Summary
Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.
Abstract
Microglia zijn de residente immuuncellen van myeloïde oorsprong die homeostase in de micro-omgeving van de hersenen handhaven en een belangrijke speler zijn geworden bij meerdere neurologische ziekten. Het bestuderen van menselijke microglia in gezondheid en ziekte vormt een uitdaging vanwege het extreem beperkte aanbod van menselijke cellen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) afgeleid van menselijke individuen kunnen worden gebruikt om deze barrière te omzeilen. Hier wordt gedemonstreerd hoe menselijke iPSC's kunnen worden gedifferentieerd in microglia-achtige cellen (iMG's) voor in vitro experimenten. Deze iMG's vertonen de verwachte en fysiologische eigenschappen van microglia, waaronder microglia-achtige morfologie, expressie van de juiste markers en actieve fagocytose. Daarnaast wordt documentatie verstrekt voor het isoleren en labelen van synaptosoomsubstraten afgeleid van menselijke iPSC-afgeleide lagere motorneuronen (i3LMN's). Een live-cell, longitudinale beeldvormingstest wordt gebruikt om de overspoeling van menselijke synaptosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof te monitoren, waardoor onderzoek naar de fagocytische capaciteit van iMG mogelijk is. De hierin beschreven protocollen zijn breed toepasbaar op verschillende gebieden die de menselijke microgliabiologie en de bijdrage van microglia aan ziekten onderzoeken.
Introduction
Microglia zijn de residente immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het CZS. Microglia zijn ook belangrijk in de volwassen hersenen voor het handhaven van homeostase en het actief reageren op trauma- en ziekteprocessen. Cumulatief bewijs toont aan dat microglia een belangrijke bijdrage leveren aan de pathogenese van meerdere neurologische en neurodegeneratieve ziekten 1,2. Hoewel de huidige kennis over microgliale biologie voornamelijk is afgeleid van muismodellen, hebben recente studies belangrijke verschillen tussen muizen- en menselijke microglia opgehelderd, wat de noodzaak onderstreept van het ontwikkelen van technologieën om de genetica en biologische functies van menselijke microglia te bestuderen 3,4. Isolatie van microglia uit ontleed primair weefsel kan microglia-eigenschappen ernstig wijzigen5, waardoor de resultaten die met dergelijke cellen worden verkregen, mogelijk worden verstoord. Het algemene doel van deze methode is om menselijke iPSC's te differentiëren in iMG's, waardoor een celkweeksysteem wordt geboden om menselijke microglia onder basale omstandigheden te bestuderen. Bovendien is een fagocytosetest met behulp van een volledig menselijk modelsysteem hierin opgenomen als een middel om de functionaliteit van iMG's te bestuderen, zowel als een kwaliteitscontrolemaatstaf als om iMG-disfunctie in de context van ziekte te beoordelen.
Meerdere protocollen voor microglia differentiatie van iPSC's zijn onlangs in de literatuur naar voren gekomen 6,7,8,9,10. Mogelijke nadelen van sommige protocollen zijn langere of lange perioden van differentiatie, de toevoeging van meerdere groeifactoren en/of complexe experimentele procedures 6,9,10. Hier wordt een "gebruiksvriendelijke" differentiatiemethode aangetoond die aspecten van microglia-ontogenie recapituuleert door differentiatie van iPSC's in voorlopercellen die primitieve macrofaagprecursoren (PMP's) worden genoemd)7,11. PMP's worden gegenereerd zoals eerder beschreven, met enkele optimalisaties hierin gepresenteerd12. De PMP's bootsen MYB-onafhankelijke dooier-zak-afgeleide macrofagen na, die tijdens de embryonale ontwikkeling microglia veroorzaken door de hersenen binnen te dringen vóór de sluiting van de bloed-hersenbarrière13. Om PMP's terminaal te differentiëren in iMG's, gebruikten we een snelle en vereenvoudigde monocultuurmethode op basis van protocollen van Haenseler et al. en Brownjohn et al., met enkele aanpassingen om een efficiënte microgliadifferentiatiemethode te genereren waarin iMG's robuust microglia-verrijkte markers tot expressie brengen 7,8. Deze differentiatiemethode kan worden gereproduceerd in laboratoria met expertise in de cultuur van iPSC's en met onderzoeksdoelen gericht op het bestuderen van microgliabiologie met behulp van een menselijk modelsysteem.
iPSC-afgeleide microglia vormen een biologisch relevante bron van menselijke microglia voor in vitro experimenten en zijn een belangrijk hulpmiddel om microgliale canonieke functies, waaronder fagocytose, te onderzoeken. Microglia zijn de professionele fagocyten van de hersenen en het CZS, waar ze celresten, geaggregeerde eiwitten en afgebroken myelineopruimen 14. Microglia functioneren ook bij synaptische remodellering door synapsen te overspoelen en in de verdediging tegen externe infecties door fagocytose van pathogenen 15,16. In dit protocol wordt fagocytose door iMG's beoordeeld met behulp van menselijke synaptosomen als materiaal voor iMG-overspoeling. Hiertoe wordt een beschrijving beschreven voor het isoleren van synaptosomen afgeleid van humane i3 LMN's. De i3LMN-afgeleide humane synaptosomen zijn gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof die kwantificering mogelijk maakt van synaptosomen gelokaliseerd in zure compartimenten tijdens fagosoomverwerking en afbraak in vitro. Een fagocytosetest met behulp van live-cell microscopie wordt getoond voor het monitoren van het dynamische proces van microglia-engulfment in realtime. Deze functionele test legt een basis om mogelijke defecten in microgliale fagocytose in gezondheid en ziekte te onderzoeken met behulp van een compleet menselijk systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, moeten steriel zijn en alle stappen moeten onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd. Alle iPSC-lijnen, evenals onderhouds- en differentiatiemedia, worden beschreven in de materiaaltabel. De hieronder geïllustreerde microgliadifferentiatiemethode is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen 7,8,12 met nieuwe wijzigingen die hierin worden beschreven.
1. Microglia differentiatie
OPMERKING: Een overzicht van het protocol is samengevat in figuur 1.
- Geïnduceerde pluripotente stamcelcultuur (iPSC)
OPMERKING: Verdere details over iPSC-kweektechnieken zijn elders te vinden17.- Ontdooien en onderhoud
- Bereid iPSC-medium, aliquot het medium en bewaar het bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Ontdooi de aliquots een nacht bij 4 °C en gebruik ze maximaal 1 week. Laat de media voor gebruik ten minste 1 uur op kamertemperatuur staan.
