Summary
Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.
Abstract
Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) behoren tot de meest voorkomende stromale cellen die aanwezig zijn in de micro-omgeving van de tumor, waardoor tumorgroei en progressie worden vergemakkelijkt. Complexiteit binnen de micro-omgeving van de tumor, waaronder tumorsecreoom, laaggradige ontsteking, hypoxie en redox-onbalans, bevordert heterotypische interactie en maakt de transformatie van inactieve residente fibroblasten mogelijk om actieve CAFs te worden. CAFs worden metabolisch onderscheiden van normale fibroblasten (NF's) omdat ze meer glycolytisch actief zijn, hogere niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceren en lactaatexporteur MCT-4 overexpresseren, wat leidt tot de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie (MPTP). Hier is een methode beschreven om de mitochondriale gezondheid van geactiveerde CAFs te analyseren die zijn geïsoleerd uit de meercellige 3D-tumorsferoïden bestaande uit menselijke longadenocarcinoomcellen (A549), menselijke monocyten (THP-1) en menselijke longfibroblastcellen (MRC5). Tumorsferoïden werden met verschillende tijdsintervallen gedesintegreerd en door magnetisch geactiveerde celsortering werden CAFs geïsoleerd. Het mitochondriale membraanpotentieel van CAFs werd beoordeeld met behulp van JC-1-kleurstof, ROS-productie door 2',7'-dichloordisofluorescerinediacetaat (DCFDA) -kleuring en enzymactiviteit in de geïsoleerde CAFs. Het analyseren van de mitochondriale gezondheid van geïsoleerde CAFs biedt een beter begrip van het omgekeerde Warburg-effect en kan ook worden toegepast om de gevolgen van CAF mitochondriale veranderingen te bestuderen, zoals metabole fluxen en de bijbehorende regulerende mechanismen op heterogeniteit van longkanker. De huidige studie pleit dus voor een goed begrip van tumor-stroma-interacties op mitochondriale gezondheid. Het zou een platform bieden om mitochondriaal-specifieke kandidaat-geneesmiddelen te controleren op hun werkzaamheid tegen CAFs als potentiële therapeutica in de tumormicro-omgeving, waardoor CAF-betrokkenheid bij de progressie van longkanker wordt voorkomen.
Introduction
Solide tumoren zijn samengesteld uit heterogene celpopulaties die worden geleid door de tumormicro-omgeving (TME), maar de oorsprong van de meeste cellen moet nog worden ontdekt. Voornamelijk stromale en immuuncellen (fibroblasten, endotheelcellen, monocyten, macrofagen, dendritische cellen, B-cellen, T-cellen en hun subsets) weerspiegelen de tumorheterogeniteit in long-, borst-, nier- en andere solide kankers 1,2,3. Inzicht in de oorsprong van elk subtype en hun transdifferentiatiepotentieel is van het grootste belang voor het ontwikkelen van geavanceerde therapieën tegen deze kankers. De analyse van deze diverse celpopulatie in menselijke biopsieën stelt zich voor verschillende uitdagingen vanwege het tumortype, de plaats, het stadium, de beperking van de hoeveelheid monster en patiëntspecifiekevariabiliteiten 4. Er is dus een experimenteel model nodig, dat niet alleen betrouwbaar is, maar ook de in vivo tumorconditie kan simuleren, wat bewijst dat het ideaal is voor het bestuderen van tumor-stroma-overspraak en de betrokkenheid ervan bij de pathofysiologie van de ziekte.
Driedimensionale (3D) meercellige tumor sferoïde (MCTS) culturen zijn een voordelig in vitro modelsysteem van tumoren vanwege hun gelijkenis met natuurlijke tegenhangers. MCTS kan aspecten van solide tumoren beter repliceren dan 2D-celkweekmodellen, inclusief hun ruimtelijke architectuur, fysiologische reacties, het vrijkomen van oplosbare mediatoren, genexpressiepatronen en medicijnresistentiemechanismen. Bovendien is een belangrijk voordeel van MCTS dat het kan worden gebruikt om tumor heterogeniteit en de tumormicro-omgeving (TME) te bestuderen. De hanging-drop methode is het meest gebruikte hulpmiddel voor het ontwikkelen en analyseren van MCTS5. Bij deze methode worden de verschillende cellen met media gesuspendeerd in de vorm van druppels, waardoor de groei op een coherente 3D-geaggregeerde manier mogelijk is en eenvoudig toegankelijk is voor onderzoek. De techniek is eenvoudig; het vereist niet veel cellen en elimineert de vereiste van een gespecialiseerd substraat zoals agarose voor de ontwikkeling van sferoïden6. Een bijkomend voordeel van deze methode ligt in de reproduceerbaarheid van de techniek. Bovendien is deze methode ook gebruikt om gemengde celpopulaties, zoals endotheelcellen en tumorcellen, te co-kweken om vroege tumorangiogenese te simuleren7.
