Summary
Multicellulære 3D-tumorsfæroider blev fremstillet med lungeadenocarcinomceller, fibroblaster og monocytter efterfulgt af isolering af kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) fra disse sfæroider. Isolerede CAF'er blev sammenlignet med normale fibroblaster for at vurdere mitokondriel sundhed ved at studere mitokondrietransmembranpotentialet, reaktive iltarter og enzymatiske aktiviteter.
Abstract
Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) er blandt de mest rigelige stromale celler, der er til stede i tumormikromiljøet, hvilket letter tumorvækst og progression. Kompleksitet inden for tumormikromiljøet, herunder tumorsekretom, lavgradig inflammation, hypoxi og redox ubalance, fremmer heterotypisk interaktion og tillader transformation af inaktive residente fibroblaster at blive aktive CAF'er. CAF'er skelnes metabolisk fra normale fibroblaster (NF'er), da de er mere glykolytisk aktive, producerer højere niveauer af reaktive iltarter (ROS) og overudtrykker laktateksportør MCT-4, hvilket fører til åbningen af mitokondriepermeabilitetsporen (MPTP). Her er der beskrevet en metode til at analysere mitokondriesundheden hos aktiverede CAF'er isoleret fra de multicellulære 3D-tumorsfæroider bestående af humane lungeadenokarcinomceller (A549), humane monocytter (THP-1) og humane lungefibroblastceller (MRC5). Tumorsfæroider blev opløst med forskellige tidsintervaller, og gennem magnetisk aktiveret cellesortering blev CAF'er isoleret. Mitokondriemembranpotentialet for CAF'er blev vurderet ved anvendelse af JC-1-farvestof, ROS-produktion ved 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetatfarvning (DCFDA) og enzymaktivitet i de isolerede CAF'er. Analyse af mitokondriesundheden hos isolerede CAF'er giver en bedre forståelse af den omvendte Warburg-effekt og kan også anvendes til at studere konsekvenserne af CAF-mitokondrieændringer, såsom metaboliske fluxer og de tilsvarende reguleringsmekanismer på lungekræftheterogenitet. Således går den nuværende undersøgelse ind for en forståelse af tumor-stroma-interaktioner på mitokondriel sundhed. Det ville give en platform til at kontrollere mitokondriespecifikke lægemiddelkandidater for deres effektivitet mod CAF'er som potentielle behandlinger i tumormikromiljøet og derved forhindre CAF-involvering i lungekræftprogression.
Introduction
Solide tumorer består af heterogene cellepopulationer, der styres af tumormikromiljøet (TME), men oprindelsen af de fleste celler er endnu ikke opdaget. Hovedsageligt stromale og immunceller (fibroblaster, endotelceller, monocytter, makrofager, dendritiske celler, B-celler, T-celler og deres undergrupper) afspejler tumorheterogeniteten i lunge-, bryst-, nyre- og andre faste kræftformer 1,2,3. Forståelse af oprindelsen af hver undertype og deres transdifferentieringspotentiale er af største behov for at udvikle avancerede terapier mod disse kræftformer. Analysen af denne forskelligartede cellepopulation i humane biopsier præsenterer sig for flere udfordringer på grund af tumortype, sted, stadium, begrænsning af prøvemængde og patientspecifikke variationer4. Således er der brug for en eksperimentel model, som ikke kun er pålidelig, men også kan simulere in vivo-tumortilstanden, hvilket viser sig at være ideel til at studere tumor-stroma krydstale og dets involvering i sygdomspatofysiologi.
Tredimensionelle (3D) multicellulære tumorsfæroidkulturer (MCTS) er et fordelagtigt in vitro-modelsystem af tumorer på grund af deres lighed med naturlige modstykker. MCTS kan bedre replikere aspekter af solide tumorer end 2D-cellekulturmodeller, herunder deres rumlige arkitektur, fysiologiske reaktioner, frigivelse af opløselige mediatorer, genekspressionsmønstre og lægemiddelresistensmekanismer. Desuden er en hovedfordel ved MCTS, at den kan bruges til at studere tumorheterogenitet og tumormikromiljøet (TME). Hanging-drop-metoden er det mest anvendte værktøj til udvikling og analyse af MCTS5. I denne metode suspenderes de forskellige celler med medier i form af dråber, hvilket tillader dets vækst på en sammenhængende 3D-aggregeret måde og er let tilgængelig til undersøgelse. Teknikken er ligetil; Det kræver ikke mange celler og eliminerer kravet om et specialiseret substrat som agarose til sfærisk udvikling6. En yderligere fordel ved denne metode ligger i reproducerbarheden af dens teknik. Desuden er denne metode også blevet brugt til co-kultur blandede cellepopulationer, såsom endotelceller og tumorceller, for at simulere tidlig tumorangiogenese7.
