Summary
Dette papiret beskriver anvendelsen av automatisert utstyr for enkelt og effektivt å skille og samle stoffer, for eksempel cellefritt DNA og sirkulerende tumorceller, fra fullblod.
Abstract
Nylig har flytende biopsier blitt brukt til å diagnostisere ulike sykdommer, inkludert kreft. Kroppsvæsker inneholder mange stoffer, inkludert celler, proteiner og nukleinsyrer som stammer fra normalt vev, men noen av disse stoffene stammer også fra det syke området. Undersøkelsen og analysen av disse stoffene i kroppsvæskene spiller en sentral rolle i diagnosen av ulike sykdommer. Derfor er det viktig å nøyaktig skille de nødvendige stoffene, og flere teknikker er utviklet for å brukes til dette formålet.
Vi har utviklet en lab-on-a-disc type enhet og plattform kalt CD-PRIME. Denne enheten er automatisert og har gode resultater for prøvekontaminering og prøvestabilitet. Videre har det fordeler med et godt oppkjøpsutbytte, kort driftstid og høy reproduserbarhet. I tillegg, avhengig av hvilken type plate som skal monteres, kan plasma som inneholder cellefritt DNA, sirkulerende tumorceller, perifere mononukleære celler i blodet eller buffy strøk skilles. Dermed kan oppkjøpet av en rekke materialer som er tilstede i kroppsvæskene gjøres for en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert studiet av omics.
Introduction
Tidlig og nøyaktig påvisning av ulike sykdommer, inkludert kreft, er den viktigste faktoren for å etablere en behandlingsstrategi 1,2,3,4. Spesielt er tidlig påvisning av kreft nært knyttet til økte overlevelsessjanser for pasienten 5,6,7,8. Nylig har flytende biopsier vært i søkelyset for tidlig påvisning av kreft. Solide svulster gjennomgår angiogenese og frigjør ulike stoffer i blodet. Spesielt har sirkulerende DNA (ctDNA), sirkulerende RNA (ctRNA), proteiner, vesikler som eksosomer og sirkulerende tumorceller (CTC) blitt funnet i blodet til kreftpasienter 2,9. Selv om det er forskjeller i mengden av disse stoffene, blir de konsekvent observert ikke bare i de tidlige stadiene, men også i de senere stadiene 6,10. Disse individuelle forskjellene er imidlertid svært høye; For eksempel er mengden cellefritt DNA (cfDNA) som inneholder ctDNA mindre enn 1000 ng, og antall CTC er mindre enn 100 i 10 ml fullblod fra kreftpasienter11,12,13. Mange studier har karakterisert kreft ved hjelp av disse stoffene som er tilstede i mindre mengder (dvs. cfDNA, ctDNA og CTC). For å oppnå nøyaktige resultater er det viktig å nøyaktig skille små mengder stoffer med høy renhet13,14. Konvensjonelle sentrifugeringsmetoder brukes ofte, men de er vanskelige å håndtere og har lav renhet avhengig av brukerens dyktighet. Siden oppdagelsen av CTC har flere separasjonsteknikker blitt utviklet, for eksempel sentrifugering eller tetthetsgradseparasjon, immunobead og mikrofluidiske metoder. Flere inneslutningsteknikker har blitt utviklet siden oppdagelsen av CTC. Imidlertid er disse teknikkene ofte begrenset når det er nødvendig å isolere celler fra de forskjellige sjetongene og membranene som brukes til å isolere dem15. Merkingsmetodene krever også utstyr som FACS, og det er grenser for nedstrømsprosessen på grunn av merking av forurensning.
Nylig har bruken av flytende biopsier økt, og ulike studier utføres for tidlig påvisning av kreft. Selv om denne metoden er enkel, er det fortsatt vanskeligheter med nedstrømsanalyse, og ulike studier forsøker å overvinne disse vanskelighetene16,17. I tillegg krever mange steder, inkludert sykehus, automatiserte, reproduserbare og høyrene metoder som er praktiske å bruke. Her har vi utviklet en lab-on-a-disc for automatisert separering av stoffer fra blodprøver etter flytende biopsi. Disse enhetene er basert på prinsippet om sentrifugering, mikrofluidikk og porestørrelsescellefangst. Det finnes tre typer plater: LBx-1 kan skaffe seg plasma og buffy frakk, mens LBx-2 kan skaffe plasma og PBMC fra fullblod med et volum på mindre enn 10 ml; FAST-auto kan også skaffe CTC-er ved hjelp av en membran som kan fjernes fra platen. Opptil fire av hver plate kan brukes i ett løp. Fremfor alt er fordelen med denne enheten og metoden at den kan oppnå en rekke kreftavledede stoffer fra samme prøve ved hjelp av en liten mengde blod. Dette betyr at pasientens blod bare trenger å bli trukket en gang. I tillegg har den fordelen av å utelukke feil på grunn av forskjeller i blodprøveperioden. Denne plattformen er enkel å bruke og gir nøyaktige resultater for flytende biopsier og nedstrøms applikasjoner. I denne protokollen introduseres bruken av enheten og kassetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle fullblodsprøver ble tatt fra lungekreftpasienter. Forskningen og analysen ved Clinomics utføres av Cancer Genomics Research Institute, og IRB-forskningsgodkjenning av regjeringen ledes av Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NO. 2021-0802) med IRB-nummeret registrert for forskning ved Clinomics.
1. Prøvepreparering
- Samle 9 ml fullblod i et EDTA- eller cfDNA-stabilt blodinnsamlingsrør.
- Bland godt ved å snu røret opp og ned omtrent 10 ganger.
- Oppbevar prøvene ved romtemperatur (RT; for korttidsoppbevaring) eller 4 °C (for langtidsoppbevaring). Ikke frys og tin.
2. Klargjøring av enhet
- Trykk på strømbryteren for å slå på instrumentet.
MERK: En lasteskjerm vises på pekeplaten, og instrumentet initialiseres. Hold hendene borte fra instrumentet under initialiseringen. Skjermbildet for valg av kassett vises etter at instrumentinitialiseringen er fullført. - Velg prøvemodusen som skal brukes. Endre antall prøver ved å trykke på pilen.
3. Enhetsdrift og prøveinnsamling
- Lasting av LBx-1-patronen
- Velg kassetttype på instrumentets berøringsskjermpanel. Endre antall prøver ved å trykke på pilknappen.
- Åpne døren til instrumentet og sett inn alle patronene som skal brukes i rekkefølge etter nummeret på kassettholderen. Sørg for å sette inn kassetten og kassettholderen riktig. Hvis kassetten ikke er riktig satt inn, kan det forårsake betydelig skade på instrumentet.
- For totalt fire kassetter, plasser dummypatronen i det tomme rommet på kassettholderen.
- Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den.
- Lukk døren og trykk på RUN-knappen på berøringsskjermen. Instrumentet lukker ventilene på patronene, som tar omtrent 30 s.
- Følg meldingen for å åpne døren, fjern støttehjulet og fjern den ventillukkede kassetten fra kassettholderen.
- Legg sylinderampullen på bordet og forbered deg på å injisere fullblodprøven. Pipette maksimalt 10 ml fullblodsprøve ved hjelp av en serologisk pipette.
FORSIKTIG: Farene ved å håndtere blod. Under hele prosedyren for håndtering av blodprøver og reagenser er det viktig å bruke laboratoriefrakk og laboratoriehansker. Den medfølgende muskel- og skjelettlidelsen bør undersøkes grundig av laboratoriearbeiderne. - Sett pipettespissen dypt inn i prøveinnløpet på sylinderampullen og injiser sakte fullblodprøven.
MERK Når du bruker mer enn eller lik 9 ml fullblodprøve, er det ikke nødvendig med fosfatbufret saltvann (PBS). Når du bruker mindre enn 9 ml fullblodprøve, legg til PBS for å gjøre det totale volumet til 9 ml. For eksempel, når du bruker 7,2 ml fullblod, må du legge til 1,8 ml PBS i prøveinnløpet. En serologisk pipette eller en pipettespiss kan brukes til injeksjon av fullblod og PBS. Når du bruker mindre enn 8 ml fullblodprøve, kan det hende at buffycoaten ikke gjenvinnes selv ved å tilsette 1 ml PBS. For gDNA prep, bruk 200 μL fullblod, som ble separert før dette trinnet. - Sett inn kassettene som skal brukes i rekkefølge etter nummeret på kassettholderen. Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den. Lukk døren og trykk på OK-knappen .
MERK: Plasma og buffy pels skilles automatisk fra fullblod, noe som tar omtrent 30 minutter.
FORSIKTIG Fare under drift. Å åpne døren eller berøre instrumentet under høyhastighets roterende operasjoner kan forårsake alvorlige skader. Det er også fare for skade på grunn av asymmetrisk belastning av rotoren. Hvis det oppstår uvanlige vibrasjoner og lyder når instrumentet starter i assistert celleberikelse eller ekspertmodus, kan plasseringen av kassetten være asymmetrisk. Trykk umiddelbart på av / på-tasten for å stoppe og installere kassetten riktig. - Se etter meldingen på skjermen ledsaget av en alarmlyd, som vises når separasjonen av plasma og buffy frakk er fullført.
- Stopp alarmen ved å åpne døren eller trykke på STOPP-knappen . Åpne døren, fjern patronen og legg den på bordet.
- Gjenopprett 3 ml plasma fra plasmautløpet ved hjelp av en pipettespiss på 1 ml. Gjenopprett den buffy pelsen på 3 ml fra buffycoatutløpet ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.
- Legge i LBx-2-kassetten
- Velg navnet på kassetten på instrumentets berøringsskjermpanel. Endre antall prøver ved å trykke på pilknappen.
- Åpne døren og sett inn patronene som skal brukes i rekkefølge etter nummeret på kassettholderen.
- For totalt fire kassetter, plasser dummypatronen i det tomme rommet på kassettholderen.
- Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den. Pass på at kassetten settes riktig inn i kassettholderen. Hvis kassetten ikke er riktig satt inn, kan det forårsake betydelig skade på instrumentet.
- Lukk døren og trykk på RUN-knappen på berøringsskjermen. Instrumentet lukker ventilene på patronen, som tar omtrent 30 s.
- Følg meldingen for å åpne døren, fjern støttehjulet og fjern den ventillukkede patronen fra patronholderen og legg den på bordet.
- Plasser sylinderampullen på bordet og gjør deg klar til å injisere tetthetsgradientoppløsningen og fullblodprøven. Kontroller volumet av tetthetsgradientoppløsningen og PBS som skal injiseres, avhengig av volumet av fullblodprøven (supplerende tabell 1).
- Pipetter tetthetsgradientløsningen ved hjelp av en serologisk pipette. Sett pipettespissen dypt inn i sylinderampullens innløp og injiser tetthetsgradientoppløsningen sakte.
- Etter injeksjon av tetthetsgradientoppløsningen, pipetter fullblodprøven ved hjelp av en serologisk pipette. Sett pipettespissen dypt inn i prøveinnløpet på sylinderampullen og injiser sakte fullblodprøven.
MERK: Når du bruker mindre enn 9 ml av fullblodprøven, legg til PBS ved å referere til denne tabellen (supplerende tabell 1). - Sett inn kassettene som skal brukes i rekkefølge i henhold til nummeret på sylinderampulleholderen. Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den. Lukk døren og trykk på OK-knappen .
- Plasma og PBMC skilles automatisk fra fullblod, noe som tar ca. 30 minutter. Se etter meldingen som vises ledsaget av en alarmlyd, når separasjonen av plasma og PBMC er fullført.
- Stopp alarmen ved å åpne døren eller trykke på STOPP-knappen . Åpne døren, fjern patronen og legg den på bordet.
- Gjenopprett 3 ml plasma fra plasmautløpet ved hjelp av en pipettespiss på 1 ml. Gjenopprett 3 ml PBMC fra PBMC-utløpet ved hjelp av en pipettespiss på 1 ml.
- Legge i FAST-auto-kassetten
- Velg kassetten på instrumentets berøringsskjermpanel. Endre antall prøver ved å trykke på pilknappen.
- Åpne døren og sett inn patronene som skal brukes i rekkefølge etter nummeret på kassettholderen. For totalt fire kassetter, plasser dummypatronen i det tomme rommet på kassettholderen.
- Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den.
- Lukk døren og trykk på RUN-knappen på berøringsskjermen. Instrumentet lukker ventilene på patronen, som tar omtrent 30 s.
- Følg meldingen for å åpne døren, fjern støttehjulet og fjern den ventillukkede kassetten fra kassettholderen.
- Plasser sylinderampullen på bordet og gjør deg klar til å injisere PBS-oppløsningen og fullblodprøven. Pipette 6 ml PBS-oppløsning ved bruk av en serologisk pipette. Sett pipettespissen dypt inn i PBS-innløpet til sylinderampullen og injiser sakte 6 ml av PBS-oppløsningen.
- Etter injeksjon av PBS-oppløsningen ble pipette 3 ml fullblod eller PBMC-prøve oppnådd fra LBx-2 ved bruk av en serologisk pipette, som tidligere ble skyllet med 1% BSA for å forhindre stikking av resten. Sett pipettespissen dypt inn i prøveinnløpet på sylinderampullen og injiser sakte fullblodprøven.
- Sett inn kassettene som skal brukes i rekkefølge etter nummeret på kassettholderen. Bruk støttehjulet til å montere patronen og stram låsemutteren for å feste den. Lukk døren og trykk på OK-knappen .
- CTC berikes automatisk fra fullblod, noe som tar omtrent 15 minutter. Se etter en melding som vises ledsaget av en alarmlyd når anrikningen av CTC-er er fullført. Stopp alarmen ved å åpne døren eller trykke på STOPP-knappen .
- Åpne døren, fjern patronen og legg den på bordet. Sett bakplatefjerneren (BPR) inn i de fire hullene på forsiden av sylinderampullen. Trykk på den mørkeblå vingen med tommelen på begge hender, og trykk deretter på den lyseblå kroppen til den klikker.
- Fjern patronkroppen forsiktig ved å løfte den opp. Ta forsiktig opp filtermembranen ved kanten ved hjelp av en pinsett. Sørg for å bruke den ytre kanten (den 1 mm brede kantdelen) av filtermembranen til å klemme og holde filtermembranen.
- Plasser filtermembranen forsiktig (som berikede CTC-er bor på) i et 1,5 ml rør for nukleinsyrepreparasjon. Gjenopprett om nødvendig det filtrerte blodet til bloduttaket ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.
4. Vedlikehold av systemet
- Forberedelse for rengjøring og desinfeksjon av instrumentet
- Rengjør alle tilgjengelige overflater på instrumentet og tilbehøret en gang i uken ved hjelp av etanol og tørket vev, og også umiddelbart når det er forurenset.
- Rengjør bollen og rotorskaftet regelmessig med alkohol (etanol og isopropanol) eller alkoholbaserte desinfeksjonsmidler.
- Rengjøring og desinfisering av instrumentet
MERK: For generell feilsøking og andre merknader på maskinen, se tilleggstabell 2.- Slå av instrumentet ved hjelp av hovedstrømbryteren. Koble støpselet fra strømforsyningen.
- Åpne døren og rengjør og desinfiser alle tilgjengelige overflater på instrumentet, inkludert strømkabelen, med en fuktig klut og anbefalte rengjøringsmidler.
- Kontroller rotorakselen for skader. Inspiser instrumentet for korrosjon og skade.
- Koble instrumentet til strømforsyningen bare hvis det er helt tørt innvendig og utvendig.
- Koble fra hovedstrømkontakten og fjern sikringsholderen. Sikringsholderen er plassert over stikkontakten. Bytt ut den brukte sikringen med en ekstra fra beholderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne teknikken er å enkelt og automatisk isolere kreftassosierte stoffer fra fullblod. Spesielt kan hvem som helst bruke denne teknikken i alle egnede forsknings- og analyseområder. Samtidig og reproduserbar separasjon av flere stoffer i en enkelt blodprøve er signifikant i flytende biopsier. LBx-1- og LBx-2-platene brukes til å isolere plasma og buffy-belegg eller PBMC fra fullblod. Figur 1 viser materialene atskilt ved bruk av denne enheten. Først ble plasmaet oppnådd fra 10 ml blod ved bruk av LBx-1 eller PBMCene ble oppnådd ved bruk av LBx-2. For det andre ble 3 ml av det separerte buffybelegget injisert på nytt med PBS i FAST-auto, og CTC ble filtrert gjennom membranen. For det tredje ble membranen overført til et rør fylt med lagringsbuffer eller umiddelbart brukt til farging. For andre applikasjoner eller langtidslagring kan CTC-er enkelt fjernes fra membranen ved vortexing.
cfDNA ble ekstrahert fra plasmaet ved hjelp av magnetisk perlebasert DNA-isolasjon som er i stand til størrelse-for-størrelse fangst av DNA ved perlekonsentrasjon. Konsentrasjonen og renheten av cfDNA ble målt ved hjelp av bioanalysatoren. Det er velkjent at konsentrasjonen av cfDNA, inkludert ctDNA, varierer avhengig av type og stadium av kreft18. I tillegg har de fleste cfDNA en lengde på 166 bp, og noen er omtrent to ganger eller tre ganger så lange. Selv om det er en forskjell i mengden oppnådd fra hver enkelt prøve, for eksempel 8,47 ng / ml og 5,2 ng / ml, var resultatene av cfDNA-ekstraksjon gode for både konsentrasjon og størrelsesfordeling i alle tilfeller (figur 2). Disse resultatene indikerer at LBx-1-metoden nøyaktig separerer plasma som inneholder cfDNA.
I FAST-auto ble membranen fjernet og farget med fluorescerende antistoffer for påvisning av CTC og hvite blodlegemer (WBC). Den fargede membranen plassert på glassglass ble observert under et fluorescensmikroskop. Farging og mikroskopiske studier ble utført etter en tidligere studie19. Bare CTC kan skilles spesifikt ved bruk av EpCAM / Cytokeratin (CTC positiv markør) og CD45 (WBC positiv markør) antistoffer. Hver membran fanget totalt 310 og 998 celler, henholdsvis. Blant disse ble totalt 3 og 43 CTC telt i henholdsvis prøve 1 og 2 (figur 3). Metoden som brukes i denne studien gjør det enkelt å bestemme tilstedeværelsen og antall CTCer. I tillegg kan endringer i cfDNA-konsentrasjonen og CTC-nummeret brukes til enkelt å overvåke tilstedeværelse og tilbakefall av kreft i feltet. Spesielt, siden disse metodene ikke bruker andre reagenser som kan påvirke resultatene, er nedstrøms eksperimenter mulig med det oppnådde materialet.
Figur 1: Arbeidsflyt for plateblandingsmetode for samtidig separasjon av stoffer fra fullblod . (A) Plasmaet som inneholder cfDNA oppnås. (B) CTC-er fjernes fra buffy-pelsen. (C,D) Etter virvel løsnes CTC fra membranen, og en liten mengde CTC forblir fortsatt på membranen. Både oppnådde celler og membranen kan gjennomgå langvarig lagring ved å fryse prøver i lagringsbufferen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Renhet og mengde ekstrahert cfDNA. De ekstraherte cfDNA-ene ble evaluert ved hjelp av Bioanalyzer, og cfDNA-skjermbånd ble brukt sammen med en elektronisk stige. Den grønne linjen ble brukt til justering mellom stigen (venstre) og prøven (høyre). Trekantmerkene indikerer DNA-båndet. Det meste av cfDNA er 166 bp, og noen finnes i heltallsmultipler av lengde. Vanligvis måler konsentrasjonen av cfDNA opp til størrelsen 50 bp til 700 bp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Telling av CTC ved hjelp av membranfarging. Etter membranimmunocytokjemi farge, viser celler DAPI (Nuclear positive) signaler i blått, mens EpCAM / CK (CTCs positive) og CD45 (WBC positive) er uthevet i henholdsvis grønt og rødt. Fluorescenssignaler ble målt ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Skalalinjen indikerer 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende tabell 1: Sammensetning av det endelige volumet for bruk av tetthetsgradientløsning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 2: Generelle problemer og forsiktighetsregler for vedlikehold. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mengden og konsentrasjonen av cfDNA og CTC avhenger av individ, stadium og type kreft. Det avhenger også av tilstanden til pasienten 2,4,5,10,20. Spesielt i de tidlige eller forstadier av kreft er konsentrasjonene av kreftrelaterte stoffer svært lave, så det er stor mulighet for at det ikke kan oppdages. Likevel har tidlig påvisning en svært positiv effekt på pasientens overlevelse og etablering av behandlingsstrategi. Siden cfDNA og CTC har kort halveringstid i blodet, reflekterer de sanntidsinformasjon om kreft 21,22,23,24,25. Derfor, for samtidig å skaffe seg ulike kreftrelaterte stoffer, er det nødvendig med en stor mengde blod under de samme forholdene. Systemet som vises her gir brukerne en enkel metode. Brukeren kan velge og bruke platen som tilsvarer materialet som kreves av fullblod. Ved hjelp av en av de gitte sylinderampullene kan plasma som inneholder cfDNA oppnås, og CTC kan samles inn fra samme blodprøve, bortkastet buffyfrakk eller PBMC ved ny injeksjon i en FAST-auto-plate (figur 1).
Størrelsesbasert CTC-fangst er enkel, men den har begrensninger for renhet. Det er mange forskjellige former og størrelser av celler i blodet26. WBCs varierer i størrelse fra 8 til 16 μm27. I en annen studie var gjennomsnittsstørrelsen på den målte WBC 9 μm. På den annen side er minimumsstørrelsen på isolerte CTC 16 μm, og gjennomsnittsstørrelsen er 30 μm28. Videre er CTC tilstede i en svært liten mengde i pasientblodet sammenlignet med andre blodceller. Minimering av WBC-kontaminering er viktig for nedstrømsanalyser. Selv om antistoffbasert deteksjon kan fange CTC, krever høyoppløselig analyse som NGS ytterligere enkeltcelleplukkingsteknikker eller et høyt nivå av bioinformatikkanalyse.
Nylig har metoder for intuitivt å observere tilstedeværelsen av CTC før høyoppløselig analyse ved hjelp av ulike fangstteknikker blitt implementert29. Som vist i resultatene, kan membranen som er anskaffet fra FAST-autopatronen, farges direkte for CTC-deteksjon. Fangede CTC-er kan også enkelt resuspenderes fra membranen ved vortexing for lagring eller ytterligere applikasjoner som cellekultur (figur 1).
Denne metoden bruker prinsippene for sentrifugering og mikrofluidikk. Derfor er balansen mellom utstyret og platen viktig, og det er også viktig å feste den med plateholderen. Det er viktig å fylle eventuelt innledende utilstrekkelig totalvolum med PBS. Hvis den opprinnelige mengden er utilstrekkelig, kan det være et problem som fører til vanskeligheter med å flytte til neste plass. Ta plateholderen ut på en bordplate for å forhindre forurensning av utstyret og for å flytte væsker inn og ut av platen. Når det gjelder FAST-auto-plate, må prøvene behandles raskt for å redusere skaden på CTC i membranen. Vær spesielt forsiktig med å forhindre forurensning ved håndtering av membranen og å følge den etablerte protokollen for langtidslagring.
Likevel er denne metoden enkel å bruke og kan behandle en til fire prøver samtidig. Også forskjellige underlag av væske kan oppnås ved ganske enkelt å bytte ut platen. Videre er det ikke nødvendig med ytterligere reagenser annet enn å bruke en tetthetsgradientløsning for å oppnå PBMCs. Derfor er det oppnådde materialet bra for nedstrøms bruk.
Denne metoden har fortsatt noen begrensninger. Brukeren kan ikke endre platen vilkårlig, og forskjellige typer plater kan ikke brukes samtidig. Det er også grenser for maksimalt volum, så flere plater må brukes til store mengder blod. Ytterligere metoder er fortsatt nødvendig for å oppnå cfDNA. Ved hjelp av membranen er det vanskelig å oppnå bare CTC ved hjelp av porestørrelsesfangstmetoden. Derfor kreves cellevalg eller sortering for CTC-spesifikke applikasjonseksperimenter.
Det finnes forskjellige væsker i kroppen, og produksjonen av visse kroppsvæsker er forbundet med sykdom30. Foreløpig er bruk av blodlegemefluidet kun foretatt for analyse. I fremtiden kan en optimal protokoll etableres ved å bekrefte ytelsen i forskjellige kroppsvæsker som urin, ascites, pleuralvæske og spinalvæske. For å gi en mer praktisk metode for brukere, utvikles for tiden enheter som automatisk trekker ut cfDNA fra platen. Videre er utstyr som er i stand til å utføre kvantitativ PCR direkte i platen etter ekstraksjonen under utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette manuskriptet ble delvis støttet av Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) og Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
