2·2H 2 O och 9,78 g MgCl2·6H 2 O i ddH 2 O till en slutlig volym av 2 L och justera pH till7,2med NaOH och HCl. För att bereda arbetskoncentrationen av E3-medium (1×), späd buljongen 60 gånger i ddH 2O. Förvara vid 28,5 °C när den inte används.
  3. Använd en plastöverföringspipett för att överföra zebrafiskembryon till en skål som innehåller E3-medium. Lyft embryona vid 28,5 °C i en inkubator och övervaka deras utveckling och hälsa. Ta bort döda embryon och ersätt orent E3-medium med färskt medium dagligen.
  4. För zebrafiskavbildningsexperiment, använd en plastöverföringspipett för att samla 0-2 h efter befruktning (hpf) embryon (cirka 200 ägg) i cirka 15 ml 1× E3-medium innehållande 0,003% N-fenyltiourea (PTU).
    OBS: PTU kan hämma bildandet av melanoforer under embryogenesen29. Behandling av embryon med PTU under embryogenesen kan förbättra signaldetekteringen i mikroskopi eller uttryck av fluorescens30.
  5. Behåll zebrafiskembryon under ovanstående förhållanden tills embryon når det önskade utvecklingslarvstadiet.

2. Förberedelser för mikroinjektion

  1. Förbered injektionen genom att dra i glaskapillärer med hjälp av en mikropipettdragare (se materialtabell), enligt femstegsprotokollet för glaskapillärrörsdragning (tabell 1).
  2. Öppna nålspetsen (tunnväggiga glaskapillärer [3,5 tum] med glödtråd, OD 1,14 mm) till lämplig storlek i vinkel med pincett (figur 2A).
  3. Fyll nålen med 0,1 ml mineralolja för att säkerställa att det inte finns några bubblor.
  4. Ta bort skruvlocket på stålnålen på mikroinjektionsapparaten. Rikta in glasnålhålet med stålnålen och dra sedan åt skruvlocket. Montera den laddade nålmikroinjektionsapparaten i en mikromanipulator (se materialförteckning).
  5. Justera mikroinjektionsapparatens position så att mikromanipulatorn flexibelt kan flytta apparaten under mikroskopet. Släpp ut en viss volym paraffinolja för att få stålnålen att komma in i kapillärglasröret.
  6. Släpp injektionslösningen (t.ex. 1× PBS eller 5 mg/ml LPS) på en glasskiva steriliserad med 70 % etanol och justera mikroinjektionsapparaten så att spetsen förs in i vätskedroppen. Ladda ~ 2 μL injektionslösning i nålen.
  7. Ställ in mikromanipulatorn (finjusteringsinställningar upp, ner, vänster och höger) så att nålspetsen på mikroinjektionsapparaten är i samma synfält som larverna vid hög förstoring (figur 2B).

3. Montering av zebrafisk för mikroinjektioner

OBS: Zebrafiskhjärnans utveckling sker inom 3 dpf och mognar vid 5 dpf med ett välutvecklat centralt nervsystem31,32. Därför är 5 dpf larver redan lämpliga för att studera LPS-medierad neuronal skada samt beteendemässiga och inflammatoriska svar.

  1. Injicera zebrafisklarverna inom cirka 30 minuter efter att ha nått intressestadiet för att bibehålla konsistensen av injektionstidpunkten.
  2. För att bedöva zebrafisklarverna, kombinera tricaine med rent akvariumvatten (slutlig koncentration på 0,02% w / v tricaine).
  3. Smält en lösning av 2% agaros i ddH2O med en mikrovågsugn. Häll den smälta agarosen i en plastskål. Den 2% agarosbelagda plastskålen kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
  4. Använd en plastöverföringspipett för att transportera bedövade larver till mitten av den 2% agarosbelagda plastskålen. Orientera de monterade larverna med hjärnsidan uppåt för nålåtkomst.