I denne undersøgelse blev multicellulære 3D-lungetumorsfæroider fremstillet med lungeadenokarcinomceller, fibroblaster og monocytter ved hjælp af hængende dråbemetoden, der efterligner lungetumormikromiljøet. Derefter blev den kræftassocierede fibroblast (CAF) befolkning isoleret for at undersøge mitokondriel sundhed. Hovedideen bag udviklingen af disse sfæroider er at isolere CAF'erne, da krydstalen mellem cellerne i sfæroider kunne omdanne fibroblasterne til en myo-fibroblastlignende aktiveret CAF-tilstand. For det andet kan denne undersøgelse også skildre, hvordan afvigende ROS-produktion og mitokondriel dysfunktion driver de normale fibroblaster mod den mere aggressive CAF-fænotype. Det blev fundet, at fibroblaster samlet i tumorsfæroider opnåede myofibroblastiske egenskaber med øget ROS-aktivitet og induktion af metabolisk genekspression. Denne protokol fremhæver vigtigheden af tumormikromiljøet i aktivering af CAF og kan være en fremragende model til in vitro-generering og undersøgelse af CAF-fænotypiske egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Kulturhumant lungeadenokarcinomcellelinje A549 og human monocytisk cellelinje THP-1 i RPMI1640-medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C i et befugtet kammer med 5% CO2.
- Dyrkning MRC-5 humane lungefibroblastceller i DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycinopløsning ved 37 °C i et befugtet kammer med 5% CO2.
2. Fremstilling af multicellulære tumorsfæroider under anvendelse af A549 lungeadenokarcinomcellelinje, MRC5-fibroblaster og THP-1-monocytter
BEMÆRK: De multicellulære tumorigene og ikke-tumorigene 3D-sfæroider blev fremstillet ved hjælp af hængende dråbemetoden i en 90 mm cellekulturskål. En detaljeret beskrivelse af disse sfæroiders udvikling er givet nedenfor. Alle cellekulturreagenser såsom komplet medium, PBS og 0,25% trypsin-EDTA-opløsning skal forvarmes til 37 °C før brug, medmindre andet er angivet.
- Fremstilling af cellesuspension
- Der dyrkes A549- og MRC5-klæbende celler (5 x 106 celler hver) i DMEM-komplet vækstmedium (Dulbeccos modificerede ørnemedium [DMEM] + 10% føtalt bovint serum [FBS] + 1% penicillin-streptomycin) i T25-kolber ved 37 °C i et befugtet kammer med 5% CO2.
- For THP-1-celler dyrkes cellesuspensionen (5 x 106 celler) i komplet vækstmedium (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin) i T25-kolber. For bedre vækst anbringes T25-kolberne ved 37 °C i et befugtet kammer med 5 % CO2 stående.
- Efter 3 dage vaskes A549- og MRC5-cellerne ved 80-85 % sammenløb med calcium- og magnesiumfri PBS (fosfatbuffersaltvand) ved at tilsætte 1 ml PBS (25-30 °C) i hver kolbe i 1 minut og aspirere den.
- A549- og MRC5-cellerne høstes fra kolben ved at inkubere dem med 500 μL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning i 5 minutter ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5% CO2. Umiddelbart efter tilsættes 4 ml komplette vækstmedier for at inaktivere trypsinet.
- Cellesuspensionen fra T25-kolben opsamles i et 15 ml rør og pelleteres ned ved 125 x g i 5 minutter. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 5 ml komplet vækstmedium.
- Etablering af multicellulære tumorsfæroider
BEMÆRK: Alle trin i tumorsfæroiddannelsen skal udføres inde i biosikkerhedsskabet for at opretholde sterile forhold. Det maksimale volumen af cellesuspensionen er blevet standardiseret som en dråbe på 25 μL for at forberede en dråbe, så den ikke falder ned, mens lågene vendes om.- Tæl A549-, MRC5- og THP-1-cellenumre ved hjælp af en celletæller. For hver sfærisk dråbe (25 μL) opretholdes følgende cellenumre: 5.000 A549-celler, 4.000 MRC5-celler og 1.000 THP-1-celler efter protokollen beskrevet af Arora et al.7. Beregn cellenumrene i overensstemmelse hermed for et volumen på 1 ml.
BEMÆRK: Sfæroider blev oprindeligt fremstillet med tre forskellige celletal pr. Sfæroid (dvs. 5000, 8000 og 10.000). Også forskellige celleforhold mellem tumorceller / fibroblaster / monocytter (1: 1: 1, 2: 2: 1, 4: 2: 1, 5: 2: 1 og 5: 4: 1) blev kontrolleret. Endelig blev en vellykket 3D multicellulær sfærisk dannelse set med et forhold på 5: 4: 1 og blev brugt til undersøgelsen. Fibroblastkoncentrationen blev øget baseret på dens andel i tumormikromiljøet, hvilket yderligere forbedrede stivheden af tumorsfæroiderne. Den detaljerede procedure blev rapporteret i en nylig publikation af Arora et al.7. - Klargør cellesuspensionen i et forhold på 5 (A549, 2 x 10 5 celler/ml) til 4 (MRC5, 1,6 x 10 5 celler/ml) til 1 (THP-1,5 x 104 celler/ml), og der fyldes op til 1 ml med komplet DMEM.