- Bestrijk de putjes van een 6-wellsplaat door 1 ml 10 μg/ml laminine 521 toe te voegen, verdund in DPBS met calcium en magnesium18. Bewaar de platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 2 uur of bij voorkeur een nacht. Bewaar het laminine na verdunning gedurende 3 maanden bij 4 °C.
- Bereid 10 mM Rho kinaseremmer Y27632 (ROCK Inhibitor) stockoplossing door verdunning in steriel water. Maak aliquots voor eenmalig gebruik van ROCK-remmeroplossing en bewaar ze maximaal 1 jaar bij -20 °C.
- Bereid 0,5 mM EDTA door de stamoplossing van 0,5 M EDTA in DPBS te verdunnen.
- Om een injectieflacon met bevroren iPSC's te ontdooien, plaatst u de injectieflacon in een waterbad bij 37 °C totdat deze grotendeels is ontdooid. Breng de inhoud van de injectieflacon onmiddellijk over in een conische buis van 15 ml met 4 ml iPSC-medium. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 1 min.
- Aspirateer het supernatant en resuspensieer de cellen door 1 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer langzaam tegen de wand van de buis toe te voegen om verstoring van de kolonies te voorkomen.
- Voeg 1,5 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer toe aan elk van de gecoate putten en breng de geresuspendeerde kolonies druppelsgewijs over naar de putten die het medium bevatten.
OPMERKING: Gebruik 5-7 druppels uit stap 1.1.1.6 voor kweekonderhoud, maar pas de optimale zaaidichtheid voor elke iPSC-lijn aan. - Verdeel de cellen gelijkmatig in de putjes door de plaat handmatig van links naar rechts en van achter naar voren te schuiven. Plaats de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de volgende dag het medium volledig door vers iPSC-medium zonder ROCK-remmer toe te voegen.
- Voor onderhoud, verander het medium elke dag totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: De cellen kunnen gedurende 2 dagen worden onderhouden zonder het medium te veranderen als het gebruikte iPSC-medium een flexibel voedingsschema mogelijk maakt. Het wordt geadviseerd om dit te beperken tot één keer per passage en alleen als de cellen minder dan 50% confluent zijn.
- Splitsen
- Aspirateer het medium en was de cellen met 1 ml DPBS (zonder calcium en magnesium).
- Om de cellen los te maken, voegt u 1 ml 0,5 mM EDTA toe en incubeert u gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur totdat de randen van de celkolonies van het oppervlak van de put opstijgen. Was de cellen opnieuw met DPBS en voeg 1 ml iPSC-medium toe.
- Dissocieer de celkolonies door ze voorzichtig te schrapen met behulp van een cellifter. Schraap elk deel van de put slechts één keer om te voorkomen dat de kolonies worden verstoord.
OPMERKING: Alternatieve methoden om de kolonies uit de put te verdrijven zijn elders te vinden17. - Verzamel de cellen met behulp van een pipetpunt van 1 ml en breng ze druppelsgewijs over in een verhouding van 1:6 (cellen tot medium) in voorgecoate putten (zoals vermeld in stap 1.1.1.2) met 1,5 ml iPSC-medium.
- Ontdooien en onderhoud
- iPSC-differentiatie naar microglia-achtige cellen (iMG's)
OPMERKING: De kleine moleculen en groeifactoren worden opgelost in steriel gefilterd 0,1% runderserumalbumine in DPBS tot een voorraadconcentratie die 1.000x hoger is dan de uiteindelijke concentratie. Het wordt aanbevolen om iPSC's te onderscheiden in iMG's tijdens vroege passages. Routinematige karyotypering van iPSC-lijnen wordt geadviseerd.- Standaardcoatingoplossing voorbereiden
- Ontdooi de stamoplossing van een extracellulair matrixcoatingreagens op ijs bij 4 °C 's nachts.
- Prechill microcentrifugebuizen en filterpipetpunten bij 4 °C.
- Aliquot 250 μL van het geconcentreerde extracellulaire matrix coatingreagens in elke buis en onmiddellijk op ijs plaatsen. Bewaar de aliquots bij -20 °C.
- Om de coatingoplossing te bereiden, ontdooit u een van de extracellulaire matrix coatingreagens op ijs bij 4 °C 's nachts.
- Voeg 50 ml ijskoude DMEM-F12 geoptimaliseerd voor de groei van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (aangeduid als DMEM-F12) media toe aan een vooraf gechilleerde conische buis en houd deze op ijs.
- Koel een pipetpunt van 1 ml door ijskoude DMEM-F12 meerdere keren op en neer te pipetteren en gebruik vervolgens onmiddellijk de pipetpunt om 250 μL van het extracellulaire matrixcoatingreagens over te brengen in de conische buis die het DMEM-F12-medium bevat.
OPMERKING: De standaard coatingoplossing kan 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
- Embryoïde lichaam (EB) vorming
- Bereid EB-medium voor dat maximaal 4 dagen op 4 °C kan worden gehouden.
- Zodra iPSC's 80% confluency hebben bereikt, dissocieert u de kolonies door te wassen met 1 ml DPBS en 1 ml dissociatiereagens toe te voegen gedurende 2 minuten bij 37 °C. Maak de kolonies los met behulp van een cellifter door meerdere keren te schrapen om een eencellige suspensie te creëren. Verzamel de cellen en breng alles over naar een conische buis van 15 ml met 9 ml DPBS.
- Centrifugeer de cellen op 500 × g gedurende 1 minuut, verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in 1 ml EB-medium. Neem 10 μL cellen en verdun 1:1 met Trypan blue. Tel de cellen met een hemacytometer en verdun op basis van het celgetal de celvoorraad tot een uiteindelijke verdunning van 10.000 cellen per 100 μL. Voeg voor platingcellen 100 μL van de verdunde cellen per put toe aan een laag hechtende, ronde bodem, 96-well plaat.
OPMERKING: Over het algemeen kunnen 48 putten van de 96-well plaat worden verkregen uit elke 80% confluent put van iPSC's. - Centrifugeer de plaat bij 125 × g gedurende 3 minuten en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 dagen. Voer op dag 2 een halve mediumverandering uit door een meerkanaals pipet te gebruiken en voorzichtig 50 μL oud medium te verzamelen en vervolgens 50 μL vers EB-medium toe te voegen.
OPMERKING: Op dag 4 zullen iPSC's bolvormige cellulaire structuren vormen die EB's worden genoemd, zoals beschreven in de sectie resultaten. Het EB-differentiatieproces kan indien nodig worden verlengd tot 7 dagen.