4. Injicera hjärnkammaren

  1. Justera mikroskopets förstoring så att hjärnkammarens ventrikulära struktur av zebrafisk tydligt visas i synfältet (Figur 2B).
  2. Placera nålen försiktigt ovanför hjärntectum (figur 2C).
  3. Punktera huden på zebrafiskhjärnan med nålspetsen långsamt med hjälp av mikromanipulatorn.
  4. Tryck på fotpedalen för att mata ut 1 nL 1x PBS eller olika koncentrationer av LPS (1,0, 2,5 och 5,0 mg / ml) (se materialförteckning). Framgångsrika ventrikelinjektionsbilder vid vilka hjärnkammaren injicerades med 1 nL av 1% Evans blått färgämne (utspätt i PBS) visas som ett exempel (figur 2D). Överför larverna till rent E3-medium omedelbart efter injektionen. Efter 24 h, samla larverna för mikroskopisk avbildning, lokomotivbeteendeanalys och bestämning av andra indikatorer.

5. Bildbehandling

  1. Förbered 1,5% lågsmält agaroslösning i E3-medium och värm den i en mikrovågsugn för att bilda en klar vätska.
  2. Använd en ren plastöverföringspipett för att transportera larverna till en glasskiva och ta bort så mycket vatten som möjligt.
  3. Använd en plastöverföringspipett för att tillsätta en droppe 1,5% lågsmältande agaros till larverna.
    OBS: Kyl den lågsmälta agarosen i pipetten ett tag innan du tillsätter för att inte skada larverna.
  4. Använd en 1 ml sprutnål för att orientera larverna. Vänta tills agarosen svalnar och stelnar innan du börjar bilda.
  5. Observera och fotografera neuronregionen i hela hjärnan hos Tg(ETvmat2:EGFP) och Tg(elavl3:mCherry) zebrafisk, samt rekryteringen av neutrofiler i Tg(mpo:EGFP)-zebrafiskhjärnan under ett fluorescensstereomikroskop (se Materialförteckning).
    OBS: Fluorescensmikroskopinställningar som används för avbildning visas nedan. Tg(ETvmat2:EGFP) zebrafiskhjärna (excitationsvåglängd: 450-490 nm, emissionsvåglängd: 500-550 nm, visuell förstoring: 100x); Tg(elavl3:mCherry) zebrafiskhjärna (excitationsvåglängd: 541-551 nm, emissionsvåglängd: 590 nm, visuell förstoring: 100x); Tg(mpo:EFGP) zebrafiskhjärna (excitationsvåglängd: 450-490 nm, emissionsvåglängd: 500-550 nm, visuell förstoring: 63x).
  6. Mät och analysera fluorescensintensiteten och längden på Ra-neuronregionen i Tg (ETvmat2: EGFP) zebrafisk och fluorescensintensiteten hos Tg (elavl3: mCherry) zebrafiskhjärnneuroner med hjälp av ImageJ-programvara. Räkna neutrofilerna manuellt i hjärnregionen av Tg (mpo: EFGP) zebrafisk.