- En dråbe på 25 μL cellesuspensionsblanding anbringes på dækslet til en 90 mm kulturskål (ca. 50 dråber/90 mm skål). Fyld bunden af 90 mm kulturskålen med 10 ml sterilt vand.
- Vend forsigtigt låget over det vandfyldte hydratiseringskammer og læg skålen i en cellekulturinkubator i 3 dage.
- Overvåg sfæroiderne under mikroskopet ved 10x forstørrelse på dag 4. For at hente billeder skal du tænde for afbryderen, placere 60 mm skålen forsigtigt på scenen og vælge forstørrelsen (10x). Juster linserne og undersøg cellerne for at analysere celleaggregering og spredning. Tryk på knapperne Frys og Gem på mikroskopet for at tage billedet.
- Skift vækstmediet på dag 4 ved forsigtigt at opsuge 20 μL medium fra hver dråbe og erstatte det med et friskt, komplet vækstmedium.
- Tæl A549-, MRC5- og THP-1-cellenumre ved hjælp af en celletæller. For hver sfærisk dråbe (25 μL) opretholdes følgende cellenumre: 5.000 A549-celler, 4.000 MRC5-celler og 1.000 THP-1-celler efter protokollen beskrevet af Arora et al.7. Beregn cellenumrene i overensstemmelse hermed for et volumen på 1 ml.
3. Levende død analyse af tumorsfæroider
- På dag 7 og 10 vendes 90 mm skålen forsigtigt i biosikkerhedsskabet og bruges en 200 μL pipette til at opsamle sfæroider fra hver dråbe. Saml fem sfæroider hver i et 1,5 ml rør.
- Tilsæt 500 μL 1x PBS til 1,5 ml røret indeholdende sfæroider og centrifuger ved 125 x g i 5 min. Supernatanten kasseres forsigtigt, og sfæroiderne resuspenderes i 200 μl 1x PBS. Pipette ikke strengt for at undgå sfærisk opløsning.
- Spheroiderne pipetteres ud ved hjælp af en 200 μL pipette på en 60 mm skål til calcein-AM og propidiumiodidfarvning.
- 5 μL 1 μM calcein-AM-opløsning og 5 μL 2 mg/ml propidiumiodidopløsning anbringes på sfæroiderne. Inkuber i 10 min. Efter afslutning af inkubationsperioden vaskes sfæroiderne forsigtigt med 1x PBS to gange.
- Placer 60 mm skålen med sfæroider under det fluorescerende inverterede mikroskop, observer og tag billeder ved 10x forstørrelse ved at vælge fluorescensindstillingen i mikroskopsoftwaren og vælge FITC (grøn fluorescenskanal; excitation 490 nm, emission 515 nm) for calcein og Texas rød kanal (TXR; excitation 535 nm, emission 617 nm).
- For at erhverve billedet skal du tænde Ctr Adv, som er switch 1, efterfulgt af at tænde CPU'en. Vent på, at softwaresystemet starter. Når du starter op, skal du placere 60 mm skålen forsigtigt på scenen og vælge forstørrelse (10x) og fluorescerende kanaler (FITC, TXR). Juster linserne, og scan efter billedet.
- For at se billedet i systemet skal du vælge indstillingen Live og se billedet. Juster intensiteten af fluorescens for passende optimering. Gem billedet ved at klikke på knappen Gem .
BEMÆRK: På dette stadium vil sfæroider være synlige gennem det blotte øje. Under lysmikroskopet vises sfæroider som runde, stive kugler ved 10x forstørrelse. Flere sfæroider kan opsamles på én gang ved hjælp af en 200 μL pipette.
4. Opløsning og cellesuspension af tumorsfæroider
- Saml 200 tumorsfæroider hver på dag 7 og 10 ved hjælp af en 1 ml pipette i et 15 ml rør.
BEMÆRK: Før indsamling skal du omhyggeligt kontrollere formen og formen af en enkelt sfæroid efter overførsel til et mikroskopisk dias eller på en 30 mm skål og observere under mikroskopet. - Pellet sfæroiderne ved centrifugering ved 125 x g i 5 min. Supernatanten suges forsigtigt uden at forstyrre tumorsfæroiderne.
- Sfæroider vaskes forsigtigt med 200 μl PBS, centrifugeres ved 125 x g i 5 min, og supernatanten kasseres forsigtigt.
- Til sfærisk opløsning tilsættes 400 μL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning og opbevares ved 37 °C i 10 minutter. Udfør kraftig pipettering for fuldstændig opløsning af sfæroiderne.
- Neutralisere trypsin ved at tilføje 1 ml komplet DMEM vækstmedium. Der centrifugeres ved 125 x g i 5 min. og supernatanten kasseres forsigtigt.
- Resuspender pellet i 1 ml komplet DMEM-medium og tæl det samlede antal celler.
5. Kræftassocieret fibroblast (CAF) isolering gennem mikroperler
- Til isolering af CAF'er fra tumorsfæroiderne resuspenderes 1 x 10 7 celler i 80 μL kold magnetisk aktiveret cellesorteringsbuffer (MACS) (PBS ved pH7,2 indeholdende 0,5% bovint serumalbumin [BSA] og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA]).
