Summary
تم تحضير كرويات الورم 3D متعددة الخلايا مع خلايا الورم الغدي الرئوي ، والخلايا الليفية ، والوحيدات ، تليها عزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من هذه الكرويات. تمت مقارنة CAFs المعزولة مع الخلايا الليفية الطبيعية لتقييم صحة الميتوكوندريا من خلال دراسة إمكانات الغشاء عبر الميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ، والأنشطة الأنزيمية.
Abstract
تعد الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من بين الخلايا اللحمية الأكثر وفرة الموجودة في البيئة المكروية للورم ، مما يسهل نمو الورم وتطوره. التعقيد داخل البيئة المكروية للورم ، بما في ذلك إفراز الورم ، والالتهاب منخفض الدرجة ، ونقص الأكسجة ، وعدم توازن الأكسدة والاختزال ، يعزز التفاعل غير المتجانس ويسمح بتحويل الخلايا الليفية المقيمة غير النشطة لتصبح CAFs نشطة. يتم تمييز CAFs الأيضية عن الخلايا الليفية العادية (NFs) لأنها أكثر نشاطا من الناحية السكرية ، وتنتج مستويات أعلى من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وتفرط في التعبير عن مصدر اللاكتات MCT-4 ، مما يؤدي إلى فتح المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا (MPTP). هنا تم وصف طريقة لتحليل صحة الميتوكوندريا من CAFs المنشط المعزولة من كرويات الورم 3D متعددة الخلايا التي تتألف من خلايا الورم الغدي الرئوي البشري (A549) ، وحيدات الإنسان (THP-1) ، وخلايا الخلايا الليفية الرئوية البشرية (MRC5). تم تفكك الأجسام الكروية السرطانية على فترات زمنية مختلفة ومن خلال فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ، تم عزل CAFs. تم تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ل CAFs باستخدام صبغة JC-1 ، وإنتاج ROS بواسطة تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFDA) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) ، ونشاط الإنزيم في CAFs المعزولة. يوفر تحليل صحة الميتوكوندريا ل CAFs المعزولة فهما أفضل لتأثير Warburg العكسي ويمكن أيضا تطبيقه لدراسة عواقب تغيرات الميتوكوندريا CAF ، مثل التدفقات الأيضية والآليات التنظيمية المقابلة على عدم تجانس سرطان الرئة. وبالتالي ، تدعو الدراسة الحالية إلى فهم تفاعلات الورم والسدى على صحة الميتوكوندريا. سيوفر منصة للتحقق من الأدوية المرشحة الخاصة بالميتوكوندريا للتأكد من فعاليتها ضد CAFs كعلاجات محتملة في البيئة المكروية للورم ، وبالتالي منع تورط CAF في تطور سرطان الرئة.
Introduction
تتكون الأورام الصلبة من مجموعات خلايا غير متجانسة تسترشد بالبيئة المكروية للورم (TME) ، ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف أصل معظم الخلايا بعد. تعكس الخلايا اللحمية والمناعية بشكل أساسي (الخلايا الليفية ، الخلايا البطانية ، الخلايا الوحيدة ، الضامة ، الخلايا المتغصنة ، الخلايا البائية ، الخلايا التائية ، ومجموعاتها الفرعية) عدم تجانس الورم في سرطانات الرئة والثدي والكلى وغيرها من السرطانات الصلبة1،2،3. إن فهم أصل كل نوع فرعي وإمكانية التمايز العابر له حاجة ماسة لتطوير علاجات متقدمة ضد هذه السرطانات. يقدم تحليل هذه المجموعة المتنوعة من الخلايا في الخزعات البشرية نفسه أمام العديد من التحديات بسبب نوع الورم والموقع والمرحلة والحد من كمية العينة والمتغيرات الخاصة بالمريض4. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج تجريبي ، وهو ليس موثوقا به فحسب ، بل يمكنه أيضا محاكاة حالة الورم في الجسم الحي ، مما يثبت أنه مثالي لدراسة الحديث المتبادل بين الورم وسدى الورم ومشاركته في الفيزيولوجيا المرضية للمرض.
تعد ثقافات الورم الكروية ثلاثية الأبعاد (3D) متعددة الخلايا (MCTS) مفيدة في نظام نموذج المختبر للأورام بسبب تشابهها مع نظيراتها الطبيعية. يمكن ل MCTS تكرار جوانب الأورام الصلبة بشكل أفضل من نماذج زراعة الخلايا 2D ، بما في ذلك بنيتها المكانية ، والاستجابات الفسيولوجية ، وإطلاق الوسطاء القابل للذوبان ، وأنماط التعبير الجيني ، وآليات مقاومة الأدوية. علاوة على ذلك ، تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MCTS في أنه يمكن استخدامه لدراسة عدم تجانس الورم والبيئة المكروية للورم (TME). طريقة التعليق والإفلات هي الأداة الأكثر استخداما لتطوير وتحليل MCTS5. في هذه الطريقة ، يتم تعليق الخلايا المختلفة ذات الوسائط في شكل قطرات ، مما يسمح بنموها بطريقة مجمعة 3D متماسكة ويسهل الوصول إليها للفحص. هذه التقنية واضحة. لا يتطلب العديد من الخلايا ويلغي الحاجة إلى ركيزة متخصصة مثل الأغاروز لتطوير كروي6. ميزة إضافية لهذه الطريقة تكمن في استنساخ تقنيتها. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة أيضا للمشاركة في زراعة مجموعات الخلايا المختلطة ، مثل الخلايا البطانية والخلايا السرطانية ، لمحاكاة تكوين الأوعية الدموية المبكرةللورم 7.
