Summary
Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.
Abstract
Onlangs zijn vloeibare biopsieën gebruikt om verschillende ziekten te diagnosticeren, waaronder kanker. Lichaamsvloeistoffen bevatten veel stoffen, waaronder cellen, eiwitten en nucleïnezuren afkomstig uit normale weefsels, maar sommige van deze stoffen zijn ook afkomstig uit het zieke gebied. Het onderzoek en de analyse van deze stoffen in de lichaamsvloeistoffen spelen een cruciale rol bij de diagnose van verschillende ziekten. Daarom is het belangrijk om de vereiste stoffen nauwkeurig te scheiden en worden verschillende technieken ontwikkeld om voor dit doel te worden gebruikt.
We hebben een lab-on-a-disc type apparaat en platform ontwikkeld met de naam CD-PRIME. Dit apparaat is geautomatiseerd en heeft goede resultaten voor monstervervuiling en monsterstabiliteit. Bovendien heeft het voordelen van een goede acquisitieopbrengst, een korte bedrijfstijd en een hoge reproduceerbaarheid. Bovendien kunnen, afhankelijk van het type schijf dat moet worden gemonteerd, plasma met celvrij DNA, circulerende tumorcellen, perifere mononucleaire bloedcellen of buffy-lagen worden gescheiden. Zo kan de verwerving van een verscheidenheid aan materialen die aanwezig zijn in de lichaamsvloeistoffen worden gedaan voor een verscheidenheid aan downstream-toepassingen, waaronder de studie van omics.
Introduction
Vroege en nauwkeurige detectie van verschillende ziekten, waaronder kanker, is de belangrijkste factor bij het vaststellen van een behandelingsstrategie 1,2,3,4. Met name vroege opsporing van kanker hangt nauw samen met verhoogde overlevingskansen voor de patiënt 5,6,7,8. Onlangs hebben vloeibare biopsieën in de schijnwerpers gestaan voor de vroege opsporing van kanker. Solide tumoren ondergaan angiogenese en geven verschillende stoffen af aan het bloed. Met name circulerende DNA's (ctDNA's), circulerende RNA's (ctRNA's), eiwitten, blaasjes zoals exosomen en circulerende tumorcellen (CTC's) zijn gevonden in het bloed van kankerpatiënten 2,9. Hoewel er verschillen zijn in de hoeveelheid van deze stoffen, worden ze consequent waargenomen, niet alleen in de vroege stadia, maar ook in de latere stadia 6,10. Deze individuele verschillen zijn echter erg groot; de hoeveelheid celvrij DNA (cfDNA) dat ctDNA bevat, is bijvoorbeeld minder dan 1.000 ng en het aantal CTC's is minder dan 100 in 10 ml volbloed van kankerpatiënten 11,12,13. Veel studies hebben kanker gekarakteriseerd met behulp van deze stoffen die in kleinere hoeveelheden aanwezig zijn (d.w.z. cfDNA, ctDNA en CTC's). Om nauwkeurige resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om kleine hoeveelheden stoffen met een hoge zuiverheid13,14 nauwkeurig te scheiden. Conventionele centrifugatiemethoden worden vaak gebruikt, maar ze zijn moeilijk te hanteren en hebben een lage zuiverheid, afhankelijk van de vaardigheid van de gebruiker. Sinds de ontdekking van CTC's zijn verschillende scheidingstechnieken ontwikkeld, zoals centrifugatie of scheiding van dichtheidsgraad, immunokraal en microfluïdische methoden. Sinds de ontdekking van CTC's zijn er verschillende containmenttechnieken ontwikkeld. Deze technieken zijn echter vaak beperkt wanneer het nodig is om cellen te isoleren van de verschillende chips en membranen die worden gebruikt om ze te isoleren15. Ook vereisen de tagging-methoden apparatuur zoals FACS en zijn er grenzen aan het downstream-proces als gevolg van tagging-verontreiniging.
Onlangs is het gebruik van vloeibare biopsieën toegenomen en worden er verschillende onderzoeken uitgevoerd voor de vroege opsporing van kanker. Hoewel deze methode eenvoudig is, zijn er nog steeds moeilijkheden bij downstream-analyse en verschillende studies proberen deze moeilijkheden te overwinnen 16,17. Bovendien vereisen veel sites, waaronder ziekenhuizen, geautomatiseerde, reproduceerbare en zeer zuivere methoden die gemakkelijk te gebruiken zijn. Hier hebben we een lab-on-a-disc ontwikkeld voor de geautomatiseerde scheiding van stoffen uit bloedmonsters na een vloeibare biopsie. Deze apparaten zijn gebaseerd op het principe van centrifugatie, microfluïdica en celopname ter grootte van een porie. Er zijn drie soorten schijven: LBx-1 kan plasma en buffy coat verkrijgen, terwijl LBx-2 plasma en PBMC kan verkrijgen uit volbloed met een volume van minder dan 10 ml; FAST-auto kan ook CTC's verkrijgen met behulp van een membraan dat van de schijf kan worden verwijderd. Maximaal vier van elke schijf kunnen in één keer worden gebruikt. Bovenal is het voordeel van dit apparaat en deze methode dat het een verscheidenheid aan van kanker afgeleide stoffen uit hetzelfde monster kan verkrijgen met behulp van een kleine hoeveelheid bloed. Dit betekent dat het bloed van de patiënt slechts één keer hoeft te worden afgenomen. Bovendien heeft het het voordeel dat fouten als gevolg van verschillen in de bloedafnameperiode worden uitgesloten. Dit platform is eenvoudig te gebruiken en biedt nauwkeurige resultaten voor vloeibare biopsieën en downstream-toepassingen. In dit protocol wordt het gebruik van het apparaat en de cartridge geïntroduceerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle volbloedmonsters werden verkregen van longkankerpatiënten. Het onderzoek en de analyse bij Clinomics worden uitgevoerd door het Cancer Genomics Research Institute en de goedkeuring van het IRB-onderzoek door de overheid wordt geleid door de Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NO. 2021-0802) met het IRB-nummer geregistreerd voor onderzoek bij Clinomics.
1. Monstervoorbereiding
- Verzamel 9 ml volbloed in een EDTA- of cfDNA-stabiele bloedafnamebuis.
- Meng goed door de buis ongeveer 10 keer op en neer te draaien.
- Bewaar de monsters bij kamertemperatuur (RT; voor kortdurende opslag) of 4 °C (voor langdurige opslag). Niet invriezen en ontdooien.
2. Voorbereiding van het apparaat
- Druk op de aan/uit-schakelaar om het instrument in te schakelen.
OPMERKING: Er verschijnt een laadscherm op het touchpad en het instrument wordt geïnitialiseerd. Houd de handen uit de buurt van het instrument tijdens de initialisatie. Het cartridgeselectiescherm wordt weergegeven nadat de initialisatie van het instrument is voltooid. - Selecteer de voorbeeldmodus die u wilt gebruiken. Wijzig het aantal voorbeelden door op de pijl te drukken.
3. Werking van het apparaat en monsterverzameling
- Laden van de LBx-1 cartridge
- Selecteer het type cartridge op het touchscreenpaneel van het instrument. Wijzig het aantal voorbeelden door op de pijlknop te drukken.
- Open de deur van het instrument en plaats alle te gebruiken patronen in volgorde van het nummer op de patroonhouder. Zorg ervoor dat u de cartridge en de cartridgehouder correct plaatst. Als de patroon niet correct is geplaatst, kan dit aanzienlijke schade aan het instrument veroorzaken.
- Voor in totaal vier cartridges plaatst u de dummycartridge in de lege ruimte van de cartridgehouder.
- Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten.
- Sluit de deur en druk op de RUN-knop op het touchpad-scherm. Het instrument sluit de kleppen op de patronen, wat ongeveer 30 s duurt.
- Volg het bericht om de deur te openen, verwijder het steunwiel en verwijder de met de klep gesloten cartridge uit de cartridgehouder.
- Plaats de patroon op tafel en bereid voor om het volbloedmonster te injecteren. Pipetteer maximaal 10 ml volbloedmonster met behulp van een serologische pipet.
LET OP: Gevaren van het omgaan met bloed. Tijdens de hele procedure van het hanteren van bloedmonsters en reagentia, is het belangrijk om een laboratoriumjas en laboratoriumhandschoenen te dragen. Het verstrekte VIB moet grondig worden bestudeerd door de laboratoriummedewerkers. - Steek de pipetpunt diep in de monsterinlaat van de patroon en injecteer langzaam het volbloedmonster.
OPMERKING Bij gebruik van meer dan of gelijk aan 9 ml volbloedmonster is geen toevoeging van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) nodig. Wanneer u minder dan 9 ml volbloedmonster gebruikt, voeg pbs toe om het totale volume op 9 ml te brengen. Als u bijvoorbeeld 7,2 ml volbloed gebruikt, voeg dan 1,8 ml PBS toe aan de monsterinlaat. Een serologische pipet of een pipetpunt kan worden gebruikt voor de injectie van volbloed en PBS. Bij gebruik van minder dan 8 ml volbloedmonster, kan de buffy vacht niet worden hersteld, zelfs niet door 1 ml PBS toe te voegen. Gebruik voor gDNA-voorbereiding 200 μL volbloed, dat vóór deze stap werd gescheiden. - Plaats de te gebruiken cartridges in volgorde van het nummer op de cartridgehouder. Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten. Sluit de deur en druk op de knop OK .
OPMERKING: Plasma en buffy vacht worden automatisch gescheiden van volbloed, wat ongeveer 30 minuten duurt.
LET OP Gevaar tijdens gebruik. Het openen van de deur of het aanraken van het instrument tijdens roterende operaties met hoge snelheid kan ernstige verwondingen veroorzaken. Er is ook een risico op letsel als gevolg van asymmetrische belasting van de rotor. Als ongebruikelijke trillingen en geluiden optreden wanneer het instrument begint in de geassisteerde celverrijking of expertmodus, kan de plaatsing van de cartridge asymmetrisch zijn. Druk onmiddellijk op de aan/uit-toets om de cartridge te stoppen en correct te installeren. - Zoek naar het bericht op het scherm vergezeld van een alarmgeluid, dat verschijnt wanneer de scheiding van plasma en buffy coat is voltooid.
- Stop het alarm door de deur te openen of op de STOP-knop te drukken. Open de deur, verwijder de patroon en plaats deze op tafel.
- Herstel 3 ml plasma uit de plasma-uitlaat met behulp van een pipetpunt van 1 ml. Herstel de buffy laag van 3 ml uit de buffy coat outlet met behulp van een 1 ml pipetpunt.
- De LBx-2 cartridge plaatsen
- Selecteer de naam van de cartridge op het aanraakscherm van het instrument. Wijzig het aantal voorbeelden door op de pijlknop te drukken.
- Open de deur en plaats de te gebruiken cartridges in volgorde van het nummer op de cartridgehouder.
- Voor in totaal vier cartridges plaatst u de dummycartridge in de lege ruimte van de cartridgehouder.
- Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten. Zorg ervoor dat u de cartridge correct in de cartridgehouder plaatst. Als de patroon niet correct is geplaatst, kan dit aanzienlijke schade aan het instrument veroorzaken.
- Sluit de deur en druk op de RUN-knop op het touchpad-scherm. Het instrument sluit de kleppen op de cartridge, wat ongeveer 30 s duurt.
- Volg het bericht om de deur te openen, verwijder het steunwiel en verwijder de klepdichte cartridge uit de cartridgehouder en plaats deze op tafel.
- Plaats de patroon op tafel en bereid u voor om de dichtheidsgradiëntoplossing en het volbloedmonster te injecteren. Controleer het volume van de dichtheidsgradiëntoplossing en pbs die moeten worden geïnjecteerd, afhankelijk van het volume van het volbloedmonster (aanvullende tabel 1).
- Pipetteer de dichtheidsgradiëntoplossing met behulp van een serologische pipet. Steek de pipetpunt diep in de inlaat van de patroon en injecteer langzaam de oplossing voor de dichtheidsgradiënt.
- Na het injecteren van de dichtheidsgradiëntoplossing pipetteert u het volbloedmonster met een serologische pipet. Steek de pipetpunt diep in de monsterinlaat van de patroon en injecteer langzaam het volbloedmonster.
OPMERKING: Wanneer u minder dan 9 ml van het volbloedmonster gebruikt, voeg PBS toe door naar deze tabel te verwijzen (aanvullende tabel 1). - Plaats de te gebruiken cartridges in volgorde volgens het nummer op de cartridgehouder. Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten. Sluit de deur en druk op de knop OK .
- Plasma en PBMC worden automatisch gescheiden van volbloed, wat ongeveer 30 minuten duurt. Zoek naar het bericht dat verschijnt vergezeld van een alarmgeluid, wanneer de scheiding van plasma en PBMC is voltooid.
- Stop het alarm door de deur te openen of op de STOP-knop te drukken. Open de deur, verwijder de patroon en plaats deze op tafel.
- Herstel 3 ml plasma uit de plasma-uitlaat met behulp van een pipetpunt van 1 ml. Herstel 3 ml van de PBMC uit de PBMC-uitlaat met behulp van een pipetpunt van 1 ml.
- De FAST-auto cartridge laden
- Selecteer de cartridge op het aanraakscherm van het instrument. Wijzig het aantal voorbeelden door op de pijlknop te drukken.
- Open de deur en plaats de te gebruiken cartridges in volgorde van het nummer op de cartridgehouder. Voor in totaal vier cartridges plaatst u de dummycartridge in de lege ruimte van de cartridgehouder.
- Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten.
- Sluit de deur en druk op de KNOP RUN op het scherm van het touchpad. Het instrument sluit de kleppen op de cartridge, wat ongeveer 30 s duurt.
- Volg het bericht om de deur te openen, verwijder het steunwiel en verwijder de met de klep gesloten cartridge uit de cartridgehouder.
- Plaats de patroon op tafel en bereid u voor op het injecteren van de PBS-oplossing en het volbloedmonster. Pipet 6 ml PBS-oplossing met behulp van een serologische pipet. Steek de pipetpunt diep in de PBS-inlaat van de cartridge en injecteer langzaam 6 ml van de PBS-oplossing.
- Na het injecteren van de PBS-oplossing pipet u 3 ml volbloed of PBMC-monster verkregen uit LBx-2 met behulp van een serologische pipet, die eerder werd gespoeld met 1% BSA om kleven van het residu te voorkomen. Steek de pipetpunt diep in de monsterinlaat van de patroon en injecteer langzaam het volbloedmonster.
- Plaats de te gebruiken cartridges in volgorde van het nummer op de cartridgehouder. Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten. Sluit de deur en druk op de knop OK .
- CTC's worden automatisch verrijkt uit volbloed, wat ongeveer 15 minuten duurt. Zoek naar een bericht dat vergezeld gaat van een alarmgeluid wanneer de verrijking van CTC's is voltooid. Stop het alarm door de deur te openen of op de STOP-knop te drukken.
- Open de deur, verwijder de patroon en plaats deze op tafel. Steek de achterplaatverwijderaar (BPR) in de vier gaten aan de voorkant van de cartridge. Druk op de donkerblauwe vleugel met de duimen van beide handen en druk vervolgens op het lichtblauwe lichaam totdat het klikt.
- Verwijder de cartridgebehuizing voorzichtig door deze op te tillen. Pak het filtermembraan heel voorzichtig aan de rand op met een pincet. Zorg ervoor dat u de buitenrand (het 1 mm brede randgedeelte) van het filtermembraan gebruikt om het filtermembraan te knijpen en vast te houden.
- Plaats het filtermembraan (waarop verrijkte CTC's zich bevinden) voorzichtig in een buis van 1,5 ml voor nucleïnezuurbereiding. Herstel indien nodig het gefilterde bloed naar de bloeduitlaat met behulp van een pipetpunt van 1 ml.
4. Onderhoud van het systeem
- Voorbereiding voor reiniging en desinfectie van het instrument
- Reinig alle toegankelijke oppervlakken van het instrument en de accessoires eenmaal per week met behulp van ethanol en gedroogd weefsel, en ook onmiddellijk wanneer besmet.
- Reinig de kom en rotorschacht regelmatig met alcohol (ethanol en isopropanol) of ontsmettingsmiddelen op basis van alcohol.
- Reinigen en desinfecteren van het instrument
OPMERKING: Voor algemene probleemoplossing en andere opmerkingen over het apparaat raadpleegt u Aanvullende tabel 2.- Schakel het instrument uit met behulp van de hoofdschakelaar. Koppel de stekker los van de voeding.
- Open de deur en reinig en desinfecteer alle toegankelijke oppervlakken van het instrument, inclusief de stroomkabel, met een vochtige doek en de aanbevolen reinigingsmiddelen.
- Controleer de rotoras op schade. Inspecteer het instrument op corrosie en schade.
- Sluit het instrument alleen aan op de voeding als het van binnen en van buiten volledig droog is.
- Koppel de stekker los en verwijder de zekeringhouder. De zekeringhouder bevindt zich boven het stopcontact. Vervang de gebruikte zekering door een reservezekering uit de container.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze techniek is om kankergerelateerde stoffen gemakkelijk en automatisch te isoleren uit volbloed. In het bijzonder kan iedereen deze techniek gebruiken in alle geschikte gebieden van onderzoek en analyse. De gelijktijdige en reproduceerbare scheiding van meerdere stoffen in een enkel bloedmonster is significant in vloeibare biopten. De LBx-1 en LBx-2 schijven worden gebruikt voor het isoleren van plasma en buffy coat of PBMC uit volbloed. Figuur 1 toont de materialen gescheiden door de toepassing van dit apparaat. Eerst werd het plasma verkregen uit 10 ml bloed met behulp van LBx-1 of de PBMC's werden verkregen met LBx-2. Ten tweede werd 3 ml van de gescheiden buffy-laag opnieuw geïnjecteerd met PBS in FAST-auto en werden CTC's door het membraan gefilterd. Ten derde werd het membraan overgebracht naar een buis gevuld met opslagbuffer of onmiddellijk gebruikt voor kleuring. Voor andere toepassingen of langdurige opslag kunnen CTC's eenvoudig uit het membraan worden verwijderd door vortexing.
cfDNA werd geëxtraheerd uit het plasma met behulp van magnetische op kralen gebaseerde DNA-isolatie die in staat is om grootte-voor-grootte DNA te vangen door kraalconcentratie. De concentratie en zuiverheid van cfDNA werden gemeten met behulp van de Bioanalyzer. Het is bekend dat de concentratie van cfDNA, inclusief ctDNA, varieert afhankelijk van het type en het stadium van kanker18. Bovendien hebben de meeste cfDNA's een lengte van 166 bp, en sommige zijn ongeveer twee of drie keer zo lang. Hoewel er een verschil is in de hoeveelheid die uit elk afzonderlijk monster wordt verkregen, zoals 8,47 ng/ml en 5,2 ng/ml, waren de resultaten van cfDNA-extractie in alle gevallen goed voor zowel de concentratie als de grootteverdeling (figuur 2). Deze resultaten geven aan dat de LBx-1-methode plasma dat cfDNA bevat nauwkeurig scheidt.
In FAST-auto werd het membraan verwijderd en gekleurd met fluorescerende antilichamen voor de detectie van CTC's en witte bloedcellen (WBC's). Het gebrandschilderde membraan dat op glasglaasjes werd geplaatst, werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Kleurings- en microscopisch onderzoek werd uitgevoerd na een eerdere studie19. Alleen CTC's kunnen specifiek worden onderscheiden met behulp van de EpCAM /Cytokeratine (CTC-positieve marker) en CD45 (WBC-positieve marker) antilichamen. Elk membraan legde in totaal respectievelijk 310 en 998 cellen vast. Onder hen werden in totaal 3 en 43 CTC's geteld in respectievelijk steekproef 1 en 2 (figuur 3). De methode die in deze studie wordt gebruikt, maakt het gemakkelijk om de aanwezigheid en het aantal CTC's te bepalen. Bovendien kunnen veranderingen in de cfDNA-concentratie en het CTC-nummer worden gebruikt om de aanwezigheid en herhaling van kanker in het veld gemakkelijk te controleren. Met name omdat deze methoden geen andere reagentia gebruiken die de resultaten kunnen beïnvloeden, zijn downstream-experimenten met het verkregen materiaal mogelijk.
Figuur 1: Workflow van schijfmengmethode voor gelijktijdige scheiding van stoffen uit volbloed. (A) Het plasma dat cfDNA bevat, wordt verkregen. (B) CTC's worden uit de buffy-vacht verwijderd. (C,D) Na vortex worden CTC's losgemaakt van het membraan en blijft er nog een kleine hoeveelheid CTC op het membraan achter. Zowel verkregen cellen als het membraan kunnen langdurig worden opgeslagen door monsters in de opslagbuffer in te vriezen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zuiverheid en hoeveelheid geëxtraheerd cfDNA. De geëxtraheerde cfDA's werden geëvalueerd met behulp van Bioanalyzer en cfDNA-schermtapes werden gebruikt in combinatie met een elektronische ladder. De groene lijn werd gebruikt voor de uitlijning tussen de ladder (links) en het monster (rechts). De driehoekmarkeringen geven de DNA-band aan. Het grootste deel van cfDNA is 166 bp, en sommige bestaan in gehele veelvouden van lengte. Gewoonlijk meet de concentratie van cfDNA tot de grootte van 50 bp tot 700 bp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Tellen van CTC's met behulp van membraankleuring. Na membraanimmunocytochemische kleuring vertonen cellen DAPI (Nuclear positive) signalen in blauw, terwijl EpCAM / CK (CTC's positief) en CD45 (WBC-positief) respectievelijk in groen en rood worden gemarkeerd. Fluorescentiesignalen werden gemeten met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De schaalbalk geeft 10 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Samenstelling van het uiteindelijke volume voor gebruik van de dichtheidsgradiëntoplossing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Algemene kwesties en waarschuwingen voor onderhoud. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hoeveelheid en concentratie van cfDNA en CTC hangt af van het individu, het stadium en het type kanker. Het hangt ook af van de toestand van de patiënt 2,4,5,10,20. Met name in de vroege of precancereuze stadia van kanker zijn de concentraties van kankergerelateerde stoffen erg laag, dus er is een grote kans dat het niet kan worden gedetecteerd. Niettemin heeft vroege detectie een zeer positief effect op de overleving van patiënten en de vaststelling van de behandelingsstrategie. Aangezien cfDNA en CTC een korte halfwaardetijd in het bloed hebben, weerspiegelen ze real-time informatie over kanker 21,22,23,24,25. Daarom is, om tegelijkertijd verschillende kankergerelateerde stoffen te verkrijgen, een grote hoeveelheid bloed nodig onder dezelfde omstandigheden. Het hier getoonde systeem biedt de gebruikers een eenvoudige methode. De gebruiker kan de schijf selecteren en gebruiken die overeenkomt met het materiaal dat nodig is voor volbloed. Met behulp van een van de gegeven patronen kan plasma met cfDNA worden verkregen en kunnen CTC's worden verzameld uit hetzelfde bloedmonster, verspilde buffy-laag of PBMC door herinjectie in een FAST-autoschijf (figuur 1).
Op grootte gebaseerde CTC-opname is eenvoudig, maar heeft beperkingen voor zuiverheid. Er zijn veel verschillende vormen en maten cellen in het bloed26. WBC's variëren in grootte van 8 tot 16 μm27. In een andere studie was de gemiddelde grootte van de gemeten WBC 9 μm. Aan de andere kant is de minimale grootte van geïsoleerde CTC's 16 μm en de gemiddelde grootte is 30 μm28. Bovendien zijn CTC's in een zeer kleine hoeveelheid aanwezig in het bloed van de patiënt in vergelijking met andere bloedcellen. Het minimaliseren van WBC-verontreiniging is belangrijk voor downstream-analyses. Hoewel op antilichamen gebaseerde detectie CTC's kan vastleggen, vereist analyse met hoge resolutie zoals NGS aanvullende single-cell picking-technieken of een hoog niveau van bio-informatica-analyse.
Onlangs zijn methoden geïmplementeerd voor het intuïtief observeren van de aanwezigheid van CTC's vóór analyse met hoge resolutie met behulp van verschillende opnametechnieken29. Zoals te zien is in de resultaten, kan het membraan dat is verkregen van de FAST-auto-cartridge direct worden gekleurd voor CTC-detectie. Afgevangen CTC's kunnen ook gemakkelijk uit het membraan worden geresuspendeerd door vortexing voor opslag of verdere toepassingen zoals celcultuur (figuur 1).
Deze methode maakt gebruik van de principes van centrifugatie en microfluïdica. Daarom is de balans van de apparatuur en de schijf belangrijk en is het ook belangrijk om deze met de schijfhouder te beveiligen. Het is belangrijk om elk initieel onvoldoende totaal volume te vullen met PBS. Als het initiële bedrag onvoldoende is, kan er een probleem zijn dat leidt tot problemen bij het verplaatsen naar de volgende ruimte. Haal de schijfhouder uit een tafelblad om besmetting van de apparatuur te voorkomen en om vloeistoffen in en uit de schijf te verplaatsen. In het geval van FAST-auto disc, verwerk de monsters snel om de schade aan de CTC in het membraan te verminderen. Wees in het bijzonder voorzichtig om verontreiniging te voorkomen bij het hanteren van het membraan en om het vastgestelde protocol voor langdurige opslag te volgen.
Niettemin is deze methode eenvoudig te gebruiken en kan één tot vier monsters tegelijkertijd worden verwerkt. Ook kunnen verschillende substraten van vloeistof worden verkregen door eenvoudig de schijf te vervangen. Bovendien zijn er geen extra reagentia nodig, behalve het gebruik van een oplossing voor dichtheidsgradiënt om PBMC's te verkrijgen. Daarom is het verkregen materiaal goed voor downstream gebruik.
Deze methode heeft nog enkele beperkingen. De gebruiker kan de schijf niet willekeurig wijzigen en verschillende typen schijven kunnen niet tegelijkertijd worden gebruikt. Ook zijn er grenzen aan het maximale volume, dus meerdere schijven moeten worden gebruikt voor grote hoeveelheden bloed. Aanvullende methoden zijn nog steeds nodig om cfDNA te verkrijgen. Met behulp van het membraan is het moeilijk om alleen CTC's te verkrijgen met behulp van de poriëngrote opnamemethode. Daarom is celselectie of -sortering vereist voor CTC-specifieke toepassingsexperimenten.
Er zijn verschillende vloeistoffen in het lichaam en de productie van bepaalde lichaamsvloeistoffen wordt geassocieerd met ziekte30. Momenteel is het gebruik van de bloedlichaamsvloeistof alleen uitgevoerd voor analyse. In de toekomst kan een optimaal protocol worden vastgesteld door de prestaties in verschillende lichaamsvloeistoffen zoals urine, ascites, pleuravocht en ruggenmergvocht te bevestigen. Om gebruikers een handigere methode te bieden, worden momenteel apparaten ontwikkeld die automatisch cfDNA uit de schijf extraheren. Bovendien is apparatuur in ontwikkeling die in staat is om kwantitatieve PCR direct in de schijf uit te voeren na de extractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
Dit manuscript werd gedeeltelijk ondersteund door het Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) en het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