- Inkuber cellesuspensionen (indeholdende 1 x 107 celler) med 20 μL antifibroblastmikroperler. Bland godt ved forsigtigt at banke på røret og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Cellerne vaskes med 1 ml kold MACS-buffer, centrifugeres ved 125 x g i 5 min, og supernatanten suges til aspiration. Resuspender cellerne i 500 μL MACS-buffer.
- Til magnetisk perlebaseret celleseparation skal du forberede MACS-kolonnen ved at skylle den med 3 ml MACS-buffer.
- Anbring cellesuspensionen i kolonnen efterfulgt af opsamling af gennemstrømning, der indeholder den umærkede cellepopulation.
- Vask kolonnen tre gange med 3 ml MACS-buffer. Fjern kolonnen fra separatoren, og læg den på opsamlingsrøret.
- Saml de antifibroblast-mikroperlemærkede celler ved at tilføje 5 ml MACS-buffer og skubbe stemplet fast ind i søjlen.
- Centrifuger de mærkede celler ved 125 x g i 5 min. Fortsæt med de isolerede fibroblaster til downstream-applikationer.
6. Flowcytometribaseret analyse af ACTA2-ekspression i isolerede CAF'er
- Tæl antallet af isolerede CAF'er og brug ca. 6 x 104 celler. Cellerne vaskes én gang med PBS, centrifugeres ved 125 x g i 5 min. og supernatanten suges til mig.
- Der tilsættes 100 μL cellepermeabiliseringsbuffer (PBS + 0,5% BSA + 0,3% v/v Triton X-100) og inkuberes cellerne ved 4 °C i 30 minutter.
- Vortex cellerne intermitterende for at opretholde en enkelt cellesuspension. Centrifuger og resuspender cellerne i 100 μL cellepermeabiliseringsbuffer.
- Der tilsættes 2 μL APC-konjugeret antihumant α-SMA-antistof og inkuberes ved 4 °C i 45 minutter. Efter inkubation tilsættes 1 ml permeabiliseringsbuffer og centrifugeres ved 125 x g i 5 minutter for at fjerne overskydende antistof.
- Resuspender pellet i 400 μL permeabiliseringsbuffer til flowcytometrisk analyse. Få i alt 10.000 hændelser af hver prøve i et flowcytometer. Vælg ACTA2-positive celler efter at have skelnet mellem populationerne af celler baseret på deres fremadgående og sidespredning, vælg singletpopulationen efterfulgt af markering af ACTA2-positive celler, der vises som en enkelt top på enkeltparameterhistogrammet.
7. JC-1-farvning til bestemmelse af mitokondriemembranpotentiale
- Antallet af isolerede CAF'er tælles, og der anvendes ca. 6 x 104 celler til farvning af tetraethylbenzimi-dazoylcarbocyaniod(JC-1) ved hjælp af flowcytometri.
- Cellerne vaskes grundigt med PBS, centrifugeres ved 125 x g i 5 min., supernatanten suges til syn, og der tilsættes 100 μl cellefarvningsbuffer.
- Tilsæt JC-1 farvestof i en arbejdskoncentration på 2 μM og inkuber ved stuetemperatur i 30 min. Efter inkubationens ophør vaskes cellerne med PBS, centrifugeres ved 125 x g i 5 minutter og resuspenderes i et slutvolumen på 400 μL.
- Få i alt 20.000 hændelser af hver prøve i et flowcytometer. Kvantificer mitokondriemembranpotentialet ved at måle de rødforskudte JC-1-aggregater på FL-2-kanalen og de grønforskudte monomerer på FL-1-kanalen.
8. DCFDA-farvning for at estimere niveauer af cellulære reaktive iltarter (ROS)
- Brug hele sfæroider (50 tal) såvel som de isolerede CAF'er (6 x 104 celler) fra sfæroider til 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFDA) farvning.
- Cellerne vaskes grundigt med PBS, centrifugeres ved 125 x g i 5 min., supernatanten suges til syn, og der tilsættes 100 μl cellefarvningsbuffer.
- Tilsæt DCFDA-farvestof i en arbejdskoncentration på 1 μM og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Cellerne vaskes to gange med PBS, centrifugeres ved 125 x g i 5 minutter, og derefter resuspenderes i et slutvolumen på 400 μL.
- Få i alt 20.000 hændelser af hver prøve i et flowcytometer. Vurder ROS-niveauerne ved at måle fluorescensen på dag 7 og dag 10 for sfæroiderne såvel som de isolerede CAF'er.
9. RT-qPCR-analyse af CAF-markører og glykolytiske gener
- Uddrag RNA fra de sorterede CAF'er ved hjælp af et enkeltcellelysesæt efter producentens protokol. Forbered cDNA fra 100 ng RNA ved hjælp af et cDNA-syntesesæt efter producentens retningslinjer.
- Udfør RT-qPCR for at analysere de relative CAF-markører (ACTA2 8 og COL1A29) og glykolytisk gen (GLUT1 10 og MCT4 11) ekspression. Udfør smeltekurveanalyse efter den endelige udvidelse for at sikre produkternes specificitet. Normaliser dataene ved hjælp af ekspressionen af GAPDH som referencegen. De primersekvenser, der anvendes til RT-qPCR, er anført i supplerende tabel 1.
