Summary
Bu protokol, ortaya çıkan nöroinflamatuar yanıtı ve nörotoksisiteyi incelemek için bir zebra balığı larva modelinde beyin ventriküler bölgesine lipopolisakkaritin mikroenjeksiyonunu göstermektedir.
Abstract
Nöroinflamasyon, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli nörolojik bozukluklarda önemli bir oyuncudur. Bu nedenle, nöroinflamasyonun nörodejenerasyondaki rolünü anlamak için alternatif in vivo nöroinflamasyon modellerinin araştırılması ve geliştirilmesi büyük ilgi görmektedir. Bu çalışmada, immün yanıtı ve nörotoksisiteyi indüklemek için lipopolisakkaritin (LPS) ventriküler mikroenjeksiyonunun aracılık ettiği larva zebra balığı nöroinflamasyon modeli geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, floresan yoğunluk analizi ile entegre floresan canlı görüntüleme ile beyin nöron canlılığının gerçek zamanlı olarak ölçülmesi için kullanılmıştır. Zebra balığı larvalarının lokomotor davranışı, bir video izleme kaydedici kullanılarak otomatik olarak kaydedildi. Larva zebra balığı kafasında LPS-indüklenen immün yanıtı değerlendirmek için nitrik oksit (NO) içeriği ve interlökin-6 (IL-6), interlökin-1β (IL-1β) ve insan tümör nekroz faktör α (TNF-α) dahil olmak üzere inflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyon düzeyleri araştırıldı. LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarında nöron kaybı ve hareket eksikliği gözlendi. Ek olarak, LPS'ye bağlı nöroinflamasyon, döllenme sonrası 6 gün (dpf) zebra balığı larvalarının başında NO salınımını ve IL-6, IL-1β ve TNF-α mRNA ekspresyonunu arttırdı ve zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasıyla sonuçlandı. Bu çalışmada, zebra balıklarının LPS ile 5 dpf'de 2.5-5 mg / mL konsantrasyonda enjeksiyonu, bu farmakolojik nöroinflamasyon testi için en uygun koşul olarak belirlenmiştir. Bu protokol, bir zebra balığı larvasında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için LPS'nin beyin ventrikülü mikroenjeksiyonu için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunar; bu, nöroinflamasyonu incelemek için yararlıdır ve aynı zamanda yüksek verimli bir in vivo ilaç tarama testi olarak da kullanılabilir.
Introduction
Nöroinflamasyon, merkezi sinir sisteminin (MSS) çeşitli nörodejeneratif hastalıklarının patogenezinde rol oynayan önemli bir anti-nörojenik faktör olarak tanımlanmıştır1. Patolojik hakaretleri takiben, nöroinflamasyon, nörogenezin inhibisyonu ve nöronal hücre ölümünün indüklenmesi de dahil olmak üzere çeşitli olumsuz sonuçlara yol açabilir 2,3. Enflamasyon indüksiyonuna yanıtın altında yatan süreçte, çoklu inflamatuar sitokinler (TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi) hücre dışı boşluğa salgılanır ve nörojen ölümünde ve nörogenezin baskılanmasında çok önemli bileşenler olarak işlev görür 4,5,6.
Enflamasyon mediatörlerinin (IL-1β, L-arginin ve endotoksinler gibi) beyne mikroenjeksiyonu, nöronal hücre azalmasına ve nöroinflamasyona neden olabilir 7,8,9. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarında bulunan patojenik bir endotoksin olan lipopolisakkarit (LPS, Şekil 1), nöroinflamasyonu indükleyebilir, nörodejenerasyonu şiddetlendirebilir ve hayvanlarda nörojenezi azaltabilir10. Doğrudan fare beyninin CNS'sine LPS enjeksiyonu, nitrik oksit, pro-inflamatuar sitokinler ve diğer düzenleyicilerin seviyelerini arttırdı11. Ayrıca, LPS'nin lokal beyin ortamına stereotaksik enjeksiyonu, nörotoksik moleküllerin aşırı üretimini indükleyebilir, bu da nöronal fonksiyonun bozulmasına ve ardından nörodejeneratif hastalıkların gelişmesine neden olabilir10,12,13,14,15. Nörobilim alanında, canlı organizmalardaki hücresel ve biyolojik süreçlerin canlı ve zaman içinde mikroskobik gözlemleri, patogenezin ve farmakolojik etkinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir16. Bununla birlikte, nöroinflamasyon ve nörotoksisitenin fare modellerinin canlı görüntülenmesi, mikroskopinin sınırlı optik penetrasyon derinliği ile temel olarak sınırlıdır, bu da fonksiyonel görüntülemeyi ve gelişimsel süreçlerin canlı gözlemini engeller17,18,19. Bu nedenle, alternatif nöroinflamasyon modellerinin geliştirilmesi, patolojik gelişimin ve nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonun altında yatan mekanizmanın canlı görüntüleme ile incelenmesini kolaylaştırmak için büyük ilgi görmektedir.