In deze studie werden meercellige 3D-longtumorsferoïden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten met behulp van de hanging drop-methode die de micro-omgeving van de longtumor nabootst. Vervolgens werd de kanker-geassocieerde fibroblast (CAF) populatie geïsoleerd om mitochondriale gezondheid te onderzoeken. Het belangrijkste idee achter het ontwikkelen van deze sferoïden is om de CAFs te isoleren, omdat de kruisverwijzing tussen de cellen in sferoïden de fibroblasten zou kunnen transformeren in een myo-fibroblastachtige geactiveerde CAF-toestand. Ten tweede kan deze studie ook laten zien hoe afwijkende ROS-productie en mitochondriale disfunctie de normale fibroblasten naar het agressievere CAF-fenotype drijft. Het bleek dat fibroblasten geassembleerd in tumorsferoïden myofibroblastische kenmerken kregen met verhoogde ROS-activiteit en de inductie van metabole genexpressie. Dit protocol benadrukt het belang van de tumormicro-omgeving bij het activeren van CAF en zou een uitstekend model kunnen zijn voor in vitro generatie en studie van CAF fenotypische kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Kweek menselijke long adenocarcinoom cellijn A549, en menselijke monocytaire cellijn THP-1 in RPMI1640 media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5% CO2.
- Kweek MRC-5 menselijke longfibroblastcellen in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine-oplossing bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5% CO2.
2. Bereiding van meercellige tumorsferoïden met behulp van A549 longadenocarcinoom cellijn, MRC5 fibroblasten en THP-1 monocyten
OPMERKING: De meercellige tumorigene en niet-tumorigene 3D-sferoïden werden bereid met behulp van de hanging drop-methode in een celkweekschaal van 90 mm. Een gedetailleerde beschrijving van de ontwikkeling van deze sferoïden wordt hieronder gegeven. Alle celkweekreagentia zoals complete medium, PBS en 0,25% trypsine-EDTA-oplossing moeten vóór gebruik worden voorverwarmd bij 37 °C, tenzij anders vermeld.
- Bereiding van celsuspensie
- Kweek A549- en MRC5-aanhangcellen (elk 5 x 106 cellen) in DMEM-volledig groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium [DMEM] + 10% foetaal runderserum [FBS] + 1% penicilline-streptomycine) in T25-kolven bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5% CO2.
- Voor THP-1-cellen kweekt u de celsuspensie (5 x 106 cellen) in volledig groeimedium (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicilline-streptomycine) in T25-kolven. Voor een betere groei plaatst u de T25-kolven bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5% CO2 in een staande positie.
- Was na 3 dagen, bij 80%-85% samenvloeiing, de A549- en MRC5-cellen met calcium- en magnesiumvrije PBS (fosfaatbufferzoutoplossing) door 1 ml PBS (25-30 °C) gedurende 1 minuut in elke kolf toe te voegen en deze te aspirateren.
- Oogst de A549- en MRC5-cellen uit de kolf door ze te incuberen met 500 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Voeg onmiddellijk daarna 4 ml volledige groeimedia toe om het trypsine te inactiveren.
- Verzamel de celsuspensie uit de T25-kolf in een buis van 15 ml en pelleteer deze gedurende 5 minuten op 125 x g . Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml volledig groeimedium.
- Oprichting van meercellige tumorsferoïden
OPMERKING: Alle stappen van de tumorsferoïdevorming moeten worden uitgevoerd in de bioveiligheidskast om steriele omstandigheden te behouden. Het maximale volume van de celsuspensie is gestandaardiseerd als een druppel van 25 μL om een druppel zo te bereiden dat deze niet naar beneden valt tijdens het omkeren van de deksels.- Tel de celnummers A549, MRC5 en THP-1 met behulp van een celteller. Houd voor elke sferoïde druppel (25 μL) de volgende celnummers aan: 5.000 A549-cellen, 4.000 MRC5-cellen en 1.000 THP-1-cellen, volgens het protocol beschreven door Arora et al.7. Bereken de celnummers dienovereenkomstig voor een volume van 1 ml.
OPMERKING: Sferoïden werden aanvankelijk bereid met drie verschillende celtellingen per sferoïde (d.w.z. 5000, 8000 en 10.000). Ook werden verschillende celverhoudingen van tumorcellen / fibroblasten / monocyten (1: 1: 1, 2: 2: 1, 4: 2: 1, 5: 2: 1 en 5: 4: 1) gecontroleerd. Ten slotte werd een succesvolle 3D meercellige sferoïde formatie gezien met een verhouding van 5:4:1 en werd gebruikt voor de studie. De fibroblastconcentratie werd verhoogd op basis van zijn aandeel in de micro-omgeving van de tumor, wat de stijfheid van de tumorsferoïden verder verbeterde. De gedetailleerde procedure werd gerapporteerd in een recente publicatie van Arora et al.7. - Bereid de celsuspensie in een verhouding van 5 (A549, 2 x 105 cellen/ml) tot 4 (MRC5, 1,6 x 105 cellen/ml) tot 1 (THP-1, 5 x 104 cellen/ml) en vul het volume aan op 1 ml met volledige DMEM.
- Plaats een druppel van 25 μL celsuspensiemengsel op de afdekking van een kweekschaal van 90 mm (ongeveer 50 druppels/90 mm schaal). Vul de bodem van de kweekschaal van 90 mm met 10 ml steriel water.