في هذه الدراسة ، تم تحضير كرويات ورم الرئة 3D متعددة الخلايا مع خلايا الورم الغدي الرئوي ، والخلايا الليفية ، والوحيدات باستخدام طريقة القطرة المعلقة التي تحاكي البيئة المكروية لورم الرئة. ثم تم عزل السكان الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) للتحقيق في صحة الميتوكوندريا. الفكرة الرئيسية وراء تطوير هذه الكرويات هي عزل CAFs لأن الحديث المتبادل بين الخلايا في الأجسام الكروية يمكن أن يحول الخلايا الليفية إلى حالة CAF نشطة تشبه الخلايا الليفية العضلية. ثانيا ، قد تصور هذه الدراسة أيضا كيف أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الشاذ واختلال الميتوكوندريا يدفع الخلايا الليفية الطبيعية نحو النمط الظاهري CAF الأكثر عدوانية. وقد وجد أن الخلايا الليفية المجمعة داخل كرويات الورم اكتسبت خصائص الخلايا الليفية العضلية مع زيادة نشاط أنواع الأكسجين التفاعلية وتحريض التعبير الجيني الأيضي. يسلط هذا البروتوكول الضوء على أهمية البيئة المكروية للورم في تنشيط CAF ويمكن أن يكون نموذجا ممتازا للتوليد في المختبر ودراسة خصائص النمط الظاهري CAF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة الخلية
- زراعة خط خلايا الورم الغدي الرئوي البشري A549 ، وخط الخلايا أحادية الخلية البشرية THP-1 في وسائط RPMI1640 المكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة بنسبة 5٪ CO2.
- زراعة خلايا الخلايا الليفية الرئوية البشرية MRC-5 في وسط DMEM تستكمل بمحلول 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة مع 5٪ CO2.
2. تحضير كرويات الورم متعدد الخلايا باستخدام خط خلايا الورم الغدي الرئوي A549 ، والخلايا الليفية MRC5 ، والخلايا الوحيدة THP-1
ملاحظة: تم تحضير الكرويات ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا السرطانية وغير السرطانية باستخدام طريقة القطرة المعلقة في طبق زراعة الخلايا 90 مم. ويرد أدناه وصف مفصل لتطور هذه الأجسام الكروية. يجب تسخين جميع كواشف زراعة الخلايا مثل الوسط الكامل و PBS ومحلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك.
- إعداد تعليق الخلية
- تنمو الخلايا الملتصقة A549 و MRC5 (5 × 106 خلايا لكل منهما) في وسط نمو كامل DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] + 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] + 1٪ بنسلين-ستربتومايسين) في قوارير T25 عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة بنسبة 5٪ CO2.
- بالنسبة لخلايا THP-1 ، قم بتنمية تعليق الخلية (5 × 106 خلايا) في وسط نمو كامل (RPMI1640 + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين-ستربتومايسين) في قوارير T25. لتحقيق نمو أفضل ، ضع قوارير T25 عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة مع 5٪ CO2 في وضع الوقوف.
- بعد 3 أيام ، عند التقاء 80٪ -85٪ ، اغسل خلايا A549 و MRC5 بمحلول ملحي خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (محلول ملحي عازل للفوسفات) بإضافة 1 مل من PBS (25-30 درجة مئوية) في كل قارورة لمدة دقيقة واحدة واستنشاقها.
- احصد خلايا A549 و MRC5 من القارورة عن طريق احتضانها ب 500 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2. بعد ذلك مباشرة ، أضف 4 مل من وسائط النمو الكاملة لتعطيل التربسين.
- اجمع معلق الخلية من دورق T25 في أنبوب سعة 15 مل وقم بتكبيله لأسفل عند 125 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط النمو الكامل.
- إنشاء كرويات الورم متعدد الخلايا
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات تكوين الورم الكروي داخل خزانة السلامة الحيوية من أجل الحفاظ على ظروف معقمة. تم توحيد الحد الأقصى لحجم تعليق الخلية كقطرة قدرها 25 ميكرولتر لإعداد قطرة بحيث لا تسقط أثناء قلب الأغطية.- عد أرقام الخلايا A549 و MRC5 و THP-1 باستخدام عداد خلايا. لكل قطرة كروية (25 ميكرولتر) تحافظ على أرقام الخلايا التالية: 5000 خلية A549 و 4000 خلية MRC5 و 1000 خلية THP-1 ، باتباع البروتوكول الذي وصفه Arora et al.7. احسب أرقام الخلايا وفقا لذلك لحجم 1 مل.
ملاحظة: تم تحضير الأجسام الكروية في البداية بثلاثة أعداد خلايا مختلفة لكل كروية (أي 5000 و 8000 و 10000). أيضا ، تم فحص نسب الخلايا المختلفة للخلايا السرطانية / الخلايا الليفية / الخلايا الوحيدة (1: 1: 1 ، 2: 2: 1 ، 4: 2: 1 ، 5: 2: 1 ، و 5: 4: 1). أخيرا ، شوهد تكوين كروي متعدد الخلايا ثلاثي الأبعاد ناجح بنسبة 5: 4: 1 وتم استخدامه للدراسة. تم زيادة تركيز الخلايا الليفية بناء على نسبتها في البيئة المكروية للورم ، مما زاد من صلابة الكرويات الورمية. تم الإبلاغ عن الإجراء التفصيلي في منشور حديث من قبل Arora et al.7. - قم بإعداد تعليق الخلية بنسبة 5 (A549 ، 2 × 10 5 خلايا / مل) إلى 4 (MRC5 ، 1.6 × 10 5 خلايا / مل) إلى 1 (THP-1 ،5 × 104 خلايا / مل) وقم بتكوين الحجم إلى 1 مل باستخدام DMEM الكامل.