Zebra balığı (Danio rerio), evrimsel olarak korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi, optik şeffaflığı, büyük embriyo debriyaj boyutu, genetik izlenebilirliği ve in vivo görüntüleme için uygunluğu nedeniyle nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonu incelemek için umut verici bir model olarak ortaya çıkmıştır19,20,21,22,23 . Önceki protokoller, LPS'yi mekanik değerlendirme olmaksızın larva zebra balıklarının yumurta sarısı ve arka beyin ventrikülüne doğrudan enjekte etmiş veya ölümcül bir sistemik bağışıklık tepkisi24,25,26,27 indüklemek için balık suyuna (kültür ortamı) LPS eklemiştir. Burada, döllenme sonrası 5 gün (dpf) zebra balığı larvalarında doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisini veya nörotoksisiteyi tetiklemek için LPS'nin beyin ventriküllerine mikroenjeksiyonu için bir protokol geliştirdik. Bu yanıt, nöronal hücre kaybı, lokomotor davranış eksikliği, artmış nitrit oksit salınımı, enflamatuar gen ekspresyonunun aktivasyonu ve enjeksiyondan 24 saat sonra zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınması ile kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB vahşi tip zebra balığı ve transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, Çin Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden (ICMS) elde edilmiştir. Hayvan deneyleri için etik onay (UMARE-030-2017) Makao Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından verilmiş ve protokol kurumsal hayvan bakım kılavuzlarını izlemektedir.
1. Zebra balığı embriyo ve larva yetiştiriciliği
- Zebra balığı embriyoları (çiftleşme başına 200-300 embriyo) daha önce bildirildiği gibi doğal çift çiftleşme yoluyla üretin28.
- ddH 2 O'da 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H2 O ve9,78 g MgCl2·6H 2 O çözerek yumurta suyu (E3) orta boy stoğunu (60×) hazırlayın ve NaOH ve HCl kullanarakpH'ı7,2'ye ayarlayın. E3 ortamının (1×) çalışma konsantrasyonunu hazırlamak için, stoku kullanılmadığında 28,5 °C'de ddH2O. Store'da 60 kez seyreltin.
- Zebra balığı embriyolarını E3 ortamı içeren bir kaba aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın. Embriyoları bir inkübatörde 28.5 ° C'de yükseltin ve gelişimlerini ve sağlıklarını izleyin. Ölü embriyoları çıkarın ve kirli E3 ortamını günlük taze ortamla değiştirin.
- Zebra balığı görüntüleme deneyleri için, %0,003 N-feniltiourea (PTU) içeren yaklaşık 15 mL 1× E3 ortamında 0-2 saat döllenme sonrası (hpf) embriyo (yaklaşık 200 yumurta) toplamak için plastik bir transfer pipeti kullanın.
NOT: PTU, embriyogenez29 sırasında melanofor oluşumunu inhibe edebilir. Embriyogenez sırasında PTU ile embriyoların tedavisi, mikroskopide sinyal tespitini veya floresan ekspresyonunu iyileştirebilir30. - Zebra balığı embriyolarını, embriyolar istenen gelişimsel larva aşamasına ulaşana kadar yukarıdaki koşullar altında tutun.
2. Mikroenjeksiyona hazırlık
- Cam kılcal boru çekme için beş adımlı protokolü izleyerek, bir mikropipet çektirici kullanarak cam kılcal damarları çekerek enjeksiyona hazırlanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Tablo 1).
- İğnenin ucunu (filamentli ince duvar cam kılcal damarları [3,5 inç], OD 1,14 mm) forseps kullanarak uygun bir açıyla açın (Şekil 2A).
- Kabarcık olmadığından emin olmak için iğneyi 0,1 mL mineral yağ ile doldurun.
