Summary
Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.
Abstract
La microglía son las células inmunes residentes de origen mieloide que mantienen la homeostasis en el microambiente cerebral y se han convertido en un jugador clave en múltiples enfermedades neurológicas. El estudio de la microglía humana en la salud y la enfermedad representa un desafío debido al suministro extremadamente limitado de células humanas. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de individuos humanos pueden usarse para eludir esta barrera. Aquí, se demuestra cómo diferenciar las iPSC humanas en células similares a la microglía (iMG) para la experimentación in vitro . Estos iMG exhiben las propiedades esperadas y fisiológicas de la microglía, incluida la morfología similar a la microglía, la expresión de marcadores adecuados y la fagocitosis activa. Además, se proporciona documentación para aislar y etiquetar sustratos sinaptosómicos derivados de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC humanas (i3LMN). Se utiliza un ensayo de imagen longitudinal de células vivas para monitorear la absorción de sinaptosomas humanos marcados con un tinte sensible al pH, lo que permite investigaciones de la capacidad fagocítica de iMG. Los protocolos descritos en este documento son ampliamente aplicables a diferentes campos que investigan la biología de la microglía humana y la contribución de la microglía a la enfermedad.
Introduction
La microglía son las células inmunes residentes en el sistema nervioso central (SNC) y desempeñan un papel crucial en el desarrollo del SNC. La microglía también es importante en el cerebro adulto para mantener la homeostasis y responder activamente a los procesos de trauma y enfermedad. La evidencia acumulada muestra que la microglía es un contribuyente clave para la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico 1,2. Aunque el conocimiento actual sobre la biología microglial se ha derivado predominantemente de modelos de ratón, estudios recientes han dilucidado diferencias importantes entre la microglía murina y humana, subrayando la necesidad de desarrollar tecnologías para estudiar la genética y las funciones biológicas de la microglía humana 3,4. El aislamiento de la microglía del tejido primario disecado puede modificar gravemente las propiedades de la microglía5, lo que podría confundir los resultados adquiridos con tales células. El objetivo general de este método es diferenciar las iPSC humanas en iMG, proporcionando así un sistema de cultivo celular para estudiar la microglía humana en condiciones basales. Además, aquí se incluye un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema modelo totalmente humano como un medio para estudiar la funcionalidad de los iMG, tanto como medida de control de calidad como para evaluar la disfunción de la MGI en el contexto de la enfermedad.
Múltiples protocolos para la diferenciación de microglia de iPSCs han surgido recientemente en la literatura 6,7,8,9,10. Las desventajas potenciales de algunos protocolos incluyen períodos prolongados o largos de diferenciación, la adición de múltiples factores de crecimiento y/o procedimientos experimentales complejos 6,9,10. Aquí, se demuestra un método de diferenciación "fácil de usar" que recapitula aspectos de la ontogenia de la microglía a través de la diferenciación de iPSCs en células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Los PMP se generan como se describió anteriormente, con algunas optimizaciones presentadas aquí en12. Los PMP imitan a los macrófagos derivados del saco vitelino independientes de MYB, que dan lugar a la microglía durante el desarrollo embrionario al invadir el cerebro antes del cierre de la barrera hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente las PMP en MGI, utilizamos un método de monocultivo rápido y simplificado basado en los protocolos de Haenseler et al. y Brownjohn et al., con algunas modificaciones para generar un método eficiente de diferenciación de microglia en el que los iMG expresan robustamente marcadores enriquecidos con microglía 7,8. Este método de diferenciación se puede reproducir en laboratorios con experiencia en el cultivo de iPSCs y con objetivos de investigación destinados a estudiar la biología de la microglía utilizando un sistema modelo humano.
La microglía derivada de iPSC representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro y es una herramienta importante para investigar las funciones canónicas microgliales, incluida la fagocitosis. La microglía son los fagocitos profesionales del cerebro y el SNC, donde limpian los desechos celulares, agregan proteínas y degradan la mielina14. La microglía también funciona en la remodelación sináptica por envolver sinapsis y en la defensa contra infecciones externas a través de fagocitosis de patógenos15,16. En este protocolo, la fagocitosis por iMGs se evalúa utilizando sinaptosomas humanos como material para la absorción de iMG. Con este fin, se describe una descripción para aislar sinaptosomas derivados de LMNs humanos i3. Los sinaptosomas humanos derivados de i3LMN están marcados con un colorante sensible al pH que permite la cuantificación de sinaptosomas localizados dentro de compartimentos ácidos durante el procesamiento del fagosoma y la degradación in vitro. Se muestra un ensayo de fagocitosis utilizando microscopía de células vivas para monitorear el proceso dinámico de envolvimiento de microglia en tiempo real. Este ensayo funcional establece una base para investigar posibles defectos en la fagocitosis microglial en la salud y la enfermedad utilizando un sistema humano completo.
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Protocol
NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo deben ser estériles, y todos los pasos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Todas las líneas iPSC, así como los medios de mantenimiento y diferenciación, se describen en la Tabla de materiales. El método de diferenciación de microglía ilustrado a continuación se basa en protocolos previamente publicados 7,8,12 con nuevas modificaciones descritas en este documento.
1. Diferenciación de la microglía
NOTA: En la figura 1 se resume una descripción general del protocolo.
- Cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
NOTA: Se pueden encontrar más detalles que describen las técnicas de cultivo iPSC en otra parte17.- Descongelación y mantenimiento
- Preparar iPSC mediana, alícuota la media, y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Descongelar las alícuotas durante la noche a 4 °C y utilizarlas durante un máximo de 1 semana. Deje el medio a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usarlo.
- Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos agregando 1 ml de 10 μg/ml de laminina 521 diluida en DPBS que contiene calcio y magnesio18. Mantener las placas en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante al menos 2 h o preferiblemente durante la noche. Una vez diluida, conservar la laminina a 4 °C durante 3 meses.