10. Ekstraktion og kvantificering af det cellulære protein fra CAF'er
BEMÆRK: Udfør alle trin i proteinekstraktion på is for at undgå proteinnedbrydning.
- Resuspender ca. 4 x 106 CAF-celler i 100 μL iskold RIPA-lysisbuffer (indeholdende 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS og 0,5% natriumdeoxycholat med 5 mM Halt-protease- og fosfatasehæmmercocktail og 5 mM EDTA ved pH 7,4).
- Vortex strengt for korrekt cellelyse. Sonikere cellesuspensionen ved 20 Hz frekvens, 20% amplitude i 15 s og 3x puls.
- Efter sonikering centrifugeres proteinekstraktet ved 13.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten overføres til et forkølet 1,5 ml glas. Udfør BCA-proteinanalysen for at kvantificere protein.
11. Spektrofotometrisk analyse af enzymatiske aktiviteter i CAF'er
BEMÆRK: Følgende enzymaktiviteter analyseres i tumorsfæroidafledte CAF'er.
- Måling af succinatdehydrogenaseaktivitet
- For at evaluere aktiviteten af succinatdehydrogenase (SDH) i CAF'er fremstilles SHE-buffer med 250 mM saccharose, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) og 1 mM ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre (EGTA) og pH justeres til 7,3. Der tilsættes 0,4 mM phenazin methosulfat (PMS), 0,2 mM 2,6-dichlorindophenol (DCPIP), 50 mM MgCl2, 0,02% Triton X-100 og 1 mM cyanid i SHE-bufferen, og opbevar ved 37 °C.
- Uddrag det cellulære protein fra CAF'erne som beskrevet i trin 10 (2 x 106 celler). I hvert hul i en plade med 96 huller inkuberes 100 μL 0,1 mg cellulært protein med 100 μL SHE-reaktionsblanding ved 37 °C i 15 minutter.
- For at starte den enzymatiske aktivitet tilsættes 10 mM succinat12. Enzymaktiviteten i nM/min/ml beregnes ved at måle ændringerne i absorbansen ved 600 nm.
- Omregningsfaktoren for DCIP er 0,0215 A/nM baseret på dens molære ekstinktionskoefficient12. Beregn SDH's relative aktivitet ved hjælp af den nævnte formel:
Relativ aktivitet (nM/min/ml/enzym) =
X 
X V
Hvor ΔA/min = hastigheden af enzymatisk reaktion (A initial- A endelig)/(tidendelig- A/mininitial), Ve = prøvevolumen og V = volumen af reaktionen.
- Estimering af cytokrom c oxidaseaktivitet
- For at evaluere cytokrom c oxidase (COX) aktiviteten i CAF'er tilsættes 0,2 mg / ml cellulært protein i en KME-reaktionsbufferopløsning indeholdende KME-buffer (125 mM KCl, 20 mM 3-(N-morpholino) propansulfonsyre [MOPS] og 1 mM EGTA, pH 7,4), 0,02% Triton X-100 og 5 mM natriumascorbat.
- I et separat glas blandes 50 μM hestehjertecytokrom c med 5 mM natriumascorbat og inkuberes ved 37 °C i 5 min13. Efter inkubationen tilsættes 20 μL reduceret cytokrom c til 500 μL KME-reaktionsbufferopløsning indeholdende cellulært protein.
- Enzymaktiviteten i enheder/μL beregnes ved at måle ændringerne i absorbansen ved 550 nm. Absorptionen af cytokrom c ved 550 nm ændres med dets oxidationstilstand. Forskellen i udryddelseskoefficienter (mM) mellem reduceret og oxideret cytokrom c er 21, 84 ved 550 nm14. Beregn mængden af enzymaktivitet i det cellulære lysat som:
Enheder/μL =
Hvor ΔA/min = A/minprøve-A/minblindprøve og 21,84 = Δt͑mM mellem oxideret cytokrom c og reduceret cytokrom c ved 550 nm
- Vurdering af laktatdehydrogenaseaktivitet
- Udfør et lactat dehydrogenase (LDH) assay ved hjælp af et lactat dehydrogenasecelleassay kit efter producentens anvisninger.
- Der tilsættes LDH-testreagens (10 μL) til 0,5 mg/ml celleproteiner og inkuberes i 5 minutter ved 37 °C. Efter inkubationens afslutning måles absorbansen ved 45 nm hvert 1. minut i 8 minutter.
- Forbered NADH-standarderne til kolorimetrisk detektion ved hjælp af 0 (blind), 2,5, 5, 7,5, 10 og 12,5 nM / hul NADH efterfulgt af tilsætning af LDH-testreagens til et slutvolumen på 50 μL.