- ضع قطرة من 25 ميكرولتر من خليط معلق الخلية على غطاء طبق استزراع 90 مم (حوالي 50 قطرة / طبق 90 مم). املأ الجزء السفلي من طبق الثقافة 90 مم ب 10 مل من الماء المعقم.
- اقلب الغطاء بعناية فوق غرفة الترطيب المملوءة بالماء وضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 3 أيام.
- راقب الأجسام الكروية تحت المجهر عند تكبير 10x في اليوم 4. للحصول على الصور ، قم بتشغيل مفتاح الطاقة ، ضع الطبق مقاس 60 مم بعناية على المسرح ، وحدد التكبير (10x). اضبط العدسات وافحص الخلايا لتحليل تجمع الخلايا وتكاثرها. اضغط على زري التجميد والحفظ المتوفرين على المجهر لالتقاط الصورة.
- قم بتغيير وسائط النمو في اليوم 4 عن طريق استنشاق 20 ميكرولتر من الوسط بعناية من كل قطرة واستبدالها بوسط نمو كامل جديد.
- عد أرقام الخلايا A549 و MRC5 و THP-1 باستخدام عداد خلايا. لكل قطرة كروية (25 ميكرولتر) تحافظ على أرقام الخلايا التالية: 5000 خلية A549 و 4000 خلية MRC5 و 1000 خلية THP-1 ، باتباع البروتوكول الذي وصفه Arora et al.7. احسب أرقام الخلايا وفقا لذلك لحجم 1 مل.
3. تحليل الأحياء والموتى من كرويات الورم
- في اليومين 7 و 10 ، اقلب الطبق 90 مم بعناية في خزانة السلامة الحيوية واستخدم ماصة 200 ميكرولتر لجمع الأجسام الكروية من كل قطرة. اجمع خمسة كرويات كل منها في أنبوب سعة 1.5 مل.
- أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على كرويات وأجهزة طرد مركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الأجسام الكروية في 200 ميكرولتر من 1x PBS. لا ماصة بدقة لتجنب التفكك الكروي.
- ماصة خارج كرويات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر على طبق 60 مم لتلطيخ الكالسيين-AM ويوديد البروبيديوم.
- ضع 5 ميكرولتر من محلول كالسيين AM 1 ميكرومتر و 5 ميكرولتر من محلول يوديد البروبيديوم 2 مجم / مل على الأجسام الكروية. احتضان لمدة 10 دقائق. بعد الانتهاء من فترة الحضانة ، اغسل الكرويات برفق باستخدام 1x PBS مرتين.
- ضع الطبق مقاس 60 مم الذي يحتوي على كرويات تحت المجهر المقلوب الفلوري ، وراقب والتقط الصور بتكبير 10x عن طريق تحديد خيار التألق في برنامج المجهر وتحديد FITC (قناة مضان خضراء ؛ إثارة 490 نانومتر ، انبعاث 515 نانومتر) للكالسيين وقناة تكساس الحمراء (TXR ؛ الإثارة 535 نانومتر ، الانبعاث 617 نانومتر).
- للحصول على الصورة ، قم بتشغيل Ctr Adv ، وهو المفتاح 1 ، متبوعا بتشغيل وحدة المعالجة المركزية. انتظر حتى يتم تمهيد نظام البرنامج. عند التمهيد ، ضع الطبق 60 مم بعناية على المسرح وحدد التكبير (10x) وقنوات الفلورسنت (FITC ، TXR). اضبط العدسات وامسح الصورة.
- لعرض الصورة في النظام ، حدد الخيار مباشر وعرض الصورة. اضبط شدة التألق من أجل التحسين المناسب. احفظ الصورة بالنقر فوق الزر حفظ .
ملاحظة: في هذه المرحلة ، ستكون الأجسام الكروية مرئية بالعين المجردة. تحت المجهر الضوئي ، ستظهر الأجسام الكروية على شكل كرات مستديرة صلبة عند تكبير 10x. يمكن جمع العديد من الأجسام الكروية في وقت واحد باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
4. تفكك وتعليق الخلايا من كرويات الورم
- اجمع 200 كرة كروية للورم في كل يوم 7 و 10 ، باستخدام ماصة سعة 1 مل في أنبوب سعة 15 مل.
ملاحظة: قبل التجميع ، تحقق بعناية من شكل وشكل كروي واحد بعد نقله إلى شريحة مجهرية أو على طبق 30 مم ولاحظ تحت المجهر. - بيليه الكروية عن طريق الطرد المركزي في 125 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح الطافية بعناية دون إزعاج كرويات الورم.
- اغسل الكرات الكروية بعناية باستخدام 200 ميكرولتر من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص بحذر من المادة الطافية.
- للتفكك الكروي ، أضف 400 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ واحتفظ به عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أداء ماصة قوية للتفكك الكامل للكرويات.
- تحييد التربسين عن طريق إضافة 1 مل من وسط نمو DMEM الكامل. جهاز طرد مركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية بعناية.
- أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط DMEM الكامل واحسب العدد الإجمالي للخلايا.
5. عزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) من خلال الميكروبيدات
- لعزل CAFs من كرويات الورم ، أعد تعليق 1 × 10 7 خلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسي البارد (MACS) (PBS عند الرقم الهيدروجيني7.2 الذي يحتوي على 0.5٪ ألبومين مصل البقر [BSA] و 2 mM حمض رباعي الخليك الإيثيلين ديامين [EDTA]).