- Keer het deksel voorzichtig om over de met water gevulde hydratatiekamer en plaats het gerecht gedurende 3 dagen in een celkweekincubator.
- Controleer de sferoïden onder de microscoop bij 10x vergroting op dag 4. Om beelden te verkrijgen, schakelt u de aan / uit-schakelaar in, plaatst u de schotel van 60 mm voorzichtig op het podium en selecteert u de vergroting (10x). Pas de lenzen aan en onderzoek de cellen om de celaggregatie en proliferatie te analyseren. Druk op de knoppen Bevriezen en Opslaan op de microscoop om het beeld vast te leggen.
- Verander de groeimedia op dag 4 door voorzichtig 20 μL medium uit elke druppel te halen en te vervangen door een vers volledig groeimedium.
- Tel de celnummers A549, MRC5 en THP-1 met behulp van een celteller. Houd voor elke sferoïde druppel (25 μL) de volgende celnummers aan: 5.000 A549-cellen, 4.000 MRC5-cellen en 1.000 THP-1-cellen, volgens het protocol beschreven door Arora et al.7. Bereken de celnummers dienovereenkomstig voor een volume van 1 ml.
3. Levend-dood analyse van tumorsferoïden
- Keer op dag 7 en 10 voorzichtig de schaal van 90 mm in de bioveiligheidskast om en gebruik een pipet van 200 μL om sferoïden van elke druppel te verzamelen. Verzamel vijf sferoïden elk in een buis van 1,5 ml.
- Voeg 500 μL 1x PBS toe aan de buis van 1,5 ml met sferoïden en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 125 x g . Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspendeer de sferoïden in 200 μL 1x PBS. Pipetteer niet rigoureus om sferoïde desintegratie te voorkomen.
- Pipetteer de sferoïden met behulp van een 200 μL pipet op een schaal van 60 mm voor calceïne-AM en propidiumjodidekleuring.
- Breng 5 μL 1 μM calceïne-AM oplossing en 5 μL 2 mg/ml propidiumjodideoplossing op de sferoïden. Incubeer gedurende 10 min. Na voltooiing van de incubatietijd, was de sferoïden voorzichtig met 1x PBS tweemaal.
- Plaats de schotel van 60 mm met sferoïden onder de fluorescerende omgekeerde microscoop, observeer en leg beelden vast met een vergroting van 10x door de fluorescentieoptie in de microscoopsoftware te selecteren en de FITC (groen fluorescentiekanaal; excitatie 490 nm, emissie 515 nm) te selecteren voor calceïne en texas rood kanaal (TXR; excitatie 535 nm, emissie 617 nm).
- Voor het verkrijgen van de afbeelding schakelt u Ctr Adv in, wat schakelaar 1 is, gevolgd door het inschakelen van de CPU. Wacht tot het softwaresysteem is opgestart. Plaats bij het opstarten de schotel van 60 mm voorzichtig op het podium en selecteer de vergroting (10x) en fluorescerende kanalen (FITC, TXR). Pas de lenzen aan en scan naar het beeld.
- Als u de afbeelding in het systeem wilt bekijken, selecteert u de optie Live en bekijkt u de afbeelding. Pas de intensiteit van fluorescentie aan voor de juiste optimalisatie. Sla de afbeelding op door op de knop Opslaan te klikken.
OPMERKING: In dit stadium zullen sferoïden zichtbaar zijn met het blote oog. Onder de lichtmicroscoop verschijnen sferoïden als ronde, stijve bollen met een vergroting van 10x. Meerdere sferoïden kunnen tegelijkertijd worden verzameld met behulp van een pipet van 200 μL.
4. Desintegratie en celsuspensie van tumorsferoïden
- Verzamel elk 200 tumorsferoïden op dag 7 en 10, met behulp van een pipet van 1 ml in een buis van 15 ml.
OPMERKING: Controleer voor het verzamelen zorgvuldig de vorm en vorm van een enkele sferoïde nadat u deze op een microscopisch kleine dia of op een schaal van 30 mm hebt overgebracht en observeer onder de microscoop. - Pelleteer de sferoïden door centrifugeren bij 125 x g gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant zorgvuldig zonder de tumorsferoïden te verstoren.
- Was de sferoïden voorzichtig met 200 μL PBS, centrifugeer gedurende 5 minuten op 125 x g en gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Voeg voor de sferoïde desintegratie 400 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe en houd gedurende 10 minuten op 37 °C. Voer krachtig pipetteren uit voor volledige desintegratie van de sferoïden.
- Neutraliseer trypsine door 1 ml compleet DMEM-groeimedium toe te voegen. Centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml volledig DMEM-medium en tel het totale aantal cellen.
5. Kanker-geassocieerde fibroblast (CAF) isolatie door microbeads
- Voor de isolatie van CAFs uit de tumorsferoïden resuspensie 1 x 107 cellen in 80 μL koude magnetische geactiveerde celsortering (MACS) buffer (PBS bij pH 7,2 met 0,5% runderserumalbumine [BSA] en 2 mM ethyleendiamine tetra-azijnzuur [EDTA]).