- Generatie van primitieve macrofaagprecursoren (PMP's)
- Bereid PMP-basismedium, steriel filter, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Bestrijk de putten van een 6-wellsplaat door 1 ml ijskoude Matrigel-coatingoplossing toe te voegen en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 2 uur of bij voorkeur een nacht.
- Breng op dag 4 van EB-differentiatie de EB's over naar de met Matrigel gecoate putten door de EB's te verzamelen met 1 ml pipetpunten (met behulp van een pipet). Pipetteer een of twee keer op en neer om de EB's uit de put te verwijderen. Houd de 6-well plaat in een gekantelde hoek zodat de EB's zich aan de rand van de put kunnen nestelen.
LET OP: Negen of tien EV's kunnen per goed gecoate partij worden verguld. - Zodra alle EB's zijn neergedaald, pipetteer en verwijder je voorzichtig het oude medium met behulp van een pipetpunt van 1 ml terwijl je de EB's aan de rand van de put houdt. Voeg 3 ml vers bereide PMP compleet medium toe aan elk putje. Verdeel de cellen gelijkmatig in de putjes door de plaat handmatig van links naar rechts en van achter naar voren te schuiven. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Verstoor de plaat gedurende 7 dagen niet zodat de EB's zich aan de bodem van de put kunnen hechten. Voer na die tijd een halve medium verandering uit met behulp van PMP complete medium.
OPMERKING: Op dit punt moeten de meeste EV's aan de plaat worden bevestigd. Eventuele zwevende EV's kunnen worden verwijderd. - Inspecteer na 5-7 dagen de EB's onder een lichtveldmicroscoop bij 4x vergroting om ervoor te zorgen dat ze aan de onderkant van de putten zijn bevestigd. Wijzig het medium zoals beschreven in 1.2.3.5. Voer op dag 21 een volledige mediumverandering uit met 3 ml PMP compleet medium.
OPMERKING: Myeloïde voorlopers die in het medium zweven, kunnen op dit punt duidelijk zijn. Deze cellen moeten worden weggegooid tijdens de mediumverandering. - Zoek op dag 28 naar ronde cellen die PMP's in het supernatant worden genoemd en verzamel het medium dat de PMP's bevat met behulp van een pipet van 10 ml en een automatische pipettor. Zorg ervoor dat u de EB's niet verstoort. Breng de PMP's en het medium over in een conische buis van 15 ml en ga verder zoals beschreven in stap 1.2.4.
OPMERKING: Meestal kunnen PMP's van dezelfde iPSC-lijn worden verzameld uit vijf putten van een 6-well plaat en samengevoegd in een enkele 15 ml conische buis. - Voeg 3 ml vers PMP compleet medium toe voor verder onderhoud van de EB's. Aangezien PMP's gedurende meer dan 3 maanden continu uit DEEB's tevoorschijn komen, verzamelt u ze om de 4-7 dagen (laat het medium niet van kleur veranderen in een gele tint) zoals beschreven in stap 1.2.3.7 en 1.2.3.8.
OPMERKING: Hoewel PMP's enkele maanden kunnen worden verzameld, kunnen ze hun fenotype in de loop van de tijd veranderen.
- Differentiatie naar iMGs
- Bereid het iMG-basismedium (materiaaltabel), steriel filter en bewaar het maximaal 3 weken bij 4 °C.
- Zodra de PMP's zijn verzameld in een conische buis van 15 ml, centrifugeert u ze gedurende 4 minuten bij 200 × g . Aspirateer het supernatant en resuspendeer de PMP's met behulp van 1-2 ml iMG basaal medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer door een kleine aliquot te nemen en 1:1 te verdunnen met Trypan blue.
OPMERKING: 0,5-1,5 × 106 PMP's worden normaal gesproken elke week verkregen, afhankelijk van de iPSC-lijn en de leeftijd van de EB-cultuur. - Centrifugeer de rest van de cellen opnieuw op 200 × g gedurende 4 minuten. Verdun de PMP's tot de gewenste concentratie, zodat cellen worden geplateerd met een dichtheid van ~ 105/cm2 op met celkweek behandelde platen met behulp van vers bereid iMG compleet medium. Voer elke 3-4 dagen gedurende 10-12 dagen een half-mediumverandering uit met behulp van vers bereide iMG complete medium om terminaldifferentiatie mogelijk te maken.
OPMERKING: Op dit punt moeten de cellen microglia-achtige morfologie verwerven. Om de toewijding van PMP's aan het lot van microglia te bevestigen, wordt immunofluorescentieanalyse uitgevoerd om de expressie van microglia-verrijkte markers zoals purinerge receptor P2RY12 en transmembraaneiwit 119 (TMEM119)9 te bevestigen. - Om de gezondheid en levensvatbaarheid van cellen te behouden, voert u alle experimenten uit tussen dag 10 en 12 van iMG-differentiatie.
- Standaardcoatingoplossing voorbereiden
2. Fagocytosetest met behulp van van motorneuronen afgeleide humane synaptosomen
- Transcriptiefactor-gemedieerde differentiatie van iPSC-afgeleide lagere motorneuronen (i3LMN's)
OPMERKING: Een WTC11-lijn met stabiele inbrenging van de hNIL-induceerbare transcriptiefactorcassette met de transcriptiefactoren neurogenine-2 (NGN2), eilandje-1 (ISL1) en LIM homeobox 3 (LHX3) in de CLYBL-safe harbor-locus werd gebruikt voor het differentiatieproces zoals eerder beschreven17. De iPSC-lijn werd gehandhaafd zoals beschreven in stap 1.1.1, maar met de coatingomstandigheden beschreven in stap 1.2.1. Elk extracellulair matrixcoatingreagens kan worden gebruikt voor het kweken van iPSC's die zullen worden gebruikt voor neuronale differentiatie, aangezien laminine 521 niet vereist is. Alle media worden gedurende ten minste 1 uur voor gebruik in evenwicht gebracht met de omgevingstemperatuur.- Bekleed schotels van 10 cm met 5 ml standaardcoatingoplossing zoals beschreven in stap 1.2.1.
OPMERKING: Hier werden schalen van 3-4 10 cm per differentiatie gebruikt. - Bereid inductiebasismedium, steriel filter, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken.
- Bereid Neuron medium, steriel-filter, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Bereid boraatbuffer door 100 mM boorzuur, 25 mM natriumtetraboraat en 75 mM natriumchloride in steriel water te mengen. Stel de pH in op 8,5 en filter deze steriel.