6. Bestämning av markörer för genuttryck

  1. Vid 24 timmar efter LPS hjärnkammarinjektion, fortsätt med bestämningen av genuttrycksmarkörer. För att göra det, bedöva zebrafisklarver med 0,02% tricaine (som nämns i steg 3.2).
  2. Använd två 1 ml sprutor för att separera larvernas huvuddelar (40 larver per grupp) utan ögon- och äggula sac-regionerna (figur 2E).
  3. Extrahera RNA från larvhuvuddelarna.
    1. För RNA-extraktion, homogenisera huvuddelen med 200 μl RNA-extraktionsreagens (se materialtabell) med hjälp av en vävnadskvarn (se materialtabell) med en rotationshastighet på 11 000 rpm i 5 s.
    2. Utför RNA-extraktion med kloroform-isopropanolmetoden. För att göra det, tillsätt 40 μL kloroform, skaka rören kraftigt och inkubera dem vid rumstemperatur i 10 min. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 °C.
    3. Överför vattenfasen till ett nytt rör (ca 100 μl) och tillsätt 100 μl isopropanol. Inkubera i 10 minuter och centrifugera sedan vid 12 000 x g i 10 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
    4. Tillsätt 200 μl 75% etanol för att tvätta RNA-pelleten. Virvla proverna en kort stund och centrifugera sedan vid 7500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och tvätta RNA-pelleten igen.
    5. Lufttorka RNA-pelleten i 5-10 min, tillsätt sedan 30 μL RNas-fritt vatten för att lösa upp RNA-pelleten. Kontrollera renheten (förhållandet mellan absorbans vid 260 nm och 280 nm) och integriteten hos RNA med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer (se materialförteckning).
  4. Syntetisera cDNA från det RNA som extraherades i steg 6.3 med hjälp av omvänd transkriptas med slumpmässiga primers (se materialförteckning).
    1. Tillsätt 1 μl slumpmässiga primers, 1 μl dNTP, 1 μg RNA och destillerat vatten (total volym till 12 μl) till ett nukleasfritt rör. Värm blandningen till 65 °C i 5 min och kyl snabbt på is.
    2. Tillsätt 1 μl 0,1 M DTT, 1 μL RNas-hämmare, 4 μl 5× förstasträngsbuffert och 1 μL M-MLV omvänd transkriptas (total volym: 20 μL) till röret. Blanda försiktigt och inkubera röret vid 25 °C i 2 minuter, följt av 42 °C i 50 minuter. Inaktivera reaktionen genom att värma vid 70 °C i 15 minuter.
  5. Utför PCR i realtid på ett qPCR-system (se materialtabell) med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt RT-qPCR-kit (se materialtabell) för att bestämma uttrycket av målgenerna (IL-1β, IL-6 och TNF-α). Reaktionsblandningen (20 μL) innehöll 10 μL SYBR-grönt, 0,4 μL ROX-referensfärgämne, 0,8 μL vardera av de främre och bakre primerarna, 6 μLddH2O- och 2 μL mall-cDNA (1 μg). Utför PCR-förstärkning under förhållandena: 95 °C i 30 s, följt av 40 cykler med 95 °C i 5 s och 60 °C i 34 s, och med ett dissociationssteg på 95 °C under 15 s, 60 °C under 60 s och 95 °C i 15 s.
  6. Normalisera mRNA-nivåerna för målgenerna till en hushållningsgen, förlängningsfaktor 1 α (Ef1α). Beräkna uttrycksnivåerna för varje målgen med 2−ΔΔCT-metoden33. Primersekvenserna för varje gen beskrivs i tabell 2.
  7. För bestämning av kväveoxid, homogenisera huvuddelen (erhållen i steg 6.2) i 100 μL kall PBS med hjälp av en vävnadskvarn. Centrifugera den resulterande PBS- och huvudportionssuspensionen vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 °C. Samla lysaterna och utför nitritkoncentrationsanalys34 med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (se materialtabell).

7. Zebrafisk lokomotiv beteendeanalys

  1. Vid 24 h efter LPS hjärnkammarinjektion, överför zebrafisklarverna till brunnarna på en 96-brunns kvadratisk mikroplatta individuellt. Tillsätt 300 μl E3-medium till varje brunn och inkubera sedan larverna i 4 timmar för att acklimatisera sig till testplattan.
  2. Överför den larvbelastade mikroplattan till zebrafiskens spårningsruta (se Materialförteckning). Slå på ljuskällan och inkubera sedan larverna i testboxen i 30 min för att acklimatisera miljön.
  3. Övervaka och spela in zebrafiskens beteende med hjälp av ett automatiserat videospårningssystem. Spela in 12 sessioner (5 min vardera, totalt 1 h) för varje zebrafisk. Definiera det totala avståndet (består av inaktiva, små och stora avstånd) som avståndet (i mm) som varje fisk rörde sig under en 60 minuters spårningsperiod.

8. Statistisk analys

  1. Utföra statistiska analyser med hjälp av standardanalysprogramvara (se Materialförteckning).
  2. Utföra statistisk analys av skillnader mellan två grupper med vanlig envägs ANOVA. Beräkna Pearsons korrelationskoefficient för att bedöma korrelationsstyrkan. P < 0,05 ansågs signifikant i alla analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbetsflödet som beskrivs här presenterar en ny, snabb och effektiv metod för att inducera LPS-medierad neuroinflammation och neurotoxicitet hos zebrafisklarver. I detta beskrivna protokoll injicerades 5 dpf zebrafiskar med LPS (figur 1) i hjärnans ventriklar med hjälp av en mikroinjektor (figur 2A-C). Framgångsrik injektion i hjärnans ventrikelställe verifierades med 1% Evans blå fläck (figur 2D). Zebrafiskhuvudet separerades från ögonen och kroppen med hjälp av sprutor (figur 2E) för att utesluta påverkan av inflammatoriskt cytokinuttryck och kväveoxidfrisättning i zebrafiskkroppen vid bestämning av neuroinflammation och neurotoxicitet i hjärnan.