- Incubeer de celsuspensie (met 1 x 107 cellen) met 20 μL anti-fibroblast microbeads. Meng goed door zachtjes op de buis te tikken en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
- Was de cellen met 1 ml koude MACS-buffer, centrifugeer gedurende 5 minuten op 125 x g en zuig het supernatant aan. Resuspendeer de cellen in 500 μL MACS-buffer.
- Voor magnetische celscheiding op basis van kralen bereidt u de MACS-kolom voor door deze te spoelen met 3 ml MACS-buffer.
- Plaats de celsuspensie in de kolom, gevolgd door de verzameling doorstroom die de niet-gelabelde celpopulatie bevat.
- Was de kolom drie keer met 3 ml MACS-buffer. Verwijder de kolom uit de afscheider en plaats deze op de opvangbuis.
- Verzamel de cellen met het anti-fibroblast microbead-label door 5 ml MACS-buffer toe te voegen en de zuiger stevig in de kolom te duwen.
- Centrifugeer de gelabelde cellen bij 125 x g gedurende 5 minuten. Ga verder met de geïsoleerde fibroblasten voor downstream-toepassingen.
6. Op flowcytometrie gebaseerde analyse van ACTA2-expressie in geïsoleerde CAFs
- Tel het aantal geïsoleerde CAFs en gebruik ongeveer 6 x 104 cellen. Was de cellen eenmaal met PBS, centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten en aspirateer het supernatant.
- Voeg 100 μL celpermeabilisatiebuffer toe (PBS + 0,5% BSA + 0,3% v/v Triton X-100) en incubeer de cellen bij 4 °C gedurende 30 minuten.
- Vortex de cellen met tussenpozen om een enkele celsuspensie te behouden. Centrifugeer en resuspendeer de cellen in 100 μL celpermeabilisatiebuffer.
- Voeg 2 μL APC geconjugeerd anti-humaan α-SMA-antilichaam toe en incubeer bij 4 °C gedurende 45 minuten. Voeg na incubatie 1 ml permeabilisatiebuffer toe en centrifugeer bij 125 x g gedurende 5 minuten om overtollig antilichaam te verwijderen.
- Resuspendeer de pellet in 400 μL permeabilisatiebuffer voor flowcytometrische analyse. Verkrijg in totaal 10.000 gebeurtenissen van elk monster in een flowcytometer. Selecteer ACTA2-positieve cellen na het onderscheiden van de populaties van cellen op basis van hun voorwaartse en zijwaartse spreiding, waarbij de singletpopulatie wordt geselecteerd, gevolgd door het selecteren van de ACTA2-positieve cellen die als een enkele piek op het histogram met één parameter verschijnen.
7. JC-1-kleuring om mitochondriaal membraanpotentiaal te bepalen
- Tel het aantal geïsoleerde CAFs en gebruik ongeveer 6 x 104 cellen voor 5,5,6,6'-tetrachloro-1,1',3,3' tetraethylbenzimi-dazoylcarbocyanine-jodide (JC-1) kleuring met behulp van flowcytometrie.
- Was de cellen grondig met PBS, centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten, adem het supernatant op en voeg 100 μL celkleuringsbuffer toe.
- Voeg JC-1 kleurstof toe in een werkconcentratie van 2 μM en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was na beëindiging van de incubatie de cellen met PBS, centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten en resuspenseer in een laatste volume van 400 μL.
- Verkrijg in totaal 20.000 gebeurtenissen van elk monster in een flowcytometer. Kwantificeer het mitochondriale membraanpotentiaal door de rood verschoven JC-1-aggregaten op het FL-2-kanaal en de groen verschoven monomeren op het FL-1-kanaal te meten.
8. DCFDA-kleuring om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) -niveaus te schatten
- Gebruik de hele sferoïden (50 nummers) en de geïsoleerde CAFs (6 x 104 cellen) uit de sferoïden voor 2',7'-dichloordisofluoresceïnediacetaat (DCFDA) kleuring.
- Was de cellen grondig met PBS, centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten, adem het supernatant op en voeg 100 μL celkleuringsbuffer toe.
- Voeg DCFDA-kleurstof toe in een werkconcentratie van 1 μM en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was de cellen twee keer met PBS, centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten en resuspenseer vervolgens in een eindvolume van 400 μL.
- Verkrijg in totaal 20.000 gebeurtenissen van elk monster in een flowcytometer. Beoordeel de ROS-niveaus door de fluorescentie op dag 7 en dag 10 te meten voor de sferoïden en de geïsoleerde CAFs.
9. RT-qPCR analyse van CAF markers en glycolytische genen
- Extraheer RNA uit de gesorteerde CAFs met behulp van een eencellige lysiskit volgens het protocol van de fabrikant. Bereid cDNA voor van 100 ng RNA met behulp van een cDNA-synthesekit volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Voer RT-qPCR uit om de relatieve CAF-markers (ACTA28 en COL1A29) en glycolytische gen (GLUT110 en MCT411) expressie te analyseren. Voer smeltcurveanalyse uit na de laatste uitbreiding om de specificiteit van de producten te garanderen. Normaliseer de gegevens met behulp van de expressie van GAPDH als het referentiegen. De primersequenties die voor RT-qPCR worden gebruikt, zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.
10. Extractie en kwantificering van het cellulaire eiwit uit CAFs
OPMERKING: Voer alle stappen van eiwitextractie op ijs uit om eiwitafbraak te voorkomen.
- Resuspensie ongeveer 4 x 106 CAF-cellen in 100 μL ijskoude RIPA-lysisbuffer (met 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS en 0,5% natriumdeoxycholaat met 5 mM Halt protease en fosfataseremmer cocktail, en 5 mM EDTA bij pH 7,4).
- Vortex rigoureus voor een goede cellyse. Soniceer de celsuspensie op 20 Hz frequentie, 20% amplitude voor 15 s en 3x puls.
- Na ultrasoonapparaat centrifugeert u het eiwitextract bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een voorgekoelde buis van 1,5 ml. Voer de BCA-eiwittest uit om eiwit te kwantificeren.
11. Spectrofotometrische analyse van enzymatische activiteiten in CAFs
OPMERKING: De volgende enzymactiviteiten worden geanalyseerd in van tumorsferoïden afgeleide CAFs.
- Meting van de activiteit van succinaatdehydrogenase
- Om de activiteit van succinaatdehydrogenase (SDH) in CAFs te evalueren, bereidt u SHE-buffer met 250 mM sucrose, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) en 1 mM ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur(EGTA) en past u de pH aan op 7,3. Voeg 0,4 mM fenazinemethosulfaat (PMS), 0,2 mM 2,6-dichloorfofenol (DCPIP), 50 mM MgCl2, 0,02% Triton X-100 en 1 mM cyanide toe aan de SHE-buffer en bewaar bij 37 °C.
- Extraheer het cellulaire eiwit uit de CAFs zoals beschreven in stap 10 (2 x 106 cellen). In elke put van een 96-well plaat incubeer 100 μL van 0,1 mg cellulair eiwit met 100 μL SHE-reactiemengsel bij 37 °C gedurende 15 min.
- Om de enzymatische activiteit te starten, voegt u 10 mM succinaat12 toe. Bereken de enzymactiviteit in nM/min/ml door de veranderingen in absorptie bij 600 nm te meten.
- De omrekeningsfactor voor DCIP is 0,0215 A/nM op basis van de molaire extinctiecoëfficiënt12. Bereken de relatieve activiteit van SDH met behulp van de genoemde formule:
Relatieve activiteit (nM/min/ml/enzym) =
X 
X V
Waarbij ΔA/min = snelheid van enzymatische reactie (Ainitieel- Adefinitief)/(tijddefinitief- A/mininitieel), Ve = volume van het monster en V = volume van de reactie.
- Schatting van de cytochroom c-oxidase-activiteit
- Om de cytochroom c-oxidase (COX) activiteit in CAFs te evalueren, voegt u 0,2 mg/ml cellulair eiwit toe aan een KME-reactiebufferoplossing met KME-buffer (125 mM KCl, 20 mM 3-(N-morpholino)propaansulfonzuur [MOPS] en 1 mM EGTA, pH 7,4), 0,02% Triton X-100 en 5 mM natriumascorbaat.
- Meng in een aparte buis 50 μM paardenhartcytochroom c met 5 mM natriumascorbaat en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min13. Voeg na de incubatie 20 μL gereduceerd cytochroom c toe aan 500 μL KME-reactiebufferoplossing die cellulair eiwit bevat.
- Bereken de enzymactiviteit in eenheden/μL door de veranderingen in absorptie bij 550 nm te meten. De absorptie van cytochroom c bij 550 nm verandert met zijn oxidatietoestand. Het verschil in extinctiecoëfficiënten (mM) tussen gereduceerd en geoxideerd cytochroom c is 21,84 bij 550 nm14. Bereken de hoeveelheid enzymactiviteit in het cellulaire lysaat als:
Eenheden/μL =
Waarbij ΔA/min = A/minmonster-A/minblanco en 21,84 = ΔԑmM tussen geoxideerd cytochroom c en gereduceerd cytochroom c bij 550 nm
- Beoordeling van lactaatdehydrogenase-activiteit
- Voer een lactaatdehydrogenase (LDH) -test uit met behulp van een lactaatdehydrogenaseceltestkit volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg LDH-testreagens (10 μL) toe aan 0,5 mg/ml cellulaire eiwitten en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Meet na beëindiging van de incubatie de absorptie bij 45 nm elke 1 min gedurende 8 min.
- Bereid de NADH-normen voor colorimetrische detectie voor met behulp van 0 (blanco), 2,5, 5, 7,5, 10 en 12,5 nM/put nadh gevolgd door de toevoeging van LDH-testreagens aan een eindvolume van 50 μL.
- Plot de verschillen in absorptie tussen Tinitieel enT-eind naar de NADH-standaardcurve om de hoeveelheid NADH-generatie te bepalen. Beoordeel de activiteit van LDH met behulp van de genoemde formule:
LDH-activiteit =
X-monsterverdunningsfactor
Waarbij B = hoeveelheid (nmole) NADH gegenereerd tussen Tinitieel en Tfinale, reactietijd = Tdefinitief - Tinitieel (min), en Ve = monstervolume (ml) toegevoegd aan goed.
X 
X V
X-monsterverdunningsfactorSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden met behulp van drie verschillende celpopulaties - A549 (longadenocarcinoom), MRC-5 (fibroblasten) en THP-1 (monocyten) - door de hanging drop-methode zoals waargenomen op dag 7 en dag 10 onder de microscoop. Op dag 7 waren sferoïden compact en stijf met een diameter van 260 ± 5,3 μm en op dag 10 waren de sferoïden 480 ± 7,5 μm in diameter (figuur 1A bovenpaneel, figuur 1B-D). De dag 7 en dag 10 sferoïden waren strakke aggregaten en meestal uniform in grootte en diameter zoals waargenomen in de hele batchanalyse. De compactheids- en stijfheidspiek van de 3D-meercellige sferoïde werd opgemerkt rond dag 10 (figuur 1A bovenpaneel, figuur 1B-D). De levensvatbaarheid van de cel werd beoordeeld door calceïne-AM/PI-kleuring. Een afname van propidiumjodide fluorescentie (rood) en een toename van calceïne-AM fluorescentie (groen) van dag 7 tot dag 10 werd waargenomen, wat wijst op celproliferatie in de 3D-micro-omgeving (figuur 1A, E). De sferoïden werden ook beoordeeld op hypoxische kenmerken met behulp van Image-iT Red hypoxiekleuring; een hypoxische kern in het midden van de dag werden 10 sferoïden gevonden (figuur 1F). Bovendien werd een duidelijke upregulatie van E-cadherine-genexpressie waargenomen in dag 7 en dag 10 sferoïden in vergelijking met dag 4 (figuur 1G), wat wijst op celcompactheid en stijfheid. Ook wijst een toename van MKi67-genexpressie met de toename in dagen van tumorsferoïdevorming (figuur 1H) op celgroei en proliferatie.
Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) werden geïsoleerd vanaf de dag 10 tumorsferoïden met behulp van anti-fibroblast microbeads zoals beschreven in het schematische overzicht in figuur 2A. Geïsoleerde fibroblasten van deze tumorsferoïden zijn ongeveer 69% ACTA2-positief (figuur 2B). Op mRNA-niveau vertoonden geïsoleerde fibroblasten bijna drievoudige (figuur 2C) en tienvoudige (figuur 2D) upregulatie in acta2 en col1a2 (collageen type 1 alfa 2 keten) genexpressies, respectievelijk, in vergelijking met de normale MRC-5 fibroblasten, wat de rol van micro-omgevingsaanwijzingen suggereert in CAF-transformatie / activering binnen deze tumorsferoïden.
Om de cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) -niveaus in de geactiveerde CAFs te evalueren, werden de ROS-niveaus in de tumorsferoïden eerst onderzocht met behulp van het 2',7'-dichloorhisonetinediacetaat (DCFDA), dat diffundeerde in de cellen en gedeacetyleerd door de cellulaire esterasen gevolgd door de ROS-afhankelijke oxidatie in het fluorescerende molecuul 2',7'-dichloorfluoresceïne (DCF). Een significante toename van ROS-niveaus op dag 10 tumorsferoïden werd waargenomen in vergelijking met dag 7, wat wijst op de mogelijke betrokkenheid van ROS-generatie bij CAF-activering (figuur 3A, B). Een significante toename werd waargenomen in cellulaire ROS-niveaus in CAFs geïsoleerd vanaf dag 7 en dag 10 tumorsferoïden (figuur 3C). Bovendien werd een verandering van mitochondriaal membraanpotentiaal opgemerkt, zoals aangegeven door de JC-1-kleuring (figuur 3D). Gezamenlijk suggereren deze resultaten een verandering in mitochondriaal membraanpotentiaal en oxidatieve stress in de geactiveerde CAFs geïsoleerd uit tumorsferoïden.
Om te analyseren of de verhoogde ROS-niveaus en mitochondriale membraandepolarisatie in de CAFs causaal verband houden met de upregulatie van bepaalde glycolytische doelen voor het produceren van het omgekeerde Warburg-effect op kankercellen in de tumormicro-omgeving, werd de relatieve genexpressie van GLUT1 en MCT4 onderzocht. Een inductie van GLUT1 (figuur 4A) en MCT4 (figuur 4B) genexpressie werd waargenomen in CAFs in vergelijking met normale fibroblasten. Deze observatie is in lijn met eerdere studies op dit gebied die een verhoogde abundantie van GLUT1 - en MCT4-niveaus in CAFs11 lieten zien. GLUT1 is verantwoordelijk voor het transport van glucose naar de cellen, terwijl MCT4 lactaat uit de cellen extrudeert, en daarom lijkt deze trend redelijk logisch voor de CAF-biologie. Aangezien mitochondriale disfunctie duidelijk gecorreleerd is met de verandering van verschillende mitochondriale enzymactiviteiten, werden de verschillende mitochondriale enzymactiviteiten in de geïsoleerde CAFs geanalyseerd. Significante inductie van lactaatdehydrogenase (LDH) enzymactiviteit in CAFs in vergelijking met de normale fibroblasten werd waargenomen (figuur 4C), wat wijst op een hoge lactaatproductie, hoge oxidatieve mitochondriale stress en omgekeerd Warburg-effect in geactiveerde CAFs. Vervolgens werd de enzymactiviteit van cytochroom c-oxidase (COX) onderzocht in CAFs, omdat bekend is dat de verbetering van cellulaire ROS-niveaus de COX-expressie en -activiteit verhoogt via de NF-kB-afhankelijke route15. Een inductie van COX-activiteit werd waargenomen in CAFs in vergelijking met de normale fibroblasten (figuur 4D), wat wijst op de betrokkenheid van ROS-afhankelijke signalering bij de conversie van CAFs uit normale fibroblasten. De mitochondriale succinaatdehydrogenase (SDH) enzymactiviteit in CAFs werd ook beoordeeld en vond zijn opmerkelijke inductie in vergelijking met normale fibroblasten (figuur 4E).
Figuur 1: Ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden en levend-dood analyse. (A) Bovenste paneel: Microscopische beelden van meercellige 3D-tumorsferoïden bestaande uit A549 (longadenocarcinoomcellen), MRC-5 (fibroblasten) en THP-1 (monocyten) op dag 7 en dag 10. Midden- en onderpaneel: samengevoegd beeld van calceïne-AM en propidiumjodide (PI) kleuring (middenpaneel) en propidiumjodidekleuring (onderste paneel) op dag 7 en dag 10 tumorsferoïden. (B) Fasecontrastbeelden van dag 7 en dag 10 tumorsferoïden gevangen bij 10x objectief. (C,D) Representatieve beelden en kwantitatieve analyse van dag 7 (d7) en dag 10 (d10) sferoïden met meting van de sferoïde diameter. (E) Kwantitatieve analyse van calceïne-AM gelabelde cellen op dag 7 en dag 10 tumorsferoïden. (F) Immunofluorescentiekleuring van Image-iTRed hypoxiekleuring in dag 10 sferoïde secties (6 μm). DAPI werd gebruikt voor kernen counterstaining. (G,H) RT-qPCR-analyse van E-cadherine (G) en MKi67 (celproliferatiemarker) (H) mRNA-niveaus op dag 7 en dag 10 van tumorsferoïden. Tweedimensionale cultuur van MRC-5 werd beschouwd als controle. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n = 3). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (S.D. **p < 0,01 voor test (dag 7 sferoïde) versus controle (2D-cultuur MRC-5) met behulp van student t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van CAF-kenmerken in geïsoleerde fibroblasten uit tumorsferoïden. (A) Schematisch overzicht van het protocol voor de isolatie van fibroblasten uit de meercellige tumorsferoïden op dag 10 met behulp van anti-fibroblastmicroeads met behulp van een magnetische celsorteerder gevolgd door de RNA-isolatie voor flowcytometrische en genexpressieanalyse. (B) Flowcytometrische analyse die een toename van ACTA2-eiwitexpressie in geïsoleerde fibroblasten weergeeft. (C,D) RT-qPCR-analyse van ACTA2 (C) en COL1A2 (D) mRNA-niveaus in de geïsoleerde fibroblasten vanaf dag 10 tumorsferoïden. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n = 3). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D. **p < 0,01 voor test (geïsoleerde CAFs) versus controle (MRC-5) met behulp van student t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus en JC1-kleuring in geïsoleerde CAFs. (A) Immunofluorescentiebeelden die reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus tonen in dag 7 en dag 10 sferoïden door DCFDA-kleuring. (B) Flowcytometrische analyse die het aantal DCFDA-positieve cellen weergeeft. X-as presenteert DCFDA en Y-as presenteert celgetal. (C) De abundantie van DCFDA-positieve CAFs geïsoleerd van dag 7 en dag 10 sferoïden door flowcytometrie. MRC-5-cellen in 2D-cultuur werden gebruikt als controle. (D) Flowcytometrische assay van JC-1-kleuring voor het analyseren van mitochondriaal membraanpotentiaal in geïsoleerde CAFs vanaf dag 7 en dag 10 tumorsferoïden. MRC-5-cellen in 2D-cultuur werden gebruikt als controle. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n = 3). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Meting van mitochondriale enzymactiviteiten in geïsoleerde CAFs. (A,B) RT-qPCR-analyse van GLUT1 (A) en MCT4 (B) mRNA-niveaus in geïsoleerde CAFs vanaf dag 7 en dag 10 tumorsferoïden in vergelijking met de normale fibroblasten (MRC-5). (C-E) Lactaatdehydrogenase (LDH) enzymactiviteit (C), cytochroom c-oxidase (COX) enzymactiviteit (D) en succinaatdehydrogenase (SDH) enzymactiviteit (E) werden gemeten in normale fibroblasten en geïsoleerde CAFs vanaf dag 10 tumorsferoïden. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud (n = 3). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D. **p < 0,01 significantie voor test (geïsoleerde CAFs) versus controle (MRC-5) met behulp van student t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Lijst van voorwaartse (F) en omgekeerde (R) primers voor RT-qPCR-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie introduceert de ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden bestaande uit tumorcellen, stromale celpopulatie (d.w.z. fibroblasten) en immuuncelpopulatie (d.w.z. monocyten) met behulp van een gemodificeerde hanging drop-methode. Fibroblasten en monocyten/macrofagen behoren tot de belangrijkste populaties die de tumormicro-omgeving (TME) vormen, en hun aanwezigheid is vaak gekoppeld aan een slechte prognose van de patiënt16. Wanneer aanwezig in de TME, transformeren fibroblasten en vertonen ze een specifiek kanker-geassocieerd fibroblast (CAF) fenotype als de tumor micro-omgevingssignalen17 beïnvloeden hen. Myofibroblasten, inflammatoire fibroblasten (iCAFs) en antigeen-presenterende fibroblasten (apCAFs) worden vaak aangetroffen in geactiveerde fibroblasten18,19. Deze fenotypen worden vaak in verband gebracht met kankeragressiviteit en therapieresistentie20. Myofibroblasten worden gerapporteerd als slechte voortekenen in meerdere solide tumoren, omdat een groter deel van deze fibroblasten T-celinfiltratie beperkt, wat leidt tot een immunosuppressieve TME21. Deze myofibroblasten vertonen karakteristieke kenmerken van verhoogde productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de afscheiding van verschillende mediatoren zoals elastines, collageen en fibronectine die leiden tot extracellulaire matrixafzetting binnen TME22.
Deze studie optimaliseerde het protocol voor de ontwikkeling van meercellige 3D-tumorsferoïden met behulp van A549 longadenocarcinoomcellen, MRC-5 longfibroblasten en THP-1-monocyten met inachtneming van celaantallen en de verhouding van 5: 4: 1 (tumorcellen: fibroblasten: monocyten) die het tumorstroma van de natuurlijke micro-omgevingsconditie nauwkeurig simuleren. De ontwikkeling en analyse van deze sferoïden ging door tot dag 10 om hun complexiteit te bereiken. Celaantal en -verhouding zijn dus kritieke stappen van dit protocol om tumor-stroma-interactie binnen de sferoïden te bestuderen die uiteindelijk meerdere kenmerken van de TME genereren, zoals verhoogde productie van ROS-niveaus, mitochondriale disfunctie, hogere glycolyse en deelname aan de conversie van normale fibroblasten naar geactiveerde CAFs.
Een van de belangrijkste beperkingen in de studie van CAF-biologie ligt in de beperkte beschikbaarheid van CAFs uit primaire tumorbiopsiemonsters. Het belangrijkste doel is om biomimetische 3D-tumorsferoïden te maken met fibroblasten en vervolgens de geactiveerde CAFs van de tumorsferoïden te isoleren met behulp van anti-fibroblasten magnetische microbeads met behulp van een magnetische geactiveerde celsorteerder (MACS). Dit zou een bron kunnen zijn om CAC's rechtstreeks te bestuderen. De CAF-populatie werd bevestigd door het analyseren van CAF-specifieke markers zoals alfa-gladde spieractine (α-SMA) en COL1A2-expressie. Kruisverwijzing van kankercellen met fibroblasten zet het fibroblastfenotype om in geactiveerde CAFs die een verhoogde glycolytische route vertonen die geassocieerd is met massale cellulaire opname van glucose en de afgifte van lactaat en pyruvaat, de eindproducten van glycolyse. Deze aanpak zal de onderzoekers dus voldoende CAF-cellen bieden om veel onbeantwoorde vragen te onthullen. Hier worden celaantallen en -ratio geoptimaliseerd voor long 3D-tumorsferoïden. Voor het vormen van andere solide tumorsferoïden, moet men mogelijk het aantal en de verhouding aanpassen om de juiste 3D-structuur te krijgen. Ook kan deze aanpak enkele aanpassingen nodig hebben om de immuuncelpopulatie te isoleren en te bestuderen, met name tumor-geassocieerde macrofagen in sferoïden.
Aangezien dit 3D-longtumorsferoïde model natuurlijke tumormicro-omgevingskenmerken samenvat, kan dit model worden gebruikt om de mechanismen van CAF-activering van normale fibroblasten te bestuderen, de betrokkenheid bij de progressie van longkanker in de 3D-tumormicro-omgeving. Ten tweede laat deze studie ook zien hoe afwijkende ROS-productie en mitochondriale disfunctie de normale fibroblasten naar het agressievere CAF-fenotype drijft. Het zal ook licht werpen op de kruisverwijzing tussen CAF en kankercellen en hun betrokkenheid bij metabole herprogrammering geassocieerd met het omgekeerde Warburg-effect. Dit model kan dus de weg vrijmaken voor een meer uitputtende studie en ontwerp van effectieve therapeutische interventies om CAF's te targeten voor longadenocarcinoombeheer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het SERB-Women Excellence Award Project, India (SB/WEA-02/2017) en het SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR/2017/000892) aan DP. De auteurs, LA en SR erkennen IIT Ropar en MHRD voor hun onderzoeksbeurzen. MK erkent ICMR voor haar onderzoeksbeurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | - | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | - | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
References
- Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
- Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
- Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
- Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , Humana Press. 141-151 (2007).
- Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
- Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
- Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
- Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
- Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
- Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
- Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
- Bregman, A. A. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , John Wiley & Sons Incorporated. (2002).
- Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
- Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
- Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
- Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
- Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
- Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).