- Zodra iPSC's 80% confluency hebben bereikt, wast u de cellen met DPBS en maakt u de kolonies los door 0,5 mM EDTA toe te voegen.
OPMERKING: Twee putten zijn meestal voldoende voor elke schaal van 10 cm. - Incubeer de cellen gedurende 4-5 minuten bij omgevingstemperatuur. Verwijder de EDTA en voeg 3 ml DMEM/F12 met HEPES toe aan elk putje.
- Schraap de cellen met behulp van een cellifter en gebruik een pipet van 10 ml om de cellen van de bodem van de put te verwijderen door 2-3x voorzichtig op en neer te pipetteren.
- Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g .
- Resuspendeer de cellen in 3 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer en tel ze met behulp van een hemacytometer.
- Plaat 1,5 × 106 iPSC's in een voorgecoate schaal van 10 cm met 12 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer.
- Verwijder de volgende dag het medium en was de cellen met DPBS. Voeg 12 ml vers bereid compleet inductiemedium toe om de expressie van de transcriptiefactoren te induceren.
- Op dag 2, bedek 10 cm gerechten met 5 ml neuroncoatingoplossing bereid met gelijke volumes van 0,1 mg / ml poly-D-lysine en 1 mg / ml poly-L-ornithine verdund in boraatbuffer. Incubeer een nacht bij 37 °C en 5% CO2.
- Was op dag 3 de gecoate gerechten 3x met steriel water, zuig het water volledig op en laat de vaat drogen door de borden te kantelen en ze gedeeltelijk onbedekt te laten in een bioveiligheidskast gedurende ten minste 1 uur bij omgevingstemperatuur.
- Zodra de gerechten volledig zijn gedroogd, bedekt u ze met 6 ml compleet inductiemedium aangevuld met 15 μg / ml laminaat en 40 μM BrdU gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: BrdU-behandeling wordt aanbevolen om mitotisch actieve cellen te elimineren en zo de zuiverheid van de neuronale culturen te verbeteren. De effecten van BrdU op de neuronale gezondheid zijn minimaal. - Behandel de differentiërende cellen met 3 ml dissociatiereagens per schaal van 10 cm en incubeer gedurende 3-4 minuten bij omgevingstemperatuur.
- Voeg 6 ml DPBS toe aan de plaat zonder het dissociatiereagens te verwijderen en pipetteer de cellen in oplossing 4-5x met een pipet van 10 ml om de cellen te dissociëren.
- Verzamel de celsuspensie en laat deze door een celzeef van 40 μm in een conische buis van 50 ml lopen. Voeg 1 ml inductiebasismedium toe om de zeef te spoelen.
- Centrifugeer de cellen op 300 × g gedurende 5 min. Aspirateer het medium en resuspendeer de cellen in 3 ml complete inductiemedium met 40 μM BrdU.
- Tel de cellen met een hemocytometer. Plaats ongeveer 2,5 × 106 cellen per schaal van 10 cm in voorgecoate schotels door de cellen te verdunnen in 6 ml volledig inductiemedium met 40 μM BrdU zonder de in stap 2.1.14 toegevoegde coatingoplossing te verwijderen.
- Op dag 4 aspirateer je het medium, was je de cellen 1x met DPBS en voeg je een vers Complete Inductiemedium toe dat 40 μM BrdU bevat.
- Op dag 6 aspirateer het medium, was de cellen 1x met DPBS en voeg Neuron medium aangevuld met 1 μg/ml laminine toe.
- Verander op dag 9 1/3rd van het medium door het te vervangen door vers Neuron-medium aangevuld met 1 μg / ml laminine.
- Handhaaf i3LMN's gedurende nog eens 25 dagen door halve medium veranderingen uit te voeren met Neuron medium aangevuld met verse 1 μg / ml laminine om de 3-4 dagen.
OPMERKING: Op dit tijdstip moeten i3 LMN'seen neuronale morfologie presenteren met lange processen. Neuronen hebben ook de neiging om klonten of clusters van cellen te vormen. Een meer gedetailleerde beschrijving van hoe de differentiatie van i3 LMN'skan worden gevalideerd, is elders te vinden17.
- Bekleed schotels van 10 cm met 5 ml standaardcoatingoplossing zoals beschreven in stap 1.2.1.
- Synasptosoomzuivering en etikettering
OPMERKING: Handhaaf steriele omstandigheden en voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast.- Was i3 LMN's twee keer met DPBS.
- Voeg 2 ml ijskoude cellysereagens toe voor isolatie van synaptokosomen, incubeer gedurende 2 minuten op ijs en schraap de neuronen stevig.
- Breng het lysaat over in meerdere microbuizen van 2 ml (~ 1,5 ml lysaat per buis) en centrifugeer op 1.200 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Houd de buizen gedurende deze procedure op ijs. - Verzamel het supernatant (gooi de pellet weg) en centrifugeer bij 15.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Bewaar en resuspendeer de pellet die de synaptokosomen bevat met een vergelijkbaar volume (als het oorspronkelijke lysaat) van 5% DMSO in DPBS.
OPMERKING: De synaposomen kunnen onmiddellijk worden geëtiketteerd met een fluorofoor of worden bewaard bij -80 °C voor toekomstig gebruik. - Voer een Bicinchoninic acid (BCA) eiwittest uit voor alle buizen om de totale opbrengst van eiwit in het synasptosoompreparaat te beoordelen.
OPMERKING: Andere testen om de eiwitconcentratie te meten kunnen worden gebruikt. De totale eiwitopbrengst verkregen uit verschillende preparaten is als referentie opgenomen in tabel 1 . Het wordt aanbevolen om western blot-analyse van het synasptosoompreparaat uit te voeren om de aanwezigheid van presynaptische en postsynaptische eiwitten te bevestigen. Hier werden de presynaptische marker, synaptophysine (SYP), en de postsynaptische marker, postsynaptische dichtheidseiwit 95 (PSD95) gekozen voor western blotting-analyse zoals eerder beschreven19. - Bereid een oplossing van 100 mM natriumbicarbonaat in water, stel de pH in op 8,5 en steriel filter.
- Verzacht 1 mg gelyofiliseerd poeder van de gebruikte pH-gevoelige kleurstof tot 150 μL DMSO. Maak aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar ze bij -80 °C.
- Centrifugeer de synaptokosomen bij 15.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verdun tot 1 mg synaptosomen in 100 μL natriumbicarbonaatoplossing van 100 mM.