- Mikroenjeksiyon aparatının çelik iğnesinin vidalı kapağını çıkarın. Cam iğne deliğini çelik iğneyle hizalayın ve ardından vidalı kapağı sıkın. Yüklenen iğne mikroenjeksiyon aparatını bir mikromanipülatöre monte edin (bkz.
- Mikroenjeksiyon aparatının konumunu, mikromanipülatörün cihazı mikroskop altında esnek bir şekilde hareket ettirebilmesi için ayarlayın. Çelik iğnenin kılcal cam tüpe girmesini sağlamak için belirli bir miktarda parafin yağı boşaltın.
- Enjeksiyon çözeltisini (1× PBS veya 5 mg / mL LPS gibi) % 70 etanol ile sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine bırakın ve mikroenjeksiyon aparatını, ucun sıvı damlasına yerleştirilmesi için ayarlayın. İğneye ~ 2 μL enjeksiyon çözeltisi yükleyin.
- Mikromanipülatörü (yukarı, aşağı, sol ve sağın ince ayar ayarları) mikroenjeksiyon aparatının iğne ucu yüksek büyütmeli larvalarla aynı görüş alanında olacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B).
3. Mikroenjeksiyonlar için zebra balığı montajı
NOT: Zebra balığı beyin gelişimi 3 dpf içinde gerçekleşir ve iyi gelişmiş bir merkezi sinir sistemi31,32 ile 5 dpf'de olgunlaşır. Bu nedenle, 5 dpf larvaları, LPS aracılı nöronal hasarın yanı sıra davranışsal ve enflamatuar yanıtları incelemek için zaten uygundur.
- Enjeksiyon zamanlamasının tutarlılığını korumak için zebra balığı larvalarını ilgilenilen aşamaya ulaştıktan yaklaşık 30 dakika sonra enjekte edin.
- Zebra balığı larvalarını uyuşturmak için, trikaini temiz balık tankı suyuyla birleştirin (son konsantrasyon % 0.02 w / v trikain).
- Bir mikrodalga kullanarak ddH 2 O'da%2'likbir agaroz çözeltisini eritin. Erimiş agarozu plastik bir kaba dökün. %2 agaroz kaplı plastik tabak, 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Anestezi uygulanmış larvaları %2 agaroz kaplı plastik kabın merkezine taşımak için plastik bir transfer pipeti kullanın. İğne erişimi için monte edilmiş larvaları beyin tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
4. Beyin ventrikülünün enjekte edilmesi
- Zebra balıklarının beyin ventriküler yapısı görüş alanında açıkça gösterilecek şekilde mikroskobun büyütülmesini ayarlayın (Şekil 2B).
- İğneyi dikkatlice beyin tektumunun üzerine yerleştirin (Şekil 2C).
- Zebra balığı beyninin derisini, mikromanipülatörü kullanarak iğne ucuyla yavaşça delin.
- 1 nL 1x PBS veya farklı LPS konsantrasyonlarını (1.0, 2.5 ve 5.0 mg/mL) çıkarmak için ayak pedalına basın (bkz. Beyin ventrikülünün 1 nL% 1 Evans mavi boyası (PBS'de seyreltilmiş) ile enjekte edildiği başarılı ventrikül enjeksiyon görüntüleri örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 2D). Larvaları enjeksiyondan hemen sonra E3 ortamını temizlemek için aktarın. 24 saat sonra, mikroskobik görüntüleme, lokomotif davranışsal tahlil ve diğer göstergelerin belirlenmesi için larvaları toplayın.
5. Görüntüleme
- E3 ortamında% 1.5 düşük eriyikli agaroz çözeltisi hazırlayın ve berrak bir sıvı oluşturmak için bir mikrodalgada ısıtın.
- Larvaları bir cam slayta taşımak ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için temiz bir plastik transfer pipeti kullanın.
- Larvalara% 1.5 düşük eriyikli agaroz damlası eklemek için plastik bir transfer pipeti kullanın.
NOT: Larvalara zarar vermemek için eklemeden önce düşük erimiş agarozu pipette bir süre soğutun. - Larvaları yönlendirmek için 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanın. Görüntülemeye başlamadan önce agaroz soğuyana ve katılaşana kadar bekleyin.
- Tg(ETvmat2:EGFP) ve Tg(elavl3:mCherry) zebra balığının tüm beynindeki nöron bölgesini ve ayrıca floresan stereo mikroskop altında Tg(mpo:EGFP) zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasını gözlemleyin ve fotoğraflayın (bkz.
NOT: Görüntüleme için kullanılan floresan mikroskop ayarları aşağıda gösterilmiştir. Tg (ETvmat2: EGFP) zebra balığı beyni (uyarma dalga boyu: 450-490 nm, emisyon dalga boyu: 500-550 nm, görsel büyütme: 100x); Tg (elavl3: mCherry) zebra balığı beyni (uyarma dalga boyu: 541-551 nm, emisyon dalga boyu: 590 nm, görsel büyütme: 100x); Tg (mpo: EFGP) zebra balığı beyni (uyarma dalga boyu: 450-490 nm, emisyon dalga boyu: 500-550 nm, görsel büyütme: 63x). - ImageJ yazılımını kullanarak Tg(ETvmat2:EGFP) zebra balığındaki Ra nöron bölgesinin floresan yoğunluğunu ve uzunluğunu ve Tg(elavl3:mCherry) zebra balığı beyin nöronlarının floresan yoğunluğunu ölçün ve analiz edin. Tg(mpo:EFGP) zebra balığının beyin bölgesindeki nötrofilleri manuel olarak sayın.
6. Gen ekspresyon belirteçlerinin belirlenmesi
- LPS beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, gen ekspresyon belirteçlerinin belirlenmesi ile devam edin. Bunu yapmak için, zebra balığı larvalarını% 0.02 trikain ile uyuşturun (adım 3.2'de belirtildiği gibi).
- Göz ve yumurta sarısı kesesi bölgeleri olmadan larvaların baş kısımlarını (grup başına 40 larva) ayırmak için iki adet 1 mL şırınga kullanın (Şekil 2E).
- RNA'yı larva kafa kısımlarından çıkarın.
- RNA ekstraksiyonu için, kafa kısmını 200 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ile homojenleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) 5 s için 11.000 rpm dönme hızında bir doku öğütücü kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kloroform-izopropanol yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bunu yapmak için, 40 μL kloroform ekleyin, tüpleri kuvvetlice sallayın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
- Sulu fazı taze bir tüpe (yaklaşık 100 μL) aktarın ve 100 μL izopropanol ekleyin. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın.
- RNA peletini yıkamak için 200 μL% 75 etanol ekleyin. Numuneleri kısaca vorteksleyin ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve RNA peletini tekrar yıkayın.
- RNA peletini 5-10 dakika boyunca hava ile kurutun, ardından RNA peletini çözmek için 30 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak RNA'nın saflığını (260 nm ve 280 nm'de absorbans oranı) ve bütünlüğünü kontrol edin (bkz.
- Rastgele primerlerle ters transkriptaz kullanarak adım 6.3'te ekstrakte edilen RNA'dan cDNA'yı sentezleyin (bkz.
- Nükleaz içermeyen bir tüpe 1 μL rastgele primer, 1 μL dNTP, 1 μg RNA ve damıtılmış su (toplam hacim 12 μL'ye) ekleyin. Karışımı 5 dakika boyunca 65 ° C'ye ısıtın ve buz üzerinde hızlı bir şekilde soğutun.
- Tüpe 1 μL 0.1 M DTT, 1 μL RNaz inhibitörü, 4 μL 5× birinci iplikçik tamponu ve 1 μL M-MLV ters transkriptaz (toplam hacim: 20 μL) ekleyin. Nazikçe karıştırın ve tüpü 2 dakika boyunca 25 ° C'de, ardından 50 dakika boyunca 42 ° C'de inkübe edin. 70 °C'de 15 dakika ısıtarak reaksiyonu etkisiz hale getirin.
- Hedef genlerin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) ekspresyonunu belirlemek için piyasada satılan bir RT-qPCR kiti (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak bir qPCR Sistemi üzerinde gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin (bkz. Reaksiyon karışımı (20 μL), 10 μL SYBR yeşili, 0.4 μL ROX referans boyası, ileri ve geri primerlerin her biri 0.8 μL, 6 μL ddH 2 O ve2μL şablon cDNA (1 μg) içeriyordu. PCR amplifikasyonunu şu koşullar altında gerçekleştirin: 30 s için 95 °C, ardından 5 s için 95 °C ve 34 s için 60 °C 40 döngü ve 15 s için 95 °C, 60 s için 60 °C ve 15 s için 95 °C ayrışma aşaması.
- Hedef genlerin mRNA seviyelerini bir temizlik genininkine normalleştirin, uzama faktörü 1 α (Ef1α). Her hedef gen için ekspresyon seviyelerini 2-ΔΔCT yöntemi33 ile hesaplayın. Her genin primer dizileri Tablo 2'de açıklanmıştır.
- Nitrik oksit tayini için, bir doku öğütücü kullanarak kafa kısmını (adım 6.2'de elde edilen) 100 μL soğuk PBS'de homojenize edin. Elde edilen PBS ve baş kısmı süspansiyonunu 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Lisatları toplayın ve ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak nitrit konsantrasyon testi34 yapın (bkz.
7. Zebra balığı lokomotif davranışsal testi
- LPS beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarını ayrı ayrı 96 kuyucuklu kare mikroplakanın kuyularına aktarın. Her bir oyuğa 300 μL E3 ortamı ekleyin ve daha sonra larvaları test plakasına alıştırmak için 4 saat boyunca inkübe edin.
- Larva yüklü mikro plakayı zebra balığı izleme kutusuna aktarın (bkz. Işık kaynağını açın ve ardından çevreye alışmak için larvaları test kutusunda 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Otomatik bir video izleme sistemi kullanarak zebra balığı davranışını izleyin ve kaydedin. Her zebra balığı için 12 seans (her biri 5 dakika, toplam 1 saat) kaydedin. Toplam mesafeyi (etkin olmayan, küçük ve büyük mesafelerden oluşur) her balığın 60 dakikalık bir izleme süresi boyunca hareket ettiği mesafe (mm cinsinden) olarak tanımlayın.
8. İstatistiksel analiz
- Standart analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analizler yapın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Sıradan tek yönlü ANOVA kullanarak iki grup arasındaki farkların istatistiksel analizini yapın. Korelasyonların gücünü değerlendirmek için Pearson'ın korelasyon katsayısını hesaplayın. P < 0.05 tüm analizlerde anlamlı bulundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan iş akışı, zebra balığı larvalarında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunmaktadır. Bu tarif edilen protokolde, 5 dpf zebra balığı, bir mikroenjektör kullanılarak beyin ventriküllerine LPS (Şekil 1) enjekte edildi (Şekil 2A-C). Beyin ventrikül bölgesine başarılı enjeksiyon% 1 Evans mavi lekesi kullanılarak doğrulandı (Şekil 2D). Zebra balığı kafası, zebra balığı vücudundaki enflamatuar sitokin ekspresyonu ve nitrik oksit salınımının beyindeki nöroinflamasyon ve nörotoksisitenin belirlenmesi üzerindeki herhangi bir etkisini dışlamak için şırıngalar kullanılarak gözlerinden ve vücudundan ayrıldı (Şekil 2E).
Aynı hacimdeki PBS (LPS olarak), zebra balığı beyin ventrikül bölgesine sahte bir kumanda ile enjekte edildi. Özellikle nöronlardaki kontrol ve sahte ameliyat edilen gruplar arasında, özellikle raphe çekirdeklerinin (Ra) ön grubundan (Şekil 3A-C), beyin nöronlarının floresan entegre yoğunluğundan (Şekil 3D, E), zebra balıklarının toplam hareket mesafesinden (Şekil 4A, B), pro-inflamatuar sitokinlerin NO üretimi ve mRNA ekspresyonundan (TNF-α anlamlı bir fark gözlenmemiştir. IL-6 ve IL-1β) (Şekil 4A-D) ve nötrofillerin larva zebra balığı beynine alınması (Şekil 6A, B). Bu sonuçlar, uygun mikroenjeksiyonun zebra balıklarında herhangi bir nörotoksisiteye ve nöroinflamasyona neden olmadığını göstermiştir.
24 saat tedaviden sonra, LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonu zebra balıklarında nörotoksisiteye neden oldu. LPS (1-5 mg / mL), Tg (ETvmat2: GFP) larva zebra balıklarının beyninde kontrol ve sahte gruplara kıyasla önemli miktarda Ra nöron kaybına neden olmuştur (Şekil 3A-C). Transgenik çizgi elav13: mCherry zebrafish, nükleer kırmızı floresan protein35 ile nöronal hücreleri özetler. Şekil 3D, E'de gösterildiği gibi, 2.5-5 mg / mL LPS, bu larva zebra balığı hattındaki beyin nöronlarının floresan entegre yoğunluğunda önemli değişikliklere yol açmıştır. Bununla birlikte, 1 mg / mL LPS enjeksiyon grubu, kontrol ve sahte gruplarla karşılaştırıldığında, beyin nöronlarının floresan entegre yoğunluğu üzerinde hiçbir etki göstermemiştir. Ayrıca, 5 mg / mL LPS bir hareket eksikliğine neden olmuştur (Şekil 4A) ve zebra balıklarının 60 dakikalık bir takip süresi boyunca toplam hareket mesafesini azaltmıştır (Şekil 4B). Sonuçlar, 1-2.5 mg / mL LPS'nin nöron kaybına neden olabileceğini, ancak anlamlı bir hareket eksikliği olmadığını göstermiştir.
Ek olarak, LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonu da zebra balığı beynindeki enflamatuar yanıtı aktive edebilir. Zebra balığı larvalarının kafasındaki proinflamatuar sitokinlerin (TNF-α, IL-6 ve IL-1β) NO üretimi (Şekil 5A) ve mRNA ekspresyonu, kontrol ve sahte gruplardaki ekspresyona kıyasla 2.5-5 mg/mL LPS tedavisinde artmıştır. 1-5 mg/mL LPS enjeksiyonundan sonra, nötrofillerin larva zebra balığı beynine alınması gözlenmiştir (Şekil 6A), Tg (mpo: EGFP) zebra balığı beyin bölgesindeki nötrofil sayısında önemli bir artışa neden olmuştur (Şekil 6B).
| Adım | Çalışma süresi (sn) | Isı seviyesi | Eylem |
| T1 | L> | H80-89 | P1L005 Serisi |
| T2 Serisi | 1.6-3 | H00 | |
| T3 Serisi | L> | H00 | P2L001c |
| T4 Serisi | 3 | H00 | SERİN |
| T5 Serisi | 0 | H00 |
Tablo 1: Cam kılcal boru çekme için beş adımlı protokol.
| Astar adı | Sıra | |
| IL-1β ileri | 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3' | |
| IL-1β ters | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| IL-6 ileri | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| IL-6 ters | 5'-TCTTTCCCTCTTTTCCTCCTG-3' | |
| TNF-α ileri | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3' | |
| TNF-α ters | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α ileri | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| Ef1α ters | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3' | |
Tablo 2: Gerçek zamanlı qPCR'de kullanılan astarlar.
Resim 1: Lipopolisakkaritin (LPS) genel yapısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Zebra balıklarının mikroenjeksiyon kurulumu, vücut duruşu ve pozisyonu ve baş kısmının ayrılması. (A) Cam iğne seçimi: Şekilde gösterildiği gibi benzer bir açıklığa sahip bir iğne elde etmek için mikroskop altında önceden çekilmiş bir iğnenin ucunu kesmek için bir cımbız kullanın. (B) Zebra balığı larvalarının beyin ventriküler alanının yüksek büyütmede gözlemlenebilmesi için mikroskobun odak uzaklığını ayarlayın (siyah renkle özetlenmiştir). Açık mavi daireler enjeksiyon bölgesini gösterir. (C) Monte edilmiş larvaların, iğne erişimi için beyin tarafı yukarı doğru yönlendirilmesi gerekir (kırmızı daire ile gösterilen beyin tektümü). (D) Zebra balığı larvalarının beyninde Evans mavisi ile başarılı ventriküler enjeksiyonun gösterilmesi. (E) Göz ve yumurta sarısı kesesi bölgeleri olmayan zebra balığı baş kısmı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonu, zebra balığı larvalarında 24 saat sonra nöronları ablate eder. (A) (Top) Farklı LPS konsantrasyonları ile tedaviden sonra vmat2: GFP zebra balıklarının temsili floresan mikroskopi görüntüleri (kırmızı parantezler raphe çekirdekleri [Ra] nöronlarını gösterir; ölçek çubuğu = 265.2 μm). (Altta) Morfolojik görüntülemeyi iyileştirmek için Ra nöronal bölgesi genişletildi. (B,C) Vmat2:GFP zebra balığı larvalarında Ra nöron bölgesinin ortalama floresan yoğunluğu ve uzunluğu. (D,E) Temsili morfoloji (ölçek çubuğu = 265.2 μm) ve Tg (elavl3: mCherry) zebra balığı beyin nöronlarının ortalama floresan yoğunluğu. Veriler, denetim grubunun yüzdesi olarak ifade edilir. *P, kontrol grubuna karşı 0,05 ve **P< 0,01'<. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonu, zebra balığı larvalarında 24 saat sonra hareket eksikliğine neden olur. (A) Zebra balığı hareket izlerinin temsili kalıpları. Dijital izleme haritasında, yüksek hızlı hareket kırmızı çizgilerle temsil edilir (> 6,6 mm / s); orta hızlı hareket yeşil çizgilerle gösterilir (3,3−6,6 mm/s); Düşük hızlı hareket siyah çizgilerle gösterilir (< 3,3 mm/s). (B) Zebra balığı tarafından 60 dakikada kat edilen ortalama toplam mesafenin nicel analizi. *P, kontrol grubuna karşı 0,05 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonu pro-inflamatuar mediatörleri arttırır. (A) Nitrik oksit seviyeleri Griess reaktifi kullanılarak ölçüldü. (B-D) Zebra balığı kafasındaki interlökin-6 (IL-6), interlökin-1β (IL-1β) ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) gen ekspresyon düzeyleri qPCR ile araştırıldı. *P, kontrol grubuna karşı 0,05 ve **P< 0,01'<. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: LPS beyin ventrikül mikroenjeksiyonu, 24 saat sonra zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasına yol açar. (A) LPS beyin ventrikül enjeksiyonundan sonra nötrofillerin (kırmızı daire içindeki alan) larvaların kafasına göçü (ölçek çubuğu = 851.1 μm). (B) LPS beyin ventrikül enjeksiyonundan sonra larva kafalarındaki nötrofil sayısı. *P, kontrol grubuna karşı 0,05 ve **P< 0,01'<. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Ham veriler Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epidemiyolojik ve deneysel verilerin giderek artan miktarı, kronik bakteriyel ve viral enfeksiyonları nörodejeneratif hastalıklar için olası risk faktörleri olarak göstermektedir36. Enfeksiyon, enflamatuar süreçlerin aktivasyonunu ve konakçı immün yanıtlarını tetikler37. Yanıt bir savunma mekanizması olarak hareket etse bile, aşırı aktive inflamasyon nörogeneze zararlıdır ve enflamatuar ortam yenidoğan nöronlarının hayatta kalmasına izin vermez38. Sonuç olarak, konakçı nöronal fonksiyonlara ve canlılığa zarar verir. Çalışmalar, inflamasyonun nörodejenerasyonun patofizyolojisinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir39.
Sıklıkla çalışılan patojenik bir endotoksin olan LPS, nörogenez ve nörodejenerasyonun inhibisyonunda rol oynamıştır. Enflamatuar süreçlerin LPS aktivasyonu, kısmen NO, TNF-α, IL-6 ve IL-1β40 üretimi yoluyla nörojenezi önemli ölçüde bozar. Giderek artan sayıda kanıt, LPS'nin davranış eksikliklerine ve nöronal kayba neden olduğunu ve nörodejeneratif kemirgen modellerinde merkezi olarak enjekte edildiğinde nörojenez ilerlemesini etkilediğini göstermektedir10,38. Zebra balığı modelleri, bağışıklık tepkilerini incelemek için alternatif deneysel modeller olarak yaygın olarak kullanılmaktadır41 ve yeni anti-enflamatuar ilaçları taramak. Zebra balıklarının doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık sistemleri, memelilerinkine benzerdir42. Ayrıca, bazı çalışmalar zebra balığı CNS43'teki memelilerde bulunan birkaç enflamatuar sitokin ve reseptör tanımlamıştır. Daha önceki çalışmalar, zebra balığı embriyolarının / larvalarının LPS'ye daldırılmasının veya LPS'nin zebra balığı larvalarının sarısına enjekte edilmesinin, bağışıklık tepkisini indükleyebileceğini ve inflamasyonla ilişkili pro-inflamatuar faktörleri artırabileceğini düşündürmektedir44,45. Bununla birlikte, LPS'nin zebra balığı sinir dokusu ve nöroinflamasyonun indüksiyonu üzerindeki spesifik etkisi henüz bilinmemektedir.
