Summary
Cet article décrit l’application d’équipements automatisés pour séparer et collecter facilement et efficacement des substances, telles que l’ADN acellulaire et les cellules tumorales circulantes, à partir du sang total.
Abstract
Récemment, des biopsies liquides ont été utilisées pour diagnostiquer diverses maladies, y compris le cancer. Les fluides corporels contiennent de nombreuses substances, y compris des cellules, des protéines et des acides nucléiques provenant de tissus normaux, mais certaines de ces substances proviennent également de la zone malade. L’investigation et l’analyse de ces substances dans les fluides corporels jouent un rôle central dans le diagnostic de diverses maladies. Par conséquent, il est important de séparer avec précision les substances requises, et plusieurs techniques sont développées à cette fin.
Nous avons développé un appareil et une plate-forme de type laboratoire sur disque nommé CD-PRIME. Cet appareil est automatisé et donne de bons résultats pour la contamination et la stabilité des échantillons. De plus, il présente les avantages d’un bon rendement d’acquisition, d’un temps de fonctionnement court et d’une reproductibilité élevée. En outre, selon le type de disque à monter, le plasma contenant de l’ADN acellulaire, les cellules tumorales circulantes, les cellules mononucléées du sang périphérique ou les couches leucocytaires peuvent être séparés. Ainsi, l’acquisition d’une variété de matériaux présents dans les fluides corporels peut être faite pour une variété d’applications en aval, y compris l’étude des omiques.
Introduction
La détection précoce et précise de diverses maladies, y compris le cancer, est le facteur le plus important dans l’établissement d’une stratégie de traitement 1,2,3,4. En particulier, la détection précoce du cancer est étroitement liée à l’augmentation des chances de survie du patient 5,6,7,8. Récemment, les biopsies liquides ont été sous les projecteurs pour la détection précoce du cancer. Les tumeurs solides subissent une angiogenèse et libèrent diverses substances dans le sang. En particulier, des ADN circulants (ADNct), des ARN circulants (ARNct), des protéines, des vésicules telles que les exosomes et des cellules tumorales circulantes (CTC) ont été trouvés dans le sang de patients cancéreux 2,9. Bien qu’il existe des différences dans la quantité de ces substances, elles sont systématiquement observées non seulement dans les premiers stades, mais aussi dans les derniers stades 6,10. Cependant, ces différences individuelles sont très élevées; par exemple, la quantité d’ADN acellulaire (cfDNA) contenant de l’ADNct est inférieure à 1 000 ng, et le nombre de CTC est inférieur à 100 dans 10 mL de sang total provenant de patients cancéreux11,12,13. De nombreuses études ont caractérisé le cancer en utilisant ces substances présentes en moindre quantité (c.-à-d. cfDNA, ADNct et CTC). Pour obtenir des résultats précis, il est important de séparer avec précision de petites quantités de substances de haute pureté13,14. Les méthodes de centrifugation conventionnelles sont couramment utilisées, mais elles sont difficiles à manipuler et ont une faible pureté en fonction des compétences de l’utilisateur. Depuis la découverte des CTC, plusieurs techniques de séparation ont été développées, telles que la centrifugation ou la séparation de grade de densité, les immunobilles et les méthodes microfluidiques. Plusieurs techniques de confinement ont été développées depuis la découverte des CTC. Cependant, ces techniques sont souvent limitées lorsqu’il est nécessaire d’isoler les cellules des différentes puces et membranes utilisées pour les isoler15. En outre, les méthodes d’étiquetage nécessitent des équipements tels que FACS, et il y a des limites au processus en aval en raison de la contamination par l’étiquetage.
Récemment, l’utilisation de biopsies liquides a augmenté et diverses études sont en cours pour la détection précoce du cancer. Bien que cette méthode soit simple, il existe encore des difficultés dans l’analyse en aval, et diverses études tentent de surmonter ces difficultés16,17. En outre, de nombreux sites, y compris les hôpitaux, nécessitent des méthodes automatisées, reproductibles et de haute pureté pratiques à utiliser. Ici, nous avons développé un laboratoire sur disque pour la séparation automatisée des substances des échantillons de sang à la suite d’une biopsie liquide. Ces dispositifs sont basés sur le principe de la centrifugation, de la microfluidique et de la capture de cellules de la taille d’un pore. Il existe trois types de disques : LBx-1 peut acquérir du plasma et une couche leucocytaire, tandis que LBx-2 peut acquérir du plasma et de la PBMC à partir de sang total d’un volume inférieur à 10 mL; FAST-auto peut également acquérir des CTC à l’aide d’une membrane amovible du disque. Jusqu’à quatre de chaque disque peuvent être utilisés en une seule fois. Surtout, l’avantage de cet appareil et de cette méthode est qu’ils peuvent obtenir une variété de substances dérivées du cancer à partir du même échantillon en utilisant une petite quantité de sang. Cela signifie que le sang du patient ne doit être prélevé qu’une seule fois. De plus, il présente l’avantage d’exclure les erreurs dues aux différences dans la période de prélèvement sanguin. Cette plateforme est facile à utiliser et fournit des résultats précis pour les biopsies liquides et les applications en aval. Dans ce protocole, l’utilisation de l’appareil et de la cartouche est introduite.
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Protocol
Tous les échantillons de sang total ont été prélevés chez des patients atteints d’un cancer du poumon. La recherche et l’analyse à Clinomics sont effectuées par l’Institut de recherche en génomique du cancer, et l’approbation de la recherche IRB par le gouvernement est dirigée par le Comité d’examen institutionnel du Centre médical Asan (IRB n ° 2021-0802) avec le numéro IRB enregistré pour la recherche à Clinomics.
1. Préparation de l’échantillon
- Prélever 9 mL de sang total dans un tube de prélèvement de sang stable à l’EDTA ou à l’ADNcf.
- Bien mélanger en retournant le tube de haut en bas environ 10 fois.
- Conservez les échantillons à température ambiante (RT; pour un stockage à court terme) ou à 4 °C (pour un stockage à long terme). Ne pas congeler et décongeler.
2. Préparation de l’appareil
- Appuyez sur l’interrupteur d’alimentation pour allumer l’instrument.
REMARQUE: Un écran de chargement apparaît sur le pavé tactile et l’instrument est initialisé. Gardez les mains loin de l’instrument pendant l’initialisation. L’écran de sélection de la cartouche s’affiche une fois l’initialisation de l’instrument terminée. - Sélectionnez le mode d’échantillonnage à utiliser. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur la flèche.
3. Fonctionnement de l’appareil et prélèvement d’échantillons
- Chargement de la cartouche LBx-1
- Sélectionnez le type de cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur le bouton fléché.
- Ouvrez la porte de l’instrument et insérez toutes les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Assurez-vous d’insérer correctement la cartouche et le porte-cartouche. Si la cartouche n’est pas insérée correctement, elle peut causer des dommages considérables à l’instrument.
- Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche.
- Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer.
- Fermez la porte et appuyez sur le bouton RUN sur l’écran du pavé tactile. L’instrument ferme les vannes sur les cartouches, ce qui prend environ 30 s.
- Suivez le message pour ouvrir la porte, retirez la roue de support et retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche.
- Placez la cartouche sur la table et préparez-vous à injecter l’échantillon de sang total. Pipeter un maximum de 10 mL d’échantillon de sang total à l’aide d’une pipette sérologique.
ATTENTION : Dangers de la manipulation du sang. Pendant toute la procédure de manipulation des échantillons de sang et des réactifs, il est important de porter une blouse de laboratoire et des gants de laboratoire. La FS fournie doit être étudiée en profondeur par les travailleurs de laboratoire. - Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total.
NOTE Lorsque vous utilisez plus de 9 mL d’échantillon de sang total, il n’est pas nécessaire d’ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lorsque vous utilisez moins de 9 mL d’échantillon de sang total, ajoutez du PBS pour porter le volume total à 9 mL. Par exemple, lorsque vous utilisez 7,2 mL de sang total, veuillez ajouter 1,8 mL de PBS dans l’entrée de l’échantillon. Une pipette sérologique ou une pointe de pipette peut être utilisée pour l’injection de sang total et de PBS. Lorsque vous utilisez moins de 8 mL d’échantillon de sang total, la couche leucocytaire peut ne pas être récupérée même en ajoutant 1 mL de PBS. Pour la préparation de l’ADNg, utilisez 200 μL de sang total, qui a été séparé avant cette étape. - Insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton OK .
REMARQUE: Le plasma et la couche leucocytaire sont séparés automatiquement du sang total, ce qui prend environ 30 minutes.
ATTENTION Danger pendant le fonctionnement. Ouvrir la porte ou toucher l’instrument pendant les opérations rotatives à grande vitesse peut causer des blessures graves. Il existe également un risque de blessure en raison de la charge asymétrique du rotor. Si des vibrations et des bruits inhabituels se produisent lorsque l’instrument démarre à l’enrichissement assisté de la cellule ou en mode expert, le placement de la cartouche peut être asymétrique. Appuyez immédiatement sur la touche d’alimentation pour arrêter et installer correctement la cartouche. - Recherchez le message à l’écran accompagné d’un son d’alarme, qui apparaît lorsque la séparation du plasma et de la couche leucocytaire est terminée.
- Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton STOP . Ouvrez la porte, retirez la cartouche et placez-la sur la table.
- Récupérer 3 mL de plasma de la sortie de plasma à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL. Récupérer la couche leucocytaire de 3 mL de la sortie de la couche leucocytaire à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
- Chargement de la cartouche LBx-2
- Sélectionnez le nom de la cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur le bouton fléché.
- Ouvrez la porte et insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche.
- Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche.
- Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Assurez-vous d’insérer correctement la cartouche dans le porte-cartouche. Si la cartouche n’est pas insérée correctement, elle peut causer des dommages considérables à l’instrument.
- Fermez la porte et appuyez sur le bouton RUN sur l’écran du pavé tactile. L’instrument ferme les vannes sur la cartouche, ce qui prend environ 30 s.
- Suivez le message pour ouvrir la porte, retirez la roue de support, retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche et placez-la sur la table.
- Placez la cartouche sur la table et préparez-vous à injecter la solution de gradient de densité et l’échantillon de sang total. Vérifier le volume de la solution à gradient de densité et du PBS à injecter en fonction du volume de l’échantillon de sang total (tableau supplémentaire 1).
- Pipeter la solution de gradient de densité à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de la cartouche et injectez lentement la solution de gradient de densité.
- Après injection de la solution à gradient de densité, pipeter l’échantillon de sang total à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total.
REMARQUE : Lorsque vous utilisez moins de 9 mL de l’échantillon de sang total, ajoutez le PBS en vous référant à ce tableau (tableau supplémentaire 1). - Insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre en fonction du numéro indiqué sur le porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton OK .
- Le plasma et la PBMC sont séparés automatiquement du sang total, ce qui prend environ 30 minutes. Recherchez le message qui apparaît accompagné d’un son d’alarme, lorsque la séparation du plasma et de la PBMC est terminée.
- Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton STOP . Ouvrez la porte, retirez la cartouche et placez-la sur la table.
- Récupérer 3 mL de plasma de la sortie de plasma à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL. Récupérer 3 mL de la PBMC de la prise PBMC à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
- Chargement de la cartouche FAST-auto
- Sélectionnez la cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur le bouton fléché.
- Ouvrez la porte et insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche.
- Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer.
- Fermez la porte et appuyez sur le bouton RUN de l’écran du pavé tactile. L’instrument ferme les vannes sur la cartouche, ce qui prend environ 30 s.
- Suivez le message pour ouvrir la porte, retirez la roue de support et retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche.
- Placez la cartouche sur la table et préparez-vous à injecter la solution de PBS et l’échantillon de sang total. Pipeter 6 mL de solution PBS à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée PBS de la cartouche et injectez lentement 6 ml de la solution PBS.
- Après l’injection de la solution de PBS, pipeter 3 mL de sang total ou d’échantillon de PBMC obtenu à partir de LBx-2 à l’aide d’une pipette sérologique, préalablement rincée avec 1% de BSA pour éviter que le résidu ne colle. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total.
- Insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton OK .
- Les CTC sont enrichis automatiquement à partir de sang total, ce qui prend environ 15 min. Recherchez un message qui apparaît accompagné d’un son d’alarme lorsque l’enrichissement des CTC est terminé. Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton STOP .
- Ouvrez la porte, retirez la cartouche et placez-la sur la table. Insérez le dissolvant de plaque arrière (BPR) dans les quatre trous situés à l’avant de la cartouche. Appuyez sur l’aile bleu foncé avec les pouces des deux mains, puis appuyez sur le corps bleu clair jusqu’à ce qu’il clique.
- Retirez délicatement le corps de la cartouche en le soulevant. Soulevez très doucement la membrane filtrante par le bord à l’aide d’une pince à épiler. Assurez-vous d’utiliser le bord extérieur (la partie bord de 1 mm de large) de la membrane filtrante pour pincer et maintenir la membrane filtrante.
- Placez soigneusement la membrane filtrante (sur laquelle résident les CTC enrichis) dans un tube de 1,5 mL pour la préparation des acides nucléiques. Si nécessaire, récupérez le sang filtré à la sortie de sang à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
4. Maintenance du système
- Préparation pour le nettoyage et la désinfection de l’instrument
- Nettoyez toutes les surfaces accessibles de l’instrument et des accessoires une fois par semaine avec de l’éthanol et du tissu séché, ainsi que immédiatement en cas de contamination.
- Nettoyez régulièrement le bol et l’arbre du rotor avec de l’alcool (éthanol et isopropanol) ou des désinfectants à base d’alcool.
- Nettoyage et désinfection de l’instrument
REMARQUE : pour un dépannage général et d’autres remarques sur la machine, reportez-vous au Tableau supplémentaire 2.- Éteignez l’instrument à l’aide de l’interrupteur d’alimentation principal. Débranchez la fiche d’alimentation du bloc d’alimentation.
- Ouvrez la porte et nettoyez et désinfectez toutes les surfaces accessibles de l’instrument, y compris le câble d’alimentation, à l’aide d’un chiffon humide et des produits de nettoyage recommandés.
- Vérifiez que l’arbre du rotor n’est pas endommagé. Inspectez l’instrument pour détecter la corrosion et les dommages.
- Connectez l’instrument à l’alimentation uniquement s’il est complètement sec à l’intérieur et à l’extérieur.
- Débranchez la fiche d’alimentation principale et retirez le porte-fusible. Le porte-fusible est situé au-dessus de la prise de courant. Remplacez le fusible usagé par un fusible de rechange du conteneur.
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Representative Results
Le but de cette technique est d’isoler facilement et automatiquement les substances associées au cancer du sang total. En particulier, tout le monde peut utiliser cette technique dans tous les domaines appropriés de recherche et d’analyse. La séparation simultanée et reproductible de plusieurs substances dans un seul échantillon de sang est significative dans les biopsies liquides. Les disques LBx-1 et LBx-2 sont utilisés pour isoler le plasma et la couche leucocytaire ou PBMC du sang total. La figure 1 montre les matériaux séparés par l’application de ce dispositif. Tout d’abord, le plasma a été obtenu à partir de 10 mL de sang en utilisant LBx-1 ou les PBMC ont été obtenus en utilisant LBx-2. Deuxièmement, 3 mL de la couche leucocytaire séparée ont été réinjectés avec du PBS dans FAST-auto, et les CTC ont été filtrés à travers la membrane. Troisièmement, la membrane a été transférée dans un tube rempli de tampon de stockage ou immédiatement utilisé pour la coloration. Pour d’autres applications ou un stockage à long terme, les CTC peuvent être facilement éliminés de la membrane par vortex.
L’ADNcf a été extrait du plasma à l’aide d’un isolement magnétique de l’ADN à base de billes magnétiques, capable de capturer l’ADN taille par taille par concentration de billes. La concentration et la pureté de l’ADNcf ont été mesurées à l’aide du bioanalyseur. Il est bien connu que la concentration d’ADNcf, y compris l’ADNct, varie en fonction du type et du stade du cancer18. En outre, la plupart des cfDNA ont une longueur de 166 pb, et certains sont environ deux ou trois fois plus longs. Bien qu’il y ait une différence dans la quantité obtenue à partir de chaque échantillon individuel, comme 8,47 ng / mL et 5,2 ng / mL, les résultats de l’extraction de l’ADNcf étaient bons pour la distribution de la concentration et de la taille dans tous les cas (Figure 2). Ces résultats indiquent que la méthode LBx-1 sépare avec précision le plasma contenant de l’ADNcf.
Dans FAST-auto, la membrane a été retirée et colorée avec des anticorps fluorescents pour la détection des CTC et des globules blancs (GB). La membrane colorée placée sur des lames de verre a été observée au microscope à fluorescence. Des études de coloration et microscopiques ont été réalisées à la suite d’une étude précédente19. Seuls les CTC peuvent être spécifiquement distingués à l’aide des anticorps EpCAM/cytokératine (marqueur CTC positif) et CD45 (marqueur WBC positif). Chaque membrane a capturé un total de 310 et 998 cellules, respectivement. Parmi eux, un total de 3 et 43 CTC ont été dénombrés dans les échantillons 1 et 2, respectivement (Figure 3). La méthode utilisée dans cette étude permet de déterminer facilement la présence et le nombre de CTC. En outre, les changements dans la concentration d’ADNcf et le nombre de CTC peuvent être utilisés pour surveiller facilement la présence et la récidive du cancer sur le terrain. En particulier, comme ces méthodes n’utilisent pas d’autres réactifs susceptibles d’affecter les résultats, des expériences en aval sont possibles avec le matériau obtenu.
Figure 1 : Déroulement de la méthode de mélange sur disque pour la séparation simultanée des substances du sang total. (A) On obtient le plasma contenant l’ADNcf. (B) Les CTC sont retirés du pelage leucocytaire. (C, D) Après le vortex, les CTC sont détachés de la membrane, et une petite quantité de CTC reste encore sur la membrane. Les cellules obtenues et la membrane peuvent subir un stockage à long terme en congelant des échantillons dans le tampon de stockage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Pureté et quantité d’ADNcf extrait. Les cfDNA extraits ont été évalués à l’aide d’un bioanalyseur, et des bandes d’écran cfDNA ont été utilisées avec une échelle électronique. La ligne verte a été utilisée pour l’alignement entre l’échelle (à gauche) et l’échantillon (à droite). Les marques triangulaires indiquent la bande d’ADN. La majeure partie de cfDNA est de 166 pb, et certains existent en multiples entiers de longueur. Habituellement, la concentration d’ADNcf mesure jusqu’à la taille de 50 pb à 700 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Comptage des CTC à l’aide de la coloration membranaire. Après coloration immunocytochimique membranaire, les cellules affichent les signaux DAPI (nucléaire positif) en bleu, tandis que EpCAM / CK (CTC positif) et CD45 (WBC positif) sont mis en évidence en vert et rouge, respectivement. Les signaux de fluorescence ont été mesurés à l’aide d’un microscope à fluorescence. La barre d’échelle indique 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1: Composition du volume final pour l’utilisation de la solution à gradient de densité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 2 : Questions générales et mises en garde concernant l’entretien. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La quantité et la concentration d’ADNcf et de CTC dépendent de l’individu, du stade et du type de cancer. Cela dépend également de l’état du patient 2,4,5,10,20. En particulier, dans les stades précoces ou précancéreux du cancer, les concentrations de substances liées au cancer sont très faibles, il y a donc une forte possibilité qu’il ne puisse pas être détecté. Néanmoins, la détection précoce a un effet très positif sur la survie des patients et l’établissement de la stratégie de traitement. Étant donné que l’ADNcf et le CTC ont une courte demi-vie dans le sang, ils reflètent des informations en temps réel sur le cancer 21,22,23,24,25. Par conséquent, pour acquérir simultanément diverses substances liées au cancer, une grande quantité de sang est nécessaire dans les mêmes conditions. Le système présenté ici fournit aux utilisateurs une méthode simple. L’utilisateur peut sélectionner et utiliser le disque correspondant au matériel requis à partir de sang total. À l’aide de l’une des cartouches données, il est possible d’obtenir du plasma contenant de l’ADNcf et de prélever des CTC à partir du même échantillon de sang, de la couche leucocytaire perdue ou du même PBMC par réinjection dans un disque FAST-auto (Figure 1).
La capture CTC basée sur la taille est simple, mais elle a des limites de pureté. Il existe de nombreuses formes et tailles différentes de cellules dans le sang26. La taille des globules blancs varie de 8 à 16 μm27. Dans une autre étude, la taille moyenne du WBC mesuré était de 9 μm. D’autre part, la taille minimale des CTC isolés est de 16 μm, et la taille moyenne est de 30 μm28. De plus, les CTC sont présents en très petite quantité dans le sang du patient par rapport aux autres cellules sanguines. Il est important de minimiser la contamination par les WBC pour les analyses en aval. Bien que la détection basée sur les anticorps puisse capturer les CTC, l’analyse à haute résolution telle que le NGS nécessite des techniques supplémentaires de prélèvement de cellules uniques ou un niveau élevé d’analyse bioinformatique.
Récemment, des méthodes permettant d’observer intuitivement la présence de CTC avant l’analyse à haute résolution à l’aide de diverses techniques de capture ont été mises en œuvre29. Comme le montrent les résultats, la membrane acquise à partir de la cartouche FAST-auto peut être colorée directement pour la détection CTC. Les CTC capturés peuvent également être facilement remis en suspension de la membrane par vortex pour le stockage ou d’autres applications telles que la culture cellulaire (Figure 1).
Cette méthode utilise les principes de centrifugation et de microfluidique. Par conséquent, l’équilibre de l’équipement et du disque est important, et il est également important de le sécuriser avec le porte-disque. Il est important de remplir tout volume total initial insuffisant avec PBS. Si le montant initial est insuffisant, il peut y avoir un problème entraînant des difficultés à passer à l’espace suivant. Placez le porte-disque sur une table pour éviter la contamination de l’équipement et pour déplacer les liquides à l’intérieur et à l’extérieur du disque. Dans le cas du disque FAST-auto, traiter les échantillons rapidement afin de réduire les dommages au CTC dans la membrane. En particulier, veillez à prévenir la contamination lors de la manipulation de la membrane et à suivre le protocole établi pour l’entreposage à long terme.
Néanmoins, cette méthode est facile à utiliser et permet de traiter un à quatre échantillons simultanément. En outre, divers substrats de liquide peuvent être obtenus en remplaçant simplement le disque. De plus, aucun réactif supplémentaire n’est nécessaire autre que l’utilisation d’une solution de gradient de densité pour obtenir des PBMC. Par conséquent, le matériau obtenu est bon pour une utilisation en aval.
Cette méthode a encore quelques limites. L’utilisateur ne peut pas modifier le disque arbitrairement et différents types de disques ne peuvent pas être utilisés en même temps. En outre, il existe des limites au volume maximum, de sorte que plusieurs disques doivent être utilisés pour de grands volumes de sang. Des méthodes supplémentaires sont encore nécessaires pour obtenir cfDNA. En utilisant la membrane, il est difficile d’obtenir uniquement des CTC en utilisant la méthode de capture de la taille des pores. Par conséquent, la sélection ou le tri des cellules est nécessaire pour les expériences d’application spécifiques au CTC.
Il existe divers fluides dans le corps, et la production de certains fluides corporels est associée à la maladie30. Actuellement, l’utilisation du liquide sanguin n’a été entreprise qu’à des fins d’analyse. À l’avenir, un protocole optimal peut être établi en confirmant la performance dans divers fluides corporels tels que l’urine, l’ascite, le liquide pleural et le liquide céphalorachidien. Pour fournir une méthode plus pratique aux utilisateurs, des dispositifs qui extraient automatiquement l’ADNcf du disque sont en cours de développement. En outre, un équipement capable d’effectuer une PCR quantitative directement dans le disque après l’extraction est en cours de développement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.
Acknowledgments
Ce manuscrit a été financé en partie par le Fonds coréen de développement des dispositifs médicaux (KMDF, subvention n° RS-2020-KD000019) et l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI, subvention n° HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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