Samma volym PBS (som LPS) injicerades i zebrafiskens hjärnkammare som en skenopererad kontroll. Inga signifikanta skillnader observerades mellan kontroll- och skenopererade grupper i neuronerna, särskilt från särskilt den främre gruppen av raphekärnor (Ra) (figur 3A-C), fluorescensintegrerad densitet hos hjärnneuronerna (figur 3D,E), zebrafiskens totala rörelseavstånd (figur 4A,B), NO-produktion och mRNA-uttryck av proinflammatoriska cytokiner (TNF-α, IL-6 och IL-1β) (figur 4A-D) och rekrytering av neutrofiler till larvzebrafiskhjärnan (figur 6A,B). Dessa resultat visade att korrekt mikroinjektion inte orsakar någon neurotoxicitet och neuroinflammation hos zebrafisk.

Efter behandling i 24 timmar, hjärnan ventrikulär injektion av LPS inducerad neurotoxicitet i zebrafisk. LPS (1-5 mg / ml) inducerade en signifikant förlust av Ra-neuroner i hjärnan hos Tg (ETvmat2: GFP) larvzebrafisk jämfört med kontroll- och skengrupperna (figur 3A-C). Den transgena linjen elav13: mCherry zebrafisk skisserar neuronala celler med det kärnröda fluorescerande proteinet35. Som visas i figur 3D,E ledde 2,5-5 mg / ml LPS till signifikanta förändringar i fluorescensintegrerad densitet hos hjärnneuronerna i denna larvzebrafisklinje. LPS-injektionsgruppen på 1 mg/ml visade emellertid ingen effekt på den fluorescensintegrerade densiteten hos hjärnneuronerna i jämförelse med kontroll- och skengrupperna. Vidare inducerade 5 mg / ml LPS en rörelsebrist (figur 4A) och minskade det totala rörelseavståndet för zebrafisk under en 60 minuters spårningsperiod (figur 4B). Resultaten visade att 1-2.5 mg/mL LPS kunde inducera förlust av nervceller men ingen signifikant rörelsebrist.

Dessutom kan hjärnans ventrikulära injektion av LPS också aktivera det inflammatoriska svaret i zebrafiskhjärnan. NO-produktion (figur 5A) och mRNA-uttryck av proinflammatoriska cytokiner (TNF-α, IL-6 och IL-1β) (figur 5B-D) i huvudet på zebrafisklarver ökade vid 2,5-5 mg / ml LPS-behandling jämfört med uttrycket i kontroll- och bluffgrupperna. Efter 1-5 mg/ml LPS-injektion observerades rekryteringen av neutrofiler till larvalzebrafiskhjärnan (figur 6A), vilket resulterade i en signifikant ökning av antalet neutrofiler i Tg(mpo:EGFP) zebrafiskhjärnregionen (figur 6B).

Steg Drifttid (sek) Värmenivå Handling
T1 L> H80-89 P1L005
T2 1.6-3 H00
T3 L> H00 P2L001c
T4 3 H00 SVAL
T5 0 H00

Tabell 1: Femstegsprotokoll för dragning av glaskapillärrör.

Primer namn Sekvens
IL-1β framåt 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3'
IL-1β omvänd 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3'
IL-6 framåt 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3'
IL-6 omvänd 5'-TCTTTCCCTCTTTTTCCTG-3'
TNF-α framåt 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTA-3'
TNF-α omvänd 5'-TGTGAGTCTCAGACACTTCCATC-3'
Ef1α framåt 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3'
Ef1α omvänd 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3'

Tabell 2: Primers som används i realtid qPCR.