- Absorbansforskellene mellemT-initial ogT-finale plottes til NADH-standardkurven for at bestemme mængden af NADH-generering. Vurder aktiviteten af LDH ved hjælp af den nævnte formel:
LDH-aktivitet =
X prøvefortyndingsfaktor
Hvor B = mængde (nmole) NADH genereret mellem T-initial og T-endelig, reaktionstid =T-endelig -T-initial (min) og Ve = prøvevolumen (ml) tilsat til brønd.
X 
X V
X prøvefortyndingsfaktorSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser udviklingen af flercellede tumorsfæroider ved hjælp af tre forskellige cellepopulationer - A549 (lungeadenokarcinom), MRC-5 (fibroblaster) og THP-1 (monocytter) - ved hængende dråbemetoden som observeret på dag 7 og dag 10 under mikroskopet. På dag 7 var sfæroider kompakte og stive med en diameter på 260 ± 5,3 μm, og på dag 10 var sfæroider 480 ± 7,5 μm i diameter (figur 1A øverste panel, figur 1B-D). Dag 7 og dag 10 sfæroider var tætte aggregater og for det meste ensartede i størrelse og diameter som observeret i hele batchanalysen. Kompaktiteten og stivhedstoppen af den 3D multicellulære sfæroid blev bemærket omkring dag 10 (figur 1A øverste panel, figur 1B-D). Cellelevedygtigheden blev vurderet ved calcein-AM/PI-farvning. Et fald i propidiumiodidfluorescens (rød) og en stigning i calcein-AM-fluorescens (grøn) fra dag 7 til dag 10 blev observeret, hvilket indikerer celleproliferation i 3D-mikromiljøet (figur 1A,E). Sfæroiderne blev også vurderet for hypoxiske egenskaber ved anvendelse af Image-iT Red hypoxi-farvning; en hypoxisk kerne i midten af dagen blev der fundet 10 sfæroider (figur 1F). Desuden blev der observeret en markant opregulering af E-cadherin-genekspression på dag 7 og dag 10 i sfæroider sammenlignet med dag 4 (figur 1G), hvilket tyder på cellekompakthed og stivhed. En stigning i MKi67-genekspression med stigningen i dage med tumorsfæroiddannelse (figur 1H) indikerer også cellevækst og proliferation.
Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) blev isoleret fra dag 10 tumorsfæroider ved hjælp af antifibroblastmikroperler som beskrevet i den diagrammatiske oversigt i figur 2A. Isolerede fibroblaster fra disse tumorsfæroider er ca. 69% ACTA2-positive (figur 2B). På mRNA-niveau viste isolerede fibroblaster næsten tre gange (figur 2C) og ti gange (figur 2D) opregulering i henholdsvis ACTA2 og COL1A2 (kollagen type 1 alfa 2-kæde) genekspressioner sammenlignet med de normale MRC-5 fibroblaster, hvilket tyder på mikromiljømæssige ledetråde i CAF-transformation / aktivering inden for disse tumorsfæroider.
For at evaluere niveauerne af cellulære reaktive iltarter (ROS) i de aktiverede CAF'er blev ROS-niveauerne i tumorsfæroiderne først undersøgt ved anvendelse af 2',7'-dichlorfluoresceindiacetat (DCFDA), som diffunderede ind i cellerne og deacetylerede af de cellulære esteraser efterfulgt af den ROS-afhængige oxidation i det fluorescerende molekyle 2',7'-dichlorfluorescein (DCF). En signifikant stigning i ROS-niveauer i dag 10 tumorsfæroider blev observeret sammenlignet med dag 7, hvilket tyder på den mulige involvering af ROS-generering på CAF-aktivering (figur 3A, B). En signifikant stigning blev observeret i cellulære ROS-niveauer i CAF'er isoleret fra dag 7 og dag 10 tumorsfæroider (figur 3C). Desuden blev der bemærket en ændring af mitokondriemembranpotentialet som angivet ved JC-1-farvningen (figur 3D). Samlet set tyder disse resultater på en ændring i mitokondriemembranpotentiale og oxidativ stress i de aktiverede CAF'er isoleret fra tumorsfæroider.
For at analysere, om de øgede ROS-niveauer og mitokondriemembrandepolarisering i CAF'erne er kausalt forbundet med opreguleringen af visse glykolytiske mål for at producere den omvendte Warburg-effekt på kræftceller i tumormikromiljøet, blev den relative genekspression af GLUT1 og MCT4 undersøgt. En induktion af GLUT1 (figur 4A) og MCT4 (figur 4B) genekspression blev observeret i CAF'er sammenlignet med normale fibroblaster. Denne observation er i tråd med tidligere undersøgelser på dette område, der viste en øget forekomst af GLUT1- og MCT4-niveauer i CAF'er 11. GLUT1 er ansvarlig for transport af glukose ind i cellerne, mens MCT4 ekstruderer laktat fra cellerne, og derfor virker denne tendens ret logisk for CAF-biologi. Da mitokondriel dysfunktion er markant korreleret med ændringen af forskellige mitokondrieenzymaktiviteter, blev de forskellige mitokondrieenzymaktiviteter i de isolerede CAF'er analyseret. Signifikant induktion af laktatdehydrogenase (LDH) enzymaktivitet i CAF'er sammenlignet med de normale fibroblaster blev observeret (figur 4C), hvilket tyder på høj laktatproduktion, høj oxidativ mitokondriestress og omvendt Warburg-effekt i aktiverede CAF'er. Dernæst blev cytokrom c oxidase (COX) enzymaktivitet undersøgt i CAF'er, da forbedringen af cellulære ROS-niveauer vides at øge COX-ekspression og aktivitet gennem den NF-kB-afhængige vej15. En induktion af COX-aktivitet blev observeret i CAF'er sammenlignet med de normale fibroblaster (figur 4D), hvilket tyder på involvering af ROS-afhængig signalering i omdannelsen af CAF'er fra normale fibroblaster. Mitokondrie-succinat-dehydrogenaseenzymaktiviteten (SDH) i CAF'er blev også vurderet og fandt dens bemærkelsesværdige induktion sammenlignet med normale fibroblaster (figur 4E).