- احتضان تعليق الخلية (يحتوي على 1 × 107 خلايا) مع 20 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للخلايا الليفية. تخلط جيدا عن طريق النقر برفق على الأنبوب واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الخلايا ب 1 مل من المخزن المؤقت البارد MACS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
- لفصل الخلايا القائمة على الخرزة المغناطيسية ، قم بإعداد عمود MACS عن طريق شطفه ب 3 مل من المخزن المؤقت MACS.
- ضع معلق الخلية في العمود متبوعا بمجموعة التدفق التي تحتوي على عدد الخلايا غير المصنف.
- اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت MACS. أخرج العمود من الفاصل وضعه على أنبوب التجميع.
- اجمع الخلايا الموسومة بالميكروبيدات المضادة للخلايا الليفية عن طريق إضافة 5 مل من المخزن المؤقت MACS ودفع المكبس بإحكام إلى العمود.
- أجهزة الطرد المركزي للخلايا المسماة عند 125 × جم لمدة 5 دقائق. المضي قدما مع الخلايا الليفية المعزولة لتطبيقات المصب.
6. التحليل القائم على قياس التدفق الخلوي لتعبير ACTA2 في CAFs المعزولة
- احسب عدد CAFs المعزولة واستخدم ما يقرب من 6 × 104 خلايا. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 125 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
- أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلية (PBS + 0.5٪ BSA + 0.3٪ v / v Triton X-100) واحتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- دوامة الخلايا بشكل متقطع للحفاظ على تعليق خلية واحدة. أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلية.
- أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد ل APC المضاد ل α-SMA المترافق مع الإنسان واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت للنفاذية وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
- أعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية لتحليل التدفق الخلوي. الحصول على إجمالي 10000 حدث لكل عينة في مقياس التدفق الخلوي. حدد الخلايا الموجبة ACTA2 بعد التمييز بين مجموعات الخلايا بناء على تشتتها الأمامي والجانبي ، واختيار السكان المفردة متبوعا بتحديد الخلايا الموجبة ACTA2 التي تظهر كقمة واحدة على الرسم البياني للمعلمة المفردة.
7. تلطيخ JC-1 لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا
- احسب عدد CAFs المعزولة واستخدم ما يقرب من 6 × 104 خلايا لتلطيخ 5،5،6،6'-رباعي كلورو-1،1'،3،3' رباعي إيثيل بنزيمي-دازويل كاربوسيانين يوديد (JC-1) باستخدام قياس التدفق الخلوي.
- اغسل الخلايا جيدا باستخدام PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية ، وإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلية.
- أضف صبغة JC-1 بتركيز عمل 2 ميكرومتر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. عند إنهاء الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في حجم نهائي يبلغ 400 ميكرولتر.
- الحصول على ما مجموعه 20000 حدث لكل عينة في مقياس التدفق الخلوي. حدد إمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق قياس مجاميع JC-1 ذات الإزاحة الحمراء على قناة FL-2 والمونومرات الخضراء على قناة FL-1.
8. تلطيخ DCFDA لتقدير مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS)
- استخدم الكرات الكروية الكاملة (50 رقما) بالإضافة إلى CAFs المعزولة (6 × 104 خلايا) من الكرات الكروية لتلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي الأسيتات 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFDA).
- اغسل الخلايا جيدا باستخدام PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية ، وإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلية.
- تضاف صبغة DCFDA بتركيز عمل 1 ميكرومتر وتحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم أعد تعليقها في الحجم النهائي 400 ميكرولتر.
- الحصول على ما مجموعه 20000 حدث لكل عينة في مقياس التدفق الخلوي. قم بتقييم مستويات ROS عن طريق قياس التألق في اليوم 7 واليوم 10 للكرويات وكذلك CAFs المعزولة.
9. تحليل RT-qPCR لعلامات CAF والجينات المحللة للسكر
- استخرج الحمض النووي الريبي من CAFs التي تم فرزها باستخدام مجموعة تحلل أحادية الخلية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. قم بإعداد cDNA من 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة توليف cDNA باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- قم بإجراء RT-qPCR لتحليل علامات CAF النسبية (ACTA2 8 و COL1A29) وتعبير جين تحلل السكر (GLUT1 10 و MCT4 11). قم بإجراء تحليل منحنى الذوبان بعد التمديد النهائي لضمان خصوصية المنتجات. تطبيع البيانات باستخدام التعبير عن GAPDH كجين مرجعي. يتم سرد تسلسلات التمهيدي المستخدمة في RT-qPCR في الجدول التكميلي 1.
10. استخراج وقياس البروتين الخلوي من CAFs
ملاحظة: نفذ جميع خطوات استخراج البروتين على الثلج لتجنب تدهور البروتين.
- أعد تعليق ما يقرب من 4 × 106 خلايا CAF في 100 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA المثلج البارد (يحتوي على 30 mM HEPES و 150 mM NaCl و 1٪ NP-40 و 0.1٪ SDS و 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم مع 5 mM من كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز Halt ، و 5 mM من EDTA عند درجة الحموضة 7.4).
- دوامة صارمة لتحلل الخلايا السليم. قم بتسخين تعليق الخلية بتردد 20 هرتز ، وسعة 20٪ لمدة 15 ثانية ، ونبضة 3x.
- بعد صوتنة ، الطرد المركزي استخراج البروتين في 13000 × غرام لمدة 15 دقيقة في 4 °C. انقل المادة الطافية إلى أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا. قم بإجراء فحص بروتين BCA لتحديد البروتين.
