Summary
Этот протокол описывает процесс дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в микроглиоподобные клетки для экспериментов in vitro . Мы также включили подробную процедуру генерации синаптосом человека из нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC, которые могут быть использованы в качестве субстрата для анализов фагоцитоза in vitro с использованием систем визуализации живых клеток.
Abstract
Микроглии являются резидентными иммунными клетками миелоидного происхождения, которые поддерживают гомеостаз в микроокружении мозга и стали ключевым игроком в многочисленных неврологических заболеваниях. Изучение микроглии человека в здоровье и болезнях представляет собой проблему из-за крайне ограниченного запаса человеческих клеток. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs), полученные от людей, могут быть использованы для обхода этого барьера. Здесь показано, как дифференцировать человеческие ИПСК в микроглиоподобные клетки (iMG) для экспериментов in vitro . Эти iMG демонстрируют ожидаемые и физиологические свойства микроглии, включая микроглиоподобную морфологию, экспрессию надлежащих маркеров и активный фагоцитоз. Кроме того, предоставляется документация по выделению и маркировке субстратов синаптосом, полученных из нижних двигательных нейронов человека, полученных из iPSC (i3LMN). Продольный анализ визуализации живых клеток используется для мониторинга поглощения синаптосом человека, помеченных pH-чувствительным красителем, что позволяет исследовать фагоцитарную способность iMG. Протоколы, описанные в настоящем документе, широко применимы к различным областям, которые исследуют биологию микроглии человека и вклад микроглии в заболевание.
Introduction
Микроглии являются резидентными иммунными клетками в центральной нервной системе (ЦНС) и играют решающую роль в развитии ЦНС. Микроглия также важна в мозге взрослого человека для поддержания гомеостаза и активного реагирования на травмы и болезненные процессы. Кумулятивные данные показывают, что микроглия является ключевым фактором патогенеза множественных заболеваний нервного развития и нейродегенеративных заболеваний 1,2. Хотя современные знания о биологии микроглии были в основном получены из мышиных моделей, недавние исследования выявили важные различия между мышиной и человеческой микроглией, подчеркнув необходимость разработки технологий для изучения генетики и биологических функций микроглии человека 3,4. Выделение микроглии из рассеченной первичной ткани может сильно модифицировать свойства микроглии5, потенциально смешивая результаты, полученные с такими клетками. Общей целью этого метода является дифференциация человеческих ИПСК в иМГ, тем самым обеспечивая систему клеточных культур для изучения микроглии человека в базальных условиях. Кроме того, анализ фагоцитоза с использованием полностью человеческой модельной системы включен в настоящий документ в качестве средства для изучения функциональности iMG, как в качестве меры контроля качества, так и для оценки дисфункции iMG в контексте заболевания.
Множественные протоколы дифференциации микроглии от ИПСК недавно появились в литературе 6,7,8,9,10. Потенциальные недостатки некоторых протоколов включают длительные или длительные периоды дифференциации, добавление нескольких факторов роста и/или сложные экспериментальные процедуры 6,9,10. Здесь продемонстрирован «удобный для пользователя» метод дифференцировки, который повторяет аспекты онтогенеза микроглии путем дифференцировки иПСК в клетки-предшественники, называемые примитивными предшественниками макрофагов (PMP)7,11. PMP генерируются, как описано ранее, с некоторыми оптимизациями, представленными здесь12. PMP имитируют MYB-независимые макрофаги, полученные из желточного мешка, которые порождают микроглию во время эмбрионального развития, вторгаясь в мозг до закрытия гематоэнцефалического барьера13. Чтобы окончательно дифференцировать PMP в iMG, мы использовали быстрый и упрощенный метод монокультуры, основанный на протоколах Haenseler et al. и Brownjohn et al., с некоторыми модификациями для создания эффективного метода дифференциации микроглии, в котором iMG надежно экспрессируют маркеры, обогащенные микроглией 7,8. Этот метод дифференциации может быть воспроизведен в лабораториях, обладающих опытом в культуре иПСК и с исследовательскими целями, направленными на изучение биологии микроглии с использованием системы моделей человека.
Микроглии, полученные из iPSC, представляют собой биологически значимый источник микроглии человека для экспериментов in vitro и являются важным инструментом для исследования канонических функций микроглии, включая фагоцитоз. Микроглии являются профессиональными фагоцитами мозга и ЦНС, где они очищают клеточный мусор, агрегированные белки и деградированный миелин14. Микроглия также функционирует в синаптическом ремоделировании путем поглощения синапсов и в защите от внешних инфекций через фагоцитоз патогенов15,16. В этом протоколе фагоцитоз iMGs оценивается с использованием синаптосом человека в качестве материала для поглощения iMG. С этой целью описано выделение синаптосом, полученных из человеческих i3ЛМН. Синаптосомы человека, полученные из i3LMN, помечены pH-чувствительным красителем, который позволяет количественно определять синаптосомы, локализованные в кислых компартментах во время обработки и деградации фагосом in vitro. Показан анализ фагоцитоза с использованием живоклеточной микроскопии для мониторинга динамического процесса поглощения микроглии в режиме реального времени. Этот функциональный анализ устанавливает основу для исследования возможных дефектов фагоцитоза микроглии в здоровье и болезни с использованием полной системы человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, используемые в этом протоколе, должны быть стерильными, и все этапы должны выполняться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях. Все линии iPSC, а также носители обслуживания и дифференциации описаны в Таблице материалов. Способ дифференцировки микроглии, проиллюстрированный ниже, основан на ранее опубликованных протоколах 7,8,12 с новыми модификациями, описанными в настоящем описании.
1. Дифференциация микроглии
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола кратко изложен на рисунке 1.
- Индуцированная культура плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию, описывающую методы культивирования iPSC, можно найти в другом месте17.- Оттаивание и техническое обслуживание
- Подготовьте iPSC medium, аликвотируйте среду и храните при -20 °C до 6 месяцев. Разморозьте аликвоты на ночь при 4 °C и используйте их до 1 недели. Оставьте среду при температуре окружающей среды не менее чем на 1 ч перед использованием.
- Покрыть колодцы 6-луночной пластины путем добавления 1 мл 10 мкг/мл ламинина 521, разбавленного в DPBS, содержащих кальций и магний18. Храните пластины в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение не менее 2 ч или предпочтительно в течение ночи. После разбавления храните ламинин при 4 °C в течение 3 месяцев.
- Готовят 10 мМ ингибитора роназы Y27632 (ингибитор ROCK) стоковым раствором путем разведения в стерильной воде. Делают одноразовые аликвоты раствора ингибитора ROCK и хранят их при -20 °C до 1 года.
- Готовят 0,5 мМ ЭДТА путем разбавления исходного раствора 0,5 М ЭДТА в ДПБС.
- Чтобы разморозить флакон замороженных ИПСК, поместите флакон на водяную баню при 37 °C, пока он не будет в основном разморожен. Немедленно перенесите содержимое флакона в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл iPSC-среды. Центрифуга при 500 × г в течение 1 мин.
- Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки, добавляя 1 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, медленно к стенке трубки, чтобы избежать нарушения колоний.
- Добавьте 1,5 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, в каждую из покрытых скважин и перенесите по каплям восстановленные колонии в скважины, содержащие среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-7 капель из шага 1.1.1.6 для поддержания культуры, но отрегулируйте оптимальную плотность посева для каждой линии iPSC. - Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и назад спереди. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. На следующий день полностью замените среду, добавив свежую среду iPSC без ингибитора ROCK.
- Для поддержания меняйте среду каждый день, пока клетки не достигнут 80% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут поддерживаться без изменения среды в течение 2 дней, если используемая среда iPSC позволяет гибкий график кормления. Рекомендуется ограничить это до одного раза за проход и только в том случае, если клетки менее 50% сливаются.
- Расщепление
- Аспирировать среду и промыть клетки 1 мл DPBS (без кальция и магния).
- Чтобы выбить клетки, добавляют 1 мл 0,5 мМ ЭДТА и инкубируют в течение 2-3 мин при комнатной температуре до тех пор, пока края клеточных колоний не поднимутся с поверхности лунки. Снова промыть клетки DPBS и добавить 1 мл iPSC среды.
- Диссоциируйте клеточные колонии, осторожно соскребая их с помощью клеточного лифтера. Соскребайте каждый участок колодца только один раз, чтобы не беспокоить колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные методы вытеснения колоний из колодца можно найти в другом месте17. - Используя наконечник пипетки объемом 1 мл, соберите ячейки и перенесите их капля за каплей в соотношении 1:6 (ячейки к среде) в предварительно покрытые лунки (как упоминалось на этапе 1.1.1.2), содержащие 1,5 мл среды iPSC.
- Оттаивание и техническое обслуживание
- Дифференцировка iPSC в микроглиоподобные клетки (iMG)
ПРИМЕЧАНИЕ: Малые молекулы и факторы роста растворяются в стерильно-фильтрованном 0,1% бычьем сывороточном альбумине в DPBS до концентрации запаса в 1000 раз выше конечной концентрации. Рекомендуется дифференцировать ИПСК в иМГ во время ранних проходов. Рекомендуется регулярное кариотипирование линий iPSC.- Приготовьте стандартный раствор для покрытия
- Разморозьте исходный раствор реагента для покрытия внеклеточного матрикса на льду при 4 °C в течение ночи.
- Трубки для микроцентрифуг Prechill и наконечники фильтрующих пипеток при 4 °C.
- Aliquot 250 мкл концентрированного экстраклеточного реагента покрытия внеклеточного матрикса вводят в каждую трубку и сразу же помещают на лед. Храните аликвоты при -20 °C.
- Для приготовления раствора покрытия разморозьте один из экстраклеточных матриксов покрытия реагентом аликот на льду при 4 °C в течение ночи.
- Добавьте 50 мл ледяной среды DMEM-F12, оптимизированной для роста эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (называемых DMEM-F12), в предварительно охлажденную коническую трубку и удерживайте ее на льду.
- Охладите наконечник пипетки объемом 1 мл, несколько раз пипетируя холодный DMEM-F12 вверх и вниз, а затем немедленно используйте наконечник пипетки для переноса 250 мкл реагента внеклеточного матричного покрытия в коническую трубку, содержащую среду DMEM-F12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный раствор для покрытия можно хранить в течение 2 недель при температуре 4 °C.
- Формирование эмбриоидного тела (EB)
- Приготовьте EB среду , которую можно поддерживать при 4 °C в течение 4 дней.
- Как только ИПСК достигнут 80% конфюентности, диссоциируют колонии путем промывки 1 мл DPBS и добавления 1 мл диссоциационного реагента в течение 2 мин при 37 °C. Вытесняйте колонии с помощью клеточного лифтера, соскребая несколько раз, чтобы создать одноклеточную суспензию. Соберите клетки и переложите все в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DPBS.
- Центрифугируют клетки при 500 × г в течение 1 мин, удаляют супернатант и повторно суспендируют клетки в 1 мл среды EB. Взять 10 мкл клеток и разбавить 1:1 трипаном синего. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и, основываясь на количестве клеток, разбавьте клеточный запас до окончательного разбавления 10 000 клеток на 100 мкл. Для гальванических ячеек добавьте 100 мкл разбавленных ячеек на скважину в пластину с низким адгезией с круглым дном, 96 лунками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 48 скважин из 96-луночной плиты могут быть получены из каждой 80% сливающейся скважины иПСК. - Центрифугируют пластину при 125 × г в течение 3 мин и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 4 дней. Выполните половинную смену среды на 2-й день, используя многоканальную пипетку и осторожно собрав 50 мкл старой среды, а затем добавив обратно 50 мкл свежей среды EB.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 4-й день иПСК образуют сферические клеточные структуры, называемые ЭБ, как описано в разделе результатов. Процесс дифференцировки EB при необходимости может быть продлен до 7 дней.
- Генерация примитивных предшественников макрофагов (PMP)
- Подготовьте базовую среду PMP, стерильно-фильтрующую, и храните ее при температуре 4 °C до 1 месяца.
- Покрывают колодцы 6-луночной пластиной, добавляя 1 мл ледяного раствора матригеля и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение по меньшей мере 2 ч или предпочтительно в течение ночи.
- На 4-й день дифференциации EB перенесите ЭБ в скважины, покрытые матригелем, собрав ЭБ с помощью наконечников пипетки объемом 1 мл (с использованием пипетки). Пипетка вверх и вниз один или два раза, чтобы выбить ЭБ из колодца. Держите плиту с 6 скважинами под наклонным углом, чтобы ЭБ располагались на краю скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Девять или десять ЭБ могут быть покрыты на одно хорошо покрытое покрытие. - После того, как все ЭБ успокоятся, аккуратно пипетку и удалите старую среду, используя наконечник пипетки 1 мл, сохраняя ЭБ на краю колодца. Добавьте в каждую лунку 3 мл свежеприготовленной полноценной среды ПМП . Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и назад спереди. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
- Не беспокоить пластину в течение 7 дней, чтобы позволить ЭБ прикрепиться к дну колодца. По истечении этого времени выполните половинное изменение среды, используя полную среду PMP.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе большинство ЭБ должны быть прикреплены к пластине. Любые плавающие ЭБ могут быть удалены. - Через 5-7 дней осмотрите ЭБ под световым полевым микроскопом с 4-кратным увеличением, чтобы убедиться, что они прикреплены к дну скважин. Изменить среду, как описано в пункте 1.2.3.5. На 21-й день выполните полную смену среды с 3 мл полной среды PMP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Миелоидные предшественники, плавающие в среде, могут быть очевидны в этот момент. Эти клетки должны быть выброшены во время изменения среды. - На 28-й день найдите в супернатанте круглые ячейки, называемые PMP, и соберите среду, содержащую PMP, используя пипетку объемом 10 мл и автоматический пипеттор. Позаботьтесь о том, чтобы не беспокоить ЭБ. Перенесите PMP и среду в коническую трубку объемом 15 мл и действуйте в соответствии с описанием, описанным на этапе 1.2.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно PMP из одной и той же линии iPSC могут быть собраны из пяти скважин 6-луночной плиты и объединены вместе в одну коническую трубу объемом 15 мл. - Добавьте 3 мл свежей полноценной среды PMP для дальнейшего поддержания ЭБ. Поскольку PMP непрерывно появляются из ЭБ в течение более 3 месяцев, собирайте их каждые 4-7 дней (не позволяйте среде изменять цвет на желтый тон), как описано в шагах 1.2.3.7 и 1.2.3.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя PMP могут собираться в течение нескольких месяцев, они могут со временем менять свой фенотип.
- Дифференциация по iMG
- Подготовьте базовый носитель iMG (Таблица материалов), стерильный фильтр и храните при 4 °C до 3 недель.
- После того, как PMP были собраны в коническую трубку объемом 15 мл, центрифугируйте их при 200 × г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать PMP, используя 1-2 мл базальной среды iMG. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, взяв небольшую аликвоту и разбавляя 1:1 трипановым синим.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,5-1,5 × 106 PMP обычно получают каждую неделю в зависимости от линии iPSC и возраста культуры EB. - Центрифугируют остальные клетки снова при 200 × г в течение 4 мин. Разбавьте PMP до желаемой концентрации таким образом, чтобы клетки покрывались плотностью ~105/см2 на обработанных клеточными культурами пластинах с использованием свежеприготовленной полной среды iMG. Выполняйте половинную смену среды, используя свежеприготовленную полную среду iMG каждые 3-4 дня в течение 10-12 дней, чтобы обеспечить терминальную дифференциацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент клетки должны приобрести микроглиоподобную морфологию. Чтобы подтвердить приверженность PMP судьбе микроглии, проводится иммунофлуоресцентный анализ для подтверждения экспрессии обогащенных микроглией маркеров, таких как пуринергический рецептор P2RY12 и трансмембранный белок 119 (TMEM119)9. - Чтобы сохранить здоровье и жизнеспособность клеток, выполните все эксперименты между 10 и 12 днями дифференцировки iMG.
- Приготовьте стандартный раствор для покрытия
2. Анализ фагоцитоза с использованием синаптосом человека, полученных из моторных нейронов
- Транскрипционный фактор-опосредованная дифференцировка нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC (i3ЛМН)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процесса дифференцировки использовалась линия WTC11 со стабильной вставкой индуцируемого hNIL-фактора транскрипционного фактора, содержащего нейрогенин-2 (NGN2), островок-1 (ISL1) и факторы транскрипции LIM homeobox 3 (LHX3), в локус безопасной гавани CLYBL, как описано ранее.17. Линия iPSC поддерживалась, как описано на этапе 1.1.1, но с условиями покрытия, описанными на этапе 1.2.1. Любой реагент покрытия внеклеточного матрикса может быть использован для культивирования иПСК, которые будут использоваться для дифференцировки нейронов, поскольку ламинин 521 не требуется. Все среды уравновешиваются до температуры окружающей среды в течение не менее 1 ч перед использованием.- Покрыть 10 см посуду 5 мл стандартного раствора покрытия, как описано на этапе 1.2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались 3-4 блюда по 10 см за дифференциацию. - Подготовьте среду Induction Base, стерильный фильтр, и храните при 4 °C до 3 недель.
- Приготовьте среду Neuron, стерильно-фильтруйте, и храните ее при 4 °C до 2 недель.
- Приготовьте боратный буфер, смешав 100 мМ борной кислоты, 25 мМ тетрабората натрия и 75 мМ хлорида натрия в стерильной воде. Отрегулируйте рН до 8,5 и стерильно отфильтруйте его.
- Как только иПСК достигнут 80% слияния, промывайте клетки с DPBS и вытесняйте колонии, добавляя 0,5 мМ ЭДТА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого 10-сантиметрового блюда обычно достаточно двух лунок. - Инкубировать клетки в течение 4-5 мин при температуре окружающей среды. Удалите ЭДТА и добавьте 3 мл DMEM/F12 с HEPES в каждую лунку.
- Соскоблите ячейки с помощью подъемника и используйте пипетку 10 мл, чтобы удалить ячейки со дна колодца, осторожно пипетируя вверх и вниз 2-3x.
- Соберите клетки в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу по 300 × г в течение 3 мин.
- Повторно суспендируют клетки в 3 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, и подсчитывают их с помощью гемацитометра.
- Пластина 1,5 × 106 iPSCs в предварительно покрытой 10 см посуде с 12 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ.
- На следующий день удалите среду и промыть клетки DPBS. Добавьте 12 мл свежеприготовленной среды Complete Induction , чтобы индуцировать экспрессию факторов транскрипции.
- На 2-й день обмазать 10 см посуду 5 мл раствора для покрытия нейронов, приготовленного с равными объемами 0,1 мг/мл поли-D-лизина и 1 мг/мл поли-L-орнитина, разведенного в боратном буфере. Инкубировать в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
- На 3-й день вымойте покрытую оболочкой посуду стерильной водой 3x, полностью аспирируйте воду и дайте посуде высохнуть, наклонив тарелки и оставив их частично непокрытыми внутри шкафа биобезопасности в течение не менее 1 ч при температуре окружающей среды.
- После того, как блюда полностью высохнут, покройте их 6 мл полной индукционной среды , дополненной 15 мкг/мл ламинина и 40 мкМ BrdU в течение не менее 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение BrdU рекомендуется для устранения митотически активных клеток и, таким образом, для повышения чистоты нейронных культур. Влияние BrdU на здоровье нейронов минимально. - Обработать дифференцирующие клетки 3 мл диссоциационного реагента на чашку 10 см и инкубировать в течение 3-4 мин при температуре окружающей среды.
- Добавьте 6 мл DPBS в пластину, не удаляя диссоциационный реагент, и пипетку клеток в растворе вверх и вниз 4-5x с пипеткой 10 мл для диссоциации клеток.
- Соберите клеточную суспензию и пропустите ее через клеточный ситечко 40 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1 мл индукционной базовой среды для промывки ситечка.
- Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать среду и повторно суспендировать клетки в 3 мл полной индукционной среды , содержащей 40 мкМ BrdU.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Пластину приблизительно 2,5 × 106 ячеек на чашку размером 10 см в предварительно покрытую посуду путем разбавления клеток в 6 мл полной индукционной среды , содержащей 40 мкМ BrdU, без удаления раствора покрытия, добавленного на стадии 2.1.14.
- На 4-й день аспирируйте среду, промывайте клетки 1 раз DPBS и добавляйте свежую среду Complete Induction , содержащую 40 мкМ BrdU.
- На 6-й день аспирируйте среду, промывайте клетки 1 раз DPBS и добавляйте среду Neuron , дополненную 1 мкг/мл ламинина.
- На 9-й день измените 1/3-ю часть среды, заменив ее свежей средой Neuron , дополненной 1 мкг/мл ламинина.
- Поддерживайтеi 3ЛМН в течение дополнительных 25 дней, выполняя половинные изменения среды с нейронной средой , дополненной свежим 1 мкг / мл ламинина каждые 3-4 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент времени i3ЛМН должны представлять морфологию нейронов с длительными процессами. Нейроны также имеют тенденцию образовывать скопления или скопления клеток. Более подробное описание того, как проверить дифференциацию i 3 ЛМН,можно найти в другом месте17.
- Покрыть 10 см посуду 5 мл стандартного раствора покрытия, как описано на этапе 1.2.1.
- Очистка и маркировка синаптосом
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильные условия и выполняйте все шаги внутри шкафа биобезопасности.- Мойтеi 3 ЛМН дважды с DPBS.
- Добавьте 2 мл ледяного клеточного лизиса реагента для выделения синаптосом, инкубируйте на льду в течение 2 мин и плотно соскоблите нейроны.
- Переложите лизат на несколько микротрубок по 2 мл (~1,5 мл лизата на пробирку) и центрифугу при 1 200 × г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте трубки на льду на протяжении всей этой процедуры. - Собрать супернатант (отбросить гранулу) и центрифугу при 15 000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Сохраните и повторно суспендируйте гранулы, содержащие синаптосомы с аналогичным объемом (как и исходный лизат) 5% DMSO в DPBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синаптосомы могут быть немедленно помечены флуорофором или сохранены при -80 °C для будущего использования. - Выполните анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA) для всех трубок, чтобы оценить общий выход белка в препарате синаптосомы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения концентрации белка могут быть использованы другие анализы. Общий выход белка, полученного из различных препаратов, был включен в таблицу 1 в качестве эталона. Рекомендуется проводить вестерн-блоттинговый анализ препарата синаптосом для подтверждения наличия пресинаптических и постсинаптических белков. Здесь пресинаптический маркер, синаптофизин (SYP), и постсинаптический маркер, постсинаптический белок плотности 95 (PSD95), были выбраны для анализа вестерн-блоттинга, как описано ранее19. - Приготовьте раствор бикарбоната натрия 100 мМ в воде, отрегулируйте рН до 8,5 и стерильно-фильтруйте.
- Солюбилизируйте 1 мг лиофилизированного порошка используемого рН-чувствительного красителя в 150 мкл ДМСО. Сделайте одноразовые аликвоты и храните их при -80 °C.
- Центрифугируют синаптосомы при 15 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Разводят до 1 мг синаптосом в 100 мкл раствора бикарбоната натрия 100 мМ.
- Чтобы маркировать синаптосомы, добавляют 1 мкл восстановленного pH-чувствительного красителя на 1 мг синаптосом и покрывают реакцию алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. Встряхните при комнатной температуре в течение 2 ч с помощью шейкера для трубок.
- Добавьте в пробирку 1 мл DPBS и центрифугируйте меченые синаптосомы при 15 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите супернатант и выполните четыре дополнительные промывки, как описано в шаге 2.2.11.
- После окончательной промывки и отжима удалите супернатант как можно больше, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте меченые синаптосомы с 5% DMSO в DPBS в объеме для желаемой концентрации (здесь используется 0,7 мкг/мкл). Приготовьте одноразовые аликвоты и храните при -80 °C. Обязательно избегайте воздействия света на меченые синаптосомы.
- Анализ фагоцитоза живых клеток
- Пластина 20-30 × 104 PMP в 96-луночные пластины в 100 мкл полной среды iMG и следовать процессу дифференцировки в течение 10 дней, как указано на этапе 1.2.4.
- В день анализа готовят раствор для ядерного окрашивания, добавляя 1 каплю ядерного пятна для живых клеток в 2 мл базальной среды iMG.
- Удалите 40 мкл среды на лунку 96-луночной пластины и добавьте 10 мкл раствора для ядерного окрашивания с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать пластину при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 ч.
- Разморозьте меченые синаптосомы на льду и аккуратно нанесите ультразвук с помощью водяного ультразвука в течение 1 мин. Немедленно перенесите синаптосомы обратно в лед. Разбавляют меченые синаптосомы в полной среде iMG в соотношении 1 мкл синаптосом на 50 мкл среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация синаптосом зависит от анализа и может потребовать оптимизации. Для поддержания относительно низкого процента (т.е. 0,1% или менее) ДМСО в среде рекомендуется не добавлять более 2 мкл синаптосом на лунку. - В качестве отрицательного контроля предварительно обработайте некоторые скважины цитохалазином D для ингибирования полимеризации актина и, следовательно, фагоцитоза. Готовят раствор 60 мкМ цитохалазина D в полной среде iMG. Добавляют 10 мкл этого раствора в каждую лунку для конечной концентрации 10 мкМ и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 30 мин.
- Выньте пластину из инкубатора и инкубируйте при 10 °C в течение 10 мин. Выдержите пластину на льду и добавьте 50 мкл среды, содержащей синаптосомы, приготовленные, как описано на этапе 2.3.4.
- Центрифугируйте пластину при 270 × г в течение 3 мин при 10 °C и держите пластину на льду до получения изображения.
- Получение и анализ изображений
- Вставьте пластину в считыватель изображений живых клеток и выберите скважины для анализа.
- Выберите объектив 20x .
- Отрегулируйте фокусировку, интенсивность светодиодов (LED), время интеграции и усиление яркого поля и синего (4',6-диамидино-2-фенилиндол [DAPI]) каналов. Флуоресценция синаптосом должна быть незначительной в начальной точке времени. Чтобы сфокусироваться на красном (RFP) канале, используйте канал яркого поля в качестве эталона. Время интеграции и коэффициент усиления могут варьироваться в зависимости от эксперимента; используйте следующие начальные настройки для красного канала: LED: 4, время интеграции: 250 и коэффициент усиления: 5.
- Выберите количество отдельных плиток, которые будут приобретены при монтаже на скважину (приобретите 16 плиток в центре скважины, тем самым получив визуализацию примерно 5% от общей площади скважины). Установите температуру на 37 °C и требуемый интервал времени для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены каждые 1 - 2 ч в течение 16 ч в этом исследовании. - Откройте программное обеспечение для анализа.
- Откройте эксперимент, содержащий изображения. Щелкните значок Сокращение данных.
- В меню выберите Imaging Stitching в разделе Обработка изображений , чтобы создать полное изображение из 4 x 4 отдельных плиток в монтаже с параметрами, описанными в таблице 2.
- После создания сшитых изображений определите порог интенсивности , используя каналы DAPI и RFP для этих изображений. Откройте изображение и нажмите « Анализировать»; в разделе Анализ выберите Клеточный анализ, а в разделе Канал обнаружения выберите сшитое изображение в каналах DAPI или RFP. Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и установите пороговое значение и значения размера объекта , которые правильно выбирают ядра ячеек в канале DAPI или сигнал синаптосомы в канале RFP. Повторяйте процесс с различными изображениями до тех пор, пока не будут оптимизированы параметры, которые могут быть применены ко всему эксперименту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые значения приведены в таблице 2. - Чтобы подсчитать количество ядер, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ изображений» выберите «Клеточный анализ». Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите сшитые изображения DAPI и используйте параметры, описанные в таблице 2.
- Перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Количество ячеек. Чтобы получить площадь сигнала синаптосомы, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ» выберите «Клеточный анализ».
- Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите Сшитые изображения RFP и используйте параметры, описанные в таблице 2.
- Перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Область суммы объектов. На вкладке Data Reduction нажмите OK и позвольте программному обеспечению проанализировать все полученные изображения.
- Экспортируйте значения «Площадь суммы объектов» и «Количество ячеек» для каждой точки времени. Разделите площадь суммы объектов на количество ячеек, чтобы вычислить нормализованную площадь за точку времени. При сравнении нескольких методов лечения или генотипов рассчитайте индекс фагоцитоза, используя уравнение (1):
(1) - Сохраните результаты и интегрируйте данные.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для генерации iMG с использованием этого протокола важно начать с недифференцированных iPSCs, которые показывают компактную колониальную морфологию с четко определенными ребрами (рисунок 2A). Диссоциированные ИПСК, поддерживаемые, как описано в разделе формирования ЭБ, будут образовывать сферические агрегаты, называемые ЭБ, которые будут расти в размерах до 4-го дня дифференциации (рисунок 2В). Как только ЭБ собираются и покрываются в соответствующих условиях для генерации PMP, они прикрепляются к пластинам, покрытым Матригелем, и слой клеток будет распространяться и окружать сферические агрегаты (рисунок 2C). Нездоровые ЭБ отсоединяются от тарелки и должны быть устранены. С 14 по 21 день генерации ПМП могут появляться потенциально различные типы клеток, которые будут плавать в среде; эти клетки должны быть выброшены во время изменениясреды 12. На 28-й день круглые клетки с большим соотношением цитоплазмы к ядру появятся в суспензии (рисунок 2D), называемой PMP. Эти клетки производятся непрерывно и могут собираться еженедельно во время средних изменений в течение 3 месяцев. Количество PMP, собираемых каждую неделю, варьируется и зависит от линии iPSC и возраста культуры; урожайность обычно снижается со временем. Настоятельно рекомендуется культивировать ИПСК в пластинах с покрытием ламинин 521 вместо Матригеля, так как выход PMP выше, когда ИПСК поддерживаются в прежних условиях, о которых сообщалось ранее и в данном исследовании (рисунок 2E)18.
После того, как PMP подвергались воздействию среды iMG в течение 10-12 дней, клетки приобретают микроглиоподобную морфологию с небольшой цитоплазмой и наличием удлиненных отростков (рисунок 3A). Чтобы проверить идентичность микроглии, мы выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против миелоидного маркера ионизированной молекулы кальций-связывающего адаптера 1 (IBA1) и обогащенных микроглией маркеров пуринергического рецептора P2RY12 и трансмембранного белка 119 (TMEM119), как описано ранее20 (см. также Таблицу материалов). Как правило, >95% клеток экспрессируют IBA1 и примерно 90% клеток экспрессируют P2RY12 и TMEM119 (рисунок 3B).
Для оценки фагоцитарной способности iMG использовали i3синаптосомы человека, полученные из LMN, помеченные pH-чувствительным красителем. Чтобы убедиться, что препарат синаптосом сохраняет канонические структурные свойства, обогащение пресинаптического маркера, синаптофизина (SYP), и постсинаптического маркера, белка постсинаптической плотности 95 (PSD95)19 , было подтверждено анализом вестерн-блоттинга (рисунок 4), выполненным, как описано до20 (см. также Таблицу материалов). ). Синаптосомы, помеченные pH-чувствительным красителем, становятся флуоресцентными после поглощения iMG и после того, как они локализованы во внутриклеточных кислых (т.е. с низким рН) отсеках.
В начальный момент времени красный флуоресцентный сигнал был минимальным, так как большинство синаптосом еще не были фагоцитозированы. Через 30 минут был обнаружен красный флуоресцентный сигнал, который со временем еще больше увеличился. Через 10 ч красный флуоресцентный сигнал был устойчивым, так как большинство синаптосом были поглощены и локализованы в кислых внутриклеточных компартментах посредством процесса фагоцитоза (рисунок 5А). Цитохалазин D является ингибитором полимеризации актина, широко используемым для блокирования фагоцитоза. Как и ожидалось, мы наблюдали сильное снижение красного флуоресцентного сигнала в iMG, обработанных цитохалазином D, что указывает на то, что обнаруженный сигнал является результатом фагоцитарных событий. Мы также заметили, что iMG показывают изменения в морфологии после 10 ч фагоцитоза, которые не были обнаружены в iMG, обработанных цитохалазином D, возможно, из-за отсутствия ремоделирования актина в iMG, обработанных цитохалазином D. Изменения морфологии микроглии обычно связаны со статусом активации2.
Используя описанный метод автоматизированной количественной оценки, мы измерили общую площадь красного сигнала в каждой точке времени и нормализовали ее до числа клеток, полученных путем подсчета ядер. Результаты показывают, что площадь поглощенных синаптосом увеличивалась со временем, пока плато не было достигнуто через 16 ч. Как и ожидалось, площадь красного сигнала от клеток, обработанных цитохалазином D, со временем не увеличивалась, так как фагоцитоз ингибировался (рисунок 5В). Вместе эти результаты показывают, что iMG способны фагоцитировать материал, связанный с заболеванием мозга, и подходят для функциональных исследований.
Рисунок 1: Схема протокола для дифференциации ИПСК в микроглиоподобные клетки. На 0-й день, как только иПСК достигают 80% слияния, колонии диссоциируют на отдельные клетки и культивируют в среде EB, чтобы индуцировать образование EB. На 4-й день ЭБ собираются и покрываются в среде PMP, чтобы вызвать генерацию PMP. Через 28 дней PMP собираются и окончательно дифференцируются в iMG с помощью среды iMG. PMP можно собирать еженедельно в течение 3 месяцев. Сокращения: iPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; iMGs = микроглиоподобные клетки; EB = эмбриоидное тело; PMP = примитивный предшественник макрофагов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфология клеток, оцениваемая с помощью световой микроскопии на этапах дифференцировки от ИПСК к PMP. (А) ИПСК поддерживаются в среде иПСК до 80% слияния. (B) Эмбриоидное тело после 4 дней дифференцировки в среде EB. (C) ЭБ, прикрепленные к пластинам с покрытием, и (D) PMP, образующиеся в виде суспензии из ЭБ после 28 дней культивирования в среде PMP. (E) Количество PMP, собранных с ~48 EB на неделе 1 (после 28 дней дифференциации PMP) и неделе 12. Гистограммы показывают среднее значение шести независимых дифференциаций (точек данных) от двух разных линий iPSC. Статистические данные были получены с помощью двустороннего теста ANOVA и Šídák. Шкала стержней = 1 000 мкм (A), 400 мкм (B-D). Сокращения: iPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; iMGs = микроглиоподобные клетки; EB = эмбриоидное тело; PMP = примитивный предшественник макрофагов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: iMG, дифференцированные по этому протоколу, демонстрируют добросовестные характеристики микроглии после 10 дней терминальной дифференциации. (A) Репрезентативное изображение яркого поля iMG, представляющее морфологию, подобную микроглии. Шкала bar= 400 мкм. (B) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения iMG, экспрессирующие миелоидные/микроглиевые маркеры IBA1, P2RY12 и TMEM119. Шкала стержней = 400 мкм (A), 50 мкм (B). Сокращения: iMGs = микроглиоподобные клетки; IBA1 = ионизированная молекула кальций-связывающего адаптера 1; P2RY12 = пуринергический рецептор P2RY12; TMEM119 = трансмембранный белок 119; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: i3Синаптосомы человека, полученные из LMN, экспрессируют синаптические маркеры с помощью анализа вестерн-блоттинга. Репрезентативный вестерн-блот-анализ препарата синаптосом человека, полученного из i3LMN после 28 дней культивирования, исследуемого постсинаптическим маркером PSD95, пресинаптическим маркером, SYP и β-тубулином. Сокращения: i3LMN = iPSC-производные нижние двигательные нейроны; PSD95 = белок постсинаптической плотности 95; SYP = синаптофизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ фагоцитоза iMG с использованием синаптосом человека, помеченных pH-чувствительным красителем и контролируемых продольной визуализацией живых клеток. (A) Репрезентативные яркильные и флуоресцентные монтажи iMG с ядерным окрашиванием (синий канал) подвергаются воздействию меченых синаптосом человека (красный канал) с обработкой цитодом и без нее в указанные моменты времени. Монтажи были созданы путем послепродажной обработки 16 плиток, приобретенных в 20 раз. Шкала баров = 400 мкм. (B) Количественная оценка площади синаптосомы флуоресцентного сигнала, нормализованного до номера ячейки. Точки данных указывают на средний ± SEM трех технических реплик. Каждая кривая показывает количественную оценку для двух независимых дифференциаций (iMG 1 и 2) от одной линии iPSC с лечением цитодом и без него. Сокращения: iMGs = микроглиоподобные клетки; cytoD = цитохалазин D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Количество блюд 10 см DIF28 i3LMN | Общий белок (мкг) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Таблица 1: Общий выход белка после выделения синаптосом из низкомоторных нейронов, полученных из iPSC, через 28 дней дифференцировки. Общее количество белка, полученное из четырех независимых дифференцировок после извлечения синаптосом. В каждой дифференциации были собраны различные количества блюд размером 10 см, содержащих i3LMN. Выход белка измеряли с помощью анализа белка BCA. Сокращения: iPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; i3LMN = нижние двигательные нейроны, полученные из iPSC; DIF28 = 28 дней дифференциации; BCA = бицинхониновая кислота.
| Параметры | Ценность |
| Канал регистрации | Яркое поле, DAPI и RFP |
| Метод синтеза | Линейное смешивание |
| Обрезка сшитого изображения для удаления черных прямоугольников на границах | Проверенный |
| Уменьшенное окончательное изображение | Проверенный |
| Параметры | Ценность |
| Порог | Определяется пользователем |
| Фон | Темный |
| Разделение соприкасающихся объектов | Проверенный |
| Заполнение отверстий в масках | Проверенный |
| Минимальный размер объекта | 7 мкм |
| Максимальный размер объекта | 30 мкм |
| Включение основных краевых объектов | Проверенный |
| Анализ всего изображения | Проверенный |
| Параметры | Ценность |
| Порог | Определяется пользователем |
| Фон | Темный |
| Разделение соприкасающихся объектов | Проверенный |
| Заполнение отверстий в масках | Проверенный |
| Минимальный размер объекта | 5 мкм |
| Максимальный размер объекта | 100 мкм |
| Включение основных краевых объектов | Проверенный |
| Анализ всего изображения | Проверенный |
Таблица 2: Параметры, используемые для получения изображений и анализа данных. Перечислены предлагаемые параметры, которые следует учитывать для получения изображений во время анализа фагоцитоза и для анализа полученных изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол дифференцировки, описанный здесь, обеспечивает эффективный метод получения микроглиоподобных клеток, полученных из iPSC, за ~ 6-8 недель с высокой чистотой и с достаточным выходом для проведения экспериментов по иммунофлуоресценции и других анализов, требующих большего количества клеток. Этот протокол дал до 1 × 106 iMG за 1 неделю, что позволяет экстракцию белка и РНК и соответствующие последующие анализы (например, RNASeq, qRT-PCR, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрию). Тем не менее, ограничение этого протокола заключается в том, что доходность iMG может ограничивать определенные приложения. Дополнительные модификации могут быть реализованы для накопления PMP из разных недель и поддержания однородной культуры в суспензии до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество прародителей для продолжения процесса дифференциации сразу18. В качестве альтернативы дифференциация ЭБ может быть расширена за счет использования пластин клеточных культур более высокой площади для увеличения производства PMP.
Рекомендуется использовать IPSCs, культивируемые в пластинах с покрытием laminin 521, чтобы инициировать процесс дифференцировки. Другие реагенты для покрытий могут уменьшить количество PMP, производимых позже в процессе18. Аналогичным образом, покрытие пластин для адгезии EB во время генерации PMP улучшает прикрепление EB, тем самым продлевая срок службы культуры. Культура EB сохраняется до 4 месяцев, после чего несколько ЭБ отделяются и умирают. Тем не менее, другие исследователи сообщают о культивировании ЭБ на срок до 1 года12. В наших руках iMG, созданные из 3-месячных культур EB, сохраняют те же функциональные свойства, что и iMG, отличающиеся от молодых культур; культуры старше 3 месяцев не использовались для функциональных экспериментов.
Для оптимизации заключительной стадии дифференциации микроглии от оригинальных протоколов, описанных выше 7,8, мы включили 100 нг/мл интерлейкина (IL)-34,7 5 нг/мл фактора стимуляции колонии 1 (M-CSF)10 и 50 нг/мл трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β) в iMG-среду. IL-34 и M-CSF стимулируют рецептор-зависимые пути CSF1, которые имеют решающее значение для поддержания судьбы и выживания микроглии8, в то время как TGF-β поддерживает гомеостаз микроглии9, тем самым способствуя более физиологической среде для приверженности PMP судьбе микроглии. Следует отметить, что весь процесс дифференцировки, описанный здесь, выполняется в условиях, свободных от сыворотки, что предотвращает возможное воздействие сыворотки на поведение iMG и изменения в последующих приложениях. Для функциональных экспериментов с iMG рекомендуется проводить эксперименты между 10 и 12 днями терминальной дифференцировки. iMG культивировали в течение 14 дней с умеренным снижением жизнеспособности клеток, после чего здоровье клеток значительно ухудшается.
Поскольку одной из канонических функций микроглии является фагоцитоз, в этот протокол был включен анализ для исследования фагоцитарной активности in vitro . Для разработки системы на основе человеческих клеток использовались синаптосомы, полученные из человеческих i3ЛМН. Качество препарата синаптосом оценивалось с помощью западного блот-анализа синаптических маркеров в этом исследовании. Кроме того, другие структурные и функциональные свойства препарата синаптосом могут быть исследованы с помощью электронной микроскопии или иммуноокрашивания перед анализом фагоцитоза. Протокол, описанный здесь для получения человеческих синаптосом, в значительной степени зависит от i3LMN, которые дают относительно большое количество нейронов. Тем не менее, выход нейронов, вероятно, будет ниже при использовании других методов дифференцировки (то есть протоколов, требующих коктейлей из малых молекул). Примечательно, что анализ фагоцитоза может быть выполнен с несколькими другими субстратами, такими как синаптосомы, полученные из мозга мыши, агрегированные белки или мертвые клетки, все из которых могут быть помечены pH-чувствительными красителями для мониторинга фагоцитоза аналогичным образом. Предлагается использовать pH-чувствительные красители, поскольку флуоресцентный сигнал в основном излучается, когда синаптосомы локализованы в кислотных компартментах во время обработки фагосом и деградации в лизосомах21. Это свойство уменьшает фоновый сигнал от синаптосом вне клеток и облегчает использование автоматизированных методов количественной оценки. Кроме того, pH-чувствительные красители позволяют обнаруживать истинные события фагоцитоза, в отличие от прилипания к субстрату или стыковки с клеточной мембраной.
Хотя в настоящем описании предлагается использовать ~35 мкг синаптосом на лунку, удельное количество синаптосом человека и других субстратов должно быть оптимизировано, так как оптимальные условия зависят от линии iPSC и условий эксперимента. Идеальный диапазон синаптосом должен привести к дозе-ответу в анализе фагоцитоза. Слишком много синаптосом может насытить систему, что затрудняет обнаружение значимых различий в зависимости от генотипа или группы лечения. Слишком мало материала приведет к слабому выходному сигналу в анализе. По этой причине рекомендуется тестировать несколько концентраций каждого субстрата, чтобы установить рабочий анализ. Кроме того, важно поддерживать % DMSO в безопасном диапазоне для сохранения здоровья клеток.
В этом протоколе фагоцитоз контролировали с помощью системы визуализации живых клеток (Таблица материалов), поскольку она предоставляет кинетическую информацию о способности поглощения клеток. Микроскопы и системы визуализации, которые могут поддерживать визуализацию живых клеток и поддерживать стабильную температуру, влажность и концентрации CO2 , также подходят для этого анализа. Все описанные здесь эксперименты с фагоцитозом были сфотографированы при 37 °C с влажностью 85%-95% и 5% CO2. Другие методы обнаружения, такие как визуализация фиксированных клеток или проточная цитометрия, также могут быть использованы для оценки фагоцитоза с использованием тех же материалов и протоколов клеточной культуры (вплоть до генерации iMG и меченых синптосом), когда визуализация живых клеток невозможна или желательна. Аналогичным образом, для анализа данных может использоваться другое программное обеспечение с открытым исходным кодом, такое как ImageJ или CellProfiler; последнее позволит проводить автоматизированный анализ, сопоставимый с используемым здесь программным обеспечением.
Таким образом, проиллюстрирована реализация надежного протокола для дифференциации микроглиоподобных клеток от ИПСК человека, тем самым преодолевая ограниченный ресурс микроглии человека. Дифференцированная микроглия может быть использована для различных применений при изучении заболеваний нервного развития и нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, включен полностью «гуманизированный» анализ фагоцитоза, который в дальнейшем поможет изучению функции и дисфункции микроглии в контексте развития человека и заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Авторы благодарят Майкла Уорда за предоставление линии WTC11 hNIL iPSC для дифференцировки моторных нейронов и Лаборатории Джексона за поставку клона KOLF2.1J WT линии B03 iPSC, используемой для дифференцировки микроглии. Мы также благодарим Дороти Шафер за ее поддержку во время внедрения протоколов, Энтони Джампетруцци и Джона Ландерса за их помощь с системой визуализации живых клеток, а также Хейдена Гэдда за его технический вклад во время пересмотра и Джонатана Юнга за его сотрудничество в этом исследовании. Эта работа была поддержана Фондом неврологии Дэна и Дианы Риччио из Медицинской школы UMASS Chan и Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