Figur 1: Udvikling af flercellede tumorsfæroider og levende-døde analyser. (A) Overpanel: Mikroskopiske billeder af flercellede 3D-tumorsfæroider bestående af A549 (lungeadenokarcinomceller), MRC-5 (fibroblaster) og THP-1 (monocytter) på dag 7 og dag 10. Midterste og nederste panel: Flettet billede af calcein-AM og propidiumiodid (PI) farvning (midterste panel) og propidiumiodid farvning (nederste panel) på dag 7 og dag 10 tumorsfæroider. (B) Fasekontrastbilleder af dag 7 og dag 10 tumorsfæroider fanget ved 10x mål. (C,D) Repræsentative billeder og kvantitativ analyse af dag 7 (d7) og dag 10 (d10) sfæroider, der viser måling af sfæroiddiameter. (E) Kvantitativ analyse af calcein-AM-mærkede celler på dag 7 og dag 10 tumorsfæroider. (F) Immunofluorescensfarvning af Image-iTRed hypoxi-farvning i dag 10 sfæroidsektioner (6 μm). DAPI blev brugt til kernefarvning. (G,H) RT-qPCR-analyse af E-cadherin (G) og MKi67 (celleproliferationsmarkør) (H) mRNA-niveauer på dag 7 og dag 10 i tumorsfæroider. Todimensionel kultur af MRC-5 blev betragtet som kontrol. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Data repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (S.D. **p < 0,01 for test (dag 7 sfærisk) versus kontrol (2D kultur MRC-5) ved hjælp af elev t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af CAF-karakteristika i isolerede fibroblaster fra tumorsfæroider. (A) Diagrammatisk oversigt over protokollen til isolering af fibroblaster fra de flercellede tumorsfæroider på dag 10 ved anvendelse af antifibroblastmikroperler ved hjælp af en magnetisk cellesorterer efterfulgt af RNA-isolationen til flowcytometrisk og genekspressionsanalyse. (B) Flowcytometrisk analyse, der viser en stigning i ACTA2-proteinekspression i isolerede fibroblaster. (C,D) RT-qPCR-analyse af ACTA2 (C) og COL1A2 (D) mRNA-niveauer i de isolerede fibroblaster fra dag 10 tumorsfæroider. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Data repræsenteret som gennemsnit ± S.D. **p < 0,01 for test (isolerede CAF'er) versus kontrol (MRC-5) ved hjælp af elev-t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Analyse af niveauer af reaktive iltarter (ROS) og JC1-farvning i isolerede CAF'er. (A) Immunofluorescensbilleder, der viser niveauer af reaktive iltarter (ROS) på dag 7 og dag 10 ved DCFDA-farvning. B) Flowcytometrisk analyse, der repræsenterer antallet af DCFDA-positive celler. X-aksen præsenterer DCFDA og Y-aksen præsenterer celleantal. (C) Forekomsten af DCFDA-positive CAF'er isoleret fra dag 7 og dag 10 sfæroider ved flowcytometri. MRC-5-celler i 2D-kultur blev anvendt som kontrol. (D) Flowcytometrisk analyse af JC-1-farvning til analyse af mitokondriemembranpotentiale i isolerede CAF'er fra dag 7 og dag 10 tumorsfæroider. MRC-5-celler i 2D-kultur blev anvendt som kontrol. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Data repræsenteret som gennemsnit ± S.D. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Måling af mitokondrieenzymaktiviteter i isolerede CAF'er. (A,B) RT-qPCR-analyse af GLUT1 (A) og MCT4 (B) mRNA-niveauer i isolerede CAF'er fra dag 7 og dag 10 tumorsfæroider sammenlignet med de normale fibroblaster (MRC-5). (C-E) Lactat dehydrogenase (LDH) enzymaktivitet (C), cytokrom c oxidase (COX) enzymaktivitet (D) og succinat dehydrogenase (SDH) enzymaktivitet (E) blev målt i normale fibroblaster og isolerede CAF'er fra dag 10 tumorsfæroider. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Data repræsenteret som gennemsnitlig ± S.D. **p < 0,01 signifikans for test (isolerede CAF'er) versus kontrol (MRC-5) ved hjælp af elev-t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Liste over fremadgående (F) og omvendt (R) primere til RT-qPCR-analyse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse introducerer udviklingen af multicellulære tumorsfæroider bestående af tumorceller, stromalcellepopulation (dvs. fibroblaster) og immuncellepopulation (dvs. monocytter) ved hjælp af en modificeret hængende dråbemetode. Fibroblaster og monocytter / makrofager er blandt de mest betydningsfulde populationer, der udgør tumormikromiljøet (TME), og deres tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig patientprognose16. Når fibroblaster er til stede i TME, transformeres de og udviser en specifik kræftassocieret fibroblast (CAF) fænotype, da tumormikro-miljømæssige signaler17 påvirker dem. Myofibroblaster, inflammatoriske fibroblaster (iCAF'er) og antigenpræsenterende fibroblaster (apCAF'er) findes almindeligvis i aktiverede fibroblaster18,19. Disse fænotyper er ofte forbundet med kræft aggressivitet og terapi resistens20. Myofibroblaster rapporteres som dårlige varsler i flere solide tumorer, da en højere andel af disse fibroblaster begrænser T-celleinfiltration, hvilket fører til en immunsuppressiv TME21. Disse myofibroblaster udviser karakteristiske træk ved øget produktion af reaktive iltarter (ROS) og udskillelsen af forskellige mediatorer, såsom elastiner, kollagener og fibronectin, der fører til ekstracellulær matrixaflejring inden for TME22.