11. التحليل الطيفي للأنشطة الأنزيمية في CAFs
ملاحظة: يتم تحليل أنشطة الإنزيم التالية في CAFs المشتقة من الورم الكروي.
- قياس نشاط نازعة هيدروجين السكسينات
- لتقييم نشاط نازعة هيدروجين السكسينات (SDH) في CAFs ، قم بإعداد مخزن SHE المؤقت مع 250 mM من السكروز ، و 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ، و 1 mM من جلايكول إيثيلين مكرر (β-aminoethyl ether) -N ، N ، N ′ ، N′-حمض رباعي الخليك (EGTA) واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3. أضف 0.4 مللي مول فينازين ميثوسلفات (PMS) ، 0.2 مللي مول 2،6-ثنائي كلورويندوفينول (DCPIP) ، 50 مللي متر MgCl2 ، 0.02٪ Triton X-100 ، و 1 ملي مول سيانيد في مخزن SHE المؤقت واحتفظ به عند 37 درجة مئوية.
- استخرج البروتين الخلوي من CAFs كما هو موضح في الخطوة 10 (2 × 106 خلايا). في كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، احتضن 100 ميكرولتر من 0.1 مجم من البروتين الخلوي مع 100 ميكرولتر من خليط تفاعل SHE عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- لبدء النشاط الأنزيمي ، أضف 10 mM succinate12. احسب نشاط الإنزيم بالنانومتر / دقيقة / مل عن طريق قياس التغيرات في الامتصاص عند 600 نانومتر.
- عامل التحويل ل DCIP هو 0.0215 A / nM بناء على معامل الانقراض المولي12. احسب النشاط النسبي ل SDH باستخدام الصيغة المذكورة:
النشاط النسبي (نانومتر / دقيقة / مل / إنزيم) =
X X 
V
حيث ΔA / min = معدل التفاعل الأنزيمي (A الأولي- A النهائي) / (الوقتالنهائي- A / minالأولي) ، Ve = حجم العينة ، و V = حجم التفاعل.
- تقدير نشاط السيتوكروم ج أوكسيديز
- لتقييم نشاط السيتوكروم سي أوكسيديز (COX) في CAFs ، أضف 0.2 مجم / مل من البروتين الخلوي في محلول عازل تفاعل KME يحتوي على محلول KME (125 mM KCl ، 20 mM 3- (N-morpholino) حمض البروبان السلفونيك [MOPS] ، و 1 mM EGTA ، درجة الحموضة 7.4) ، 0.02٪ Triton X-100 ، و 5 mM أسكوربات الصوديوم.
- في أنبوب منفصل ، امزج 50 ميكرومتر من السيتوكروم ج قلب الحصان مع 5 مليمتر من أسكوربات الصوديوم واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائقو 13. بعد الحضانة ، أضف 20 ميكرولتر من السيتوكروم المختزل c إلى 500 ميكرولتر من محلول عازلة تفاعل KME يحتوي على البروتين الخلوي.
- احسب نشاط الإنزيم بالوحدات / ميكرولتر عن طريق قياس التغيرات في الامتصاص عند 550 نانومتر. يتغير امتصاص السيتوكروم ج عند 550 نانومتر مع حالة الأكسدة. الفرق في معاملات الانقراض (mM) بين السيتوكروم المختزل والمؤكسد c هو 21.84 عند 550 نانومتر14. احسب مقدار نشاط الإنزيم في المحللة الخلوية على النحو التالي:
الوحدات / ميكرولتر =
حيث ΔA / min = A / minعينة - A / minفارغة و 21.84 = ΔtmM بين السيتوكروم المؤكسد c والسيتوكروم المختزل c عند 550 نانومتر
- تقييم نشاط نازعة هيدروجين اللاكتات
- قم بإجراء فحص نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) باستخدام مجموعة مقايسة خلايا نازعة هيدروجين اللاكتات باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- أضف كاشف اختبار LDH (10 ميكرولتر) إلى 0.5 مجم / مل من البروتينات الخلوية واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. عند إنهاء الحضانة ، قم بقياس الامتصاص عند 45 نانومتر كل 1 دقيقة لمدة 8 دقائق.
- إعداد معايير NADH للكشف اللوني باستخدام 0 (فارغ) و 2.5 و 5 و 7.5 و 10 و 12.5 نانومتر / بئر من NADH متبوعا بإضافة كاشف اختبار LDH إلى الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر.
- ارسم الاختلافات في الامتصاص بين Tالأولي و Tالنهائي إلى منحنى NADH القياسي لتحديد مقدار توليد NADH. تقييم نشاط LDH باستخدام الصيغة المذكورة:
نشاط LDH =
عامل تخفيف العينة X
حيث B = كمية (nmole) من NADH المتولدة بين T الأولي و T النهائي ، وقت رد الفعل = Tالنهائي - Tالأولي (دقيقة) ، و Ve = حجم العينة (مل) المضافة إلى البئر.