- Om de synaptosomen te labelen, voegt u 1 μL van de gereconstitueerde pH-gevoelige kleurstof per 1 mg synaptosomen toe en bedekt u de reactie met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Schud op kamertemperatuur gedurende 2 uur met behulp van een tube shaker.
- Voeg 1 ml DPBS toe aan de buis en centrifugeer de gelabelde synaptokosomen bij 15.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en voer vier extra wasbeurten uit zoals beschreven in stap 2.2.11.
- Verwijder na de laatste wasbeurt en spin het supernatant zoveel mogelijk zonder de pellet te verstoren en resuspenseer de gelabelde synaposomen met 5% DMSO in DPBS op een volume voor de gewenste concentratie (0,7 μg/μL die hier wordt gebruikt). Bereid aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar bij -80 °C. Zorg ervoor dat u blootstelling aan licht aan de gelabelde synaptokosomen vermijdt.
- Levendcellige fagocytosetest
- Plaat 20-30 × 104 PMP's in 96-well platen in 100 μL iMG compleet medium en volg het differentiatieproces gedurende 10 dagen zoals aangegeven in stap 1.2.4.
- Bereid op de dag van de test de nucleaire kleuringsoplossing door 1 druppel van een kernvlek voor levende cellen toe te voegen aan 2 ml iMG basaal medium.
- Verwijder 40 μL medium per putje van de 96-wellsplaat en voeg 10 μL van de nucleaire kleuringsoplossing toe met behulp van een meerkanaals pipet. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur.
- Ontdooi de gelabelde synaposomen op ijs en soniceer voorzichtig met behulp van een water sonicator gedurende 1 minuut. Breng de synapptosomen onmiddellijk terug naar ijs. Verdun de gelabelde synaptosomen in iMG complete medium in een verhouding van 1 μL synaptosomen per 50 μL medium.
OPMERKING: De concentratie van synaptosoom is assay-afhankelijk en kan optimalisatie vereisen. Om een relatief laag percentage (d.w.z. 0,1% of minder) DMSO in het medium te behouden, wordt geadviseerd om niet meer dan 2 μL synaptosomen per put toe te voegen. - Als negatieve controle, voorbehandeling van sommige van de putten met cytochalasine D om actinepolymerisatie en dus fagocytose te remmen. Bereid een oplossing van 60 μM cytochalasine D in iMG compleet medium. Voeg 10 μL van deze oplossing toe aan elk putje voor een eindconcentratie van 10 μM en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Haal de plaat uit de incubator en incubeer bij 10 °C gedurende 10 min. Houd de plaat op ijs en voeg 50 μL medium toe dat synaptosomen bevat, bereid zoals beschreven in stap 2.3.4.
- Centrifugeer de plaat op 270 × g gedurende 3 minuten bij 10 °C en houd de plaat op ijs totdat de beeldvorming is verkregen.
- Imaging acquisitie en analyse
- Plaats de plaat in een live-cell imaging reader en selecteer de putjes die geanalyseerd moeten worden.
- Selecteer een lens met een 20x objectief.
- Pas de focus, led-intensiteit (light-emitting diode), integratietijd en versterking van de heldere veld - en blauwe (4',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]) kanalen aan. De fluorescentie van het synptoptosoom moet op het beginpunt verwaarloosbaar zijn. Als u zich wilt concentreren op het rode (RFP)-kanaal, gebruikt u het brightfield-kanaal als referentie. De integratietijd en -winst kunnen variëren tussen experimenten; gebruik deze initiële instellingen voor het rode kanaal: LED: 4, integratietijd: 250 en gain: 5.
- Selecteer het aantal afzonderlijke tegels dat in een montage per put moet worden verkregen (verkrijg 16 tegels in het midden van de put, waardoor ongeveer 5% van het totale putoppervlak wordt afgebeeld). Stel de temperatuur in op 37 °C en het gewenste tijdsinterval voor beeldvorming.
OPMERKING: Afbeeldingen werden elke 1 - 2 uur gedurende maximaal 16 uur in dit onderzoek verkregen. - Open de analysesoftware.
- Open het experiment dat de afbeeldingen bevat. Klik op het pictogram Gegevensreductie.
- Kies in het menu Imaging Stitching onder Imaging Processing om een volledige afbeelding te maken van de 4 x 4 afzonderlijke tegels in de montage met de parameters die worden beschreven in tabel 2.
- Zodra de gestikte afbeeldingen zijn gemaakt, definieert u een intensiteitsdrempel met behulp van de DAPI- en RFP-kanalen voor deze afbeeldingen. Open een afbeelding en klik op Analyseren; selecteer onder Analyse de optie Cellulaire analyse en kies onder Detectiekanaal een gestikte afbeelding in de DAPI- of RFP-kanalen. Ga naar het tabblad Primair masker en aantal en stel een drempelwaarde en objectgroottewaarden vast waarmee de celkernen in het DAPI-kanaal of het synasptosoomsignaal in het RFP-kanaal correct worden geselecteerd. Herhaal het proces met verschillende afbeeldingen totdat parameters die op het hele experiment kunnen worden toegepast, zijn geoptimaliseerd.
OPMERKING: Voorgestelde waarden zijn te vinden in tabel 2. - Als u het aantal kernen wilt tellen, gaat u naar het menu Gegevensreductie en selecteert u onder Beeldanalyse de optie Cellulaire analyse. Ga naar het tabblad Primair masker en aantal en selecteer onder Kanaal de DAPI-gestikte afbeeldingen en gebruik de parameters die worden beschreven in tabel 2.
- Ga naar het tabblad Berekende statistieken en selecteer Celaantal. Als u het gebied van het synasptosoomsignaal wilt verkrijgen, gaat u naar het menu Gegevensreductie en selecteert u onder Analyse de optie Cellulaire analyse.
- Ga naar het tabblad Primair masker en aantal en selecteer onder Kanaal de optie RFP-gestikte afbeeldingen en gebruik de parameters die in tabel 2 worden beschreven.
- Ga naar het tabblad Berekende statistieken en selecteer Objectsomgebied. Klik op het tabblad Gegevensreductie op OK en laat de software alle verkregen afbeeldingen analyseren.
