Summary
Detta protokoll beskriver differentieringsprocessen av humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) till mikroglialiknande celler för in vitro-experiment. Vi inkluderar också en detaljerad procedur för att generera humana synaptosomer från iPSC-härledda lägre motorneuroner som kan användas som ett substrat för in vitro-fagocytosanalyser med hjälp av levande cellavbildningssystem.
Abstract
Microglia är de bosatta immuncellerna av myeloiskt ursprung som upprätthåller homeostas i hjärnans mikromiljö och har blivit en nyckelspelare i flera neurologiska sjukdomar. Att studera mänsklig mikroglia i hälsa och sjukdom utgör en utmaning på grund av den extremt begränsade tillgången på mänskliga celler. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som härrör från mänskliga individer kan användas för att kringgå denna barriär. Här demonstreras hur man kan differentiera humana iPSC till mikroglialiknande celler (iMG) för in vitro-experiment . Dessa iMGs uppvisar de förväntade och fysiologiska egenskaperna hos microglia, inklusive mikroglialiknande morfologi, uttryck av korrekta markörer och aktiv fagocytos. Dessutom tillhandahålls dokumentation för isolering och märkning av synaptosomsubstrat härledda från humana iPSC-härledda lägre motorneuroner (i3LMN). En live-cell, longitudinell avbildningsanalys används för att övervaka uppslukandet av humana synaptosomer märkta med ett pH-känsligt färgämne, vilket möjliggör undersökningar av iMG: s fagocytiska kapacitet. Protokollen som beskrivs häri är i stort sett tillämpliga på olika områden som undersöker mänsklig mikrogliabiologi och mikroglias bidrag till sjukdom.
Introduction
Microglia är de inneboende immuncellerna i centrala nervsystemet (CNS) och spelar en avgörande roll för att utveckla CNS. Microglia är också viktiga i den vuxna hjärnan för att upprätthålla homeostas och aktivt svara på trauma och sjukdomsprocesser. Kumulativa bevis visar att mikroglia är viktiga bidragsgivare till patogenesen av flera neuroutvecklings- och neurodegenerativa sjukdomar 1,2. Även om nuvarande kunskap om mikroglialbiologi huvudsakligen har härletts från musmodeller, har nyligen genomförda studier belyst viktiga skillnader mellan murin och mänsklig mikroglia, vilket understryker behovet av att utveckla teknik för att studera genetik och biologiska funktioner hos mänsklig mikroglia 3,4. Isolering av mikroglia från dissekerad primärvävnad kan allvarligt modifiera mikrogliaegenskaper5, vilket potentiellt förvirrar resultat som erhållits med sådana celler. Det övergripande målet med denna metod är att differentiera humana iPSC till iMGs och därigenom tillhandahålla ett cellodlingssystem för att studera human mikroglia under basala förhållanden. Dessutom ingår en fagocytosanalys med ett helt mänskligt modellsystem häri som ett sätt att studera funktionaliteten hos iMGs, både som ett kvalitetskontrollmått och för att bedöma iMG-dysfunktion i samband med sjukdom.
Flera protokoll för mikrogliadifferentiering från iPSC har nyligen dykt upp i litteraturen 6,7,8,9,10. Potentiella nackdelar med vissa protokoll inkluderar förlängda eller långa perioder av differentiering, tillägg av flera tillväxtfaktorer och / eller komplexa experimentella förfaranden 6,9,10. Här demonstreras en "användarvänlig" differentieringsmetod som rekapitulerar aspekter av mikroglia-ontogeni genom differentiering av iPSC till prekursorceller som kallas primitiva makrofagprekursorer (PMP)7,11. PMP: er genereras som beskrivits tidigare, med vissa optimeringar som presenteras häri12. PMP: erna efterliknar MYB-oberoende äggula-sac-härledda makrofager, som ger upphov till mikroglia under embryonal utveckling genom att invadera hjärnan innan blod-hjärnbarriären stängs13. För att terminalt differentiera PMP till iMGs använde vi en snabb och förenklad monokulturmetod baserad på protokoll från Haenseler et al. och Brownjohn et al., med vissa modifieringar för att generera en effektiv mikrogliadifferentieringsmetod där iMGs robust uttrycker mikrogliaberikade markörer 7,8. Denna differentieringsmetod kan reproduceras i laboratorier med expertis inom iPSC: s kultur och med forskningsmål som syftar till att studera mikrogliabiologi med hjälp av ett mänskligt modellsystem.
iPSC-härledd mikroglia representerar en biologiskt relevant källa till human mikroglia för in vitro-experiment och är ett viktigt verktyg för att undersöka mikrogliala kanoniska funktioner, inklusive fagocytos. Microglia är de professionella fagocyterna i hjärnan och CNS, där de rensar cellskräp, aggregerade proteiner och nedbrutet myelin14. Microglia fungerar också vid synaptisk ombyggnad genom att uppsluka synapser och i försvaret mot yttre infektioner genom fagocytos av patogener15,16. I detta protokoll bedöms fagocytos av iMGs med användning av humana synaptosomer som material för iMG-uppslukande. För detta ändamål beskrivs en beskrivning för isolerande synaptosomer härledda från humana i3LMN. De i3LMN-härledda humana synaptosomerna är märkta med ett pH-känsligt färgämne som möjliggör kvantifiering av synaptosomer lokaliserade i sura fack under fagosombearbetning och nedbrytning in vitro. En fagocytosanalys med hjälp av levande cellmikroskopi visas för att övervaka den dynamiska processen för mikroglia-uppslukande i realtid. Denna funktionella analys skapar en grund för att undersöka eventuella defekter i mikroglial fagocytos i hälsa och sjukdom med hjälp av ett komplett mänskligt system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla reagenser som används i detta protokoll måste vara sterila och alla steg måste utföras i ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden. Alla iPSC-linjer, liksom underhålls- och differentieringsmedier, beskrivs i materialförteckningen. Mikrogliadifferentieringsmetoden som illustreras nedan är baserad på tidigare publicerade protokoll 7,8,12 med nya modifieringar som beskrivs häri.
1. Microglia differentiering
OBS: En översikt över protokollet sammanfattas i figur 1.
- Inducerad pluripotent stamcellsodling (iPSC)
OBS: Mer information som beskriver iPSC-odlingstekniker finns på andra ställen17.- Upptining och underhåll
- Förbered iPSC-mediet, alikvotera mediet och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader. Tina alikvoterna över natten vid 4 °C och använd dem i upp till 1 vecka. Låt mediet stå i rumstemperatur i minst 1 timme före användning.
- Täck brunnarna på en 6-brunnsplatta genom att tillsätta 1 ml 10 μg/ml laminin 521 utspädd i DPBS innehållande kalcium och magnesium18. Förvara plattorna i en inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 i minst 2 timmar eller helst över natten. När laminin har spätts vid 4 °C i 3 månader.
- Bered 10 mM Rho-kinashämmare Y27632 (ROCK-hämmare) stamlösning genom utspädning i sterilt vatten. Gör alikvoter av ROCK-hämmare för engångsbruk och förvara dem vid -20 °C i upp till 1 år.
- Bered 0,5 mM EDTA genom att späda stamlösningen av 0,5 M EDTA i DPBS.
- För att tina en injektionsflaska med frysta iPSC: er, placera injektionsflaskan i ett vattenbad vid 37 ° C tills den mestadels tinas. Överför omedelbart innehållet i injektionsflaskan till ett 15 ml koniskt rör innehållande 4 ml iPSC-medium. Centrifugera vid 500 × g i 1 min.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna igen genom att tillsätta 1 ml iPSC-medium innehållande 10 μM ROCK-hämmare långsamt mot rörets vägg för att undvika störningar i kolonierna.
- Tillsätt 1,5 ml iPSC-medium innehållande 10 μM ROCK-hämmare till var och en av de belagda brunnarna och överför de återsuspenderade kolonierna droppe för droppe till brunnarna som innehåller mediet.
OBS: Använd 5-7 droppar från steg 1.1.1.6 för odlingsunderhåll men justera den optimala sådddensiteten för varje iPSC-linje. - Fördela cellerna jämnt i brunnarna genom att manuellt blanda plattan från sida till sida och bakifrån och fram. Placera cellerna i en inkubator vid 37 °C och 5 %CO2. Nästa dag, ersätt mediet helt genom att lägga till färskt iPSC-medium utan ROCK-hämmare.
- För underhåll, byt medium varje dag tills cellerna når 80% sammanflöde.
OBS: Cellerna kan underhållas utan att byta medium i 2 dagar om det använda iPSC-mediet möjliggör ett flexibelt matningsschema. Det rekommenderas att begränsa detta till en gång per passage och endast om cellerna är mindre än 50% sammanflytande.
- Dela
- Aspirera mediet och tvätta cellerna med 1 ml DPBS (utan kalcium och magnesium).
- För att lossa cellerna, tillsätt 1 ml 0,5 mM EDTA och inkubera i 2-3 minuter vid rumstemperatur tills kanterna på cellkolonierna lyfter från brunnens yta. Tvätta cellerna igen med DPBS och tillsätt 1 ml iPSC-medium.
- Dissociera cellkolonierna genom att försiktigt skrapa dem med en celllyftare. Skrapa varje område av brunnen bara en gång för att undvika att störa kolonierna.
OBS: Alternativa metoder för att lossa kolonierna från brunnen finns någon annanstans17. - Använd en 1 ml pipettspets, samla cellerna och överför dem droppe för droppe i förhållandet 1: 6 (celler till medium) till förbelagda brunnar (som nämns i steg 1.1.1.2) som innehåller 1,5 ml iPSC-medium.
- Upptining och underhåll
- iPSC-differentiering till mikroglialiknande celler (iMG)
OBS: De små molekylerna och tillväxtfaktorerna löses i sterilfiltrerat 0,1% bovint serumalbumin i DPBS till en stamkoncentration som är 1 000 gånger högre än den slutliga koncentrationen. Det rekommenderas att differentiera iPSC till iMGs under tidiga passager. Rutinmässig karyotypning av iPSC-linjer rekommenderas.- Förbered standardbeläggningslösning
- Tina stamlösningen av ett extracellulärt matrisbeläggningsreagens på is vid 4 °C över natten.
- Prechill mikrocentrifugrör och filterpipettspetsar vid 4 °C.
- Alikvot 250 μl av det koncentrerade extracellulära matrisbeläggningsreagenset i varje rör och placera omedelbart på is. Förvara alikvoterna vid -20 °C.
- För att bereda beläggningslösningen, tina en av de extracellulära matrisbeläggningsreagensalikvoterna på is vid 4 °C över natten.
- Tillsätt 50 ml iskall DMEM-F12 optimerad för tillväxt av humant embryonalt och inducerat pluripotenta stamceller (kallas DMEM-F12) media till ett förkylt koniskt rör och håll det på is.
- Kyl en 1 ml pipettspets genom att pipettera iskall DMEM-F12 upp och ner flera gånger och använd sedan omedelbart pipettspetsen för att överföra 250 μL av det extracellulära matrisbeläggningsreagenset till det koniska röret som innehåller DMEM-F12-mediet.
OBS: Standardbeläggningslösningen kan förvaras i 2 veckor vid 4 °C.
- Bildning av embryoidkropp (EB)
- Förbered EB-medium som kan hållas vid 4 °C i upp till 4 dagar.
- När iPSC har nått 80% sammanflöde, dissociera kolonierna genom att tvätta med 1 ml DPBS och tillsätta 1 ml av ett dissociationsreagens i 2 minuter vid 37 ° C. Lossa kolonierna med hjälp av en celllyftare genom att skrapa flera gånger för att skapa en encellssuspension. Samla cellerna och överför allt till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 9 ml DPBS.
- Centrifugera cellerna vid 500 × g i 1 min, ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml EB-medium. Ta 10 μl celler och späd 1:1 med Trypan blå. Räkna cellerna med en hemacytometer, och baserat på cellantalet, späd cellstammen till en slutlig utspädning av 10 000 celler per 100 μl. För pläteringsceller, tillsätt 100 μL av de utspädda cellerna per brunn i en låg vidhäftning, rundbotten, 96-brunnsplatta.
OBS: I allmänhet kan 48 brunnar av 96-brunnsplattan erhållas från varje 80% sammanflytande brunn av iPSC. - Centrifugera plattan vid 125 × g i 3 minuter och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 4 dagar. Utför en halvmediumförändring på dag 2 genom att använda en flerkanalig pipett och försiktigt samla 50 μL gammalt medium och sedan lägga tillbaka 50 μL färskt EB-medium.
OBS: På dag 4 kommer iPSC att bilda sfäriska cellulära strukturer som kallas EBs som beskrivs i resultatavsnittet. EB-differentieringsprocessen kan vid behov förlängas upp till 7 dagar.
- Generering av primitiva makrofagprekursorer (PMP)
- Förbered PMP-basmediet, sterilfiltret, och förvara det vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Täck brunnarna på en 6-brunnsplatta genom att tillsätta 1 ml iskall matrigelbeläggningslösning och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i minst 2 timmar eller helst över natten.
- På dag 4 av EB-differentiering, överför EB: erna till de matrigelbelagda brunnarna genom att samla EB: erna med 1 ml pipettspetsar (med en pipett). Pipettera upp och ner en eller två gånger för att lossa EBs från brunnen. Håll 6-brunnsplattan i en lutad vinkel så att EB: erna kan slå sig ner vid brunnens kant.
OBS: Nio eller tio EBs kan pläteras per belagd brunn. - När alla EBs har lagt sig, pipettera försiktigt och ta bort det gamla mediet med en 1 ml pipettspets medan du håller EB: erna vid brunnens kant. Tillsätt 3 ml nyberedd PMP komplett medium till varje brunn. Fördela cellerna jämnt i brunnarna genom att manuellt blanda plattan från sida till sida och bakifrån och fram. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2.
- Stör inte plattan i 7 dagar så att EB: erna kan fästa på botten av brunnen. Efter den tiden, utför en halvmediumförändring med PMP komplett medium.
OBS: Vid denna tidpunkt bör de flesta EB: erna fästas på plattan. Alla flytande EBs kan tas bort. - Efter 5-7 dagar, inspektera EB: erna under ett ljusfältmikroskop med 4x förstoring för att säkerställa att de är fästa vid botten av brunnarna. Byt medium enligt beskrivningen i 1.2.3.5. På dag 21, utför en fullständig mediumbyte med 3 ml PMP komplett medium.
OBS: Myeloida förfäder som flyter i mediet kan vara uppenbara vid denna tidpunkt. Dessa celler ska kasseras under mediumförändringen. - På dag 28, leta efter runda celler som kallas PMP i supernatanten och samla mediet som innehåller PMP: erna med en 10 ml pipett och automatisk pipettor. Var försiktig så att du inte stör EB: erna. Överför PMP:erna och mediet till ett koniskt 15 ml rör och fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.2.4.
OBS: Vanligtvis kan PMP: er från samma iPSC-linje samlas in från fem brunnar i en 6-brunnsplatta och samlas i ett enda 15 ml koniskt rör. - Tillsätt 3 ml färskt PMP-komplett medium för ytterligare underhåll av EBs. Eftersom PMP: er kontinuerligt dyker upp från EBs i mer än 3 månader, samla in dem var 4-7: e dag (låt inte mediet ändra färg till en gul ton) enligt beskrivningen i steg 1.2.3.7 och 1.2.3.8.
OBS: Även om PMP kan samlas in i flera månader kan de ändra fenotyp över tiden.
- Differentiering till iMGs
- Förbered iMG-basmediet (Materialtabell), sterilfilter och förvara det vid 4 °C i upp till 3 veckor.
- När PMP:erna har samlats upp i ett 15 ml koniskt rör, centrifugera dem vid 200 × g i 4 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera PMP: erna med 1-2 ml iMG basalmedium. Räkna cellerna med en hemocytometer genom att ta en liten alikvot och späda 1:1 med Trypan blue.
OBS: 0,5-1,5 × 106 PMP erhålls normalt varje vecka beroende på iPSC-linjen och EB-kulturens ålder. - Centrifugera resten av cellerna igen vid 200 × g i 4 min. Späd PMP: erna till önskad koncentration så att cellerna pläteras med en densitet av ~ 105 / cm2 på cellodlingsbehandlade plattor med nyberedt iMG-komplett medium. Utför en halvmediumförändring med nyberedd iMG komplett medium var 3-4: e dag under 10-12 dagar för att möjliggöra terminaldifferentiering.
OBS: Vid denna tidpunkt bör cellerna förvärva mikroglialiknande morfologi. För att bekräfta PMP: s engagemang för mikroglia öde utförs immunofluorescensanalys för att bekräfta uttrycket av mikrogliaberikade markörer såsom purinergreceptor P2RY12 och transmembranprotein 119 (TMEM119)9. - För att bevara cellhälsa och livskraft, utför alla experiment mellan dag 10 till 12 av iMG-differentiering.
- Förbered standardbeläggningslösning
2. Fagocytosanalys med hjälp av motor-neuron-härledda humana synaptosomer
- Transkriptionsfaktormedierad differentiering av iPSC-härledda lägre motorneuroner (i3LMN)
OBS: En WTC11-linje med stabil införande av hNIL-inducerbar transkriptionsfaktorkassett innehållande neurogenin-2 (NGN2), ö-1 (ISL1) och LIM homeobox 3 (LHX3) transkriptionsfaktorer i CLYBL safe harbor-locus användes för differentieringsprocessen som beskrivits tidigare17. iPSC-linjen bibehölls enligt beskrivningen i steg 1.1.1 men med de beläggningsförhållanden som beskrivs i steg 1.2.1. Alla extracellulära matrisbeläggningsreagens kan användas för odling av iPSC som kommer att användas för neuronal differentiering eftersom laminin 521 inte krävs. Alla medier är jämställda med omgivningstemperatur i minst 1 h före användning.- Täck 10 cm skålar med 5 ml standardlösning enligt beskrivningen i steg 1.2.1.
OBS: Här användes 3-4 10 cm rätter per differentiering. - Förbered Induction Base-mediet, sterilfilter, och förvara det vid 4 °C i upp till 3 veckor.
- Förbered Neuron-medium, sterilfilter, och förvara det vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Bered boratbuffert genom att blanda 100 mM borsyra, 25 mM natriumtetraborat och 75 mM natriumklorid i sterilt vatten. Justera pH-värdet till 8,5 och sterilfiltrera det.
- När iPSC har nått 80% sammanflöde, tvätta cellerna med DPBS och lossa kolonierna genom att tillsätta 0,5 mM EDTA.
OBS: Två brunnar räcker vanligtvis för varje 10 cm skål. - Inkubera cellerna i 4-5 minuter vid omgivningstemperatur. Ta bort EDTA och tillsätt 3 ml DMEM/F12 med HEPES till varje brunn.
- Skrapa cellerna med en celllyftare och använd en 10 ml pipett för att ta bort cellerna från botten av brunnen genom att försiktigt pipettera upp och ner 2-3x.
- Samla cellerna i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 × g i 3 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 3 ml iPSC-medium innehållande 10 μM ROCK-hämmare och räkna dem med hjälp av en hemacytometer.
- Platta 1,5 × 106 iPSC i en förbelagd 10 cm skål med 12 ml iPSC-medium innehållande 10 μM ROCK-hämmare.
- Nästa dag, ta bort mediet och tvätta cellerna med DPBS. Tillsätt 12 ml nyberedt komplett induktionsmedium för att inducera uttrycket av transkriptionsfaktorerna.
- På dag 2, täck 10 cm skålar med 5 ml neuronbeläggningslösning framställd med lika stora volymer av 0,1 mg / ml poly-D-lysin och 1 mg / ml poly-L-ornitin utspädd i boratbuffert. Inkubera över natten vid 37 °C och 5 %CO2.
- På dag 3, tvätta de belagda diskarna med sterilt vatten 3x, aspirera vattnet helt och låt diskarna torka genom att luta plattorna och lämna dem delvis avtäckta i ett biosäkerhetsskåp i minst 1 timme vid omgivningstemperatur.
- När diskarna har torkat helt, täck dem med 6 ml komplett induktionsmedium kompletterat med 15 μg/ml laminin och 40 μM BrdU i minst 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2.
OBS: BrdU-behandling rekommenderas för att eliminera mitotiskt aktiva celler och därmed förbättra renheten hos neuronala kulturer. Effekterna av BrdU på neuronal hälsa är minimala. - Behandla de differentierande cellerna med 3 ml dissociationsreagens per 10 cm skål och inkubera i 3-4 minuter vid omgivningstemperatur.
- Tillsätt 6 ml DPBS i plattan utan att ta bort dissociationsreagenset och pipettera cellerna i lösning upp och ner 4-5x med en 10 ml pipett för att dissociera cellerna.
- Samla cellsuspensionen och för den genom en 40 μm cellsil in i ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 1 ml induktionsbasmedium för att skölja silen.
- Centrifugera cellerna vid 300 × g i 5 minuter. Aspirera mediet och återsuspendera cellerna i 3 ml komplett induktionsmedium innehållande 40 μM BrdU.
- Räkna cellerna med en hemocytometer. Platta ca 2,5 × 10 6 celler per 10 cm skål i förbelagda skålar genom att späda cellerna i6 ml komplett induktionsmedium innehållande 40 μM BrdU utan att avlägsna beläggningslösningen som tillsattes i steg 2.1.14.
- På dag 4, aspirera mediet, tvätta cellerna 1x med DPBS och tillsätt färskt komplett induktionsmedium som innehåller 40 μM BrdU.
- På dag 6, aspirera mediet, tvätta cellerna 1x med DPBS och tillsätt Neuron-medium kompletterat med 1 μg / ml laminin.
- Vid dag 9, ändra 1/3rd av mediet genom att ersätta det med färskt Neuron-medium kompletterat med 1 μg / ml laminin.
- Behåll i 3 LMN i ytterligare 25 dagar genom att utföra halva medelstora förändringar med Neuron medium kompletterat med färskt 1 μg/ml laminin var3-4:e dag.
OBS: Vid denna tidpunkt bör i3LMN presentera en neuronal morfologi med långa processer. Neuroner tenderar också att bilda klumpar eller kluster av celler. En mer detaljerad beskrivning av hur man validerar differentieringen av i3LMN finns på andra ställen17.
- Täck 10 cm skålar med 5 ml standardlösning enligt beskrivningen i steg 1.2.1.
- Synaptosomrening och märkning
OBS: Håll sterila förhållanden och utför alla steg inuti ett biosäkerhetsskåp.- Tvätta i3 LMN två gånger med DPBS.
- Tillsätt 2 ml iskallt celllysreagens för isolering av synaptosomer, inkubera på is i 2 minuter och skrapa neuronerna ordentligt.
- Överför lysatet till flera 2 ml mikrorör (~1,5 ml lysat per rör) och centrifugera vid 1 200 × g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: Håll rören på is under hela denna procedur. - Samla upp supernatanten (kassera pelleten) och centrifugera vid 15 000 × g i 20 minuter vid 4 °C. Spara och återsuspendera pelleten som innehåller synaptosomerna med en liknande volym (som den ursprungliga lysaten) på 5% DMSO i DPBS.
OBS: Synaptosomerna kan omedelbart märkas med en fluorofor eller förvaras vid -80 ° C för framtida bruk. - Utför en bicinchoninsyra (BCA) proteinanalys för alla rör för att bedöma det totala utbytet av protein i synaptosompreparatet.
OBS: Andra analyser för att mäta proteinkoncentrationen kan användas. Det totala proteinutbytet från olika beredningar har tagits med i tabell 1 som referens. Det rekommenderas att utföra western blot-analys av synaptosompreparatet för att bekräfta närvaron av presynaptiska och postsynaptiska proteiner. Här valdes den presynaptiska markören, synaptofysin (SYP), och den postsynaptiska markören, postsynaptic density protein 95 (PSD95) för western blotting-analys som beskrivits tidigare19. - Förbered en lösning av 100 mM natriumbikarbonat i vatten, justera pH till 8,5 och sterilfilter.
- Lösgör 1 mg frystorkat pulver av det använda pH-känsliga färgämnet i 150 μl DMSO. Gör alikvoter för engångsbruk och förvara dem vid -80 °C.
- Centrifugera synaptosomerna vid 15 000 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Späd upp till 1 mg synaptosomer i 100 μl 100 mM natriumbikarbonatlösning.
- För att märka synaptosomerna, tillsätt 1 μL av det rekonstituerade pH-känsliga färgämnet per 1 mg synaptosomer och täck reaktionen med aluminiumfolie för att undvika ljusexponering. Skaka vid rumstemperatur i 2 timmar med en rörskakare.
- Tillsätt 1 ml DPBS i röret och centrifugera de märkta synaptosomerna vid 15 000 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och utför ytterligare fyra tvättar enligt beskrivningen i steg 2.2.11.
- Efter den sista tvätten och snurrningen, ta bort supernatanten så mycket som möjligt utan att störa pelleten och återsuspendera de märkta synaptosomerna med 5% DMSO i DPBS vid en volym för önskad koncentration (0,7 μg / μL används här). Förbered alikvoter för engångsbruk och förvara vid -80 °C. Var noga med att undvika ljusexponering för de märkta synaptosomerna.
- Analys av fagocytos i levande celler
- Platta 20–30 × 10 4 PMP i 96-brunnsplattor i 100 μL iMG komplett medium och följ differentieringsprocessen i 10 dagar enligt steg 1.2.4.
- På analysdagen, förbered kärnfärgningslösningen genom att tillsätta 1 droppe av en kärnfläck för levande celler i 2 ml iMG basalmedium.
- Ta bort 40 μl medium per brunn på 96-brunnsplattan och tillsätt 10 μl kärnfärgningslösningen med en flerkanalig pipett. Inkubera plattan vid 37 °C och 5 %CO2 i 2 timmar.
- Tina de märkta synaptosomerna på is och försiktigt sonikera med en vattensonicator i 1 min. Överför omedelbart synaptosomerna tillbaka till is. Späd de märkta synaptosomerna i iMG-komplett medium i ett förhållande av 1 μL synaptosomer per 50 μL medium.
OBS: Koncentrationen av synaptosom är analysberoende och kan kräva optimering. För att upprätthålla en relativt låg procentandel (dvs. 0,1% eller mindre) av DMSO i mediet rekommenderas att man inte tillsätter mer än 2 μl synaptosomer per brunn. - Som negativ kontroll, förbehandla några av brunnarna med cytochalasin D för att hämma aktinpolymerisation och därmed fagocytos. Förbered en lösning av 60 μM cytochalasin D i iMG komplett medium. Tillsätt 10 μl av denna lösning till varje brunn för en slutlig koncentration på 10 μM och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2i 30 minuter.
- Ta bort plattan från inkubatorn och inkubera vid 10 °C i 10 minuter. Håll plattan på is och tillsätt 50 μl medium som innehåller synaptosomer, beredda enligt beskrivningen i steg 2.3.4.
- Centrifugera plattan vid 270 × g i 3 minuter vid 10 °C och håll plattan på is tills avbildningen hämtas.
- Bildinsamling och analys
- Sätt i plattan i en levande cellavbildningsläsare och välj de brunnar som ska analyseras.
- Välj en 20x objektivlins.
- Justera fokus, lysdiodintensitet (LED), integrationstid och förstärkning av de ljusa fält- och blåa (4',6-diamidino-2-fenylindol- [DAPI]) kanalerna. Synaptosomfluorescensen bör vara försumbar vid den ursprungliga tidpunkten. Om du vill fokusera på den röda (RFP) kanalen använder du brightfield-kanalen som referens. Integrationstiden och vinsten kan variera mellan experiment; använd dessa initiala inställningar för den röda kanalen: LED: 4, integrationstid: 250 och förstärkning: 5.
- Välj antalet enskilda plattor som ska förvärvas i ett montage per brunn (skaffa 16 plattor i mitten av brunnen och därigenom avbilda cirka 5% av det totala brunnsområdet). Ställ in temperaturen på 37 °C och önskat tidsintervall för avbildning.
OBS: Bilder förvärvades var 1 - 2 h i upp till 16 timmar i denna studie. - Öppna analysprogramvaran.
- Öppna experimentet som innehåller bilderna. Klicka på ikonen Datareduktion.
- I menyn väljer du Bildsömnad under Bildbehandling för att skapa en komplett bild från de 4 x 4 enskilda panelerna i montaget med parametrarna som beskrivs i tabell 2.
- När de sammanfogade bilderna har skapats definierar du en intensitetströskel med hjälp av DAPI- och RFP-kanalerna för dessa bilder. Öppna en bild och klicka på Analysera; Under Analys väljer du Cellanalys och under Identifieringskanal väljer du en sydd bild antingen i DAPI- eller RFP-kanalerna. Gå till fliken Primär mask och antal och upprätta ett tröskelvärde och objektstorleksvärden som korrekt väljer cellkärnorna i DAPI-kanalen eller synaptosomsignalen i RFP-kanalen. Upprepa processen med olika bilder tills parametrar som kan tillämpas på hela experimentet optimeras.
OBS: Föreslagna värden finns i tabell 2. - Om du vill räkna antalet kärnor går du till menyn Datareduktion och väljer Cellanalys under Bildanalys. Gå till fliken Primär mask och antal och under Kanal väljer du DAPI-sydda bilder och använder parametrarna som beskrivs i tabell 2.
- Gå till fliken Beräknade måttenheter och välj Antal celler. För att få området för synaptosomsignalen, gå till menyn Datareduktion och välj Cellanalys under Analys.
- Gå till fliken Primär mask och antal och under Kanal väljer du RFP-sydda bilder och använder parametrarna som beskrivs i tabell 2.
- Gå till fliken Beräknade måttenheter och välj Objektsummaområde. I Datareduktion fliken , klicka på OK och låt programvaran analysera alla förvärvade bilder.
- Exportera värdena för objektsummans yta och antal celler för varje tidpunkt. Dela objektsummans yta med cellantalet för att beräkna det normaliserade området per tidpunkt. Om du jämför flera behandlingar eller genotyper, beräkna fagocytosindexet med hjälp av ekvation (1):
(1) - Spara resultaten och integrera data.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att generera iMG med detta protokoll är det viktigt att börja med odifferentierade iPSC som visar kompakt kolonimorfologi med väldefinierade kanter (figur 2A). Dissocierade iPSC som upprätthålls enligt beskrivningen i EB-bildningsavsnittet kommer att bilda sfäriska aggregat, kallade EBs, som kommer att växa i storlek fram till dag 4 av differentiering (figur 2B). När EB: erna har samlats in och pläterats under lämpliga förhållanden för PMP-generering, fäster de på de matrigelbelagda plattorna, och ett lager av celler kommer att spridas och omge de sfäriska aggregaten (figur 2C). Felaktiga EBs lossnar från plattan och bör elimineras. Från dag 14 till 21 av PMP-generering kan potentiellt olika celltyper dyka upp och flyta i mediet; Dessa celler ska kasseras under medieändringar12. På dag 28 kommer runda celler med ett stort cytoplasma-till-kärnförhållande att visas i suspension (Figur 2D), kallade PMP. Dessa celler produceras kontinuerligt och kan skördas varje vecka under medelstora förändringar i upp till 3 månader. Antalet PMP som skördas varje vecka varierar och beror på iPSC-linjen och kulturens ålder. avkastningen minskar i allmänhet med tiden. Det rekommenderas starkt att odla iPSC i laminin 521-belagda plattor istället för Matrigel, eftersom PMP-utbytet är högre när iPSC bibehålls under de tidigare förhållanden som rapporterats tidigare och i denna studie (Figur 2E)18.
Efter att PMP har exponerats för iMG-medium i 10-12 dagar förvärvar cellerna en mikroglialiknande morfologi med en liten cytoplasma och närvaron av långsträckta processer (Figur 3A). För att verifiera mikrogliaidentiteten utförde vi immunofluorescensfärgning med antikroppar mot den myeloida markörjoniserade kalciumbindande adaptermolekylen 1 (IBA1) och de mikrogliaberikade markörerna purinergreceptor P2RY12 och transmembranprotein 119 (TMEM119) som beskrivits tidigare20 (se även materialtabellen). Vanligtvis uttrycker >95% av cellerna IBA1 och cirka 90% av cellerna uttrycker P2RY12 och TMEM119 (Figur 3B).
För att bedöma den fagocytiska kapaciteten hos iMGs användes i3LMN-härledda humana synaptosomer märkta med ett pH-känsligt färgämne. För att verifiera att synaptosompreparatet behåller kanoniska strukturella egenskaper bekräftades anrikningen av den presynaptiska markören, synaptofysin (SYP) och den postsynaptiska markören, postsynaptiskt densitetsprotein 95 (PSD95)19 genom Western blot-analys (figur 4) utförd enligt beskrivningen före20 (se även materialförteckningen ). Synaptosomer märkta med ett pH-känsligt färgämne blir fluorescerande efter att ha uppslukats av iMGs och när de är lokaliserade i intracellulära sura (dvs låga pH) fack.
Vid den första tidpunkten var den röda fluorescerande signalen minimal, eftersom de flesta synaptosomerna ännu inte var fagocytoserade. Efter 30 min upptäcktes en röd fluorescerande signal och ökade ytterligare med tiden. Vid 10 h var den röda fluorescerande signalen robust, eftersom de flesta synaptosomerna hade uppslukats och lokaliserades till sura intracellulära fack via processen med fagocytos (figur 5A). Cytochalasin D är en aktinpolymerisationshämmare som ofta används för att blockera fagocytos. Som förväntat observerade vi en stark minskning av den röda fluorescerande signalen i cytochalasin D-behandlade iMGs, vilket indikerar att den detekterade signalen härrör från fagocytiska händelser. Vi märkte också att iMGs visar förändringar i morfologi efter 10 h fagocytos som inte upptäcktes i cytochalasin D-behandlade iMGs, möjligen på grund av bristen på aktinombyggnad i cytochalasin D-behandlade iMGs. Förändringar i mikrogliamorfologi är vanligtvis förknippade med aktiveringsstatus2.
Genom att använda den beskrivna automatiserade kvantifieringsmetoden mätte vi den totala ytan av röd signal vid varje tidpunkt och normaliserade den till det cellnummer som erhölls genom att räkna kärnorna. Resultaten indikerar att området med uppslukade synaptosomer ökade med tiden tills en platå uppnåddes vid 16 timmar. Som förväntat ökade inte området med röd signal från cytochalasin D-behandlade celler med tiden, eftersom fagocytos hämmades (figur 5B). Tillsammans indikerar dessa resultat att iMG kan fagocytosera hjärnsjukdomsrelevant material och är lämpliga för funktionella studier.
Figur 1: Schematisk för protokollet för att differentiera iPSC till mikroglialiknande celler. På dag 0, när iPSC har nått 80% sammanflöde, dissocieras kolonierna i enstaka celler och odlas i EB-medium för att inducera EB-bildning. På dag 4 samlas EBs in och pläteras i PMP-medium för att inducera PMP-generering. Efter 28 dagar samlas PMP:er in och differentieras terminalt till iMG med hjälp av iMG-medium. PMP kan samlas in varje vecka i upp till 3 månader. Förkortningar: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iMGs = mikroglialiknande celler; EB = embryoid kropp; PMP = primitiv makrofagprekursor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cellmorfologi bedömd med ljusmikroskopi vid differentieringsstegen från iPSC till PMP. (A) iPSC upprätthålls i iPSC-medium tills 80% sammanflöde. (B) En embryoid kropp efter 4 dagars differentiering i EB-medium. C) EBs fästa vid belagda plattor och (D) PMP som uppstår i suspension från EBs efter 28 dagars odling i PMP-medium. (E) Antal PMP som samlats in från ~ 48 EBs vid vecka 1 (efter 28 dagars PMP-differentiering) och vecka 12. Stapeldiagram visar medelvärdet av sex oberoende differentieringar (datapunkter) från två olika iPSC-linjer. Statistik erhölls genom tvåvägs ANOVA och Šídáks flera jämförelser test. Skalstänger = 1 000 μm (A), 400 μm (B-D). Förkortningar: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; iMGs = mikroglialiknande celler; EB = embryoid kropp; PMP = primitiv makrofagprekursor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: iMGs differentierade av detta protokoll visar bona fide microglia-egenskaper efter 10 dagars terminal differentiering. (A) Representativ ljusfältsbild av iMGs som presenterar mikroglialiknande morfologi. Skala bar = 400 μm. (B) Representativa immunofluorescensbilder av iMGs som uttrycker myeloid/ mikrogliamarkörerna IBA1, P2RY12 och TMEM119. Skalstreck= 400 μm (A), 50 μm (B). Förkortningar: iMGs = mikroglialiknande celler; IBA1 = joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1; P2RY12 = purinerg receptor P2RY12; TMEM119 = transmembranprotein 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: i3LMN-härledda humana synaptosomer uttryckta synaptiska markörer genom western blot-analys. Representativ western blot-analys av ett humant synaptosompreparat härrörande från i3LMN efter 28 dagars kultur undersökt med den postsynaptiska markören, PSD95, den presynaptiska markören, SYP och β-tubulin. Förkortningar: i3LMN = iPSC-härledda lägre motorneuroner; PSD95 = postsynaptiskt densitetsprotein 95; SYP = synaptofysin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fagocytosanalys av iMGs med humana synaptosomer märkta med ett pH-känsligt färgämne och övervakas av live-cell, longitudinell avbildning. (A) Representativa ljusfälts- och fluorescensmontage av iMG med kärnfärgning (blå kanal) exponerade för märkta humana synaptosomer (röd kanal) med och utan cytoD-behandling vid de angivna tidpunkterna. Montagena skapades genom efterförvärvsbearbetning av 16 plattor förvärvade vid 20x. Skalstänger = 400 μm. (B) Kvantifiering av området för synaptosomfluorescerande signal normaliserad till cellnumret. Datapunkter anger medelvärdet ± SEM för tre tekniska replikat. Varje kurva visar kvantifieringen för två oberoende differentieringar (iMGs 1 och 2) från en iPSC-linje med och utan cytoD-behandling. Förkortningar: iMGs = mikroglialiknande celler; cytoD = cytochalasin D. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antal 10 cm rätter av DIF28 i3LMN | Totalt protein (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabell 1: Totalt proteinutbyte efter synaptosomisolering från iPSC-härledda lägre motorneuroner vid 28 dagars differentiering. Total proteinmängd erhållen från fyra oberoende differentieringar efter att synaptosomer extraherats. Olika antal 10 cm rätter innehållande i3LMN skördades i varje differentiering. Proteinutbytet mättes med BCA-proteinanalys. Förkortningar: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; i3LMN = iPSC-härledda lägre motorneuroner; DIF28 = 28 dagars differentiering; BCA = bicinchoninsyra.
| Parametrar | Värde |
| Kanal för registrering | Ljust fält, DAPI och RFP |
| Fusionsmetod | Linjär blandning |
| Beskär sydd bild för att ta bort svarta rektanglar på kantlinjerna | Rutig |
| Förminska den slutliga bilden | Rutig |
| Parametrar | Värde |
| Tröskel | Bestäms av användaren |
| Bakgrund | Mörk |
| Dela vidrörande objekt | Rutig |
| Fyll hål i masker | Rutig |
| objektets storlek | 7 μm |
| objektstorlek | 30 μm |
| Inkludera primära kantobjekt | Rutig |
| Analysera hela bilden | Rutig |
| Parametrar | Värde |
| Tröskel | Bestäms av användaren |
| Bakgrund | Mörk |
| Dela vidrörande objekt | Rutig |
| Fyll hål i masker | Rutig |
| objektets storlek | 5 μm |
| objektstorlek | 100 μm |
| Inkludera primära kantobjekt | Rutig |
| Analysera hela bilden | Rutig |
Tabell 2: Parametrar som används för bildinsamling och dataanalys. Föreslagna parametrar att överväga för bildförvärv under fagocytosanalysen och för analys av de förvärvade bilderna listas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Differentieringsprotokollet som beskrivs här ger en effektiv metod för att erhålla iPSC-härledda mikroglialiknande celler på ~ 6-8 veckor med hög renhet och i ett tillräckligt utbyte för att utföra immunofluorescensexperiment och andra analyser som kräver ett högre antal celler. Detta protokoll har gett upp till 1 × 106 iMG på 1 vecka, vilket möjliggör protein- och RNA-extraktion och motsvarande nedströmsanalyser (t.ex. RNASeq, qRT-PCR, western blot, masspektrometri). Som sagt, en begränsning av detta protokoll är att utbytet av iMGs kan begränsa vissa applikationer. Ytterligare modifieringar kan genomföras för att ackumulera PMP från olika veckor och upprätthålla en homogen kultur i suspension tills tillräckligt många förfäder samlas in för att fortsätta med differentieringsprocessen på en gång18. Alternativt kan differentieringen av EBs skalas upp genom att använda cellodlingsplattor med högre område för att öka produktionen av PMP.
Det rekommenderas att använda iPSCs odlade i laminin 521-belagda plattor för att initiera differentieringsprocessen. Andra beläggningsreagenser kan minska antalet PMP som produceras senare i processen18. På samma sätt förbättrar beläggning av plattorna för EB-vidhäftning under PMP-generering EB-fastsättning, vilket förlänger kulturens livslängd. EB-kulturen har upprätthållits i upp till 4 månader, då flera EBs lossnar och dör. Andra forskare rapporterar dock att de odlar EBs i upp till 1 år12. I våra händer upprätthåller iMGs genererade från 3 månader gamla EB-kulturer liknande funktionella egenskaper som iMGs differentierade från unga kulturer; kulturer äldre än 3 månader har inte använts för funktionella experiment.
För att optimera det sista steget av mikrogliadifferentiering från de ursprungliga protokollensom beskrivs ovan 7,8 inkluderade vi 100 ng / ml interleukin (IL) -34,7 5 ng / ml kolonistimuleringsfaktor 1 (M-CSF) 10 och 50 ng / ml transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-β) i iMG-mediet. IL-34 och M-CSF stimulerar CSF1-receptorberoende vägar som är avgörande för att upprätthålla mikroglia öde och överlevnad8 medan TGF-β stöder mikrogliahomeostas9, vilket främjar en mer fysiologisk miljö för PMP-engagemang för mikroglia öde. Observera att hela differentieringsprocessen som beskrivs här utförs under serumfria förhållanden, vilket förhindrar eventuella effekter av serum på iMG-beteende och förändringar i nedströmsapplikationer. För funktionellt experiment med iMGs rekommenderas att experiment utförs mellan 10 och 12 dagars terminal differentiering. iMGs har odlats i upp till 14 dagar med en blygsam minskning av cellviabiliteten, varefter cellhälsan äventyras avsevärt.
Eftersom en av de kanoniska funktionerna hos microglia är fagocytos, inkluderades en analys för att undersöka fagocytisk aktivitet in vitro i detta protokoll. För att utveckla ett mänskligt cellbaserat system användes synaptosomer härledda från humana i3LMN. Kvaliteten på synaptosompreparatet bedömdes genom western blot-analys av synaptiska markörer i denna studie. Dessutom kan andra strukturella och funktionella egenskaper hos synaptosompreparatet undersökas genom elektronmikroskopi eller immunfärgning före fagocytosanalysen. Protokollet som beskrivs här för att erhålla mänskliga synaptosomer är starkt beroende av i3LMNs, vilket ger ett relativt stort antal neuroner. Emellertid kommer neuronala utbyten sannolikt att vara lägre vid användning av andra differentieringsmetoder (dvs. protokoll som kräver cocktails av små molekyler). I synnerhet kan fagocytosanalysen utföras med flera andra substrat, såsom mus-hjärn-härledda synaptosomer, aggregerade proteiner eller döda celler, som alla kan märkas med pH-känsliga färgämnen för att övervaka fagocytos på ett liknande sätt. Det föreslås att använda pH-känsliga färgämnen eftersom den fluorescerande signalen huvudsakligen emitteras när synaptosomerna är lokaliserade i syrafack under fagosombearbetning och nedbrytning i lysosomerna21. Denna egenskap minskar bakgrundssignalen från synaptosomer utanför cellerna och underlättar användningen av automatiserade kvantifieringsmetoder. Dessutom möjliggör pH-känsliga färgämnen detektion av sanna fagocytoshändelser i motsats till substratföljsamhet eller dockning på cellmembranet.
Medan det här föreslås att använda ~ 35 μg synaptosomer per brunn, bör den specifika mängden humana synaptosomer och andra substrat optimeras, eftersom optimala förhållanden beror på iPSC-linjen och de experimentella förhållandena. Ett idealiskt intervall av synaptosomer bör resultera i ett dos-svar i fagocytosanalysen. För mycket synaptosomer kan mätta systemet, vilket gör det svårt att upptäcka meningsfulla skillnader som en funktion av genotyp eller behandlingsgrupp. För lite material kommer att resultera i en svag utsignal i analysen. Av denna anledning rekommenderas det att testa flera koncentrationer av varje substrat för att upprätta en arbetsanalys. Dessutom är det viktigt att hålla % DMSO inom ett säkert intervall för att bevara cellhälsan.
I detta protokoll övervakades fagocytos med hjälp av ett levande cellavbildningssystem (materialtabell) eftersom det ger kinetisk information om cellernas uppslukande kapacitet. Mikroskop och bildsystem som kan stödja levande cellavbildning och upprätthålla stabil temperatur, fuktighet och CO 2-koncentrationer är också lämpliga för denna analys. Alla fagocytosexperiment som beskrivs här avbildades vid 37 ° C med 85% -95% luftfuktighet och 5% CO2. Andra detektionsmetoder såsom avbildning av fasta celler eller flödescytometri kan också användas för att bedöma fagocytos med samma material och cellodlingsprotokoll (upp till och med generering av iMG och märkta synptosomer) när levande cellavbildning inte är genomförbar eller önskad. På samma sätt kan annan programvara med öppen källkod användas för dataanalys som ImageJ eller CellProfiler; Det senare möjliggör en automatiserad analys som är jämförbar med den programvara som används här.
Sammanfattningsvis illustreras implementeringen av ett robust protokoll för att skilja mikroglialiknande celler från mänskliga iPSC: er, vilket övervinner den begränsade resursen hos mänsklig mikroglia. Differentierad mikroglia kan användas för en mängd olika tillämpningar i studien av neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar. Dessutom ingår en helt "humaniserad" fagocytosanalys, vilket ytterligare kommer att hjälpa till att studera mikrogliafunktion och dysfunktion i samband med mänsklig utveckling och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna tackar Michael Ward för att ha tillhandahållit WTC11 hNIL iPSC-linjen för motorneurondifferentiering och Jackson Laboratories för att leverera KOLF2.1J WT-klon B03 iPSC-linjen som används för mikrogliadifferentiering. Vi tackar också Dorothy Schafer för hennes stöd under implementeringen av protokollen, Anthony Giampetruzzi och John Landers för deras hjälp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd för hans tekniska bidrag under revisioner och Jonathan Jung för hans samarbete i denna studie. Detta arbete stöddes av Dan och Diane Riccio Fund for Neuroscience från UMASS Chan Medical School och Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
