Summary
このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。
Abstract
ミクログリアは、脳微小環境の恒常性を維持する骨髄系起源の常在免疫細胞であり、複数の神経疾患の主要なプレーヤーとなっています。健康と病気におけるヒトミクログリアの研究は、ヒト細胞の供給が非常に限られているため、課題を表しています。ヒト個体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)は、この障壁を回避するために使用することができる。ここでは、ヒトiPS細胞をミクログリア様細胞(iMG)に分化させて in vitro 実験を行う方法を実証します。これらのiMGは、ミクログリア様形態、適切なマーカーの発現、活発な食作用など、ミクログリアの期待される生理学的特性を示します。さらに、ヒトiPS細胞由来の下位運動ニューロン(i3LMN)に由来するシナプトソーム基質を単離および標識するための文書が提供されています。生細胞の縦断的イメージングアッセイを使用して、pH感受性色素で標識されたヒトシナプトソームの飲み込みを監視し、iMGの貪食能力を調べることができます。本明細書に記載のプロトコルは、ヒトミクログリア生物学および疾患へのミクログリアの寄与を調査している異なる分野に広く適用可能である。
Introduction
ミクログリアは中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であり、CNSの発症に重要な役割を果たしています。ミクログリアは、成人の脳において恒常性を維持し、外傷や疾患のプロセスに積極的に反応するためにも重要です。累積的な証拠は、ミクログリアが複数の神経発達および神経変性疾患の病因の主要な原因であることを示しています1,2。ミクログリア生物学に関する現在の知見は主にマウスモデルから得られてきましたが、最近の研究ではマウスとヒトミクログリアの重要な違いが解明されており、ヒトミクログリアの遺伝学と生物学的機能を研究する技術を開発する必要性が強調されています3,4。解剖された初代組織からのミクログリアの単離は、ミクログリアの特性を著しく変化させる可能性があり5、そのような細胞で得られた結果を交絡させる可能性があります。この方法の全体的な目標は、ヒトiPS細胞をiMGに分化させることであり、それによって基礎条件下でヒトミクログリアを研究するための細胞培養システムを提供することです。さらに、完全ヒトモデル系を用いた食作用アッセイは、品質管理尺度として、および疾患の状況におけるiMG機能障害を評価する手段として、iMGの機能性を研究する手段として本明細書に含まれる。
iPS細胞からのミクログリア分化のための複数のプロトコルが、最近、文献6、7、8、9、10に出現した。いくつかのプロトコルの潜在的な欠点には、長期間または長期間の分化、複数の成長因子の追加、および/または複雑な実験手順が含まれる6、9、10。ここでは、iPS細胞をプリミティブマクロファージ前駆体(PMP)と呼ばれる前駆細胞に分化させることで、ミクログリア個体発生の側面を再現する「ユーザーフレンドリーな」分化方法が実証されています7,11。PMPは、前述のように生成され、いくつかの最適化が本明細書12に提示される。PMPは、MYB非依存性の卵黄嚢由来のマクロファージを模倣しており、血液脳関門閉鎖の前に脳に侵入することにより、胚発生中にミクログリアを引き起こします13。PMPをiMGに最終的に分化させるために、HaenselerらとBrownjohnらのプロトコルに基づく高速で簡略化された単一培養法を使用し、iMGがミクログリア富化マーカーを堅牢に発現する効率的なミクログリア分化法を生成するためにいくつかの変更を加えました7,8。この分化法は、iPS細胞の培養に関する専門知識を持ち、ヒトモデルシステムを用いたミクログリア生物学の研究を目的とした研究目標を持つ研究室で再現することができます。
iPS細胞由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に関連する供給源であり、食作用を含むミクログリアの標準機能を調査するための重要なツールです。ミクログリアは、脳とCNSの専門的な食細胞であり、細胞の破片、凝集したタンパク質、および分解されたミエリンを取り除きます14。ミクログリアはまた、シナプスを飲み込むことによるシナプスリモデリングや、病原体の食作用による外部感染に対する防御にも機能します15,16。このプロトコルでは、iMGによる食作用は、iMG巻き込みの材料としてヒトシナプトソームを使用して評価されます。この目的のために、ヒトi3LMNsに由来するシナプトソームを単離するための記載が記載されている。i3LMN由来のヒトシナプトソームは、pH感受性色素で標識されており、in vitroでのファゴソーム処理および分解中に酸性コンパートメント内に局在するシナプトソームの定量を可能にします。ミクログリア巻き込みの動的プロセスをリアルタイムでモニタリングするために、生細胞顕微鏡を用いた食作用アッセイが示されています。この機能アッセイは、完全なヒトシステムを使用して、健康と病気におけるミクログリア食作用の可能性のある欠陥を調査するための基礎を確立します。
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Protocol
注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は無菌である必要があり、すべてのステップは無菌条件下でバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。すべてのiPS細胞株、ならびに維持および分化培地は、材料表に記載されています。以下に図示されるミクログリア鑑別方法は、本明細書に記載される新たな改変を伴う以前に公表されたプロトコル7、8、12に基づく。
1.ミクログリア分化
メモ: プロトコルの概要を 図 1 に示します。
- 人工多能性幹細胞(iPSC)培養
注:iPS細胞培養技術を説明する詳細については、他の場所17を参照してください。- 解凍とメンテナンス
- iPSC培地を調製し、培地を分注し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。アリコートを4°Cで一晩解凍し、最大1週間使用します。使用前に、メディアを周囲温度に少なくとも1時間放置してください。
- カルシウムとマグネシウム18を含むDPBSで希釈した10 μg/mLのラミニン521を1 mL添加して、6ウェルプレートのウェルをコーティングします。プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに少なくとも2時間、できれば一晩保管します。希釈したら、ラミニンを4°Cで3ヶ月間保存します。
- 滅菌水で希釈することにより、10 mM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632(ROCK阻害剤)ストック溶液を調製します。ROCK阻害剤溶液のシングルユースアリコートを作成し、-20°Cで最大1年間保存します。
- 0.5 M EDTAのストック溶液をDPBSで希釈して、0.5 mM EDTAを調製します。
- 凍結したiPS細胞のバイアルを解凍するには、バイアルを37°Cの水浴に入れて、ほとんど解凍するまで入れます。バイアルの内容物を直ちに、4 mLの iPS細胞培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します。500 × g で1分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を含む iPS細胞培地 1 mLをチューブの壁にゆっくりと加え、コロニーの乱れを避けるために細胞を再懸濁します。
- 10 μM ROCK阻害剤を含む iPS細胞 培地1.5 mLをコーティングした各ウェルに加え、再懸濁したコロニーを培地を含むウェルに一滴ずつ移します。
注:培養の維持にはステップ1.1.1.6から5〜7滴を使用しますが、すべてのiPS細胞株に最適な播種密度を調整します。 - プレートを手動で左右および前後にシャッフルすることにより、ウェル内の細胞を均等に分配します。細胞を37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れる。翌日、ROCK阻害剤を含まない新鮮な iPS細胞 培地を添加して培地を完全に交換する。
- メンテナンスのために、細胞が80%コンフルエントに達するまで毎日培地を交換してください。
注:使用する iPS 細胞培地が柔軟な給餌スケジュールを可能にする場合、細胞は培地を交換することなく2日間維持することができます。これを継代ごとに1回に制限し、細胞が50%未満のコンフルエントである場合にのみ行うことをお勧めします。.
- 分割
- 培地を吸引し、1 mLのDPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)で細胞を洗浄します。
- 細胞を除去するには、1 mLの0.5 mM EDTAを加え、細胞コロニーの端がウェルの表面から持ち上がるまで室温で2〜3分間インキュベートします。細胞をDPBSで再度洗浄し、1 mLの iPS細胞培地を加えます。
- 細胞リフターを使用して細胞コロニーを穏やかにこすり、細胞コロニーを解離します。コロニーを乱さないように、井戸の各領域を一度だけこすります。
注:コロニーを井戸から取り除くための代替方法は、他の場所で見つけることができます17。 - 1 mLのピペットチップを使用して細胞を回収し、1.5 mLの iPS細胞培地を含むプレコートウェル(ステップ1.1.1.2で説明)に1:6の比率(細胞と培地)で一滴ずつ移します。
- 解凍とメンテナンス
- ミクログリア様細胞(iMG)へのiPS細胞分化
注:低分子および成長因子は、DPBS中の滅菌ろ過された0.1%ウシ血清アルブミンに最終濃度の1,000倍のストック濃度に溶解されます。早期継代時にiPS細胞をiMGに分化させることが推奨されます。iPS細胞株の定期的な核型検査が推奨されます。- 標準コーティング液の準備
- 細胞外マトリックスコーティング試薬のストック溶液を氷上で4°Cで一晩解凍します。
- マイクロ遠心チューブとフィルターピペットチップを4°Cでプレチルします。
- 濃縮した細胞外マトリックスコーティング試薬250 μLを各チューブに分注し、直ちに氷上に置きます。アリコートは-20°Cで保存してください。
- コーティング溶液を調製するには、細胞外マトリックスコーティング試薬アリコートの1つを氷上で4°Cで一晩解凍します。
- ヒト胚性および人工多能性幹細胞(DMEM-F12と呼ばれる)の増殖に最適化された50 mLの氷冷DMEM-F12培地をプレチルドコニカルチューブに加え、氷上に保ちます。
- 氷冷したDMEM-F12を複数回上下にピペッティングして1 mLのピペットチップを冷却し、すぐにピペットチップを使用して250 μLの細胞外マトリックスコーティング試薬をDMEM-F12培地を含むコニカルチューブに移します。
注:標準コーティング溶液は、4°Cで2週間保存できます。
- 胚様体(EB)形成
- 4°Cで最大4日間維持できる EB培地 を準備します。
- iPS細胞が80%のコンフルエントに達したら、1 mLのDPBSで洗浄し、1 mLの解離試薬を加えて37°Cで2分間解離させ、コロニーを解離させます。 セルリフターを使用してコロニーを複数回こすり、単一細胞懸濁液を作成します。細胞を収集し、9 mLのDPBSを含む15 mLのコニカルチューブにすべてを移します。
- 細胞を500 × g で1分間遠心分離し、上清を除去して、細胞を1 mLの EB培地に再懸濁します。10 μLの細胞を取り、トリパンブルーで1:1に希釈します。血球計算盤で細胞をカウントし、細胞数に基づいて、細胞ストックを100 μLあたり10,000細胞の最終希釈まで希釈します。プレーティングセルの場合は、ウェルあたり100 μLの希釈セルを低接着性の丸底96ウェルプレートに追加します。
注:一般に、96ウェルプレートの48ウェルは、iPS細胞の80%コンフルエントウェルから得ることができます。 - プレートを125 × g で3分間遠心分離し、37°C、5%CO2 で4日間インキュベートします。2日目にマルチチャンネルピペットを使用し、50 μLの古い培地を静かに回収し、50 μLの新しい EB培地を再び追加して、ハーフ培地交換を行います。
注:4日目に、iPS細胞は結果セクションで説明されているように、EBと呼ばれる球状の細胞構造を形成します。EB鑑別プロセスは、必要に応じて最大7日間延長することができます。
- プリミティブマクロファージ前駆体(PMP)の生成
- PMPベース培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存します。
- 1 mLの氷冷マトリゲルコーティング溶液を加えて6ウェルプレートのウェルをコーティングし、37°Cおよび5%CO2 で少なくとも2時間または好ましくは一晩インキュベートします。
- EB分化の4日目に、1 mLピペットチップでEBを回収することにより、EBをマトリゲルコーティングウェルに移します(ピペットを使用)。ピペットを上下に1〜2回使用して、EBをウェルから取り除きます。6ウェルプレートを傾斜角度で保持し、EBがウェルの端に落ち着くようにします。
注:コーティングされたウェルごとに9個または10個のEBをメッキできます。 - すべてのEBが落ち着いたら、EBをウェルの端に保ちながら、1 mLピペットチップを使用して古い培地を静かにピペットで取り除きます。3 mLの新しく調製した PMP完全培地 を各ウェルに加えます。プレートを手動で左右および前後にシャッフルすることにより、ウェル内の細胞を均等に分配します。プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れる。
- EBがウェルの底に付着できるように、プレートを7日間乱さないでください。その後、完全培地の PMPを用いて半培地交換を行う。
注:この時点で、ほとんどのEBをプレートに取り付ける必要があります。フローティング EB はすべて削除できます。 - 5〜7日後、4倍の倍率でライトフィールド顕微鏡でEBを検査して、ウェルの底に付着していることを確認します。1.2.3.5の説明に従ってメディアを変更します。21日目に、3 mLのPMP完全培地で 完全培地交換を行います。
注:培地に浮遊する骨髄系前駆細胞は、この時点で明らかである可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります。 - 28日目に、上清中のPMPと呼ばれる丸い細胞を探し、10 mLピペットと自動ピペッターを使用してPMPを含む培地を収集します。EBを邪魔しないように注意してください。PMPと培地を15 mLのコニカルチューブに移し、ステップ1.2.4の説明に従って進めます。
注:通常、同じiPSCラインからのPMPは、6ウェルプレートの5つのウェルから収集し、単一の15 mLコニカルチューブに一緒にプールすることができます。 - EBのさらなるメンテナンスのために、3 mLの新鮮な PMP完全培地 を追加します。PMPは3か月以上EBから継続的に出現するため、手順1.2.3.7および1.2.3.8で説明されているように、4〜7日ごとにPMPを収集します(培地の色が黄色の色調に変化しないようにしてください)。
注:PMPは数か月間収集できますが、時間の経過とともに表現型が変化する可能性があります。
- iMGへの差別化
- iMGベース培地(材料表)を調製し、滅菌フィルターを4°Cで最大3週間保存します。
- PMPを15 mLのコニカルチューブに回収したら、200 × g で4分間遠心分離します。上清を吸引し、1〜2 mLの iMG基礎培地を使用してPMPを再懸濁します。血球計算盤を使用して、少量のアリコートを取り、トリパンブルーで1:1に希釈して細胞を数えます。
注:0.5-1.5×106 PMPは通常、iPS細胞株とEB培養の年齢に応じて毎週得られます。 - 残りの細胞を200 × gで4分間遠心分離します。新たに調製したiMG完全培地を使用して、細胞を細胞培養処理プレート上に~105/cm2の密度で播種するように、PMPを所望の濃度に希釈します。最終分化を可能にするために、10〜12日間、3〜4日ごとに、新たに調製したiMG完全培地を使用して半培地交換を行います。
注:この時点で、細胞はミクログリア様の形態を獲得するはずです。ミクログリアの運命に対するPMPの関与を確認するために、免疫蛍光分析が行われ、プリン作動性受容体P2RY12や膜貫通タンパク質119(TMEM119)9などのミクログリア富化マーカーの発現が裏付けられます。 - 細胞の健全性と生存率を維持するために、iMG分化の10日目から12日目の間にすべての実験を実施してください。
- 標準コーティング液の準備
2. 運動ニューロン由来ヒトシナプトソームを用いた貪食アッセイ
- 転写因子を介したiPS細胞由来低運動ニューロンの分化(i3ティッカー)
注:ニューロゲニン-2(NGN2)、膵島-1(ISL1)、およびLIMホメオボックス3(LHX3)転写因子を含むhNIL誘導性転写因子カセットをCLYBLセーフハーバー遺伝子座に安定的に挿入したWTC11株を、前述のように分化プロセスに使用しました。17.iPSCラインは、ステップ1.1.1で説明されているように維持されましたが、ステップ1.2.1で説明されているコーティング条件でした。ラミニン521は必要ないため、神経分化に使用されるiPS細胞の培養には、任意の細胞外マトリックスコーティング試薬を使用できます。すべてのメディアは、使用前に少なくとも1時間周囲温度に平衡化されています。- ステップ1.2.1の説明に従って、10 cmの皿に5 mLの標準コーティング溶液をコーティングします。
注:ここでは、分化ごとに3〜4個の10cmディッシュを使用しました。 - 誘導ベース培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大3週間保管します。
- ニューロン培地、滅菌フィルターを調製し、4°Cで最大2週間保存します。
- 滅菌水中で100 mMホウ酸、25 mM四ホウ酸ナトリウム、および75 mM塩化ナトリウムを混合してホウ酸緩衝液を調製します。pHを8.5に調整し、滅菌ろ過します。
- iPS細胞が80%のコンフルエントに達したら、細胞をDPBSで洗浄し、0.5 mM EDTAを加えてコロニーを除去します。
注:通常、10 cmの皿ごとに2つのウェルで十分です。 - 周囲温度で4〜5分間細胞をインキュベートします。EDTAを取り外し、HEPESを含むDMEM/F12を3 mLずつ各ウェルに加えます。
- セルリフターを使用して細胞をこすり落とし、10 mLピペットを使用して、2〜3倍に穏やかに上下にピペッティングして、ウェルの底から細胞を取り除きます。
- 細胞を15 mLのコニカルチューブに集め、300 × g で3分間遠心分離します。
- 10 μM ROCK阻害剤を含む3 mLの iPS細胞培地 に細胞を再懸濁し、血球計算盤を使用してカウントします。
- 10 μM ROCK阻害剤を含む12 mLのiPS細胞培地を入れたプレコート10 cmディッシュに1.5 ×10 6個の iPS細胞 をプレートします。
- 翌日、培地を取り除き、細胞をDPBSで洗浄します。新たに調製した 完全誘導培地 12 mLを加えて、転写因子の発現を誘導します。
- 2日目に、ホウ酸緩衝液で希釈した0.1 mg/mLのポリ-D-リジンと1 mg/mLのポリ-L-オルニチンを等量で調製した5 mLのニューロンコーティング溶液で10 cmのディッシュをコーティングします。37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。
- 3日目に、コーティングされた皿を滅菌水で3回洗浄し、水を完全に吸引し、プレートを傾けて、周囲温度で少なくとも1時間、バイオセーフティキャビネット内で部分的に覆われていないままにして、皿を乾かします。
- 皿が完全に乾いたら、15 μg/mLのラミニンと40 μM BrdUを添加した6 mLの 完全誘導培地 で、37°Cと5%CO2で少なくとも1時間コーティングします。
注:BrdU処理は、有糸分裂活性細胞を排除し、ニューロン培養の純度を高めるために推奨されます。ニューロンの健康に対するBrdUの影響は最小限です。 - 分化細胞を10 cmディッシュあたり3 mLの解離試薬で処理し、周囲温度で3〜4分間インキュベートします。
- 解離試薬を除去せずに6 mLのDPBSをプレートに加え、溶液中の細胞を10 mLピペットで4〜5倍にピペットで上下にピペットして細胞を解離させます。
- 細胞懸濁液を回収し、40 μmのセルストレーナーを通して50 mLのコニカルチューブに入れます。1 mLの 誘導ベース培地 を加えて、ストレーナーをすすぎます。
- 細胞を300 × g で5分間遠心分離します。培地を吸引し、40 μM BrdUを含む3 mLの 完全誘導培地 に細胞を再懸濁します。
- 血球計算盤で細胞を数えます。ステップ2.1.14で添加したコーティング溶液を除去せずに、40 μM BrdUを含む6 mLの完全誘導培地で細胞を希釈することにより、10 cmディッシュあたり約2.5×106細胞をプレコートディッシュにプレートします。
- 4日目に、培地を吸引し、細胞をDPBSで1回洗浄し、40 μM BrdUを含む新しい 完全誘導培地 を追加します。
- 6日目に、培地を吸引し、細胞をDPBSで1回洗浄し、1 μg/mLのラミニンを添加した ニューロン培地 を加えます。
- 9日目に、1 μg/mLのラミニンを添加した新しいニューロン培地と交換して、培地の1/3を交換します。
- 3〜4日ごとに新鮮な1 μg / mLのラミニンを添加したニューロン培地でハーフ培地交換を行うことにより、さらに3つのLMNをさらに25日間維持します。
注:この時点で、i3LMNは長いプロセスを持つニューロン形態を示すはずです。ニューロンはまた、細胞の塊またはクラスターを形成する傾向があります。i3LMNの分化を検証する方法のより詳細な説明は、他の場所17で見つけることができます。
- ステップ1.2.1の説明に従って、10 cmの皿に5 mLの標準コーティング溶液をコーティングします。
- シナプトソームの精製と標識
注意: 無菌状態を維持し、バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行します。- 3つのLMNをDPBSで2回洗浄します。
- シナプトソームを単離するための氷冷細胞溶解試薬2 mLを加え、氷上で2分間インキュベートし、ニューロンをしっかりとこすります。
- ライセートを複数の2 mLマイクロチューブ(チューブあたり~1.5 mLライセート)に移し、1,200 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
注意: この手順全体を通して、チューブを氷上に維持してください。 - 上清を回収し(ペレットを廃棄)、15,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。 シナプトソームを含むペレットを、DPBSの5%DMSOと同様の容量(元のライセートと)で保存して再懸濁します。
注:シナプトソームは、蛍光色素で直ちに標識するか、将来の使用のために-80°Cで保存することができます。 - すべてのチューブに対してビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイを実行して、シナプトソーム調製物中のタンパク質の総収量を評価します。
注:タンパク質濃度を測定するための他のアッセイを使用できます。異なる調製物から得られた総タンパク質収率は、基準として 表1 に含まれている。シナプス前およびシナプス後タンパク質の存在を確認するために、シナプトソーム調製物のウェスタンブロット分析を行うことが推奨される。ここでは、シナプス前マーカーであるシナプトフィジン(SYP)とシナプス後マーカーであるシナプス後密度タンパク質95(PSD95)を、前述のようにウェスタンブロッティング解析用に選択した19。 - 100 mM重炭酸ナトリウムを水中に溶かした溶液を調製し、pHを8.5に調整し、滅菌フィルターに入れます。
- 使用したpH感受性色素の凍結乾燥粉末1 mgを150 μLのDMSOに可溶化します。使い捨てアリコートを作り、-80°Cで保管します。
- シナプトソームを15,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 100 μLの100 mM重炭酸ナトリウム溶液で最大1 mgのシナプトソームを希釈します。
- シナプトソームを標識するには、シナプトソーム1 mgあたり再構成されたpH感受性色素を1 μL添加し、光にさらされないように反応物をアルミホイルで覆います。チューブシェーカーを使用して室温で2時間振とうします。
- 1 mLのDPBSをチューブに加え、標識シナプトソームを15,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、ステップ 2.2.11 の説明に従ってさらに 4 回の洗浄を実行します。
- 最後の洗浄とスピンの後、ペレットを乱すことなく上清をできるだけ取り除き、標識したシナプトソームをDPBS中の5%DMSOで所望の濃度(ここでは0.7 μg/μLを使用)の量で再懸濁します。使い捨てアリコートを調製し、-80°Cで保存します。 標識されたシナプトソームへの光の露出を避けるようにしてください。
- 生細胞食作用アッセイ
- プレート20-30 ×10 4 PMPを100 μLの iMG完全培地中の96ウェルプレートに入れ、ステップ1.2.4に示すように10日間分化プロセスに従います。
- アッセイ当日、生細胞用核染色剤1滴を iMG基礎培地2mLに添加して核染色液を調製する。
- 96ウェルプレートのウェルあたり40 μLの培地を除去し、マルチチャンネルピペットを使用して10 μLの核染色溶液を追加します。プレートを37°C、5%CO2 で2時間インキュベートします。
- 標識されたシナプトソームを氷上で解凍し、1分間水超音波処理器を使用して穏やかに超音波処理する。すぐにシナプトソームを氷に戻します。標識シナプトソームを iMG完全培地 で、培地50 μLあたりシナプトソーム1 μLの比率で希釈します。
注:シナプトソームの濃度はアッセイに依存し、最適化が必要な場合があります。培地中のDMSOの割合を比較的低く(すなわち、0.1%以下)維持するために、ウェルあたり2μLを超えるシナプトソームを追加しないことをお勧めします。 - 陰性対照として、いくつかのウェルをサイトカラシンDで前処理して、アクチン重合を阻害し、したがって食作用を阻害する。 iMG完全培地中の60 μMサイトカラシンDの溶液を調製する。この溶液を各ウェルに10 μL加え、最終濃度10 μMとし、37°C、5%CO2 で30分間インキュベートします。
- プレートをインキュベーターから取り出し、10°Cで10分間インキュベートします。プレートを氷上に維持し、ステップ2.3.4の説明に従って調製したシナプトソームを含む培地50 μLを追加します。
- プレートを270 × g で10°Cで3分間遠心分離し、画像取得までプレートを氷上に維持します。
- 画像の取得と分析
- プレートを生細胞イメージングリーダーに挿入し、分析するウェルを選択します。
- 20倍の対物レンズを選択します。
- 明視野チャンネルと青色(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール[DAPI])チャンネルのフォーカス、発光ダイオード(LED)強度、積分時間、ゲインを調整します。シナプトソーム蛍光は、最初の時点では無視できるはずです。赤(RFP)チャンネルに焦点を合わせるには、明視野チャンネルを参照として使用します。積分時間とゲインは実験によって異なります。赤チャンネルには、LED:4、積分時間:250、ゲイン:5の初期設定を使用します。
- ウェルごとにモンタージュで取得する個々のタイルの数を選択します(ウェルの中心で16個のタイルを取得し、それによってウェル全体の約5%をイメージングします)。温度を37°Cに設定し、イメージングに必要な時間間隔を設定します。
注:この研究では、画像は1〜2時間ごとに最大16時間取得されました。 - 解析ソフトウェアを開きます。
- 画像を含む実験を開きます。 データ削減 アイコンをクリックします。
- メニューの「画像処理」の「イメージングスティッチング」を選択すると、表 2 に示すパラメータを使用して、モンタージュ内の 4 x 4 の個別のタイルから完全な画像が作成されます。
- ステッチされた画像が作成されたら、これらの画像のDAPIおよびRFPチャネルを使用して強度しきい値を定義します。画像を開き、[分析]をクリックします。[分析] で [セルラー分析] を選択し、[検出チャネル] で、DAPI チャネルまたは RFP チャネルでステッチされた画像を選択します。[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、DAPIチャネルの細胞核またはRFPチャネルのシナプトソーム信号を適切に選択するしきい値とオブジェクトサイズの値を設定します。実験全体に適用できるパラメーターが最適化されるまで、異なる画像でこのプロセスを繰り返します。
メモ: 推奨値は 表 2 に記載されています。 - 核の数をカウントするには、[データ削減]メニューに移動し、[画像分析]で[細胞分析]を選択します。[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でDAPIステッチ画像を選択し、表2で説明されているパラメーターを使用します。
- [計算指標] タブに移動し、[セル数] を選択します。シナプトソームシグナルの領域を取得するには、[データ削減]メニューに移動し、[分析]で[細胞分析]を選択します。
- [プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でRFPステッチ画像を選択し、表2に詳述されているパラメーターを使用します。
- [計算指標]タブに移動し、[オブジェクト合計領域]を選択します。の中に データ削減 タブで、[OK]をクリックして、ソフトウェアが取得したすべての画像を分析できるようにします。
- 各時点の[ オブジェクトの合計面積 ]と [セル数 ]の値をエクスポートします。 オブジェクト合計面積 を セル数で割って、時間ポイントごとの正規化面積を計算します。複数の治療法または遺伝子型を比較する場合は、式 (1) を使用して食作用指数を計算します。
(1) - 結果を保存し、データを統合します。
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Representative Results
このプロトコルを使用してiMGを生成するには、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示す未分化iPS細胞から始めることが重要です(図2A)。EB形成のセクションで説明したように維持された解離したiPS細胞は、EBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化の4日目までサイズが大きくなります(図2B)。EBが収集され、PMP生成に適した条件でメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます(図2C)。不健康なEBはプレートから外れるため、排除する必要があります。PMP生成の14日目から21日目まで、潜在的に異なる細胞タイプが出現し、培地中に浮遊する可能性があります。これらの細胞は、培地交換中に廃棄する必要があります12。28日目に、細胞質と核の比率が大きい丸い細胞が浮遊状態で現れます(図2D)、PMPと呼ばれます。これらの細胞は継続的に生産され、培地交換中に最大3か月間毎週回収できます。毎週収穫されるPMPの数はさまざまであり、iPS細胞株と培養の年齢によって異なります。収量は一般的に時間とともに減少します。iPS細胞をマトリゲルではなくラミニン521コーティングプレートで培養することを強くお勧めしますが、これはiPS細胞を前者の条件で維持した場合、PMP収量が高くなるためです(図2E)18。
PMPを iMG培地 に10〜12日間曝露した後、細胞は小さな細胞質と細長い突起の存在を伴うミクログリア様形態を獲得します(図3A)。ミクログリアの同一性を検証するために、前述のように、骨髄系マーカーイオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)およびミクログリア富化マーカープリン作動性受容体P2RY12および膜貫通タンパク質119(TMEM119)に対する抗体を用いて免疫蛍光染色を行った20 ( 材料の表も参照)。典型的には、細胞の>95%がIBA1を発現し、細胞の約90%がP2RY12およびTMEM119を発現する(図3B)。
iMGの貪食能力を評価するために、pH感受性色素で標識されたi3LMN由来のヒトシナプトソームを使用した。シナプトソーム調製物が標準的な構造特性を保持していることを確認するために、シナプス前マーカーであるシナプトフィジン(SYP)およびシナプス後マーカーであるシナプス後密度タンパク質95(PSD95)19の濃縮を、20の前に説明したように実施したウエスタンブロット分析(図4)によって確認しました(材料の表も参照してください)。).pH感受性色素で標識されたシナプトソームは、iMGに取り込まれた後、細胞内の酸性(すなわち低pH)コンパートメント内に局在すると蛍光になります。
最初の時点では、ほとんどのシナプトソームがまだ貪食していなかったため、赤色蛍光シグナルは最小限でした。30分後、赤色蛍光シグナルが検出され、時間とともにさらに増加した。10時間までに、ほとんどのシナプトソームが飲み込まれ、食作用のプロセス を介して 酸性の細胞内コンパートメントに局在していたため、赤色蛍光シグナルは堅牢でした(図5A)。サイトカラシンDは、食作用をブロックするために広く使用されているアクチン重合阻害剤です。予想通り、サイトカラシンD処理iMGでは赤色蛍光シグナルの大幅な減少が観察され、検出されたシグナルは食作用イベントに起因することを示しています。また、iMGは、サイトカラシンD処理iMGでは検出されなかった食作用の10時間後に形態の変化を示すことに気づきました。ミクログリアの形態の変化は、通常、活性化状態2に関連しています。
記載した自動定量法を用いて、各時点での赤色シグナルの総面積を測定し、核をカウントした細胞数で正規化した。結果は、取り込まれたシナプトソームの面積が16時間でプラトーに達するまで時間とともに増加したことを示しています。予想通り、サイトカラシンD処理細胞からの赤色シグナルの面積は、食作用が阻害されたため、時間とともに増加しなかった(図5B)。これらの結果は、iMGが脳疾患関連物質を貪食することができ、機能研究に適していることを示しています。
図1:iPS細胞をミクログリア様細胞に分化させるためのプロトコルの概略図。0日目に、iPS細胞が80%コンフルエントに達すると、コロニーは単一細胞に解離され、EB培地で培養されてEB形成が誘導されます。4日目に、EBを回収し、PMP培地に播種してPMP生成を誘導する。28日後、PMPを採取し、iMG培地を用いてiMGに最終分化させる。PMPは、最大3か月間毎週収集できます。略語:iPS細胞=人工多能性幹細胞;iMGs=ミクログリア様細胞;EB =胚様体;PMP = 原始マクロファージ前駆体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:iPS細胞からPMPへの分化段階で光学顕微鏡で評価した細胞形態。 (A)iPS細胞を80%コンフルエントになるまでiPS細胞培地で維持する。(b)EB培地で分化4日後の胚様体。(C)コーティングされたプレートに付着したEBおよび(D)PMP培地での28日間の培養後にEBから浮遊して出現するPMP。(E)1週目(PMP鑑別28日後)および12週目に~48EBから収集されたPMPの数。棒グラフは、2つの異なるiPS細胞株からの6つの独立した微分(データポイント)の平均を示しています。統計量は、二元配置分散分析とŠídákの多重比較検定によって得られました。スケールバー = 1,000 μm (A)、400 μm (B-D)。略語:iPS細胞=人工多能性幹細胞;iMGs=ミクログリア様細胞;EB =胚様体;PMP = 原始マクロファージ前駆体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:このプロトコルによって鑑別されたiMGは、終末分化の10日後に 真正 なミクログリア特性を示します。 (A)ミクログリア様形態を示すiMGの代表的な明視野像。スケールバー= 400μm。 (B)骨髄/ミクログリアマーカーIBA1、P2RY12、およびTMEM119を発現するiMGの代表的な免疫蛍光画像。スケールバー= 400μm(A)、50μm(B)。略語:iMGs=ミクログリア様細胞;IBA1 =イオン化カルシウム結合アダプター分子1;P2RY12 =プリン作動性受容体P2RY12;TMEM119 = 膜貫通タンパク質119;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:3LMN由来ヒトシナプトソームがウェスタンブロット解析によりシナプスマーカーを発現した。 シナプス後マーカーPSD95、シナプス前マーカー、SYP、およびβチューブリンでプローブした28日間の培養後のi3LMNに由来するヒトシナプトソーム調製物の代表的なウェスタンブロット分析。略語:i3LMN = iPS細胞由来の低運動ニューロン;PSD95 =シナプス後密度タンパク質95;SYP =シナプトフィジン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:pH感受性色素で標識され、生細胞の縦断的イメージングによってモニターされたヒトシナプトソームを使用したiMGの 食作用アッセイ。 (A)示された時点でのCytoD処理の有無にかかわらず、標識されたヒトシナプトソーム(赤チャネル)に曝露された核染色(青チャネル)を伴うiMGの代表的な明視野および蛍光モンタージュ。モンタージュは、20倍で取得した16枚のタイルの取得後処理によって作成されました。スケールバー= 400 μm。 (B)細胞数で標準化したシナプトソーム蛍光シグナルの面積の定量。データポイントは、3つのテクニカルレプリケートの平均±SEMを示します。各曲線は、cytoD処理の有無にかかわらず、1つのiPS細胞株からの2つの独立した分化(iMGs1および2)の定量を示しています。略語:iMGs=ミクログリア様細胞;cytoD = サイトカラシンD. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| DIF28 i3LMNの10cm皿の数 | 総タンパク質(μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
表1:分化28日目におけるiPS細胞由来の低運動ニューロンからのシナプトソーム単離後の総タンパク質収率。シナプトソームの4つの独立した分化から得られた総タンパク質量が抽出された。i3LMNを含有する異なる数の10cmディッシュを各分化において回収した。タンパク質収率は、BCAタンパク質アッセイにより測定した。略語:iPS細胞=人工多能性幹細胞;i3LMN = iPS細胞由来の下位運動ニューロン;DIF28 = 28日の分化;BCA = ビシンコニン酸。
| パラメーター | 価値 |
| 登録チャネル | 明視野、DAPI、およびRFP |
| 融合方式 | 線形ブレンド |
| ステッチされた画像をトリミングして、境界線の黒い長方形を削除します | チェック |
| 最終画像の縮小 | チェック |
| パラメーター | 価値 |
| 閾 | ユーザーによる決定 |
| バックグラウンド | 暗い |
| タッチするオブジェクトの分割 | チェック |
| マスクの穴を埋める | チェック |
| 最小オブジェクトサイズ | 7ミクロン |
| 最大オブジェクトサイズ | 30ミクロン |
| プライマリエッジオブジェクトを含める | チェック |
| 画像全体を分析 | チェック |
| パラメーター | 価値 |
| 閾 | ユーザーによる決定 |
| バックグラウンド | 暗い |
| タッチするオブジェクトの分割 | チェック |
| マスクの穴を埋める | チェック |
| 最小オブジェクトサイズ | 5ミクロン |
| 最大オブジェクトサイズ | 100ミクロン |
| プライマリエッジオブジェクトを含める | チェック |
| 画像全体を分析 | チェック |
表2:画像取得とデータ解析に使用されるパラメータ。 食作用アッセイ中の画像取得および取得画像の分析のために考慮すべき推奨パラメータがリストされています。
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Discussion
ここで説明する分化プロトコルは、iPS細胞由来のミクログリア様細胞を6~8週間で高純度で、より多くの細胞を必要とする免疫蛍光実験やその他のアッセイを行うのに十分な収率で得る効率的な方法を提供します。このプロトコルでは、1週間で最大1×106 iMGが得られ、タンパク質とRNAの抽出、および対応するダウンストリーム分析(RNASeq、qRT-PCR、ウェスタンブロット、質量分析など)が可能になります。とはいえ、このプロトコルの制限は、iMGの歩留まりによって特定のアプリケーションが制限される可能性があることです。異なる週からのPMPを蓄積し、分化プロセスを一度に進行させるのに十分な前駆細胞が収集されるまで懸濁液中で均質な培養を維持するために、追加の修飾を実施することができる18。あるいは、EBの分化は、PMPの産生を増加させるために、より高い面積の細胞培養プレートを使用することによってスケールアップすることができる。
分化プロセスを開始するには、ラミニン521コーティングプレートで培養したiPS細胞を使用することをお勧めします。他のコーティング試薬は、プロセス18の後半で生成されるPMPの数を減らすことができる。同様に、PMP生成中にEB接着のためにプレートをコーティングすると、EB接着が改善され、培養の寿命が延びます。EB培養は最大4ヶ月間維持され、その時点で複数のEBが剥離して死滅する。しかし、他の研究者はEBを最大1年間培養したと報告しています12。私たちの手では、生後3か月のEB培養から生成されたiMGは、若い培養物から分化したiMGと同様の機能特性を維持します。3ヶ月以上経過した培養物は、機能実験には使用されていません。
上記の元のプロトコル7,8からのミクログリア分化の最終段階を最適化するために、100 ng / mLのインターロイキン(IL)-34,7 5 ng / mLのコロニー刺激因子1(M-CSF)10、および50 ng / mLのトランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)をiMG培地に含めました。IL-34とM-CSFは、ミクログリアの運命と生存を維持するのに重要なCSF1受容体依存性経路を刺激し8、TGF-βはミクログリアの恒常性9をサポートし、ミクログリアの運命に対するPMPの関与のためのより生理学的な環境を促進します。注目すべきことに、ここで説明する鑑別プロセス全体は無血清条件下で実行されるため、iMGの挙動に対する血清の影響やダウンストリームアプリケーションの変化を防ぐことができます。iMGの機能実験では、終末分化の10〜12日の間に実験を行うことが推奨されます。iMGは最大14日間培養され、細胞の生存率はわずかに低下し、その後、細胞の健康状態は著しく損なわれます。
ミクログリアの標準的な機能の1つは食作用であるため、 in vitro で食作用活性を調べるためのアッセイがこのプロトコルに含まれていました。ヒト細胞ベースのシステムを開発するために、ヒトi3LMNに由来するシナプトソームが使用されました。シナプトソーム調製物の品質は、本研究におけるシナプスマーカーのウェスタンブロット分析によって評価された。さらに、シナプトソーム調製物の他の構造的および機能的特性は、食作用アッセイの前に電子顕微鏡または免疫染色によって調べることができる。ヒトシナプトソームを得るためにここで説明するプロトコルは、比較的多数のニューロンを生成するi3LMNに大きく依存しています。ただし、ニューロンの収量は、他の分化方法(つまり、低分子のカクテルを必要とするプロトコル)を使用すると低くなる可能性があります。特に、食作用アッセイは、マウス脳由来シナプトソーム、凝集タンパク質、または死細胞などの他の複数の基質を用いて行うことができ、これらはすべてpH感受性色素で標識して、同様の方法で食作用をモニターすることができる。蛍光シグナルは主に、リソソーム21におけるファゴソームプロセシングおよび分解中にシナプトソームが酸区画内に局在するときに放出されるため、pH感受性色素を使用することが提案されている。この特性は、細胞外のシナプトソームからのバックグラウンドシグナルを低減し、自動化された定量法の使用を容易にします。さらに、pH感受性色素は、基質の接着や細胞膜へのドッキングとは対照的に、真の食作用イベントの検出を可能にします。
ここでは、ウェルあたり~35 μgのシナプトソームを使用することが推奨されていますが、最適な条件はiPS細胞株と実験条件に依存するため、ヒトシナプトソームやその他の基質の特定の量を最適化する必要があります。シナプトソームの理想的な範囲は、食作用アッセイにおいて用量反応をもたらすはずである。シナプトソームが多すぎるとシステムが飽和する可能性があり、遺伝子型または治療グループの関数として意味のある違いを検出することが困難になります。材料が少なすぎると、アッセイの出力シグナルが弱くなります。このため、実用的なアッセイを確立するために、各基質の複数の濃度をテストすることをお勧めします。さらに、細胞の健康を維持するために、%DMSOを安全な範囲内に維持することが重要です。
このプロトコルでは、食作用は、細胞の飲み込み能力に関する動態情報を提供するため、生細胞イメージングシステム(材料表)を使用してモニターされました。生細胞イメージングをサポートし、安定した温度、湿度、CO2 濃度を維持できる顕微鏡およびイメージングシステムも、このアッセイに適しています。ここで記載された全ての食作用実験は、85%〜95%の湿度および5%のCO2を用いて37°Cで画像化された。生細胞イメージングが不可能または望ましくない場合、固定細胞のイメージングやフローサイトメトリーなどの他の検出方法を使用して、同じ材料および細胞培養プロトコル(iMGおよび標識シンプトソームの生成まで)を使用して食作用を評価することもできます。同様に、ImageJやCellProfilerなどの他のオープンソースソフトウェアをデータ分析に利用できます。後者は、ここで使用されているソフトウェアに匹敵する自動分析を可能にします。
要約すると、ミクログリア様細胞をヒトiPS細胞から分化させるための堅牢なプロトコルの実装が例示され、したがってヒトミクログリアの限られた資源を克服する。分化ミクログリアは、神経発達疾患および神経変性疾患の研究におけるさまざまな用途に使用できます。さらに、完全に「ヒト化された」食作用アッセイが含まれており、ヒトの発達と疾患の文脈におけるミクログリアの機能と機能障害の研究をさらに支援します。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、運動ニューロン分化用のWTC11 hNIL iPS細胞株を提供してくれたMichael Wardと、ミクログリア分化に使用されるKOLF2.1J WTクローンB03 iPS細胞株を提供してくれたジャクソン研究所に感謝している。また、プロトコルの実施中の支援を提供してくれたドロシー・シェイファー氏、生細胞イメージングシステムを支援してくれたアンソニー・ジャンペトルッツィ氏とジョン・ランダース氏、改訂中の技術的貢献をしてくれたヘイデン・ガッド氏、この研究での協力についてジョナサン・ユング氏にも感謝します。この研究は、UMASSチャン医科大学の神経科学のためのダンとダイアンリッチョ基金とエンジェル基金、Inc.によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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