Kemirgen modellerinin diğer hayvan modellerine göre birçok avantajı olmasına rağmen, gerçek zamanlı in vivo görüntüleme ve ilaç taraması açısından sınırlamaları açıktır. İn vivo görüntüleme, güçlü ve noninvaziv bir araç olarak sinir sistemi gelişiminin ve patolojik beyin değişikliklerinin altında yatan mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır46,47. Zebra balığı embriyolarının ve larvalarının optik şeffaflığı nedeniyle, beyin gözleminin canlı görüntüleme deneyleri için çok uygundurlar48,49. Özellikle, zebra balıklarının küçük boyutları ve binlerce embriyo üretme yetenekleri, zebra balığı embriyoları veya larvaları kullanılarak yüksek verimli ilaç taramasının yapılabileceği anlamına gelir50,51. Ayrıca, bilim ve teknolojideki gelişmelerle birlikte, robotik mikroenjeksiyonlar hassas ve etkili bir şekilde verilebilmekte ve büyük miktarlarda embriyo veya larva enjekte etmek için kullanılabilmektedir52,53. Mikrorobotik enjeksiyon sisteminin nöronal araştırmalara, malzemelerin çok sayıda embriyo veya larvaya zamanında enjekte edilmesi için uygulanması, biyomoleküllerin ve ilaç bileşiklerinin büyük ölçekli taranmasını kolaylaştıracaktır.
Bu çalışmada, 5 dpf'deki zebra balığına, 2.5-5 mg / mL'lik bir konsantrasyonda LPS enjekte edildi; bu, nöroinflamasyon modeli gelişimi için en uygun koşul olarak belirlenmiştir. Bildiğimiz kadarıyla, bu metodoloji literatürde tanımlanmamıştır. Sonuç olarak, zebra balığı larvalarında LPS'nin beyin ventriküler mikroenjeksiyonu, nöron kaybına ve hareket eksikliğine neden olabilir. Dahası, sonuçlarımız LPS'ye bağlı nöroinflamasyonun NO, TNF-α, IL-6 ve IL-1β gibi proinflamatuar mediatörlerin seviyelerini arttırdığını ve enjeksiyondan 24 saat sonra larva zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasına yol açtığını göstermiştir. Diğer hayvan modellerinde, LPS enjeksiyonu da inflamasyonun gelişimini teşvik edebilir ve beyinde nöropatolojik değişikliklere neden olabilir13,54. Bu çalışmanın sonuçları, nöroinflamatuar yolları daha iyi anlamamızı sağlamıştır. Bu yöntemde, mikroenjeksiyon için iğnelerin açılmasının, mekanik işlemin neden olduğu beyin hasarını önlemek için çok büyük olmaması gerektiği ve larvalara zarar vermemek için makul miktarda kuvvet uygulanması gerektiği belirtilmelidir. Ek olarak, enflamatuar faktörlerin ve nitrik oksidin belirlenmesi için kafayı zebra balıklarının gözlerinden ve vücudundan ayırmak önemlidir, çünkü bu, LPS beyin ventrikül enjeksiyonu tarafından indüklenen nöroinflamasyonu özel olarak yansıtan yönlü sonuçların elde edilmesine yardımcı olacaktır.
Bu yöntemin küçük bir dezavantajı, zebra balığı larvalarının küçük boyutu nedeniyle, homojenizasyon ve ekstraksiyon yoluyla elde edilen toplam mRNA gibi biyomoleküllerin miktarlarının fare modelinden daha düşük olmasıdır. Bununla birlikte, zebra balığı her hafta birkaç yüz yumurta ile sık sık yumurtlayabilir. Her grupta kullanılan zebra balığı larvalarının sayısının arttırılması, farklı biyokimyasal analizler için yeterli miktarda ekstrakte edilmiş biyomolekül sağlayabilir. Sonuç olarak, bu yöntem larva zebra balığı beyninde nörotoksisiteye ve bağışıklık tepkisine neden olur. Zebra balıklarının şeffaflığı nedeniyle, larva canlı zebra balığı beynindeki değişiklikler in vivo görüntüleme ile daha iyi anlaşılabilir. Burada açıklanan teknik, olası anti-nöroinflamatuar ilaçları hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirmek için mükemmel bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Makao ÖİB Bilim ve Teknoloji Geliştirme Fonu'ndan (FDCT) gelen hibelerle desteklenmiştir (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 ve 0016/2019/AKP), Araştırma Komitesi, Makao Üniversitesi (MYRG2020-00183-ICMS ve CPG2022-00023-ICMS) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