X X 
V
عامل تخفيف العينة XSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 تطور كرويات الورم متعددة الخلايا باستخدام ثلاث مجموعات مختلفة من الخلايا - A549 (سرطان الرئة الغدي) ، MRC-5 (الخلايا الليفية) ، و THP-1 (وحيدات) - من خلال طريقة القطرة المعلقة كما لوحظ في اليوم 7 واليوم 10 تحت المجهر. في اليوم السابع ، كانت الكرويات مضغوطة وصلبة بقطر 260 ± 5.3 ميكرومتر ، وفي اليوم العاشر ، كان قطر الأجسام الكروية 480 ± 7.5 ميكرومتر (الشكل 1 أ اللوحة العلوية ، الشكل 1 ب - د). كانت كرويات اليوم 7 واليوم 10 عبارة عن مجاميع ضيقة وموحدة في الغالب في الحجم والقطر كما لوحظ في تحليل الدفعات بالكامل. لوحظت ذروة الاكتناز والصلابة للكروية متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد في حوالي اليوم العاشر (الشكل 1A اللوحة العلوية ، الشكل 1B-D). تم تقييم صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ الكالسيين-AM / PI. لوحظ انخفاض في مضان يوديد البروبيديوم (أحمر) وزيادة في مضان الكالسيين-AM (أخضر) من اليوم 7 إلى اليوم 10 ، مما يشير إلى تكاثر الخلايا في البيئة المكروية ثلاثية الأبعاد (الشكل 1 أ ، ه). تم تقييم الأجسام الكروية أيضا لخصائص نقص الأكسجين باستخدام تلطيخ نقص الأكسجة Image-iT Red. نواة نقص الأكسجين في وسط اليوم تم العثور على 10 كرويات (الشكل 1F). علاوة على ذلك ، لوحظ وجود تنظيم ملحوظ للتعبير الجيني E-cadherin في اليوم 7 واليوم 10 من الكرويات مقارنة باليوم 4 (الشكل 1G) ، مما يشير إلى انضغاط الخلية وصلابتها. أيضا ، تشير الزيادة في التعبير الجيني MKi67 مع الزيادة في أيام تكوين الورم الكروي (الشكل 1H) إلى نمو الخلايا وانتشارها.
تم عزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من اليوم 10 من الأورام الكروية باستخدام الميكروبيدات المضادة للخلايا الليفية كما هو موضح في النظرة العامة التخطيطية في الشكل 2 أ. الخلايا الليفية المعزولة من هذه الكرويات السرطانية هي حوالي 69٪ ACTA2 إيجابية (الشكل 2B). على مستوى mRNA ، أظهرت الخلايا الليفية المعزولة ما يقرب من ثلاثة أضعاف (الشكل 2C) وعشرة أضعاف (الشكل 2D) في التعبيرات الجينية ACTA2 و COL1A2 (سلسلة الكولاجين من النوع 1 ألفا 2) ، على التوالي ، مقارنة بالخلايا الليفية MRC-5 العادية ، مما يشير إلى دور القرائن البيئية الدقيقة في تحويل / تنشيط CAF داخل هذه الكرات الكروية الورمية.
لتقييم مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS) في CAFs المنشط ، تم فحص مستويات ROS في كرويات الورم أولا باستخدام 2',7'-dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) ، والتي انتشرت في الخلايا وأزيلت الأسيتيل بواسطة الإسترات الخلوية متبوعة بالأكسدة المعتمدة على ROS في جزيء الفلورسنت 2',7'-ثنائي كلورو فلوريسئين (DCF). لوحظت زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في اليوم 10 من الأورام الكروية عند مقارنتها باليوم 7 ، مما يشير إلى احتمال مشاركة جيل أنواع الأكسجين التفاعلية في تنشيط CAF (الشكل 3 أ ، ب). لوحظت زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية في CAFs المعزولة من اليوم 7 واليوم 10 من كرويات الورم (الشكل 3C). علاوة على ذلك ، لوحظ تغيير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا كما هو موضح في تلطيخ JC-1 (الشكل 3D). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى حدوث تغيير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي في CAFs المنشط المعزول عن كرويات الورم.
لتحليل ما إذا كانت مستويات ROS المتزايدة وإزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا في CAFs مرتبطة سببيا بتنظيم بعض أهداف تحلل السكر لإنتاج تأثير Warburg العكسي على الخلايا السرطانية في البيئة المكروية للورم ، تم فحص التعبير الجيني النسبي ل GLUT1 و MCT4. لوحظ تحريض التعبير الجيني GLUT1 (الشكل 4A) و MCT4 (الشكل 4B) في CAFs عند مقارنته بالخلايا الليفية الطبيعية. تتماشى هذه الملاحظة مع الدراسات السابقة في هذا المجال التي أظهرت وفرة متزايدة من مستويات GLUT1 و MCT4 في CAFs11. GLUT1 مسؤول عن نقل الجلوكوز إلى الخلايا ، في حين أن MCT4 يقذف اللاكتات من الخلايا ، وبالتالي ، يبدو هذا الاتجاه منطقيا إلى حد ما لبيولوجيا CAF. نظرا لأن خلل الميتوكوندريا يرتبط بشكل ملحوظ بتغيير أنشطة إنزيم الميتوكوندريا المختلفة ، فقد تم تحليل أنشطة إنزيم الميتوكوندريا المختلفة في CAFs المعزولة. لوحظ تحريض كبير لنشاط إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) في CAFs مقارنة بالخلايا الليفية الطبيعية (الشكل 4C) ، مما يشير إلى ارتفاع إنتاج اللاكتات ، وارتفاع إجهاد الميتوكوندريا التأكسدي ، وتأثير Warburg العكسي في CAFs المنشط. بعد ذلك ، تم فحص نشاط إنزيم السيتوكروم سي أوكسيديز (COX) في CAFs حيث من المعروف أن تعزيز مستويات ROS الخلوية يزيد من تعبير COX ونشاطه من خلال المسار المعتمد على NF-kB15. لوحظ تحريض نشاط COX في CAFs مقارنة بالخلايا الليفية العادية (الشكل 4D) ، مما يشير إلى تورط الإشارات المعتمدة على ROS في تحويل CAFs من الخلايا الليفية العادية. كما تم تقييم نشاط إنزيم نازعة هيدروجين الميتوكوندريا سكسينات (SDH) في CAFs ووجد تحريضه الملحوظ مقارنة بالخلايا الليفية الطبيعية (الشكل 4E).