Figure 1
Figur 1: Allmän struktur för lipopolysackarid (LPS). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Mikroinjektionsinställning, kroppshållning och zebrafiskens position och separation av huvuddelen. (A) Val av glasnål: använd en pincett för att skära spetsen på en fördragen nål under mikroskopet för att få en nål med en liknande öppning som visas i figuren. (B) Justera mikroskopets brännvidd så att hjärnkammarens område hos zebrafisklarver kan observeras vid hög förstoring (skisserat i svart). Ljusblå cirklar indikerar injektionsstället. (C) De monterade larverna måste orienteras med hjärnsidan uppåt för nålåtkomst (hjärntectum indikerat med röd cirkel). (D) Demonstration av framgångsrik ventrikulär injektion med Evans blå i zebrafisklarvernas hjärna. (E) Zebrafiskhuvuddel utan ögon- och äggulasäcksregioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Hjärnkammarinjektion av LPS ablaterar neuroner efter 24 timmar i zebrafisklarver. (A) (Överst) Representativa fluorescensmikroskopibilder av vmat2: GFP zebrafisk efter behandling med olika koncentrationer av LPS (röda parenteser indikerar raphekärnor [Ra] neuroner; skalstång = 265,2 μm). (Nederst) Ra neuronal region förstorades för att förbättra den morfologiska visualiseringen. (B,C) Genomsnittlig fluorescensintensitet och längd av Ra-neuronregionen i vmat2: GFP zebrafisklarver. (D,E) Representativ morfologi (skalstreck = 265,2 μm) och genomsnittlig fluorescensintensitet hos Tg(elavl3:mCherry) zebrafiskhjärnneuroner. Data uttrycks i procent av kontrollgruppen. *P < 0,05 och **P < 0,01 jämfört med kontrollgrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Hjärnkammarinjektion av LPS inducerar rörelsebrist efter 24 timmar hos zebrafisklarver . (A) Representativa mönster för zebrafiskens rörelsespår. I den digitala spårningskartan representeras höghastighetsrörelse av röda linjer (> 6,6 mm / s); medelhastighetsrörelse avbildas av gröna linjer (3,3-6,6 mm/s); Låghastighetsrörelse avbildas av svarta linjer (< 3,3 mm/s). (B) Kvantitativ analys av den genomsnittliga totala sträckan som zebrafisken tillryggalagt på 60 minuter *P < 0,05 jämfört med kontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Hjärnkammarinjektion av LPS ökar proinflammatoriska mediatorer . (A) Kväveoxidnivåerna mättes med hjälp av Griess-reagens. (BD) Genuttrycksnivåerna av interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) och tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) i zebrafiskhuvudet undersöktes av qPCR. *P < 0,05 och **P < 0,01 jämfört med kontrollgrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: LPS hjärnkammarmikroinjektion leder till rekrytering av neutrofiler i zebrafiskhjärnan efter 24 h. (A) Migration av neutrofiler (område inuti den röda cirkeln) in i larvernas huvud efter LPS hjärnkammarinjektion (skalstång = 851,1 μm). (B) Antalet neutrofiler i larvhuvuden efter LPS hjärnkammarinjektion. *P < 0,05 och **P < 0,01 jämfört med kontrollgrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tilläggsfil 1: Rådata Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En ökande mängd epidemiologiska och experimentella data implicerar kroniska bakteriella och virusinfektioner som möjliga riskfaktorer för neurodegenerativa sjukdomar36. Infektionen utlöser aktivering av inflammatoriska processer och värdimmunsvar37. Även om svaret fungerar som en försvarsmekanism, är överaktiverad inflammation skadlig för neurogenes, och den inflammatoriska miljön tillåter inte överlevnad av nyfödda neuroner38. Som ett resultat orsakar det skador på värdens neuronala funktioner och livskraft. Studier tyder på att inflammation spelar en viktig roll i patofysiologin för neurodegeneration39.

Som ett ofta studerat patogent endotoxin har LPS varit inblandat i hämningen av neurogenes och neurodegeneration. LPS-aktivering av inflammatoriska processer försämrar signifikant neurogenesen, delvis genom produktion av NO, TNF-α, IL-6 och IL-1β40. En växande mängd bevis visar att LPS orsakar beteendeunderskott och neuronal förlust och påverkar neurogenesprogressionen när den injiceras centralt i neurodegenerativa gnagarmodeller10,38. Zebrafiskmodeller har använts i stor utsträckning som alternativa experimentella modeller för att studera immunsvar41 och screena nya antiinflammatoriska läkemedel. Zebrafiskens medfödda och adaptiva immunsystem liknar däggdjurens42. Dessutom har vissa studier identifierat flera inflammatoriska cytokiner och receptorer som finns hos däggdjur i zebrafisken CNS43. Tidigare studier tyder på att nedsänkning av zebrafiskembryon/larver i LPS eller injicering av LPS i äggulan hos zebrafisklarver kan inducera immunsvaret och öka proinflammatoriska faktorer i samband med inflammation44,45. Den specifika effekten av LPS på zebrafisk nervvävnad och på induktion av neuroinflammation är dock ännu inte känd.