- Preparar 10 mM de solución madre inhibidora de la quinasa Rho Y27632 (inhibidor de ROCK) diluyendo en agua estéril. Hacer alícuotas de un solo uso de la solución inhibidora de ROCK y almacenarlas a -20 °C durante un máximo de 1 año.
- Preparar 0,5 mM EDTA diluyendo la solución madre de 0,5 M EDTA en DPBS.
- Para descongelar un vial de iPSCs congeladas, coloque el vial en un baño maría a 37 °C hasta que esté casi descongelado. Transfiera inmediatamente el contenido del vial a un tubo cónico de 15 ml que contenga 4 ml de medio iPSC. Centrifugar a 500 × g durante 1 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo 1 ml de medio iPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK lentamente contra la pared del tubo para evitar la perturbación de las colonias.
- Añadir 1,5 ml de medio iPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK a cada uno de los pocillos recubiertos y transferir las colonias resuspendidas gota a gota a los pocillos que contienen el medio.
NOTA: Utilice 5-7 gotas del paso 1.1.1.6 para el mantenimiento del cultivo, pero ajuste la densidad de siembra óptima para cada línea iPSC. - Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos barajando manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante. Colocar las células en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Al día siguiente, reemplace completamente el medio agregando un medio iPSC fresco sin inhibidor de ROCK.
- Para el mantenimiento, cambie el medio todos los días hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
NOTA: Las células se pueden mantener sin cambiar el medio durante 2 días si el medio iPSC utilizado permite un horario de alimentación flexible. Se recomienda limitar esto a una vez por pasaje y solo si las células son menos del 50% confluentes.
- Desdoblamiento
- Aspirar el medio y lavar las células con 1 mL de DPBS (sin calcio y magnesio).
- Para desalojar las células, agregue 1 ml de 0.5 mM EDTA e incube durante 2-3 minutos a temperatura ambiente hasta que los bordes de las colonias celulares se levanten de la superficie del pozo. Lave las células de nuevo con DPBS y agregue 1 ml de medio iPSC.
- Disocie las colonias celulares raspándolas suavemente con un elevador celular. Raspa cada área del pozo solo una vez para evitar molestar a las colonias.
NOTA: Los métodos alternativos para desalojar las colonias del pozo se pueden encontrar en otros lugares17. - Con una punta de pipeta de 1 ml, recoger las células y transferirlas gota a gota en una proporción de 1:6 (células a medio) a pocillos prerecubiertos (como se mencionó en el paso 1.1.1.2) que contengan 1,5 ml de medio iPSC.
- Descongelación y mantenimiento
- Diferenciación de iPSC a células similares a la microglía (iMG)
NOTA: Las moléculas pequeñas y los factores de crecimiento se disuelven en albúmina sérica bovina al 0,1% filtrada estéril en DPBS a una concentración madre 1.000 veces mayor que la concentración final. Se recomienda diferenciar las iPSC en iMG durante los primeros pasajes. Se recomienda el cariotipo rutinario de las líneas iPSC.- Preparar una solución de recubrimiento estándar
- Descongelar la solución madre de un reactivo de recubrimiento de matriz extracelular en hielo a 4 °C durante la noche.
- Preenfriar tubos de microcentrífuga y puntas de pipeta filtrante a 4 °C.
- Alícuota 250 μL del reactivo concentrado de recubrimiento de matriz extracelular en cada tubo y colocarlo inmediatamente en hielo. Conservar las alícuotas a -20 °C.
- Para preparar la solución de recubrimiento, descongelar una de las alícuotas del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular en hielo a 4 °C durante la noche.
- Agregue 50 ml de DMEM-F12 helado optimizado para el crecimiento de células madre embrionarias humanas y pluripotentes inducidas (denominadas DMEM-F12) a un tubo cónico preenfriado y manténgalo en hielo.
- Enfríe una punta de pipeta de 1 ml pipeteando DMEM-F12 helada hacia arriba y hacia abajo varias veces, y luego use inmediatamente la punta de la pipeta para transferir 250 μL del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular al tubo cónico que contiene el medio DMEM-F12.
NOTA: La solución de recubrimiento estándar puede conservarse durante 2 semanas a 4 °C.
- Formación del cuerpo embrioide (EB)
- Prepare un medio EB que pueda mantenerse a 4 °C durante un máximo de 4 días.
- Una vez que las iPSCs hayan alcanzado el 80% de confluencia, disociar las colonias lavando con 1 mL de DPBS y añadiendo 1 mL de un reactivo de disociación durante 2 min a 37 °C. Desaloje las colonias usando un elevador celular raspando varias veces para crear una suspensión de una sola célula. Recoja las células y transfiera todo a un tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de DPBS.
- Centrifugar las células a 500 × g durante 1 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio EB. Tomar 10 μL de células y diluir 1:1 con azul de tripano. Contar las células con un hemacitómetro y, basándose en el recuento de células, diluir el stock celular hasta una dilución final de 10.000 células por 100 μL. Para las células de recubrimiento, agregue 100 μL de las células diluidas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo de baja adherencia.
NOTA: En general, se pueden obtener 48 pozos de la placa de 96 pocillos de cada pozo confluente del 80% de las iPSC. - Centrifugar la placa a 125 × g durante 3 min e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 4 días. Realice un cambio de medio medio el día 2 utilizando una pipeta multicanal y recogiendo suavemente 50 μL de medio viejo, y luego agregando 50 μL de medio EB fresco.
NOTA: El día 4, las iPSC formarán estructuras celulares esféricas denominadas EB como se describe en la sección de resultados. El proceso de diferenciación de EB se puede extender hasta 7 días, si es necesario.
- Generación de precursores primitivos de macrófagos (PMPs)
- Prepare el medio base PMP, filtro estéril, y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
- Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos agregando 1 ml de solución de recubrimiento Matrigel helada e incube a 37 °C y 5% deCO2 durante al menos 2 h o preferiblemente durante la noche.
- En el día 4 de la diferenciación de EB, transfiera las EB a los pocillos recubiertos de Motrigel recolectando las EB con puntas de pipeta de 1 ml (usando una pipeta). Pipetear hacia arriba y hacia abajo una o dos veces para desalojar los EB del pozo. Sostenga la placa de 6 pocillos en un ángulo inclinado para permitir que los EB se asienten en el borde del pozo.
NOTA: Se pueden chapar nueve o diez EB por pozo recubierto. - Una vez que todos los EB se hayan asentado, pipetear suavemente y retirar el medio viejo con una punta de pipeta de 1 ml mientras mantiene los EB en el borde del pozo. Agregue 3 ml de medio completo PMP recién preparado a cada pocillo. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos barajando manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C y 5%CO2.
- No perturbe la placa durante 7 días para permitir que los EB se adhieran al fondo del pozo. Después de ese tiempo, realice un cambio medio-medio utilizando el medio completo PMP.
NOTA: En este punto, la mayoría de los EB deben estar unidos a la placa. Cualquier EB flotante se puede eliminar. - Después de 5-7 días, inspeccione los EB bajo un microscopio de campo de luz con un aumento de 4x para asegurarse de que estén conectados al fondo de los pozos. Cambie el medio como se describe en 1.2.3.5. El día 21, realizar un cambio completo de medio con 3 mL de medio completo PMP.
NOTA: Los progenitores mieloides que flotan en el medio pueden ser evidentes en este punto. Estas células deben descartarse durante el cambio del medio. - El día 28, busque células redondas denominadas PMP en el sobrenadante y recoja el medio que contiene las PMP utilizando una pipeta de 10 ml y una pipeta automática. Tenga cuidado de no molestar a los EB. Transfiera las PMP y el medio a un tubo cónico de 15 ml y proceda como se describe en el paso 1.2.4.
NOTA: Por lo general, los PMP de la misma línea iPSC se pueden recolectar de cinco pocillos de una placa de 6 pocillos y agruparse en un solo tubo cónico de 15 ml. - Agregue 3 ml de medio completo PMP fresco para un mayor mantenimiento de los EB. Como los PMP emergen continuamente de los EB durante más de 3 meses, recójalos cada 4-7 días (no permita que el medio cambie de color a un tono amarillo) como se describe en los pasos 1.2.3.7 y 1.2.3.8.
NOTA: Aunque las PMP se pueden recolectar durante varios meses, pueden cambiar su fenotipo con el tiempo.
- Diferenciación a los iMG
- Prepare el medio base iMG (Tabla de materiales), el filtro estéril y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
- Una vez que las PMP se hayan recogido en un tubo cónico de 15 ml, centrifugarlas a 200 × g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las PMP utilizando 1-2 mL de medio basal iMG. Contar las células con un hemocitómetro tomando una pequeña alícuota y diluyendo 1:1 con azul de tripano.
NOTA: 0.5-1.5 × 106 PMP se obtienen normalmente cada semana dependiendo de la línea iPSC y la edad del cultivo EB. - Centrifugar el resto de las células de nuevo a 200 × g durante 4 min. Diluir las PMP a la concentración deseada de tal manera que las células se coloquen en una densidad de ~ 105 / cm2 en placas tratadas con cultivo celular utilizando un medio completo iMG recién preparado. Realice un cambio medio-medio utilizando un medio completo iMG recién preparado cada 3-4 días a lo largo de 10-12 días para permitir la diferenciación terminal.
NOTA: En este punto, las células deben adquirir una morfología similar a la microglía. Para confirmar el compromiso de las PMP con el destino de la microglía, se realiza un análisis de inmunofluorescencia para corroborar la expresión de marcadores enriquecidos con microglía, como el receptor purinérgico P2RY12 y la proteína transmembrana 119 (TMEM119)9. - Para preservar la salud y viabilidad celular, realice todos los experimentos entre los días 10 a 12 de diferenciación iMG.
- Preparar una solución de recubrimiento estándar
2. Ensayo de fagocitosis utilizando sinaptosomas humanos derivados de neuronas motoras
- Diferenciación mediada por el factor de transcripción de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC (i3LMN)
NOTA: Para el proceso de diferenciación se utilizó una línea WTC11 con inserción estable del casete del factor de transcripción inducible hNIL que contiene los factores de transcripción neurogenina-2 (NGN2), islote-1 (ISL1) y LIM homeobox 3 (LHX3) en el locus de puerto seguro CLYBL17. La línea iPSC se mantuvo como se describe en el paso 1.1.1, pero con las condiciones de recubrimiento descritas en el paso 1.2.1. Cualquier reactivo de recubrimiento de matriz extracelular se puede utilizar para cultivar iPSCs que se utilizarán para la diferenciación neuronal ya que no se requiere laminina 521. Todos los medios se equilibran a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de su uso.- Cubra los platos de 10 cm con 5 ml de solución de recubrimiento patrón como se describe en el paso 1.2.1.
NOTA: Aquí, se utilizaron 3-4 platos de 10 cm por diferenciación. - Preparar Induction Base media, filtro estéril, y almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
- Prepare Neuron medium, filtro estéril, y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Prepare el tampón de borato mezclando 100 mM de ácido bórico, tetraborato de sodio de 25 mM y cloruro de sodio de 75 mM en agua estéril. Ajuste el pH a 8.5 y filtre estéril.
- Una vez que las iPSC hayan alcanzado el 80% de confluencia, lave las células con DPBS y desaloje las colonias agregando 0.5 mM EDTA.
NOTA: Dos pocillos suelen ser suficientes para cada plato de 10 cm. - Incubar las células durante 4-5 min a temperatura ambiente. Retire el EDTA y agregue 3 ml de DMEM/F12 con HEPES a cada pocillo.
- Raspa las células con un elevador de células y usa una pipeta de 10 ml para extraer las células del fondo del pozo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3x.
- Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300 × g durante 3 min.
- Resuspender las células en 3 ml de medio iPSC que contiene 10 μM inhibidor de ROCK y contarlas con un hemacitómetro.
- Placa 1,5 × 106 iPSCs en una placa prerecubierta de 10 cm con 12 mL de medio iPSC que contiene 10 μM inhibidor de ROCK.
- Al día siguiente, retire el medio y lave las células con DPBS. Añadir 12 ml de medio de inducción completa recién preparado para inducir la expresión de los factores de transcripción.
- El día 2, cubra los platos de 10 cm con 5 ml de solución de recubrimiento neuronal preparada con volúmenes iguales de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina y 1 mg / ml de poli-L-ornitina diluida en tampón de borato. Incubar durante la noche a 37 °C y 5% deCO2.
- El día 3, lavar los platos recubiertos con agua estéril 3x, aspirar el agua completamente y dejar que los platos se sequen inclinando los platos y dejándolos parcialmente descubiertos dentro de un gabinete de bioseguridad durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
- Una vez que los platos se hayan secado completamente, cúbralos con 6 mL de medio de inducción completa suplementado con 15 μg/mL de laminina y 40 μM de BrdU durante al menos 1 h a 37 °C y 5% deCO2.
NOTA: El tratamiento con BrdU se recomienda para eliminar las células mitoticamente activas y así mejorar la pureza de los cultivos neuronales. Los efectos de BrdU en la salud neuronal son mínimos. - Tratar las células diferenciadoras con 3 mL de reactivo de disociación por plato de 10 cm e incubar durante 3-4 min a temperatura ambiente.
- Añadir 6 ml de DPBS en la placa sin quitar el reactivo de disociación y pipetear las células en solución hacia arriba y hacia abajo 4-5x con una pipeta de 10 ml para disociar las células.
- Recoja la suspensión celular y pásela a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo cónico de 50 ml. Agregue 1 ml de medio base de inducción para enjuagar el colador.
- Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min. Aspirar el medio y resuspender las células en 3 mL de medio de inducción completa que contenga 40 μM de BrdU.
- Cuente las células con un hemocitómetro. Colocar aproximadamente 2,5 × 10 6 células por plato de 10 cm en platos prerecubiertos diluyendo las células en6 ml de medio de inducción completa que contenga 40 μM de BrdU sin eliminar la solución de recubrimiento añadida en el paso 2.1.14.
- El día 4, aspirar el medio, lavar las células 1x con DPBS y añadir un nuevo medio de inducción completa que contenga 40 μM de BrdU.
- El día 6, aspirar el medio, lavar las células 1x con DPBS y añadir medio neuronal suplementado con 1 μg/ml de laminina.
- En el día 9, cambie 1/3 del medio reemplazándolo con medio Neuron fresco suplementado con 1 μg / ml de laminina.
- Mantener i 3 LMNs durante 25 días adicionales realizando cambios de medio medio con medio neuronal suplementado con 1 μg/ml fresco de laminina cada3-4días.
NOTA: En este punto temporal, i3LMNs deben presentar una morfología neuronal con procesos largos. Las neuronas también tienden a formar grupos o grupos de células. Una descripción más detallada de cómo validar la diferenciación de i3LMN se puede encontrar en otra parte17.
- Cubra los platos de 10 cm con 5 ml de solución de recubrimiento patrón como se describe en el paso 1.2.1.
- Purificación y etiquetado de sinaptosomalos
NOTA: Mantenga las condiciones estériles y realice todos los pasos dentro de un gabinete de bioseguridad.- Lavei 3 LMN dos veces con DPBS.
- Agregue 2 ml de reactivo de lisis celular helada para el aislamiento de sinaptosomas, incubar en hielo durante 2 minutos y raspar firmemente las neuronas.
- Transfiera el lisado a múltiples microtubos de 2 ml (~ 1,5 ml de lisado por tubo) y centrifugar a 1.200 × g durante 10 minutos a 4 °C.
NOTA: Mantenga los tubos en hielo durante todo este procedimiento. - Recoger el sobrenadante (desechar el pellet) y centrifugar a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. Guarde y resuspenda el pellet que contiene los sinaptosomas con un volumen similar (como el lisado original) de 5% de DMSO en DPBS.
NOTA: Los sinaptosomas pueden etiquetarse inmediatamente con un fluoróforo o almacenarse a -80 °C para su uso futuro. - Realice un ensayo de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) para todos los tubos para evaluar el rendimiento total de proteína en la preparación del sinaptosoma.
NOTA: Se pueden utilizar otros ensayos para medir la concentración de proteínas. El rendimiento proteico total obtenido de diferentes preparados se ha incluido en la Tabla 1 como referencia. Se recomienda realizar un análisis de Western blot de la preparación sinaptosómica para confirmar la presencia de proteínas presinápticas y postsinápticas. Aquí, el marcador presináptico, sinaptofisina (SYP), y el marcador postsináptico, la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD95) fueron elegidos para el análisis de western blotting como se describió anteriormente19. - Prepare una solución de 100 mM de bicarbonato de sodio en agua, ajuste el pH a 8.5 y filtro estéril.
- Solubilizar 1 mg de polvo liofilizado del colorante sensible al pH utilizado en 150 μL de DMSO. Hacer alícuotas de un solo uso y almacenarlas a -80 °C.
- Centrifugar los sinaptosomas a 15.000 × g durante 5 min a 4 °C.
- Diluir hasta 1 mg de sinaptosomas en 100 μL de solución de bicarbonato de sodio a 100 mM.
- Para etiquetar los sinaptosomas, agregue 1 μL del colorante sensible al pH reconstituido por 1 mg de sinaptosomas y cubra la reacción con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Agitar a temperatura ambiente durante 2 h con un agitador de tubos.
- Añadir 1 ml de DPBS al tubo y centrifugar los sinaptosomas marcados a 15.000 × g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y realice cuatro lavados adicionales como se describe en el paso 2.2.11.
- Después del lavado y centrifugado final, retire el sobrenadante tanto como sea posible sin alterar el pellet y vuelva a suspender los sinaptosomas marcados con DMSO al 5% en DPBS a un volumen para la concentración deseada (0.7 μg / μL utilizado aquí). Preparar las alícuotas de un solo uso y almacenar a -80 °C. Asegúrese de evitar la exposición a la luz a los sinaptosomas etiquetados.
- Ensayo de fagocitosis de células vivas
- Placa 20-30 × 10 4 PMP en placas de 96 pocillos en 100 μL de medio completo iMG y seguir el proceso de diferenciación durante 10 días como se indica en el paso 1.2.4.
- El día del ensayo, prepare la solución de tinción nuclear agregando 1 gota de una tinción nuclear para células vivas en 2 ml de medio basal iMG.
- Extraer 40 μL de medio por pocillo de la placa de 96 pocillos y añadir 10 μL de la solución de tinción nuclear utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa a 37 °C y 5% deCO2 durante 2 h.
- Descongele los sinaptosomas etiquetados en hielo y sonicar suavemente usando un sonicador de agua durante 1 minuto. Transfiera inmediatamente los sinaptosomas de nuevo al hielo. Diluir los sinaptosomas marcados en medio completo iMG en una proporción de 1 μL de sinaptosomas por 50 μL de medio.
NOTA: La concentración de sinaptosoma depende del ensayo y puede requerir optimización. Para mantener un porcentaje relativamente bajo (es decir, 0,1% o menos) de DMSO en el medio, se recomienda no agregar más de 2 μL de sinaptosomas por pocillo. - Como control negativo, pretratar algunos de los pocillos con citocalasina D para inhibir la polimerización de actina y, por lo tanto, la fagocitosis. Preparar una solución de citocalasina D de 60 μM en medio completo iMG. Añadir 10 μL de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración final de 10 μM e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 30 min.
- Retirar la placa de la incubadora e incubar a 10 °C durante 10 min. Mantener la placa en hielo y añadir 50 μL de medio que contenga sinaptosomas preparados como se describe en el paso 2.3.4.
- Centrifugar la placa a 270 × g durante 3 min a 10 °C y mantener la placa en hielo hasta la obtención de imágenes.
- Adquisición y análisis de imágenes
- Inserte la placa en un lector de imágenes de células vivas y seleccione los pocillos que se analizarán.
- Seleccione una lente objetivo 20x .
- Ajuste el enfoque, la intensidad del diodo emisor de luz (LED), el tiempo de integración y la ganancia de los canales de campo claro y azul (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]). La fluorescencia del sinaptosoma debe ser insignificante en el punto de tiempo inicial. Para centrarse en el canal rojo (RFP), utilice el canal de campo claro como referencia. El tiempo de integración y la ganancia pueden variar entre experimentos; utilice estos ajustes iniciales para el canal rojo: LED: 4, tiempo de integración: 250 y ganancia: 5.
- Seleccione el número de baldosas individuales que se adquirirán en un montaje por pozo (adquiera 16 baldosas en el centro del pozo, obteniendo así una imagen de aproximadamente el 5% del área total del pozo). Ajuste la temperatura a 37 °C y el intervalo de tiempo deseado para la obtención de imágenes.
NOTA: Las imágenes fueron adquiridas cada 1 - 2 h hasta 16 h en este estudio. - Abra el software de análisis.
- Abra el experimento que contiene las imágenes. Haga clic en el icono Reducción de datos.
- En el menú, seleccione Costura de imágenes en Procesamiento de imágenes para crear una imagen completa a partir de los mosaicos individuales de 4 x 4 del montaje con los parámetros descritos en la Tabla 2.
- Una vez creadas las imágenes cosidas, defina un umbral de intensidad utilizando los canales DAPI y RFP para estas imágenes. Abra una imagen y haga clic en Analizar; en Análisis, seleccione Análisis celular y, en Canal de detección, elija una imagen cosida en los canales DAPI o RFP. Vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y establezca un valor de umbral y valores de tamaño de objeto que seleccionen correctamente los núcleos celulares en el canal DAPI o la señal sinaptosómica en el canal RFP. Repita el proceso con diferentes imágenes hasta que se optimicen los parámetros que se pueden aplicar a todo el experimento.
NOTA: Los valores sugeridos se pueden encontrar en la Tabla 2. - Para contar el número de núcleos, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis de imágenes, seleccione Análisis celular. Vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y, en Canal, seleccione las imágenes cosidas DAPI y use los parámetros descritos en la Tabla 2.
- Vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Recuento de celdas. Para obtener el área de la señal del sinaptosoma, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis, seleccione Análisis celular.
- Vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y, en Canal, seleccione Imágenes unidas RFP y use los parámetros detallados en la Tabla 2.
- Vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Área de suma de objetos. En la pestaña Reducción de datos , haga clic en Aceptar y permita que el software analice todas las imágenes adquiridas.
- Exporte los valores Área de suma de objetos y Recuento de celdas para cada punto de tiempo. Divida el área de suma de objetos por el recuento de celdas para calcular el área normalizada por punto de tiempo. Si compara múltiples tratamientos o genotipos, calcule el índice de fagocitosis utilizando la ecuación (1):
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Representative Results
Para generar iMGs utilizando este protocolo, es importante comenzar con iPSCs indiferenciadas que muestren morfología de colonia compacta con bordes bien definidos (Figura 2A). Las iPSC disociadas mantenidas como se describe en la sección de formación de EB formarán agregados esféricos, denominados EB, que crecerán en tamaño hasta el día 4 de diferenciación (Figura 2B). Una vez que los EB se recogen y chapan en las condiciones apropiadas para la generación de PMP, se adhieren a las placas recubiertas de Matrigel, y una capa de células se extenderá y rodeará los agregados esféricos (Figura 2C). Los EB no saludables se desprenderán de la placa y deben eliminarse. Del día 14 al 21 de la generación de PMP, pueden surgir tipos de células potencialmente diferentes que flotarán en el medio; Estas células deben descartarse durante los cambios de medios12. El día 28, las células redondas con una gran relación citoplasma-núcleo aparecerán en suspensión (Figura 2D), denominadas PMP. Estas células se producen continuamente y se pueden cosechar semanalmente durante cambios medios de hasta 3 meses. El número de PMP cosechadas cada semana varía y depende de la línea iPSC y la edad del cultivo; El rendimiento generalmente disminuye con el tiempo. Se recomienda encarecidamente cultivar iPSCs en placas recubiertas con laminina 521 en lugar de Matrigel, ya que el rendimiento de PMP es mayor cuando las iPSCs se mantienen en las condiciones anteriores como se informó anteriormente y en este estudio (Figura 2E)18.
Después de que las PMP han sido expuestas al medio iMG durante 10-12 días, las células adquieren una morfología similar a la microglía con un citoplasma pequeño y la presencia de procesos alargados (Figura 3A). Para verificar la identidad de la microglía, realizamos tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos contra el marcador mieloide ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (IBA1) y los marcadores enriquecidos con microglía del receptor purinérgico P2RY12 y la proteína transmembrana 119 (TMEM119) como se describió anteriormente20 (ver también la Tabla de materiales). Típicamente, el >95% de las células expresan IBA1 y aproximadamente el 90% de las células expresan P2RY12 y TMEM119 (Figura 3B).
Para evaluar la capacidad fagocítica de los iMG, se utilizaroni 3sinaptosomas humanos derivados de LMN marcados con un colorante sensible al pH. Para verificar que la preparación sinaptosómica conserva propiedades estructurales canónicas, el enriquecimiento del marcador presináptico, sinaptofisina (SYP), y el marcador postsináptico, la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD95)19 se confirmó mediante análisis de Western blot (Figura 4) realizado como se describió antes20 (ver también la Tabla de Materiales) ). Los sinaptosomas marcados con un colorante sensible al pH se vuelven fluorescentes después de ser engullidos por iMG y una vez que se localizan dentro de compartimentos ácidos intracelulares (es decir, de pH bajo).
En el punto de tiempo inicial, la señal fluorescente roja era mínima, ya que la mayoría de los sinaptosomas aún no estaban fagocitados. Después de 30 minutos, se detectó una señal fluorescente roja y aumentó aún más con el tiempo. A las 10 h, la señal fluorescente roja era robusta, ya que la mayoría de los sinaptosomas habían sido engullidos y se localizaron en compartimentos intracelulares ácidos a través del proceso de fagocitosis (Figura 5A). La citocalasina D es un inhibidor de la polimerización de actina ampliamente utilizado para bloquear la fagocitosis. Como era de esperar, observamos una fuerte reducción de la señal fluorescente roja en los iMG tratados con citocalasina D, lo que indica que la señal detectada resulta de eventos fagocíticos. También observamos que los iMG muestran cambios en la morfología después de 10 h de fagocitosis que no se detectaron en los MGI tratados con citocalasina D, posiblemente debido a la falta de remodelación de actina en los MGI tratados con citocalasina D. Los cambios en la morfología de la microglía generalmente se asocian con el estadode activación 2.
Mediante el uso del método de cuantificación automatizado descrito, medimos el área total de señal roja en cada punto de tiempo y la normalizamos al número de células obtenido al contar los núcleos. Los resultados indican que el área de sinaptosomas engullidos aumentó con el tiempo hasta que se alcanzó una meseta a las 16 h. Como era de esperar, el área de señal roja de las células tratadas con citocalasina D no aumentó con el tiempo, ya que la fagocitosis fue inhibida (Figura 5B). Juntos, estos resultados indican que los iMG son capaces de fagocitar material relevante para enfermedades cerebrales y son adecuados para estudios funcionales.
Figura 1: Esquema del protocolo para diferenciar iPSCs en células similares a la microglía. El día 0, una vez que las iPSCs han alcanzado el 80% de confluencia, las colonias se disocian en células individuales y se cultivan en medio EB para inducir la formación de EB. El día 4, los EB se recolectan y se colocan en medio PMP para inducir la generación de PMP. Después de 28 días, las PMP se recogen y se diferencian terminalmente en iMG mediante el uso de medio iMG. Los PMP se pueden recolectar semanalmente hasta por 3 meses. Abreviaturas: iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iMGs = células similares a la microglía; EB = cuerpo embrioide; PMP = precursor primitivo de macrófagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología celular evaluada por microscopía óptica en las etapas de diferenciación de iPSCs a PMPs. (A) iPSCs mantenidas en medio iPSCs hasta 80% de confluencia. (B) Un cuerpo embrioide después de 4 días de diferenciación en medio EB. (C) EBs unidas a placas recubiertas y (D) PMPs emergentes en suspensión de EBs después de 28 días de cultivo en medio PMP. (E) Número de PMP recolectados de ~ 48 EB en la semana 1 (después de 28 días de diferenciación de PMP) y la semana 12. Los gráficos de barras muestran el promedio de seis diferenciaciones independientes (puntos de datos) de dos líneas iPSC diferentes. Las estadísticas se obtuvieron mediante ANOVA bidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. Barras de escala = 1.000 μm (A), 400 μm (B-D). Abreviaturas: iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; iMGs = células similares a la microglía; EB = cuerpo embrioide; PMP = precursor primitivo de macrófagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los iMG diferenciados por este protocolo muestran características de microglía de buena fe después de 10 días de diferenciación terminal. (A) Imagen representativa de campo claro de iMGs que presentan morfología similar a la microglía. Barra de escala = 400 μm. (B) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de iMG que expresan los marcadores mieloides/microgliales IBA1, P2RY12 y TMEM119. Barras de escala = 400 μm (A), 50 μm (B). Abreviaturas: iMGs = células similares a la microglía; IBA1 = molécula adaptadora ionizada de unión al calcio 1; P2RY12 = receptor purinérgico P2RY12; TMEM119 = proteína transmembrana 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: i3sinaptosomas humanos derivados de LMN expresaron marcadores sinápticos mediante análisis de Western blot. Análisis representativo de Western blot de una preparación sinaptosómica humana derivada de i3LMN después de 28 días de cultivo probado con el marcador postsináptico, PSD95, el marcador presináptico, SYP y β-tubulina. Abreviaturas: i3LMN = neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC; PSD95 = proteína de densidad postsináptica 95; SYP = sinaptofisina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo de fagocitosis de iMGs usando sinaptosomas humanos marcados con un colorante sensible al pH y monitoreados por imágenes longitudinales de células vivas. (A) Montajes representativos de campo claro y fluorescencia de iMGs con tinción nuclear (canal azul) expuestos a sinaptosomas humanos marcados (canal rojo) con y sin tratamiento con cytoD en los puntos de tiempo indicados. Los montajes fueron creados mediante el procesamiento posterior a la adquisición de 16 fichas adquiridas a 20x. Barras de escala = 400 μm. (B) Cuantificación del área de la señal fluorescente del sinaptosoma normalizada al número celular. Los puntos de datos indican el promedio ± SEM de tres réplicas técnicas. Cada curva muestra la cuantificación de dos diferenciaciones independientes (iMGs 1 y 2) de una línea iPSC con y sin tratamiento con cytoD. Abreviaturas: iMGs = células similares a la microglía; cytoD = citocalasina D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número de platos de 10 cm de DIF28 i3LMN | Proteína total (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabla 1: Rendimiento total de proteínas después del aislamiento sinaptosómico de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC a los 28 días de diferenciación. Cantidad total de proteína obtenida de cuatro diferenciaciones independientes después de la extracción de sinaptosomas. Se cosecharon diferentes números de platos de 10 cm que contenían i3LMN en cada diferenciación. El rendimiento de proteína se midió mediante ensayo de proteína BCA. Abreviaturas: iPSCs = células madre pluripotentes inducidas; i3LMN = neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC; DIF28 = 28 días de diferenciación; BCA = ácido bicinchonínico.
| Parámetros | Valor |
| Canal de registro | Campo brillante, DAPI y RFP |
| Método de fusión | Mezcla lineal |
| Recortar imagen cosida para eliminar rectángulos negros en los bordes | Comprobado |
| Reducir el tamaño de la imagen final | Comprobado |
| Parámetros | Valor |
| Umbral | Determinado por el usuario |
| Fondo | Oscuro |
| Dividir objetos táctiles | Comprobado |
| Rellenar agujeros en máscaras | Comprobado |
| Tamaño mínimo del objeto | 7 μm |
| Tamaño máx. del objeto | 30 μm |
| Incluir objetos perimetrales principales | Comprobado |
| Analizar toda la imagen | Comprobado |
| Parámetros | Valor |
| Umbral | Determinado por el usuario |
| Fondo | Oscuro |
| Dividir objetos táctiles | Comprobado |
| Rellenar agujeros en máscaras | Comprobado |
| Tamaño mínimo del objeto | 5 μm |
| Tamaño máx. del objeto | 100 μm |
| Incluir objetos perimetrales principales | Comprobado |
| Analizar toda la imagen | Comprobado |
Tabla 2: Parámetros utilizados para la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Se enumeran los parámetros sugeridos a considerar para la adquisición de imágenes durante el ensayo de fagocitosis y para el análisis de las imágenes adquiridas.
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Discussion
El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método eficiente para obtener células similares a la microglía derivadas de iPSC en ~ 6-8 semanas con alta pureza y en un rendimiento suficiente para realizar experimentos de inmunofluorescencia y otros ensayos que requieren un mayor número de células. Este protocolo ha producido hasta 1 × 106 iMGs en 1 semana, lo que permite la extracción de proteínas y ARN y los correspondientes análisis posteriores (por ejemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espectrometría de masas). Dicho esto, una limitación de este protocolo es que el rendimiento de los iMG puede restringir ciertas aplicaciones. Se pueden implementar modificaciones adicionales para acumular PMPs de diferentes semanas y mantener un cultivo homogéneo en suspensión hasta que se recojan suficientes progenitores para proceder con el proceso de diferenciación de una vez18. Alternativamente, la diferenciación de EB puede ampliarse mediante el uso de placas de cultivo celular de área superior para aumentar la producción de PMP.
Se recomienda utilizar iPSCs cultivadas en placas recubiertas de laminina 521 para iniciar el proceso de diferenciación. Otros reactivos de recubrimiento pueden reducir el número de PMP producidos más adelante en el proceso18. Del mismo modo, el recubrimiento de las placas para la adhesión de EB durante la generación de PMP mejora la fijación de EB, prolongando así la vida útil del cultivo. El cultivo de EB se ha mantenido hasta por 4 meses, momento en el cual múltiples EB se desprenden y mueren. Sin embargo, otros investigadores informan que cultivan EB hasta por 1 año12. En nuestras manos, los iMG generados a partir de cultivos EB de 3 meses de edad mantienen propiedades funcionales similares a las iMG diferenciadas de los cultivos jóvenes; Los cultivos de más de 3 meses de antigüedad no se han utilizado para la experimentación funcional.
Para optimizar la etapa final de la diferenciación de la microglía de los protocolos originales descritos anteriormente 7,8, incluimos 100 ng/mL de interleucina (IL)-34,7, 5 ng/mL de factor de estimulación de colonias 1 (M-CSF)10, y 50 ng/mL de factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) en el medio iMG. IL-34 y M-CSF estimulan las vías dependientes del receptor CSF1 que son cruciales para mantener el destino y la supervivencia de la microglía8, mientras que TGF-β apoya la homeostasis de la microglía9, promoviendo así un entorno más fisiológico para el compromiso de PMP con el destino de la microglía. Cabe destacar que todo el proceso de diferenciación descrito aquí se realiza en condiciones libres de suero, lo que evita posibles efectos del suero en el comportamiento de iMG y alteraciones en aplicaciones posteriores. Para la experimentación funcional con iMGs, se recomienda realizar experimentos entre 10 y 12 días de diferenciación terminal. Los iMG se han cultivado durante un máximo de 14 días con una reducción modesta de la viabilidad celular, después de lo cual la salud celular se ve significativamente comprometida.
Dado que una de las funciones canónicas de la microglía es la fagocitosis, se incluyó en este protocolo un ensayo para investigar la actividad fagocítica in vitro . Para desarrollar un sistema basado en células humanas, se utilizaron sinaptosomas derivados de LMN humanos i3. La calidad de la preparación del sinaptosoma se evaluó mediante el análisis de Western blot de marcadores sinápticos en este estudio. Además, otras propiedades estructurales y funcionales de la preparación sinaptosómica pueden investigarse mediante microscopía electrónica o inmunotinción antes del ensayo de fagocitosis. El protocolo descrito aquí para obtener sinaptosomas humanos se basa en gran medida en i3LMN, que producen un número relativamente alto de neuronas. Sin embargo, los rendimientos neuronales probablemente serán menores cuando se utilicen otros métodos de diferenciación (es decir, protocolos que requieren cócteles de moléculas pequeñas). En particular, el ensayo de fagocitosis se puede realizar con muchos otros sustratos, como sinaptosomas derivados del cerebro de ratón, proteínas agregadas o células muertas, todos los cuales se pueden etiquetar con colorantes sensibles al pH para monitorear la fagocitosis de manera similar. Se propone utilizar colorantes sensibles al pH porque la señal fluorescente se emite principalmente cuando los sinaptosomas se localizan dentro de compartimentos ácidos durante el procesamiento y degradación del fagosoma en los lisosomas21. Esta propiedad reduce la señal de fondo de los sinaptosomas fuera de las células y facilita el uso de métodos automatizados de cuantificación. Además, los colorantes sensibles al pH permiten la detección de verdaderos eventos de fagocitosis en lugar de la adherencia al sustrato o el acoplamiento a la membrana celular.
Si bien aquí se sugiere usar ~ 35 μg de sinaptosomas por pocillo, la cantidad específica de sinaptosomas humanos y otros sustratos deben optimizarse, ya que las condiciones óptimas dependen de la línea iPSC y las condiciones experimentales. Un rango ideal de sinaptosomas debe dar lugar a una dosis-respuesta en el ensayo de fagocitosis. Demasiados sinaptosomas pueden saturar el sistema, lo que dificulta la detección de diferencias significativas en función del genotipo o grupo de tratamiento. Muy poco material dará como resultado una señal de salida débil en el ensayo. Por esta razón, se recomienda probar múltiples concentraciones de cada sustrato para establecer un ensayo de trabajo. Además, es importante mantener el % de DMSO dentro de un rango seguro para preservar la salud celular.
En este protocolo, la fagocitosis se monitorizó utilizando un sistema de imágenes de células vivas (Tabla de materiales) porque proporciona información cinética sobre la capacidad de absorción de las células. Los microscopios y los sistemas de imágenes que pueden admitir imágenes de células vivas y mantener estables la temperatura, la humedad y las concentraciones deCO2 también son adecuados para este ensayo. Todos los experimentos de fagocitosis descritos aquí fueron fotografiados a 37 °C con 85%-95% de humedad y 5% deCO2. Otros métodos de detección, como la obtención de imágenes de células fijas o la citometría de flujo, también se pueden utilizar para evaluar la fagocitosis utilizando los mismos materiales y protocolos de cultivo celular (hasta e incluyendo la generación de iMG y sinptosomas marcados) cuando las imágenes de células vivas no son factibles o deseadas. Del mismo modo, se puede utilizar otro software de código abierto para el análisis de datos como ImageJ o CellProfiler; Este último permitirá un análisis automatizado comparable al software utilizado aquí.
En resumen, se ilustra la implementación de un protocolo robusto para diferenciar las células similares a la microglía de las iPSC humanas, superando así el recurso limitado de la microglía humana. La microglía diferenciada se puede utilizar para una variedad de aplicaciones en el estudio de enfermedades neurodegenerativas y del neurodesarrollo. Además, se incluye un ensayo de fagocitosis totalmente "humanizado", que ayudará aún más al estudio de la función y disfunción de la microglía en el contexto del desarrollo humano y la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Michael Ward por proporcionar la línea WTC11 hNIL iPSC para la diferenciación de neuronas motoras y a Jackson Laboratories por suministrar la línea KOLF2.1J WT clon B03 iPSC utilizada para la diferenciación de microglía. También agradecemos a Dorothy Schafer por su apoyo durante la implementación de los protocolos, a Anthony Giampetruzzi y John Landers por su ayuda con el sistema de imágenes de células vivas, así como a Hayden Gadd por sus contribuciones técnicas durante las revisiones y a Jonathan Jung por su colaboración en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Dan y Diane Riccio para la Neurociencia de la Escuela de Medicina UMASS Chan y el Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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