الشكل 1: تطور الكرات الكروية متعددة الخلايا وتحليل الأحياء والموتى. (أ) اللوحة العلوية: صور مجهرية للكرويات السرطانية ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا تتكون من A549 (خلايا الورم الغدي الرئوي) ، MRC-5 (الخلايا الليفية) ، و THP-1 (الخلايا الوحيدة) في اليوم 7 واليوم 10. اللوحة الوسطى والسفلية: صورة مدمجة لتلطيخ الكالسيين-AM ويوديد البروبيديوم (PI) (اللوحة الوسطى) وتلطيخ يوديد البروبيديوم (اللوحة السفلية) في اليوم 7 واليوم 10 من كرويات الورم. (ب) صور تباين الطور لليوم 7 واليوم 10 من الأورام الكروية التي تم التقاطها عند هدف 10x. (ج، د) صور تمثيلية وتحليل كمي لليوم 7 (d7) واليوم 10 (d10) كروية توضح قياس قطر الكروية. (ه) التحليل الكمي للخلايا الموسومة بالكالسيين-AM في اليوم 7 واليوم 10 من الكرات الكروية للورم. (F) تلطيخ التألق المناعي لتلطيخ نقص الأكسجة Image-iTRed في اليوم 10 أقسام كروية (6 ميكرومتر). تم استخدام DAPI للتلطيخ المضاد للنوى. (ز، ح) تحليل RT-qPCR لمستويات E cadherin (G) و MKi67 (علامة تكاثر الخلايا) (H) mRNA في اليوم 7 واليوم 10 من كرويات الورم. تم اعتبار الثقافة ثنائية الأبعاد ل MRC-5 كعنصر تحكم. أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن = 3). تم تمثيل البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (S.D. **p < 0.01 للاختبار (اليوم 7 كروي) مقابل التحكم (ثقافة 2D MRC-5) باستخدام اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحليل خصائص CAF في الخلايا الليفية المعزولة من الكرات الكروية الورمية. (أ) نظرة عامة تخطيطية لبروتوكول عزل الخلايا الليفية من الكرات الكروية متعددة الخلايا للورم في اليوم 10 باستخدام الميكروبيدات المضادة للخلايا الليفية بمساعدة فارز الخلايا المغناطيسية متبوعا بعزل الحمض النووي الريبي لقياس التدفق الخلوي وتحليل التعبير الجيني. (ب) تحليل التدفق الخلوي الذي يصور زيادة في تعبير بروتين ACTA2 في الخلايا الليفية المعزولة. (ج، د) تحليل RT-qPCR لمستويات ACTA2 (C) و COL1A2 (D) mRNA في الخلايا الليفية المعزولة من اليوم 10 من كرويات الورم. أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن = 3). تم تمثيل البيانات كمتوسط ± S.D. ** p < 0.01 للاختبار (CAFs المعزولة) مقابل التحكم (MRC-5) باستخدام اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتلطيخ JC1 في CAFs المعزولة. (أ) صور التألق المناعي التي تظهر مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في اليوم 7 واليوم 10 من الكرات الكروية بواسطة تلطيخ DCFDA. (ب) تحليل التدفق الخلوي الذي يمثل عدد الخلايا الموجبة DCFDA. يعرض المحور X DCFDA ويعرض المحور Y عدد الخلايا. (ج) وفرة CAFs إيجابية DCFDA المعزولة من اليوم 7 واليوم 10 كرويات عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم استخدام خلايا MRC-5 في ثقافة 2D كعنصر تحكم. (د) مقايسة التدفق الخلوي لتلطيخ JC-1 لتحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا في CAFs المعزولة من اليوم 7 واليوم 10 من كرويات الورم. تم استخدام خلايا MRC-5 في ثقافة 2D كعنصر تحكم. أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن = 3). البيانات ممثلة كمتوسط ± S.D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: قياس أنشطة إنزيم الميتوكوندريا في الأجسام المكافئة المعزولة. (أ ، ب) تحليل RT-qPCR لمستويات GLUT1 (A) و MCT4 (B) mRNA في CAFs المعزولة من اليوم 7 واليوم 10 من كرويات الورم مقارنة بالخلايا الليفية الطبيعية (MRC-5). (جيم - ه) تم قياس نشاط إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) (C) ، ونشاط إنزيم السيتوكروم سي أوكسيديز (COX) (D) ، ونشاط إنزيم نازعة هيدروجين السكسينات (SDH) (E) في الخلايا الليفية الطبيعية و CAFs المعزولة من اليوم 10 من كرويات الورم. أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن = 3). تم تمثيل البيانات كمتوسط ± S.D. ** p < 0.01 دلالة للاختبار (CAFs المعزولة) مقابل التحكم (MRC-5) باستخدام اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول التكميلي 1: قائمة البادئات الأمامية (F) والخلفية (R) لتحليل RT-qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم الدراسة الحالية تطور كرويات الورم متعددة الخلايا التي تضم الخلايا السرطانية ، وعدد الخلايا اللحمية (أي الخلايا الليفية) ، وعدد الخلايا المناعية (أي الخلايا الوحيدة) باستخدام طريقة إسقاط معلقة معدلة. تعد الخلايا الليفية والوحيدات / البلاعم من بين أهم المجموعات السكانية التي تشكل البيئة المكروية للورم (TME) ، وغالبا ما يرتبط وجودها بسوء تشخيص المريض16. عندما تكون موجودة في TME ، تتحول الخلايا الليفية ، وتظهر نمطا ظاهريا محددا مرتبطا بالسرطان (CAF) حيث تؤثر الإشارات البيئية الدقيقةللورم 17 عليها. توجد الخلايا الليفية العضلية والخلايا الليفية الالتهابية (iCAFs) والخلايا الليفية المقدمة للمستضد (apCAFs) بشكل شائع في الخلايا الليفية المنشطة18,19. غالبا ما ترتبط هذه الأنماط الظاهرية بعدوانية السرطان ومقاومة العلاج20. تم الإبلاغ عن الخلايا الليفية العضلية على أنها نذير شؤم في أورام صلبة متعددة حيث أن نسبة أعلى من هذه الخلايا الليفية تقيد تسلل الخلايا التائية مما يؤدي إلى TME21 المثبط للمناعة. تظهر هذه الخلايا الليفية العضلية سمات مميزة لزيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وإفراز وسطاء مختلفين مثل الإيلاستين والكولاجين والفبرونيكتين التي تؤدي إلى ترسب المصفوفة خارج الخلية داخل TME22.