Denne undersøgelse optimerede protokollen til udvikling af multicellulære 3D-tumorsfæroider ved hjælp af A549 lungeadenocarcinomceller, MRC-5 lungefibroblaster og THP-1-monocytter under hensyntagen til cellenumre og forholdet 5: 4: 1 (tumorceller: fibroblaster: monocytter), der nøje simulerer tumorstroma af den naturlige mikromiljøtilstand. Disse sfæroiders udvikling og analyse fortsatte indtil dag 10 for at nå deres kompleksitet. Således er celleantal og forhold kritiske trin i denne protokol til undersøgelse af tumor-stroma-interaktion inden for sfæroiderne, der til sidst genererer flere træk ved TME, såsom øget produktion af ROS-niveauer, mitokondriel dysfunktion, højere glykolyse og deltagelse i omdannelsen af normale fibroblaster til aktiverede CAF'er.
En af de største begrænsninger i studiet af CAF-biologi ligger i den begrænsede tilgængelighed af CAF'er fra primære tumorbiopsiprøver. Hovedmålet er at skabe biomimetiske 3D-tumorsfæroider med fibroblaster og derefter isolere de aktiverede CAF'er fra tumorsfæroiderne ved hjælp af magnetiske mikroperler mod fibroblaster ved hjælp af en magnetisk aktiveret cellesorterer (MACS). Dette kunne give en kilde til at studere CAF'er direkte. CAF-populationen blev bekræftet ved at analysere CAF-specifikke markører såsom alfa-glat muskelaktin (α-SMA) og COL1A2-ekspression. Crosstalk af kræftceller med fibroblaster omdanner fibroblastfænotypen mod aktiverede CAF'er, der udviser en øget glykolytisk vej forbundet med massiv cellulær optagelse af glukose og frigivelse af lactat og pyruvat, slutprodukterne af glykolyse. Således vil denne tilgang give nok CAF-celler til forskerne til at afsløre mange ubesvarede spørgsmål. Her optimeres celletal og forhold til lunge 3D-tumorsfæroider. For at danne andre faste tumorsfæroider skal man muligvis justere antallet og forholdet for at få den rette 3D-struktur. Denne tilgang kan også have brug for nogle ændringer for at isolere og studere immuncellepopulationen, især tumorassocierede makrofager inden for sfæroider.
Da denne 3D-lungetumorsfæroidmodel rekapitulerer naturlige tumormikromiljøfunktioner, kan denne model bruges til at studere mekanismerne for CAF-aktivering fra normale fibroblaster, dets involvering i lungekræftprogression i 3D-tumormikromiljøet. For det andet viser denne undersøgelse også, hvordan afvigende ROS-produktion og mitokondriel dysfunktion driver de normale fibroblaster mod den mere aggressive CAF-fænotype. Det vil også kaste lys over krydstalen mellem CAF og kræftceller og deres involvering i metabolisk omprogrammering forbundet med den omvendte Warburg-effekt. Således kan denne model bane vejen for en mere udtømmende undersøgelse og design af effektive terapeutiske interventioner til at målrette CAF'er til lungeadenokarcinombehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af SERB-Women Excellence Award Project, Indien (SB/WEA-02/2017) og SERB-Early Career Research Award Project, Indien (ECR/2017/000892) til DP. Forfatterne, LA og SR anerkender IIT Ropar og MHRD for deres forskningsstipendier. MK anerkender ICMR for sit forskningsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | - | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | - | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
References
- Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
- Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
- Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
- Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , Humana Press. 141-151 (2007).
- Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
- Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
- Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
- Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
- Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
- Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
- Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
- Bregman, A. A. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , John Wiley & Sons Incorporated. (2002).
- Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
- Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
- Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
- Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
- Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
- Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).