- Exporteer de waarden objectsomgebied en celtelling voor elk tijdstip. Deel het objectsomgebied door het aantal cellen om het genormaliseerde gebied per tijdstip te berekenen. Als u meerdere behandelingen of genotypen vergelijkt, berekent u de fagocytose-index met behulp van vergelijking (1):
(1) - Sla de resultaten op en integreer de gegevens.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om iMG's te genereren met behulp van dit protocol, is het belangrijk om te beginnen met ongedifferentieerde iPSC's die compacte koloniemorfologie vertonen met goed gedefinieerde randen (figuur 2A). Gedissocieerde iPSC's die worden onderhouden zoals beschreven in de EB-formatiesectie zullen bolvormige aggregaten vormen, EB's genaamd, die in omvang zullen toenemen tot dag 4 van differentiatie (figuur 2B). Zodra de EB's zijn verzameld en verguld in de juiste omstandigheden voor het genereren van PMP, hechten ze zich aan de matrigel-gecoate platen en zal een laag cellen zich verspreiden en de bolvormige aggregaten omringen (figuur 2C). Ongezonde EB's zullen loskomen van de plaat en moeten worden geëlimineerd. Van dag 14 tot 21 van de PMP-generatie kunnen potentieel verschillende celtypen ontstaan en zullen ze in het medium zweven; deze cellen moeten worden weggegooid tijdens mediaveranderingen12. Op dag 28 verschijnen ronde cellen met een grote cytoplasma-kernverhouding in suspensie (figuur 2D), PMP's genoemd. Deze cellen worden continu geproduceerd en kunnen wekelijks worden geoogst tijdens gemiddelde veranderingen gedurende maximaal 3 maanden. Het aantal PMP's dat elke week wordt geoogst varieert en is afhankelijk van de iPSC-lijn en de leeftijd van de cultuur; de opbrengst neemt over het algemeen af met de tijd. Het wordt sterk aanbevolen om iPSC's te kweken in laminine 521-gecoate platen in plaats van Matrigel, omdat de PMP-opbrengst hoger is wanneer iPSC's worden gehandhaafd in de eerste omstandigheden zoals eerder gemeld en in deze studie (figuur 2E)18.
Nadat PMP's gedurende 10-12 dagen zijn blootgesteld aan iMG-medium , krijgen de cellen een microglia-achtige morfologie met een klein cytoplasma en de aanwezigheid van langwerpige processen (figuur 3A). Om de identiteit van microglia te verifiëren, voerden we immunofluorescentiekleuring uit met antilichamen tegen de myeloïde marker geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1 (IBA1) en de microglia-verrijkte markers purinerge receptor P2RY12 en transmembraaneiwit 119 (TMEM119) zoals eerder beschreven20 (zie ook de Tabel van Materialen). Doorgaans drukt >95% van de cellen IBA1 tot expressie en ongeveer 90% van de cellen drukt P2RY12 en TMEM119 uit (figuur 3B).
Om de fagocytische capaciteit van iMG's te beoordelen, werden i3LMN-afgeleide humane synaptosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof gebruikt. Om te verifiëren dat het synasptosoompreparaat canonieke structurele eigenschappen behoudt, werd de verrijking van de presynaptische marker, synaptophysine (SYP) en de postsynaptische marker, postsynaptische dichtheidseiwit 95 (PSD95)19 bevestigd door Western blot-analyse (figuur 4) uitgevoerd zoals beschreven vóór20 (zie ook de tabel met materialen ). Synaptokosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof worden fluorescerend nadat ze zijn overspoeld door iMG's en zodra ze zijn gelokaliseerd in intracellulaire zure (d.w.z. lage pH) compartimenten.
Op het beginpunt was het rode fluorescerende signaal minimaal, omdat de meeste synaptosomen nog niet fagocytoseerd waren. Na 30 minuten werd een rood fluorescerend signaal gedetecteerd en in de loop van de tijd verder verhoogd. Na 10 uur was het rode fluorescerende signaal robuust, omdat de meeste synaptosomen waren overspoeld en gelokaliseerd in zure intracellulaire compartimenten via het proces van fagocytose (figuur 5A). Cytochalasine D is een actinepolymerisatieremmer die veel wordt gebruikt om fagocytose te blokkeren. Zoals verwacht zagen we een sterke vermindering van het rode fluorescerende signaal in cytochalasine D-behandelde iMG's, wat aangeeft dat het gedetecteerde signaal het gevolg is van fagocytische gebeurtenissen. We merkten ook op dat iMG's veranderingen in morfologie vertonen na 10 uur fagocytose die niet werden gedetecteerd in de met cytochalasine D behandelde iMG's, mogelijk als gevolg van het gebrek aan actineremodellering in de met cytochalasine D behandelde iMG's. Veranderingen in de morfologie van microglia worden meestal geassocieerd met activeringsstatus2.
Door de beschreven geautomatiseerde kwantificeringsmethode te gebruiken, hebben we de totale oppervlakte van het rode signaal op elk tijdstip gemeten en genormaliseerd naar het celnummer dat wordt verkregen door de kernen te tellen. De resultaten geven aan dat het gebied van overspoelde synaptosomen met de tijd toenam totdat een plateau werd bereikt na 16 uur. Zoals verwacht nam het gebied van rood signaal van met cytochalasine D behandelde cellen niet toe met de tijd, omdat fagocytose werd geremd (figuur 5B). Samen geven deze resultaten aan dat iMG's in staat zijn om hersenziekterelevant materiaal te fagocyteren en geschikt zijn voor functionele studies.
Figuur 1: Schema van het protocol om iPSC's te differentiëren in microglia-achtige cellen. Op dag 0, zodra iPSC's 80% confluency hebben bereikt, worden de kolonies gedissocieerd in afzonderlijke cellen en gekweekt in EB-medium om EB-vorming te induceren. Op dag 4 worden EV's verzameld en verguld in PMP-medium om PMP-generatie te induceren. Na 28 dagen worden PMP's verzameld en terminaal gedifferentieerd in iMG's met behulp van iMG-medium. PMP's kunnen tot 3 maanden lang wekelijks worden opgehaald. Afkortingen: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; iMG's = microglia-achtige cellen; EB = embryoïsch lichaam; PMP = primitieve macrofaagvoorloper. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Celmorfologie beoordeeld door lichtmicroscopie in de differentiatiestadia van iPSC's naar PMP's. (A) iPSC's gehandhaafd in iPSC-medium tot 80% confluency. (B) Een embryoïsch lichaam na 4 dagen differentiatie in EB-medium. C) EB's bevestigd aan gecoate platen en (D) PMP's die in suspensie uit EB's tevoorschijn komen na 28 dagen kweek in PMP-medium. (E) Aantal PMP's verzameld van ~48 EB's in week 1 (na 28 dagen PMP-differentiatie) en week 12. Staafdiagrammen tonen het gemiddelde van zes onafhankelijke differentiaties (gegevenspunten) van twee verschillende iPSC-lijnen. Statistieken werden verkregen door tweerichtings ANOVA en Šídák's meervoudige vergelijkingstest. Schaalstaven = 1.000 μm (A), 400 μm (B-D). Afkortingen: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; iMG's = microglia-achtige cellen; EB = embryoïsch lichaam; PMP = primitieve macrofaagvoorloper. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: iMG's die door dit protocol worden gedifferentieerd, vertonen bonafide microglia-kenmerken na 10 dagen terminale differentiatie. (A) Representatief brightfieldbeeld van iMGs met microglia-achtige morfologie. Schaalbalk= 400 μm. (B) Representatieve immunofluorescentiebeelden van iMG's die de myeloïde/microgliamarkers IBA1, P2RY12 en TMEM119 tot expressie brengen. Schaalstaven= 400 μm (A), 50 μm (B). Afkortingen: iMGs = microglia-achtige cellen; IBA1 = geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1; P2RY12 = purinerge receptor P2RY12; TMEM119 = transmembraaneiwit 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: i3LMN-afgeleide humane synaptosomen drukten synaptische markers uit door western blot-analyse. Representatieve western blot analyse van een humaan synaptosoompreparaat afgeleid van i3LMN na 28 dagen kweek onderzocht met de postsynaptische marker, PSD95, de presynaptische marker, SYP en β-tubuline. Afkortingen: i3LMN = iPSC-afgeleide lagere motorneuronen; PSD95 = postynaptische dichtheid eiwit 95; SYP = synaptophysine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fagocytosetest van iMG's met behulp van menselijke synaptosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof en gecontroleerd door levende cel, longitudinale beeldvorming. (A) Representatieve brightfield- en fluorescentiemontages van iMG's met nucleaire kleuring (blauw kanaal) blootgesteld aan gelabelde menselijke synaptosomen (rood kanaal) met en zonder cytoD-behandeling op de aangegeven tijdstippen. De montages zijn gemaakt door postacquisitie verwerking van 16 tegels verworven op 20x. Schaalstaven= 400 μm. (B) Kwantificering van het gebied van het synaptosoom fluorescerend signaal genormaliseerd naar het celnummer. Gegevenspunten geven de gemiddelde ± SEM van drie technische replicaties aan. Elke curve toont de kwantificering voor twee onafhankelijke differentiaties (iMGs 1 en 2) van één iPSC-lijn met en zonder cytoD-behandeling. Afkortingen: iMGs = microglia-achtige cellen; cytoD = cytochalasine D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Aantal 10 cm schotels van DIF28 i3LMN | Totaal eiwit (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabel 1: Totale eiwitopbrengst na synaptosoomisolatie van iPSC-afgeleide lagere motorneuronen na 28 dagen differentiatie. Totale eiwithoeveelheid verkregen uit vier onafhankelijke differentiaties nadat synaptokosomen werden geëxtraheerd. In elke differentiatie werden verschillende aantallen schalen van 10 cm met i3LMN geoogst. De eiwitopbrengst werd gemeten door middel van een BCA-eiwittest. Afkortingen: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; i3LMN = iPSC-afgeleide lagere motorneuronen; DIF28 = 28 dagen differentiatie; BCA = bicinchonininezuur.
| Parameters | Waarde |
| Registratiekanaal | Helder veld, DAPI en RFP |
| Fusie methode | Lineaire mix |
| Gestikte afbeelding bijsnijden om zwarte rechthoeken aan de randen te verwijderen | Geruit |
| Downsize definitieve afbeelding | Geruit |
| Parameters | Waarde |
| Drempel | Bepaald door gebruiker |
| Achtergrond | Donker |
| Aanrakende objecten splitsen | Geruit |
| Gaten in maskers vullen | Geruit |
| Min. objectgrootte | 7 μm |
| Maximale objectgrootte | 30 μm |
| Primaire randobjecten opnemen | Geruit |
| Analyseer de hele afbeelding | Geruit |
| Parameters | Waarde |
| Drempel | Bepaald door gebruiker |
| Achtergrond | Donker |
| Aanrakende objecten splitsen | Geruit |
| Gaten in maskers vullen | Geruit |
| Min. objectgrootte | 5 μm |
| Maximale objectgrootte | 100 μm |
| Primaire randobjecten opnemen | Geruit |
| Analyseer de hele afbeelding | Geruit |
Tabel 2: Parameters die worden gebruikt voor beeldvormingsacquisitie en gegevensanalyse. Voorgestelde parameters om te overwegen voor beeldvormingsacquisitie tijdens de fagocytosetest en voor analyse van de verworven beelden worden vermeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een efficiënte methode om iPSC-afgeleide microglia-achtige cellen te verkrijgen in ~ 6-8 weken met een hoge zuiverheid en in een voldoende opbrengst om immunofluorescentie-experimenten en andere testen uit te voeren die een groter aantal cellen vereisen. Dit protocol heeft in 1 week tot 1 × 106 iMG's opgeleverd, wat eiwit- en RNA-extractie en bijbehorende downstream-analyses mogelijk maakt (bijv. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massaspectrometrie). Dat gezegd hebbende, een beperking van dit protocol is dat de opbrengst van iMG's bepaalde toepassingen kan beperken. Aanvullende wijzigingen kunnen worden geïmplementeerd om PMP's van verschillende weken te accumuleren en een homogene cultuur in suspensie te behouden totdat voldoende voorlopers zijn verzameld om onmiddellijk door te gaan met het differentiatieproces18. Als alternatief kan de differentiatie van EB's worden opgeschaald door celkweekplaten met een hoger gebied te gebruiken om de productie van PMP's te verhogen.
Het wordt geadviseerd om iPSC's gekweekt in laminine 521-gecoate platen te gebruiken om het differentiatieproces te starten. Andere coatingreagentia kunnen het aantal PMP's dat later in het proces wordt geproduceerd verminderen18. Op dezelfde manier verbetert het coaten van de platen voor EB-hechting tijdens de PMP-generatie de EB-bevestiging, waardoor de levensduur van de cultuur wordt verlengd. Eb-cultuur is tot 4 maanden in stand gehouden, waarna meerdere EB's loskomen en sterven. Andere onderzoekers melden echter dat ze EBs tot 1 jaar kweken12. In onze handen behouden iMG's gegenereerd uit 3 maanden oude EB-culturen vergelijkbare functionele eigenschappen als iMG's die zich onderscheiden van jonge culturen; culturen ouder dan 3 maanden zijn niet gebruikt voor functionele experimenten.
Om de laatste fase van microgliadifferentiatie ten opzichte van de oorspronkelijke hierboven beschreven protocollen 7,8 te optimaliseren, hebben we 100 ng / ml interleukine (IL) -34,7 5 ng / ml koloniestimulatiefactor 1 (M-CSF) 10 en 50 ng / ml transformerende groeifactor-bèta (TGF-β) in het iMG-medium opgenomen. IL-34 en M-CSF stimuleren CSF1-receptorafhankelijke routes die cruciaal zijn voor het behoud van het lot en de overleving van microglia8, terwijl TGF-β microgliahomeostase9 ondersteunt, waardoor een meer fysiologische omgeving voor PMP-toewijding aan het lot van microglia wordt bevorderd. Van belang is dat het volledige differentiatieproces dat hier wordt beschreven, wordt uitgevoerd in serumvrije omstandigheden, wat mogelijke effecten van serum op iMG-gedrag en veranderingen in downstream-toepassingen voorkomt. Voor functionele experimenten met iMG's wordt aanbevolen om experimenten uit te voeren tussen 10 en 12 dagen terminale differentiatie. iMG's zijn tot 14 dagen gekweekt met een bescheiden vermindering van de levensvatbaarheid van cellen, waarna de celgezondheid aanzienlijk wordt aangetast.
Aangezien een van de canonieke functies van microglia fagocytose is, werd een test om fagocytische activiteit in vitro te onderzoeken in dit protocol opgenomen. Om een op menselijke cellen gebaseerd systeem te ontwikkelen, werden synaposomen afgeleid van menselijke i3 LMN'sgebruikt. De kwaliteit van het synasptosoompreparaat werd beoordeeld door western blot-analyse van synaptische markers in deze studie. Bovendien kunnen andere structurele en functionele eigenschappen van het synaposoompreparaat worden onderzocht door elektronenmicroscopie of immunostaining vóór de fagocytosetest. Het hier beschreven protocol om menselijke synaptosomen te verkrijgen is sterk afhankelijk van i3LMN's, die een relatief hoog aantal neuronen opleveren. Neuronale opbrengsten zullen echter waarschijnlijk lager zijn bij het gebruik van andere differentiatiemethoden (d.w.z. protocollen die cocktails van kleine moleculen vereisen). Met name kan de fagocytosetest worden uitgevoerd met meerdere andere substraten zoals van muizenhersenen afgeleide synptosomen, geaggregeerde eiwitten of dode cellen, die allemaal kunnen worden gelabeld met pH-gevoelige kleurstoffen om fagocytose op een vergelijkbare manier te controleren. Er wordt voorgesteld om pH-gevoelige kleurstoffen te gebruiken omdat het fluorescerende signaal voornamelijk wordt uitgezonden wanneer de synaptokosomen zijn gelokaliseerd in zuurcompartimenten tijdens fagosoomverwerking en afbraak in de lysosomen21. Deze eigenschap vermindert het achtergrondsignaal van synaptosomen buiten de cellen en vergemakkelijkt het gebruik van geautomatiseerde kwantificeringsmethoden. Bovendien maken pH-gevoelige kleurstoffen de detectie van echte fagocytosegebeurtenissen mogelijk in tegenstelling tot substraataanhanging of docking op het celmembraan.
Hoewel hierin wordt voorgesteld om ~ 35 μg synaptosomen per put te gebruiken, moet de specifieke hoeveelheid menselijke synaptosomen en andere substraten worden geoptimaliseerd, omdat optimale omstandigheden afhankelijk zijn van de iPSC-lijn en de experimentele omstandigheden. Een ideaal bereik van synaptokosomen zou moeten resulteren in een dosis-respons in de fagocytosetest. Te veel synaptosomen kunnen het systeem verzadigen, waardoor het moeilijk wordt om betekenisvolle verschillen te detecteren als functie van genotype of behandelingsgroep. Te weinig materiaal zal resulteren in een zwak uitgangssignaal in de test. Om deze reden wordt geadviseerd om meerdere concentraties van elk substraat te testen om een werkende test vast te stellen. Daarnaast is het belangrijk om het % DMSO binnen een veilig bereik te houden om de gezondheid van de cellen te behouden.
In dit protocol werd fagocytose gemonitord met behulp van een levend-cel beeldvormingssysteem (Table of Materials) omdat het kinetische informatie geeft over de overspoelingscapaciteit van de cellen. Microscopen en beeldvormingssystemen die live-cell imaging kunnen ondersteunen en stabiele temperatuur, vochtigheid en CO2-concentraties kunnen handhaven, zijn ook geschikt voor deze test. Alle hier beschreven fagocytose-experimenten werden afgebeeld bij 37 °C met 85%-95% luchtvochtigheid en 5% CO2. Andere detectiemethoden zoals beeldvorming van vaste cellen of flowcytometrie kunnen ook worden gebruikt om fagocytose te beoordelen met behulp van dezelfde materialen en celkweekprotocollen (tot en met het genereren van iMG's en gelabelde synptosomen) wanneer live-cell imaging niet haalbaar of gewenst is. Evenzo kan andere open-source software worden gebruikt voor gegevensanalyse, zoals ImageJ of CellProfiler; dit laatste zal een geautomatiseerde analyse mogelijk maken die vergelijkbaar is met de software die hier wordt gebruikt.
Samenvattend wordt de implementatie van een robuust protocol om microglia-achtige cellen te differentiëren van menselijke iPSC's geïllustreerd, waardoor de beperkte bron van menselijke microglia wordt overwonnen. Gedifferentieerde microglia kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen in de studie van neurologische en neurodegeneratieve ziekten. Bovendien is een volledig "gehumaniseerde" fagocytosetest opgenomen, die de studie van microgliafunctie en disfunctie in de context van menselijke ontwikkeling en ziekte verder zal ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Michael Ward voor het leveren van de WTC11 hNIL iPSC-lijn voor motorneurondifferentiatie en de Jackson Laboratories voor het leveren van de KOLF2.1J WT-kloon B03 iPSC-lijn die wordt gebruikt voor microgliadifferentiatie. We bedanken ook Dorothy Schafer voor haar steun tijdens de implementatie van de protocollen, Anthony Giampetruzzi en John Landers voor hun hulp bij het live-cell imaging systeem, evenals Hayden Gadd voor zijn technische bijdragen tijdens revisies en Jonathan Jung voor zijn medewerking aan deze studie. Dit werk werd ondersteund door het Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience van UMASS Chan Medical School en het Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