قامت هذه الدراسة بتحسين بروتوكول تطوير كرويات الورم ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا باستخدام خلايا الورم الغدي الرئوي A549 ، والخلايا الليفية الرئوية MRC-5 ، والخلايا الوحيدة THP-1 مع مراعاة أعداد الخلايا ونسبة 5: 4: 1 (الخلايا السرطانية: الخلايا الليفية: الخلايا الوحيدة) التي تحاكي عن كثب سدى الورم للحالة البيئية الدقيقة الطبيعية. استمر تطوير هذه الأجسام الكروية وتحليلها حتى اليوم 10 للوصول إلى تعقيدها. وبالتالي ، فإن عدد الخلايا ونسبتها هي خطوات حاسمة في هذا البروتوكول لدراسة تفاعل الورم والسدى داخل الأجسام الكروية التي تولد في النهاية ميزات متعددة من TME ، مثل زيادة إنتاج مستويات ROS ، وضعف الميتوكوندريا ، وتحلل السكر العالي ، والمشاركة في تحويل الخلايا الليفية الطبيعية إلى CAFs المنشطة.
يكمن أحد القيود الرئيسية في دراسة بيولوجيا CAF في التوافر المحدود ل CAFs من عينات خزعة الورم الأولية. الهدف الرئيسي هو إنشاء كرويات الورم 3D المحاكاة الحيوية مع الخلايا الليفية ومن ثم عزل CAFs المنشط من كرويات الورم باستخدام الميكروبيدات المغناطيسية المضادة للخلايا الليفية بمساعدة فارز الخلايا المنشط المغناطيسي (MACS). يمكن أن يوفر هذا مصدرا لدراسة CAFs مباشرة. تم تأكيد عدد CAF من خلال تحليل العلامات الخاصة ب CAF مثل أكتين العضلات الملساء ألفا (α-SMA) وتعبير COL1A2. يحول الحديث المتبادل للخلايا السرطانية مع الخلايا الليفية النمط الظاهري للخلايا الليفية نحو CAFs المنشط الذي يظهر مسارا زاديا للسكر مرتبطا بالامتصاص الخلوي الهائل للجلوكوز وإطلاق اللاكتات والبيروفات ، المنتجات النهائية لتحلل السكر. وبالتالي ، فإن هذا النهج سيوفر ما يكفي من خلايا CAF للباحثين للكشف عن العديد من الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها. هنا ، يتم تحسين أرقام الخلايا ونسبتها للكرويات ورم الرئة 3D. لتشكيل كرويات الورم الصلبة الأخرى ، قد يضطر المرء إلى ضبط العدد والنسبة للحصول على بنية 3D المناسبة. أيضا ، قد يحتاج هذا النهج إلى بعض التعديلات لعزل ودراسة عدد الخلايا المناعية ، وخاصة الضامة المرتبطة بالورم داخل الأجسام الكروية.
نظرا لأن هذا النموذج الكروي لورم الرئة ثلاثي الأبعاد يلخص ميزات البيئة المكروية الطبيعية للورم ، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة آليات تنشيط CAF من الخلايا الليفية الطبيعية ، ومشاركتها في تطور سرطان الرئة في البيئة المكروية للورم ثلاثي الأبعاد. ثانيا ، تصور هذه الدراسة أيضا كيف أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الشاذ والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا يدفع الخلايا الليفية الطبيعية نحو النمط الظاهري CAF الأكثر عدوانية. كما سيلقي الضوء على الحديث المتبادل بين CAF والخلايا السرطانية ومشاركتها في إعادة البرمجة الأيضية المرتبطة بتأثير Warburg العكسي. وبالتالي ، يمكن لهذا النموذج أن يمهد الطريق لدراسة أكثر شمولا وتصميم التدخلات العلاجية الفعالة لاستهداف CAFs لإدارة سرطان الرئة الغدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع جائزة التميز للمرأة الصربية ، الهند (SB / WEA-02/2017) ومشروع جائزة SERB-Early Career Research ، الهند (ECR / 2017 / 000892) إلى DP. يعترف المؤلفون ، LA و SR ب IIT Ropar و MHRD لزمالاتهم البحثية. تعترف MK ب ICMR لزمالتها البحثية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | - | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | - | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
References
- Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
- Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
- Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
- Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , Humana Press. 141-151 (2007).
- Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
- Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
- Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
- Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
- Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
- Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
- Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
- Bregman, A. A. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , John Wiley & Sons Incorporated. (2002).
- Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
- Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
- Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
- Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
- Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
- Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).