Även om gnagarmodeller har många fördelar jämfört med andra djurmodeller, är deras begränsningar när det gäller realtidsavbildning in vivo och läkemedelsscreening uppenbara. In vivo-avbildning används ofta för att undersöka mekanismerna bakom nervsystemets utveckling och patologiska hjärnförändringar som ett kraftfullt och icke-invasivt verktyg46,47. På grund av den optiska transparensen hos zebrafiskembryon och larver är de väl lämpade för levande avbildningsexperiment av hjärnobservation48,49. I synnerhet innebär zebrafiskens ringa storlek och deras förmåga att producera tusentals embryon att screening av läkemedel med hög kapacitet kan utföras med hjälp av zebrafiskembryon eller larver50,51. Med utvecklingen inom vetenskap och teknik kan dessutom robotmikroinjektioner levereras exakt och effektivt och kan användas för att injicera stora mängder embryon eller larver52,53. Tillämpningen av det mikrorobotiska injektionssystemet på neuronal forskning, för snabb injektion av material i ett stort antal embryon eller larver, kommer att underlätta storskalig screening av biomolekyler och läkemedelsföreningar.

I denna studie injicerades zebrafisk vid 5 dpf med LPS i en koncentration av 2,5-5 mg/ml; Detta bestämdes som det optimala villkoret för utveckling av neuroinflammationsmodell. Såvitt vi vet har denna metod inte beskrivits i litteraturen. Följaktligen kunde hjärnans ventrikulära mikroinjektion av LPS i zebrafisklarver orsaka förlust av neuroner och rörelsebrist. Dessutom visade våra resultat att LPS-inducerad neuroinflammation ökar nivåerna av proinflammatoriska mediatorer som NO, TNF-α, IL-6 och IL-1β, och leder till rekrytering av neutrofiler i larvzebrafiskhjärnan vid 24 timmar efter injektion. I andra djurmodeller kan LPS-injektion också främja utvecklingen av inflammation och orsaka neuropatologiska förändringar i hjärnan13,54. Resultaten från denna studie främjar vår förståelse av neuroinflammatoriska vägar. I denna metod bör det noteras att öppningen av nålar för mikroinjektion inte bör vara för stor för att undvika hjärnskador orsakade av mekanisk drift, och en rimlig mängd kraft bör appliceras för att undvika att larverna skadas. Dessutom är det viktigt att separera huvudet från zebrafiskens ögon och kropp för bestämning av inflammatoriska faktorer och kväveoxid, eftersom detta kommer att bidra till att få riktningsresultat som specifikt återspeglar neuroinflammation inducerad av LPS hjärnkammarinjektion.

En liten nackdel med denna metod är att på grund av den lilla storleken på zebrafisklarver är mängderna biomolekyler såsom totalt mRNA erhållet genom homogenisering och extraktion lägre än för musmodellen. Zebrafisk kan dock leka ofta med flera hundra ägg varje vecka. Att öka antalet zebrafisklarver som används i varje grupp kan ge tillräckliga mängder extraherade biomolekyler för olika biokemiska analyser. Sammanfattningsvis inducerar denna metod neurotoxicitet och ett immunsvar i larvzebrafiskhjärnan. På grund av zebrafiskens transparens kan förändringar i larvens levande zebrafiskhjärna förstås bättre via in vivo-avbildning . Tekniken som beskrivs här är ett utmärkt verktyg för att snabbt och effektivt utvärdera möjliga anti-neuroinflammatoriska läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiskt intresse.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidrag från Science and Technology Development Fund (FDCT) i Macao SAR (Ref. FDCT0058/2019/A1 och 0016/2019/AKP), forskningskommittén, University of Macau (MYRG2020-00183-ICMS och CPG2022-00023-ICMS) och National Natural Science Foundation of China (nr 81803398).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

Tags

Neurovetenskap Fråga 186 Hjärna ventrikelmikroinjektion zebrafisk lipopolysackarid neuroinflammation neurotoxicitet
Hjärnan ventrikulära mikroinjektioner av lipopolysackarid i larv zebrafisk för att bedöma neuroinflammation och neurotoxicitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Y., Lee, S. M. Y. BrainMore

He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter