Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64315
* These authors contributed equally

Summary

Gli sferoidi tumorali 3D multicellulari sono stati preparati con cellule di adenocarcinoma polmonare, fibroblasti e monociti, seguiti dall'isolamento dei fibroblasti associati al cancro (CAF) da questi sferoidi. I CAF isolati sono stati confrontati con fibroblasti normali per valutare la salute mitocondriale studiando il potenziale transmembrana mitocondriale, le specie reattive dell'ossigeno e le attività enzimatiche.

Abstract

I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono tra le cellule stromali più abbondanti presenti nel microambiente tumorale, facilitando la crescita e la progressione del tumore. La complessità all'interno del microambiente tumorale, tra cui secretoma tumorale, infiammazione di basso grado, ipossia e squilibrio redox, favorisce l'interazione eterotipica e consente la trasformazione dei fibroblasti residenti inattivi per diventare CAF attivi. I CAF sono metabolicamente distinti dai fibroblasti normali (NF) in quanto sono più glicoliticamente attivi, producono livelli più elevati di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e sovraesprimono l'esportatore di lattato MCT-4, portando all'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (MPTP). Qui è stato descritto un metodo per analizzare la salute mitocondriale di CAF attivati isolati dagli sferoidi tumorali 3D multicellulari comprendenti cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A549), monociti umani (THP-1) e cellule di fibroblasti polmonari umani (MRC5). Gli sferoidi tumorali sono stati disintegrati a diversi intervalli di tempo e attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente, i CAF sono stati isolati. Il potenziale di membrana mitocondriale dei CAF è stato valutato utilizzando il colorante JC-1, la produzione di ROS mediante colorazione con 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFDA) e l'attività enzimatica nei CAF isolati. L'analisi della salute mitocondriale dei CAF isolati fornisce una migliore comprensione dell'effetto Warburg inverso e può anche essere applicata per studiare le conseguenze dei cambiamenti mitocondriali della CAF, come i flussi metabolici e i corrispondenti meccanismi regolatori sull'eterogeneità del cancro del polmone. Pertanto, il presente studio sostiene una comprensione delle interazioni tumore-stroma sulla salute mitocondriale. Fornirebbe una piattaforma per verificare i candidati farmaci mitocondriali specifici per la loro efficacia contro i CAF come potenziali terapie nel microambiente tumorale, prevenendo così il coinvolgimento del CAF nella progressione del cancro del polmone.

Introduction

I tumori solidi sono composti da popolazioni cellulari eterogenee che sono guidate dal microambiente tumorale (TME), tuttavia, l'origine della maggior parte delle cellule deve ancora essere scoperta. Principalmente le cellule stromali e immunitarie (fibroblasti, cellule endoteliali, monociti, macrofagi, cellule dendritiche, cellule B, cellule T e loro sottogruppi) riflettono l'eterogeneità tumorale nei tumori polmonari, mammari, renali e altri tumori solidi 1,2,3. Comprendere l'origine di ciascun sottotipo e il loro potenziale di trans-differenziazione è della massima necessità per lo sviluppo di terapie avanzate contro questi tumori. L'analisi di questa variegata popolazione cellulare nelle biopsie umane presenta diverse sfide a causa del tipo di tumore, del sito, dello stadio, della limitazione della quantità del campione e delle variabilità specifiche del paziente4. Pertanto, è necessario un modello sperimentale, che non sia solo affidabile, ma possa anche simulare la condizione tumorale in vivo, dimostrandosi ideale per lo studio della diafonia tumore-stroma e il suo coinvolgimento nella fisiopatologia della malattia.

Le colture tridimensionali (3D) di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono un sistema modello in vitro vantaggioso di tumori a causa della loro somiglianza con le controparti naturali. MCTS può replicare meglio gli aspetti dei tumori solidi rispetto ai modelli di coltura cellulare 2D, compresa la loro architettura spaziale, le risposte fisiologiche, il rilascio di mediatori solubili, i modelli di espressione genica e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Inoltre, uno dei principali vantaggi della MCTS è che può essere utilizzato per studiare l'eterogeneità tumorale e il microambiente tumorale (TME). Il metodo hanging-drop è lo strumento più comunemente impiegato per lo sviluppo e l'analisi di MCTS5. In questo metodo, le diverse cellule con i media sono sospese sotto forma di goccioline, il che consente la sua crescita in modo coerente aggregato 3D ed è semplice da accedere per l'esame. La tecnica è semplice; Non richiede molte cellule ed elimina la necessità di un substrato specializzato come l'agarosio per lo sviluppo di sferoidi6. Un ulteriore vantaggio di questo metodo risiede nella riproducibilità della sua tecnica. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato anche per co-coltivare popolazioni cellulari miste, come cellule endoteliali e cellule tumorali, per simulare l'angiogenesi tumorale precoce7.

In questo studio, sferoidi tumorali polmonari 3D multicellulari sono stati preparati con cellule di adenocarcinoma polmonare, fibroblasti e monociti utilizzando il metodo della goccia sospesa che imita il microambiente del tumore polmonare. Quindi la popolazione di fibroblasti associati al cancro (CAF) è stata isolata per studiare la salute mitocondriale. L'idea principale alla base dello sviluppo di questi sferoidi è quella di isolare i CAF poiché la diafonia tra le cellule negli sferoidi potrebbe trasformare i fibroblasti in uno stato CAF attivato simile ai miofibroblasti. In secondo luogo, questo studio può anche descrivere come la produzione aberrante di ROS e la disfunzione mitocondriale spingano i fibroblasti normali verso il fenotipo CAF più aggressivo. È stato scoperto che i fibroblasti assemblati all'interno degli sferoidi tumorali hanno acquisito caratteristiche miofibroblastiche con una maggiore attività ROS e l'induzione dell'espressione genica metabolica. Questo protocollo evidenzia l'importanza del microambiente tumorale nell'attivazione della CAF e potrebbe essere un ottimo modello per la generazione in vitro e lo studio delle caratteristiche fenotipiche della CAF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coltura cellulare

  1. Linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano di coltura A549 e linea cellulare monocitica umana THP-1 in terreni RPMI1640 integrati con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina a 37 °C in camera umidificata con 5% di CO2.
  2. Coltura di cellule di fibroblasti polmonari umani MRC-5 in terreno DMEM integrato con soluzione di FBS al 10% e soluzione di penicillina-streptomicina all'1% a 37 °C in camera umidificata con CO2 al 5%.

2. Preparazione di sferoidi tumorali multicellulari utilizzando la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare A549, fibroblasti MRC5 e monociti THP-1

NOTA: Gli sferoidi 3D tumorigenici e non tumorigenici multicellulari sono stati preparati utilizzando il metodo della goccia sospesa in un piatto di coltura cellulare da 90 mm. Di seguito viene fornita una descrizione dettagliata dello sviluppo di questi sferoidi. Tutti i reagenti di coltura cellulare come terreno completo, PBS e soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% devono essere preriscaldati a 37 °C prima dell'uso, salvo diversa indicazione.

  1. Preparazione della sospensione cellulare
    1. Coltivare cellule aderenti A549 e MRC5 (5 x 106 cellule ciascuna) in terreno di coltura completo DMEM (terreno di aquila modificato di Dulbecco [DMEM] + 10% siero bovino fetale [FBS] + 1% penicillina-streptomicina) in palloni T25 a 37 °C in camera umidificata con 5% di CO2.
    2. Per le cellule THP-1, far crescere la sospensione cellulare (5 x 106 cellule) in un mezzo di crescita completo (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina) in flaconi T25. Per una migliore crescita, posizionare i palloni T25 a 37 °C in una camera umidificata con il 5% di CO2 in posizione eretta.
    3. Dopo 3 giorni, all'80%-85% di confluenza, lavare le cellule A549 e MRC5 con PBS (soluzione salina tampone fosfato) privo di calcio e magnesio aggiungendo 1 mL di PBS (25-30 °C) in ciascun matraccio per 1 minuto e aspirandolo.
    4. Raccogliere le cellule A549 e MRC5 dal matraccio incubandole con 500 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per 5 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato con CO2 al 5%. Subito dopo, aggiungere 4 ml di terreno di coltura completo per inattivare la tripsina.
    5. Raccogliere la sospensione cellulare dal matraccio T25 in un tubo da 15 ml e pellettarla a 125 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di terreno di crescita completo.
  2. Istituzione di sferoidi tumorali multicellulari
    NOTA: Tutte le fasi della formazione dello sferoide tumorale devono essere eseguite all'interno dell'armadio di biosicurezza al fine di mantenere condizioni sterili. Il volume massimo della sospensione cellulare è stato standardizzato come una goccia di 25 μL per preparare una goccia in modo tale che non cada mentre si capovolgono i coperchi.
    1. Contare i numeri di celle A549, MRC5 e THP-1 utilizzando un contatore di celle. Per ogni goccia sferoide (25 μL) mantenere i seguenti numeri di cellule: 5.000 cellule A549, 4.000 cellule MRC5 e 1.000 cellule THP-1, seguendo il protocollo descritto da Arora et al.7. Calcolare i numeri di cella di conseguenza per un volume di 1 ml.
      NOTA: Gli sferoidi sono stati inizialmente preparati con tre diversi conteggi cellulari per sferoide (cioè 5000, 8000 e 10.000). Inoltre, sono stati controllati diversi rapporti cellulari di cellule tumorali / fibroblasti / monociti (1: 1: 1, 2: 2: 1, 4: 2: 1, 5: 2: 1 e 5: 4: 1). Infine, è stata osservata una formazione sferoide multicellulare 3D di successo con un rapporto di 5: 4: 1 ed è stata utilizzata per lo studio. La concentrazione di fibroblasti è stata aumentata in base alla sua proporzione nel microambiente tumorale, che ha ulteriormente migliorato la rigidità degli sferoidi tumorali. La procedura dettagliata è stata riportata in una recente pubblicazione di Arora et al.7.
    2. Preparare la sospensione cellulare in un rapporto di 5 (A549, 2 x 10 5 cellule/ml) a 4 (MRC5, 1,6 x 10 5 cellule/ml) a 1 (THP-1,5 x 104 celle/ml) e portare il volume a 1 mL con DMEM completo.
    3. Introdurre una goccia di 25 μL di miscela di sospensione cellulare sul coperchio di un piatto di coltura da 90 mm (circa 50 gocce/piatto da 90 mm). Riempire il fondo del piatto di coltura da 90 mm con 10 ml di acqua sterile.
    4. Capovolgere con attenzione il coperchio sopra la camera di idratazione piena d'acqua e posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare per 3 giorni.
    5. Monitorare gli sferoidi al microscopio con un ingrandimento 10x il giorno 4. Per acquisire immagini, accendere l'interruttore di alimentazione, posizionare con attenzione il piatto da 60 mm sul palco e selezionare l'ingrandimento (10x). Regolare le lenti ed esaminare le cellule per analizzare l'aggregazione e la proliferazione cellulare. Premere i pulsanti Freeze e Save forniti sul microscopio per acquisire l'immagine.
    6. Cambiare il terreno di coltura il giorno 4 aspirando con cura 20 μL di terreno da ciascuna goccia e sostituendolo con un nuovo substrato di crescita completo.

3. Analisi dei morti vivi degli sferoidi tumorali

  1. Nei giorni 7 e 10, capovolgere con attenzione il piatto da 90 mm nell'armadio di biosicurezza e utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere gli sferoidi da ciascuna goccia. Raccogliere cinque sferoidi ciascuno in un tubo da 1,5 ml.
  2. Aggiungere 500 μL di 1x PBS al tubo da 1,5 mL contenente sferoidi e centrifugare a 125 x g per 5 minuti. Scartare attentamente il surnatante e risospendere gli sferoidi in 200 μL di 1x PBS. Non pipettare rigorosamente per evitare la disintegrazione sferoide.
  3. Pipetta gli sferoidi utilizzando una pipetta da 200 μL su un piatto da 60 mm per la colorazione con calcein-AM e ioduro di propidio.
  4. Mettere sugli sferoidi 5 μL di soluzione di calceina-AM da 1 μM e 5 μL di soluzione di ioduro di propidio 2 mg/ml. Incubare per 10 min. Dopo il completamento del periodo di incubazione, lavare delicatamente gli sferoidi con 1x PBS due volte.
  5. Posizionare il piatto da 60 mm contenente sferoidi sotto il microscopio invertito fluorescente, osservare e acquisire immagini con un ingrandimento 10x selezionando l'opzione di fluorescenza nel software del microscopio e selezionando il FITC (canale di fluorescenza verde; eccitazione 490 nm, emissione 515 nm) per calceina e canale rosso Texas (TXR; eccitazione 535 nm, emissione 617 nm).
    1. Per acquisire l'immagine, attivare Ctr Adv, che è l'interruttore 1, seguito dall'accensione della CPU. Attendere l'avvio del sistema software. Una volta avviato, posizionare con attenzione il piatto da 60 mm sul palco e selezionare l'ingrandimento (10x) e i canali fluorescenti (FITC, TXR). Regolare le lenti ed eseguire la scansione dell'immagine.
    2. Per visualizzare l'immagine nel sistema, selezionare l'opzione Live e visualizzare l'immagine. Regolare l'intensità della fluorescenza per un'ottimizzazione appropriata. Salvare l'immagine facendo clic sul pulsante Salva .
      NOTA: In questa fase, gli sferoidi saranno visibili ad occhio nudo. Sotto il microscopio ottico, gli sferoidi appariranno come sfere rotonde e rigide con un ingrandimento 10x. È possibile raccogliere più sferoidi contemporaneamente utilizzando una pipetta da 200 μL.

4. Disintegrazione e sospensione cellulare di sferoidi tumorali

  1. Raccogliere 200 sferoidi tumorali ciascuno nei giorni 7 e 10, utilizzando una pipetta da 1 mL in una provetta da 15 ml.
    NOTA: Prima della raccolta, controllare attentamente la forma e la forma di un singolo sferoide dopo averlo trasferito su un vetrino microscopico o su un piatto da 30 mm e osservare al microscopio.
  2. Pellettare gli sferoidi mediante centrifugazione a 125 x g per 5 min. Aspirare il surnatante con attenzione senza disturbare gli sferoidi tumorali.
  3. Lavare accuratamente gli sferoidi con 200 μL di PBS, centrifugare a 125 x g per 5 minuti e scartare con cautela il surnatante.
  4. Per la disintegrazione dello sferoide, aggiungere 400 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e mantenere a 37 °C per 10 minuti. Eseguire un pipettaggio vigoroso per la completa disintegrazione degli sferoidi.
  5. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 1 mL di terreno di crescita DMEM completo. Centrifugare a 125 x g per 5 minuti ed eliminare accuratamente il surnatante .
  6. Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo DMEM completo e contare il numero totale di cellule.

5. Isolamento dei fibroblasti associati al cancro (CAF) attraverso microsfere

  1. Per l'isolamento dei CAF dagli sferoidi tumorali, risospendere 1 x 10 7 cellule in 80 μL di tampone MACS (cold magnetic activated cell sorting) (PBS a pH7,2 contenente lo 0,5% di sieroalbumina bovina [BSA] e 2 mM di acido etilendiamminatraacetico [EDTA]).
  2. Incubare la sospensione cellulare (contenente 1 x 107 cellule) con 20 μL di microsfere anti-fibroblasti. Mescolare bene picchiettando delicatamente il tubo e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  3. Lavare le celle con 1 mL di tampone MACS freddo, centrifugare a 125 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le celle in 500 μL di buffer MACS.
  4. Per la separazione delle cellule basata su sfere magnetiche, preparare la colonna MACS risciacquandola con 3 ml di tampone MACS.
  5. Posizionare la sospensione cellulare nella colonna seguita dalla raccolta del flusso contenente la popolazione cellulare non etichettata.
  6. Lavare la colonna tre volte con 3 ml di tampone MACS. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla sul tubo di raccolta.
  7. Raccogliere le cellule marcate con microsfere anti-fibroblasti aggiungendo 5 ml di tampone MACS e spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna.
  8. Centrifugare le celle marcate a 125 x g per 5 minuti. Procedere con i fibroblasti isolati per applicazioni a valle.

6. Analisi basata sulla citometria a flusso dell'espressione di ACTA2 in CAF isolati

  1. Contare il numero di CAF isolati e utilizzare circa 6 x 104 celle. Lavare le cellule una volta con PBS, centrifugare a 125 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
  2. Aggiungere 100 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare (PBS + 0,5% BSA + 0,3% v/v Triton X-100) e incubare le cellule a 4 °C per 30 minuti.
  3. Vortice le cellule a intermittenza per mantenere una singola sospensione cellulare. Centrifugare e risospendere le cellule in 100 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare.
  4. Aggiungere 2 μL di anticorpo anti-α SMA anti-umano coniugato APC e incubare a 4 °C per 45 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione e centrifugare a 125 x g per 5 minuti per rimuovere l'anticorpo in eccesso.
  5. Risospendere il pellet in 400 μL di tampone di permeabilizzazione per analisi citometrica a flusso. Acquisire un totale di 10.000 eventi di ciascun campione in un citometro a flusso. Selezionare le cellule ACTA2 positive dopo aver distinto le popolazioni di cellule in base alla loro dispersione diretta e laterale, selezionando la popolazione di singoletto seguita selezionando le cellule ACTA2 positive che appaiono come un singolo picco sull'istogramma a singolo parametro.

7. Colorazione JC-1 per determinare il potenziale della membrana mitocondriale

  1. Contare il numero di CAF isolati e utilizzare circa 6 x 104 cellule per la colorazione con 5,5,6,6'-tetracloro-1,1',3,3' tetraetilbenzimi-dazoilcarbocianina ioduro (JC-1) utilizzando la citometria a flusso.
  2. Lavare accuratamente le cellule con PBS, centrifugare a 125 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 100 μL di tampone colorante cellulare.
  3. Aggiungere il colorante JC-1 ad una concentrazione di lavoro di 2 μM e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con PBS, centrifugare a 125 x g per 5 minuti e risospendere in un volume finale di 400 μL.
  4. Acquisire un totale di 20.000 eventi di ciascun campione in un citometro a flusso. Quantificare il potenziale della membrana mitocondriale misurando gli aggregati JC-1 spostati verso il rosso sul canale FL-2 e i monomeri spostati verso il verde sul canale FL-1.

8. Colorazione DCFDA per stimare i livelli di specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS)

  1. Utilizzare gli sferoidi interi (50 numeri) e i CAF isolati (6 x 104 cellule) dagli sferoidi per la colorazione con diacetato di 2',7'-diclorodiidrofluoresceina (DCFDA).
  2. Lavare accuratamente le cellule con PBS, centrifugare a 125 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 100 μL di tampone colorante cellulare.
  3. Aggiungere il colorante DCFDA ad una concentrazione di lavoro di 1 μM e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le celle due volte con PBS, centrifugare a 125 x g per 5 minuti, quindi risospendere in un volume finale di 400 μL.
  4. Acquisire un totale di 20.000 eventi di ciascun campione in un citometro a flusso. Valutare i livelli di ROS misurando la fluorescenza al giorno 7 e al giorno 10 per gli sferoidi e i CAF isolati.

9. Analisi RT-qPCR di marcatori CAF e geni glicolitici

  1. Estrarre l'RNA dai CAF selezionati utilizzando un kit di lisi a singola cellula seguendo il protocollo del produttore. Preparare cDNA da 100 ng di RNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA seguendo le linee guida del produttore.
  2. Eseguire RT-qPCR per analizzare i relativi marcatori CAF (ACTA2 8 e COL1A29) e l'espressione del gene glicolitico (GLUT1 10 e MCT4 11). Eseguire l'analisi della curva di fusione dopo l'estensione finale per garantire la specificità dei prodotti. Normalizzare i dati usando l'espressione di GAPDH come gene di riferimento. Le sequenze di primer utilizzate per RT-qPCR sono elencate nella Tabella supplementare 1.

10. Estrazione e quantificazione della proteina cellulare dai CAF

NOTA: Eseguire tutte le fasi di estrazione delle proteine sul ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.

  1. Risospendere circa 4 x 106 cellule CAF in 100 μL di tampone di lisi RIPA ghiacciato (contenente 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS e 0,5% desossicolato di sodio con 5 mM di cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt e 5 mM di EDTA a pH 7,4).
  2. Vortice rigorosamente per una corretta lisi cellulare. Sonicare la sospensione cellulare alla frequenza di 20 Hz, al 20% di ampiezza per 15 s e all'impulso 3x.
  3. Dopo la sonicazione, centrifugare l'estratto proteico a 13.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una provetta pre-raffreddata da 1,5 ml. Eseguire il test della proteina BCA per quantificare la proteina.

11. Analisi spettrofotometrica delle attività enzimatiche nei CAF

NOTA: Le seguenti attività enzimatiche sono analizzate nei CAF derivati da sferoidi tumorali.

  1. Misurazione dell'attività della succinato deidrogenasi
    1. Per valutare l'attività della succinato deidrogenasi (SDH) nei CAF, preparare tampone SHE con 250 mM di saccarosio, 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) e 1 mM di glicole etilenico-bis(β-amminoetiletere)-N,N,N′,N′-tetraacetico (EGTA) e regolare il pH a 7,3. Aggiungere 0,4 mM di fenazina metosolfato (PMS), 0,2 mM di 2,6-dicloroindofenolo (DCPIP), 50 mM MgCl2, 0,02% Triton X-100 e 1 mM di cianuro nel tampone SHE e mantenere a 37 °C.
    2. Estrarre la proteina cellulare dai CAF come descritto al punto 10 (2 x 106 cellule). In ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, incubare 100 μL di 0,1 mg di proteine cellulari con 100 μL di miscela di reazione SHE a 37 °C per 15 minuti.
    3. Per iniziare l'attività enzimatica, aggiungere 10 mM di succinato12. Calcolare l'attività enzimatica in nM/min/mL misurando le variazioni di assorbanza a 600 nm.
    4. Il fattore di conversione per DCIP è 0,0215 A / nM in base al suo coefficiente di estinzione molare12. Calcolare l'attività relativa di SDH utilizzando la formula menzionata:
      Attività relativa (nM/min/mL/enzima) = Equation 1 X X Equation 2 V
      Dove ΔA/min = velocità di reazione enzimatica (iniziale A- A finale)/(tempofinale- A/mininiziale), Ve = volume del campione e V = volume della reazione.
  2. Stima dell'attività della citocromo c ossidasi
    1. Per valutare l'attività della citocromo c ossidasi (COX) nei CAF, aggiungere 0,2 mg/ml di proteina cellulare in una soluzione tampone di reazione KME contenente tampone KME (125 mM KCl, 20 mM di acido 3-(N-morfolino)propano solfonico [MOPS] e 1 mM EGTA, pH 7,4), 0,02% Triton X-100 e 5 mM di ascorbato di sodio.
    2. In una provetta separata, mescolare 50 μM di citocromo c del cuore di cavallo con 5 mM di ascorbato di sodio e incubare a 37 °C per 5 min13. Dopo l'incubazione, aggiungere 20 μL di citocromo c ridotto a 500 μL di soluzione tampone di reazione KME contenente proteine cellulari.
    3. Calcolare l'attività enzimatica in unità/μL misurando le variazioni di assorbanza a 550 nm. L'assorbimento del citocromo c a 550 nm cambia con il suo stato di ossidazione. La differenza nei coefficienti di estinzione (mM) tra citocromo c ridotto e ossidato è 21,84 a 550 nm14. Calcola la quantità di attività enzimatica nel lisato cellulare come:
      Unità/μL =Equation 3
      Dove ΔA/min = A/mincampione-A/minbianco e 21,84 = ΔӑmM tra citocromo c ossidato e citocromo c ridotto a 550 nm
  3. Valutazione dell'attività della lattato deidrogenasi
    1. Eseguire un test della lattato deidrogenasi (LDH) utilizzando un kit di analisi delle cellule della lattato deidrogenasi seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Aggiungere il reagente per il test LDH (10 μL) a 0,5 mg/ml di proteine cellulari e incubare per 5 minuti a 37 °C. Al termine dell'incubazione, misurare l'assorbanza a 45 nm ogni 1 minuto per 8 minuti.
    3. Preparare gli standard NADH per il rilevamento colorimetrico utilizzando 0 (bianco), 2,5, 5, 7,5, 10 e 12,5 nM/pozzetto di NADH seguito dall'aggiunta del reagente di prova LDH a un volume finale di 50 μL.
    4. Tracciare le differenze di assorbanza tra Tiniziale e Tfinale alla curva standard NADH per determinare la quantità di generazione di NADH. Valutare l'attività di LDH utilizzando la formula menzionata:
      Attività LDH = Equation 4 fattore di diluizione del campione X
      Dove B = quantità (nmole) di NADH generata tra Tiniziale e T finale, tempo di reazione = Tfinale - Tiniziale (min) e Ve = volume del campione (ml) aggiunto al pozzo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La Figura 1 mostra lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari utilizzando tre diverse popolazioni cellulari - A549 (adenocarcinoma polmonare), MRC-5 (fibroblasti) e THP-1 (monociti) - con il metodo della goccia sospesa come osservato il giorno 7 e il giorno 10 al microscopio. Il giorno 7, gli sferoidi erano compatti e rigidi con un diametro di 260 ± 5,3 μm, e il giorno 10, gli sferoidi avevano un diametro di 480 ± 7,5 μm (Figura 1A pannello superiore, Figura 1B-D). Gli sferoidi del giorno 7 e del giorno 10 erano aggregati stretti e per lo più uniformi per dimensioni e diametro, come osservato nell'intera analisi del lotto. Il picco di compattezza e rigidità dello sferoide multicellulare 3D è stato notato intorno al giorno 10 (Figura 1A pannello superiore, Figura 1B-D). La vitalità cellulare è stata valutata mediante colorazione calceina-AM/PI. È stata osservata una diminuzione della fluorescenza dello ioduro di propidio (rosso) e un aumento della fluorescenza della calceina-AM (verde) dal giorno 7 al giorno 10, indicando la proliferazione cellulare nel microambiente 3D (Figura 1A,E). Gli sferoidi sono stati anche valutati per le caratteristiche ipossiche utilizzando la colorazione dell'ipossia Image-iT Red; un nucleo ipossico al centro del giorno 10 sferoidi è stato trovato (Figura 1F). Inoltre, una marcata sovraregolazione dell'espressione genica della E-caderina è stata osservata negli sferoidi del giorno 7 e del giorno 10 rispetto al giorno 4 (Figura 1G), suggerendo compattezza e rigidità cellulare. Inoltre, un aumento dell'espressione del gene MKi67 con l'aumento dei giorni di formazione sferoidale tumorale (Figura 1H) indica la crescita e la proliferazione cellulare.

I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono stati isolati dagli sferoidi tumorali del giorno 10 utilizzando microsfere anti-fibroblasti come descritto dalla panoramica schematica nella Figura 2A. I fibroblasti isolati da questi sferoidi tumorali sono circa il 69% ACTA2 positivi (Figura 2B). A livello di mRNA, i fibroblasti isolati hanno mostrato una sovraregolazione quasi triplicata (Figura 2C) e dieci volte superiore (Figura 2D) nelle espressioni geniche ACTA2 e COL1A2 (catena del collagene di tipo 1 alfa 2), rispettivamente, rispetto ai normali fibroblasti MRC-5, suggerendo il ruolo degli indizi microambientali nella trasformazione / attivazione della CAF all'interno di questi sferoidi tumorali.

Per valutare i livelli di specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) nei CAF attivati, i livelli di ROS negli sferoidi tumorali sono stati esaminati prima utilizzando il 2',7'-diclorofluoresceindiacetato (DCFDA), che si diffonde nelle cellule e deacetilato dalle esterasi cellulari seguito dall'ossidazione dipendente dai ROS nella molecola fluorescente 2',7'-diclorofluoresceina (DCF). Un aumento significativo dei livelli di ROS negli sferoidi tumorali del giorno 10 è stato osservato rispetto al giorno 7, suggerendo il possibile coinvolgimento della generazione di ROS nell'attivazione della CAF (Figura 3A,B). Un aumento significativo è stato osservato nei livelli cellulari di ROS nei CAF isolati dagli sferoidi tumorali del giorno 7 e del giorno 10 (Figura 3C). Inoltre, è stata notata un'alterazione del potenziale della membrana mitocondriale come indicato dalla colorazione JC-1 (Figura 3D). Collettivamente, questi risultati suggeriscono un cambiamento nel potenziale della membrana mitocondriale e nello stress ossidativo nei CAF attivati isolati dagli sferoidi tumorali.

Per analizzare se l'aumento dei livelli di ROS e la depolarizzazione della membrana mitocondriale nei CAF siano causalmente collegati con la sovraregolazione di alcuni bersagli glicolitici per produrre l'effetto Warburg inverso sulle cellule tumorali nel microambiente tumorale, è stata esaminata l'espressione genica relativa di GLUT1 e MCT4. Un'induzione dell'espressione genica GLUT1 (Figura 4A) e MCT4 (Figura 4B) è stata osservata nei CAF rispetto ai fibroblasti normali. Questa osservazione è in linea con precedenti studi in questo campo che hanno mostrato una maggiore abbondanza di livelli di GLUT1 e MCT4 nei CAF 11. GLUT1 è responsabile del trasporto del glucosio nelle cellule, mentre MCT4 estrude il lattato dalle cellule e, pertanto, questa tendenza sembra abbastanza logica per la biologia CAF. Poiché la disfunzione mitocondriale è marcatamente correlata con l'alterazione di varie attività enzimatiche mitocondriali, sono state analizzate le diverse attività enzimatiche mitocondriali nei CAF isolati. È stata osservata una significativa induzione dell'attività dell'enzima lattato deidrogenasi (LDH) nei CAF rispetto ai fibroblasti normali (Figura 4C), suggerendo un'elevata produzione di lattato, un elevato stress mitocondriale ossidativo e un effetto Warburg inverso nei CAF attivati. Successivamente, l'attività dell'enzima citocromo c ossidasi (COX) è stata esaminata nei CAF poiché è noto che l'aumento dei livelli di ROS cellulare aumenta l'espressione e l'attività di COX attraverso la via15 dipendente da NF-kB. Un'induzione dell'attività della COX è stata osservata nei CAF rispetto ai fibroblasti normali (Figura 4D), suggerendo il coinvolgimento della segnalazione ROS-dipendente nella conversione dei CAF dai fibroblasti normali. Anche l'attività dell'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi (SDH) nei CAF è stata valutata e ha trovato la sua notevole induzione rispetto ai fibroblasti normali (Figura 4E).

Figure 1
Figura 1: Sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari e analisi dei morti vivi. (A) Pannello superiore: immagini microscopiche di sferoidi tumorali 3D multicellulari composti da A549 (cellule di adenocarcinoma polmonare), MRC-5 (fibroblasti) e THP-1 (monociti) il giorno 7 e il giorno 10. Pannello centrale e inferiore: immagine unita della colorazione calcein-AM e dello ioduro di propidio (PI) (pannello centrale) e della colorazione dello ioduro di propidio (pannello inferiore) sugli sferoidi tumorali del giorno 7 e del giorno 10. (B) Immagini di contrasto di fase degli sferoidi tumorali del giorno 7 e del giorno 10 catturate con obiettivo 10x. (C,D) Immagini rappresentative e analisi quantitativa degli sferoidi del giorno 7 (d7) e del giorno 10 (d10) che mostrano la misurazione del diametro sferoide. (E) Analisi quantitativa di cellule marcate calceina-AM a sferoidi tumorali al giorno 7 e al giorno 10. (F) Colorazione con immunofluorescenza della colorazione dell'ipossia Image-iTRed nelle sezioni sferoidi del giorno 10 (6 μm). DAPI è stato utilizzato per la controcolorazione dei nuclei. (G,H) Analisi RT-qPCR dei livelli di mRNA della caderina E (G) e MKi67 (marcatore di proliferazione cellulare) (H) nel giorno 7 e nel giorno 10 degli sferoidi tumorali. La coltura bidimensionale di MRC-5 è stata considerata come controllo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia (n = 3). Dati rappresentati come deviazione media ± standard (S.D. **p < 0,01 per il test (giorno 7 sferoide) rispetto al controllo (coltura 2D MRC-5) utilizzando il t-test dello studente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi delle caratteristiche CAF in fibroblasti isolati da sferoidi tumorali . (A) Panoramica schematica del protocollo per l'isolamento dei fibroblasti dagli sferoidi tumorali multicellulari al giorno 10 utilizzando microsfere anti-fibroblasti con l'aiuto di un selezionatore di cellule magnetiche seguito dall'isolamento dell'RNA per l'analisi citometrica a flusso e dell'espressione genica. (B) Analisi citometrica a flusso che mostra un aumento dell'espressione della proteina ACTA2 in fibroblasti isolati. (C,D) Analisi RT-qPCR dei livelli di mRNA ACTA2 (C) e COL1A2 (D) nei fibroblasti isolati dagli sferoidi tumorali del giorno 10. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia (n = 3). I dati rappresentati come media ± S.D. **p < 0,01 per il test (CAF isolati) rispetto al controllo (MRC-5) utilizzando il test t dello studente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Analisi dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e colorazione JC1 in CAF isolati. (A) Immagini di immunofluorescenza che mostrano i livelli delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli sferoidi del giorno 7 e del giorno 10 mediante colorazione DCFDA. (B) Analisi citometrica a flusso che rappresenta il numero di cellule DCFDA positive. L'asse X presenta DCFDA e l'asse Y presenta il conteggio delle cellule. (C) L'abbondanza di CAF positivi DCFDA isolati dagli sferoidi del giorno 7 e del giorno 10 mediante citometria a flusso. Le cellule MRC-5 in coltura 2D sono state utilizzate come controllo. (D) Saggio citometrico a flusso della colorazione JC-1 per l'analisi del potenziale della membrana mitocondriale in CAF isolati da sferoidi tumorali del giorno 7 e del giorno 10. Le cellule MRC-5 in coltura 2D sono state utilizzate come controllo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia (n = 3). Dati rappresentati come media ± S.D. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Misurazione delle attività enzimatiche mitocondriali in CAF isolati. (A,B) Analisi RT-qPCR dei livelli di mRNA GLUT1 (A) e MCT4 (B) in CAF isolati da sferoidi tumorali del giorno 7 e del giorno 10 rispetto ai fibroblasti normali (MRC-5). (C-E) L'attività enzimatica della lattato deidrogenasi (LDH) (C), l'attività enzimatica della citocromo c ossidasi (COX), l'attività enzimatica (D) e l'attività enzimatica della succinato deidrogenasi (SDH) (E) sono state misurate nei fibroblasti normali e nei CAF isolati dagli sferoidi tumorali del giorno 10. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia (n = 3). I dati rappresentati come media ± S.D. **p < 0,01 significatività per il test (CAF isolati) rispetto al controllo (MRC-5) utilizzando il test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare 1: Elenco dei primer forward (F) e reverse (R) per l'analisi RT-qPCR. Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il presente studio introduce lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari comprendenti cellule tumorali, popolazione di cellule stromali (cioè fibroblasti) e popolazione di cellule immunitarie (cioè monociti) utilizzando un metodo di goccia sospesa modificata. I fibroblasti e i monociti/macrofagi sono tra le popolazioni più significative che costituiscono il microambiente tumorale (TME) e la loro presenza è spesso correlata a una prognosi infausta16. Quando presenti nella TME, i fibroblasti si trasformano, esibendo uno specifico fenotipo dei fibroblasti associati al cancro (CAF) poiché i segnali microambientali del tumore17 li influenzano. Miofibroblasti, fibroblasti infiammatori (iCAF) e fibroblasti presentanti l'antigene (apCAF) si trovano comunemente nei fibroblasti attivati18,19. Questi fenotipi sono spesso legati all'aggressività del cancro e alla resistenza alla terapia20. I miofibroblasti sono riportati come cattivi presagi in più tumori solidi poiché una percentuale maggiore di questi fibroblasti limita l'infiltrazione delle cellule T portando ad una TME21 immunosoppressiva. Questi miofibroblasti presentano caratteristiche di una maggiore produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e della secrezione di vari mediatori come elastine, collagene e fibronectina che portano alla deposizione di matrice extracellulare all'interno della TME22.

Questo studio ha ottimizzato il protocollo per lo sviluppo di sferoidi tumorali 3D multicellulari utilizzando cellule di adenocarcinoma polmonare A549, fibroblasti polmonari MRC-5 e monociti THP-1 tenendo conto del numero di cellule e del rapporto di 5:4:1 (cellule tumorali:fibroblasti:monociti) che simulano da vicino lo stroma tumorale della condizione micro-ambientale naturale. Lo sviluppo e l'analisi di questi sferoidi sono continuati fino al giorno 10 per raggiungere la loro complessità. Pertanto, il numero e il rapporto cellulare sono passaggi critici di questo protocollo per studiare l'interazione tumore-stroma all'interno degli sferoidi che alla fine generano molteplici caratteristiche della TME, come l'aumento della produzione di livelli di ROS, la disfunzione mitocondriale, la glicolisi più elevata e la partecipazione alla conversione dei fibroblasti normali in CAF attivati.

Uno dei principali vincoli nello studio della biologia della CAF risiede nella limitata disponibilità di CAF da campioni primari di biopsia tumorale. L'obiettivo principale è quello di creare sferoidi tumorali 3D biomimetici con fibroblasti e quindi isolare i CAF attivati dagli sferoidi tumorali utilizzando microsfere magnetiche anti-fibroblasti con l'aiuto di un selezionatore di cellule attivate magnetiche (MACS). Ciò potrebbe fornire una fonte per studiare direttamente i CAF. La popolazione CAF è stata confermata analizzando marcatori specifici CAF come l'actina della muscolatura liscia alfa (α-SMA) e l'espressione di COL1A2. La diafonia delle cellule tumorali con fibroblasti converte il fenotipo dei fibroblasti verso CAF attivati che mostrano un aumento della via glicolitica associata a un massiccio assorbimento cellulare di glucosio e al rilascio di lattato e piruvato, i prodotti finali della glicolisi. Pertanto, questo approccio fornirà abbastanza cellule CAF ai ricercatori per rivelare molte domande senza risposta. Qui, il numero e il rapporto delle cellule sono ottimizzati per gli sferoidi tumorali 3D polmonari. Per formare altri sferoidi tumorali solidi, potrebbe essere necessario regolare il numero e il rapporto per ottenere la corretta struttura 3D. Inoltre, questo approccio potrebbe richiedere alcune modifiche per isolare e studiare la popolazione di cellule immunitarie, in particolare i macrofagi associati al tumore all'interno degli sferoidi.

Poiché questo modello sferoidale 3D del tumore polmonare ricapitola le caratteristiche del microambiente tumorale naturale, questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi di attivazione della CAF da fibroblasti normali, il suo coinvolgimento nella progressione del cancro del polmone nel microambiente tumorale 3D. In secondo luogo, questo studio descrive anche come la produzione aberrante di ROS e la disfunzione mitocondriale spingano i fibroblasti normali verso il fenotipo CAF più aggressivo. Farà anche luce sulla diafonia tra CAF e cellule tumorali e sul loro coinvolgimento nella riprogrammazione metabolica associata all'effetto Warburg inverso. Pertanto, questo modello può aprire la strada a uno studio più esaustivo e alla progettazione di interventi terapeutici efficaci per indirizzare i CAF per la gestione dell'adenocarcinoma polmonare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal SERB-Women Excellence Award Project, India (SB/WEA-02/2017) e dal SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR/2017/000892) a DP. Gli autori, LA e SR riconoscono IIT Ropar e MHRD per le loro borse di ricerca. MK riconosce l'ICMR per la sua borsa di ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
APC anti-human α-SMA R&D systems Cat# IC1420A
Anti-fibroblast microbeads Miltenyi Biotec Cat# 130-050-601
Cell lines
A549 lung adenocarcinoma cells NCCS Pune -
MRC-5 fetal lung fibroblasts ATCC CCL-171
THP-1 Human monocytes NCCS Pune -
Chemicals
BSA Himedia Cat# 9048-46-8
2,6-dichloroindophenol (DCPIP) SRL Cat# 55287
Calcein-AM Thermo Fisher Scientific Cat# C3099
DAPI Thermo Fisher Scientific Cat# D1306
DCFDA Sigma Cat# D6883
DMEM Gibco Cat# 11995073
DPBS Gibco Cat# 14190-144
EDTA Thermo fisher scientific Cat# 17892
EGTA SRL Cat# 62858
EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit HiMedia Cat# CCK036
FBS Gibco Cat# 10082147
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific Cat# 87786
HEPES Thermo Fisher Scientific Cat# 15630080
Horse heart Cytochrome c SRL Cat# 81551
Image-iT Red hypoxia reagent Thermo Fisher Scientific Cat# H10498
JC-1 Dye Thermo Fisher Scientific Cat# T3168
KCl Merck Cat# P9541
MgCl2 Merck Cat# M8266
MOPS Thermo Fisher Scientific Cat# 69824
Nacl Sigma-Aldrich Cat# S9888
NADH MB Grade SRL Cat# 54941
NP-40 Thermo Fisher Scientific Cat# 85124
Penicillin/Streptomycin Gibco Cat# 15140122
Phenazine methosulfate (PMS) SRL Cat# 55782
Propidium iodide Thermo fisher scientific Cat# P1304MP
RPMI 1640 Gibco Cat# 11875093
Single Cell Lysis Kit Thermo Fisher Scientific Cat# 4458235
Sodium ascorbate Merck Cat# A7631
Sodium cyanide Sigma Cat# 205222
Sodium Deoxycholate Thermo Fisher Scientific Cat# 89904
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich Cat# L3771
Sodium succinate hexahydrate SRL Cat# 36313
Sucrose Sigma Cat# S0389
SuperScript VILO cDNA synthesis kit Thermo Fisher Scientific Cat# 11754-050
Triton X-100 Sigma Cat# T8787
Trypsin 0.25% EDTA Gibco Cat# 25200072
Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD Cat# 172-5124
Plasticware
MACS LS Columns Miltenyi Biotec Cat# 130-042-401
Equipment
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific Cat# AMQAF1000
EVOS XL core imaging system Thermo Fisher Scientific Serial Number F0518-1727-0191
LAS X software Leica Microsystems
Leica fluorescent inverted microscope s DMi8 automated S/N 424150)
Midi MACS separator Miltenyi Biotec Cat# 130-042-302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
  2. Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
  3. Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
  4. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  5. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , Humana Press. 141-151 (2007).
  6. Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
  7. Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
  8. Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
  9. Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
  10. Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
  11. Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
  12. Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
  13. Bregman, A. A. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , John Wiley & Sons Incorporated. (2002).
  14. Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
  15. Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
  16. Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  17. Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
  18. Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
  19. Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
  20. Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
  21. Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
  22. Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).

Tags

Ricerca sul cancro numero 188 fibroblasti associati al cancro CAF sferoidi tumorali multicellulari metabolismo mitocondriale specie reattive dell'ossigeno ROS
Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arora, L., Kalia, M., Roy, S., Pal,More

Arora, L., Kalia, M., Roy, S., Pal, D. Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids. J. Vis. Exp. (188), e64315, doi:10.3791/64315 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter