Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في نموذج Teleost اليابانية Medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

توضح هذه المقالة طريقتين سريعتين وفعالتين لجمع الحيوانات المنوية من نموذج ميداكا الأسماك الصغيرة (Oryzias latipes) ، بالإضافة إلى بروتوكول لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA).

Abstract

ميداكا اليابانية (Oryzias latipes) هي سمكة teleost ونموذج فقاري ناشئ لأبحاث السموم البيئية والتنموية والوراثية وعلم وظائف الأعضاء. يستخدم Medaka أيضا على نطاق واسع للتحقيق في تكاثر الفقاريات ، وهي وظيفة بيولوجية أساسية لأنها تسمح للأنواع بالاستمرار. جودة الحيوانات المنوية هي مؤشر مهم على خصوبة الذكور ، وبالتالي نجاح التكاثر. تقنيات استخراج الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية موثقة جيدا للعديد من الأنواع ، بما في ذلك أسماك teleost. يعد جمع الحيوانات المنوية أمرا بسيطا نسبيا في الأسماك الكبيرة ولكن يمكن أن يكون أكثر تعقيدا في الأسماك النموذجية الصغيرة لأنها تنتج منوية أقل وأكثر حساسية. لذلك ، تصف هذه المقالة طريقتين لجمع الحيوانات المنوية في الأسماك النموذجية الصغيرة ، medaka اليابانية: تشريح الخصيتين وتدليك البطن. توضح هذه الورقة أن كلا النهجين ممكنان ل medaka وتظهر أنه يمكن إجراء تدليك البطن عدة مرات بشكل متكرر حيث تتعافى الأسماك بسرعة من الإجراء. توضح هذه المقالة أيضا بروتوكولا لتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في medaka لتقييم موضوعي للعديد من المؤشرات المهمة لجودة الحيوانات المنوية في medaka (الحركة ، التقدمية ، مدة الحركة ، التركيز النسبي). هذه الإجراءات ، المحددة لهذا النموذج الصغير المفيد ، ستعزز بشكل كبير فهم العوامل البيئية والفسيولوجية والوراثية التي تؤثر على الخصوبة لدى ذكور الفقاريات.

Introduction

medaka اليابانية هي سمكة صغيرة تضع البيض في المياه العذبة موطنها شرق آسيا. أصبح Medaka نظاما نموذجيا ممتازا للفقاريات لعلم السموم البيئية ، وعلم الوراثة التنموي ، وعلم الجينوم ، ودراسات علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاءالتطوري 1,2. على غرار الزرد الشعبي ، فهي سهلة التكاثر نسبيا ومقاومة للغاية للعديد من أمراض الأسماك الشائعة 1,2. هناك العديد من المزايا لاستخدام medaka كنموذج ، بما في ذلك وقت جيل قصير ، وأجنة شفافة1،2 ، وجينوممتسلسل 3. على عكس الزرد ، يحتوي medaka على جين يحدد الجنس 4 بالإضافة إلى درجة حرارة عالية (من4-40 درجة مئوية) وتحمل الملوحة (أنواع euryhaline)5. أيضا ، تم تطوير العديد من الأدوات الوراثية والتشريحية ، بالإضافة إلى البروتوكولات6،7،8،9،10،11،12 ، في ميداكا لتسهيل دراسة بيولوجيتها.

التكاثر هو وظيفة فسيولوجية أساسية لأنه يسمح للنوع بالاستمرار. يتطلب تكاثر الفقاريات عددا لا يحصى من الأحداث المنسقة بدقة ، بما في ذلك إنتاج البويضات في الإناث وإنتاج الحيوانات المنوية في الذكور. الحيوانات المنوية هي خلايا فريدة من نوعها ، يتم إنتاجها من خلال عملية معقدة لتكوين الحيوانات المنوية ، حيث يوجد عدد من نقاط التفتيش لضمان تسليم منتج عالي الجودة13. أصبحت جودة الأمشاج محط تركيز في دراسات تربية الأحياء المائية وأعداد الأسماك نظرا لتأثيرها على نجاح الإخصاب وبقاء اليرقات. وبالتالي ، فإن جودة الحيوانات المنوية هي مؤشر مهم لخصوبة الذكور في الفقاريات.

ثلاثة عوامل مفيدة لتقييم جودة الحيوانات المنوية للأسماك هي الحركة والتقدمية وطول العمر. تعد النسبة المئوية للحركة والحركة التقدمية من المؤشرات الشائعة لجودة الحيوانات المنوية حيث أن الحركة التقدمية ضرورية وترتبط ارتباطا وثيقا بنجاح الإخصاب14,15. تعد مدة الحركة أيضا مؤشرا مهما في الأسماك حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة بالكامل لمدة تقل عن 2 دقيقة في معظم أنواع teleost ويكون مسار الحيوانات المنوية بشكل عام أقل خطية من الثدييات15. ومع ذلك ، اعتمدت العديد من الدراسات التي تقيم حركة الحيوانات المنوية في الماضي على طرق ذاتية أو شبه كمية لتحليل الحيوانات المنوية15,16. على سبيل المثال ، تم تقدير حركة الحيوانات المنوية في medaka في الماضي بصريا تحت المجهر17. كما تم تقديره من خلال تسجيل حركة الحيوانات المنوية واستخدام برامج التصوير لدمج الإطارات وقياس مسار السباحة وسرعتها18،19،20. غالبا ما تفتقر هذه الأساليب إلى المتانة ، حيث تقدم نتائج مختلفة وفقا للشخص الذي يقوم بإجراء التحليل15,21.

تم تطوير تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA) في البداية للثدييات. CASA هي طريقة كمية سريعة لتقييم جودة الحيوانات المنوية عن طريق تسجيل وقياس السرعة والمسار بطريقة آلية15. في الأسماك ، تم استخدامه في أنواع مختلفة لرصد آثار العديد من ملوثات المياه على جودة الحيوانات المنوية ، لتحديد السلف المثيرة للاهتمام لتحسين الأمهات ، لتحسين كفاءة الحفظ بالتبريد والتخزين ، وتحسين ظروف الإخصاب15. لذلك ، فهي أداة قوية لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق في أنواع الفقاريات المختلفة. ومع ذلك ، نظرا للتنوع المهم في استراتيجيات التكاثر بين الأسماك ، فإن الحيوانات المنوية لأسماك teleost تختلف عن تلك الموجودة في الثدييات ومن نوع سمكي إلى آخر. تحتوي أسماك Teleost ، التي تخصب البيض خارجيا بشكل أساسي عن طريق إطلاق الأمشاج في الماء ، على منوية عالية التركيز بسيطة نسبيا في التركيب بدون جسيم ، على عكس الثدييات ، التي تخصب داخليا وبالتالي لا يتعين عليها تعويض التخفيف في الماء ، ولكن عليها تحمل المزيد من السوائل اللزجة14. بالإضافة إلى ذلك ، تتحرك الحيوانات المنوية من معظم الأسماك بسرعة ولكنها متحركة بالكامل لمدة تقل عن دقيقتين بعد التنشيط ، على الرغم من وجود العديد من الاستثناءات15,22. نظرا لأن الحركة يمكن أن تنخفض بسرعة في معظم الأسماك ، يجب توخي الحذر الشديد مع توقيت التحليل بعد التنشيط عند تحديد بروتوكول تحليل الحيوانات المنوية للأسماك.

التكاثر هو أحد المجالات في علم الأحياء التي تم فيها استخدام teleosts و medaka على نطاق واسع ككائنات نموذجية. في الواقع ، يظهر ذكور medaka سلوكيات إنجابية واجتماعية مثيرة للاهتمام ، مثل حراسة الشريك23,24. بالإضافة إلى ذلك ، توجد العديد من الخطوط المعدلة وراثيا لدراسة التحكم في الغدد الصم العصبية للتكاثر في هذا النوع25،26،27. يمكن أن يكون أخذ عينات من الحيوانات المنوية ، وهو إجراء بسيط نسبيا في الأسماك الكبيرة ، أكثر تعقيدا في الأسماك النموذجية الصغيرة لأنها تنتج منوية أقل وأكثر حساسية. لهذا السبب ، فإن معظم الدراسات التي تنطوي على أخذ عينات من الحيوانات المنوية في medaka استخراج milt (السائل المنوي للأسماك) عن طريق سحق الخصيتين تشريح17،28،29،30. تستخدم بعض الدراسات أيضا تدليكا معدلا للبطن للتعبير عن الذوبان مباشرة في الوسط المنشط18،19،20 ؛ ومع ذلك ، مع هذه الطريقة ، من الصعب تصور كمية ولون الذوبان المستخرج. في الزرد ، يستخدم تدليك البطن بشكل شائع للتعبير عن الميل ، والذي يتم جمعه على الفور في أنبوب شعري31،32،33. تتيح هذه الطريقة تقدير حجم الذوبان ، وكذلك مراقبة لون القذف ، وهو مؤشر سريع وبسيط لجودة الحيوانات المنوية32,33. لذلك ، لا يوجد بروتوكول واضح وموضح جيدا لجمع الحيوانات المنوية وتحليلها في medaka.

لذلك توضح هذه المقالة طريقتين لجمع الحيوانات المنوية في نموذج صغير للأسماك اليابانية medaka: تشريح الخصيتين وتدليك البطن بأنابيب شعرية. يوضح أن كلا النهجين ممكنان ل medaka ويظهر أنه يمكن إجراء تدليك البطن عدة مرات متكررة حيث تتعافى الأسماك بسرعة من الإجراء. كما يصف بروتوكولا لتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في ميداكا لقياس العديد من المؤشرات المهمة لجودة الحيوانات المنوية في ميداكا (الحركة ، والتقدم ، وطول العمر ، والتركيز النسبي للحيوانات المنوية). هذه الإجراءات ، المحددة لهذا النموذج الصغير المفيد ، ستعزز بشكل كبير فهم العوامل البيئية والفسيولوجية والوراثية التي تؤثر على الخصوبة لدى ذكور الفقاريات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب والتعامل مع الحيوانات وفقا للتوصيات المتعلقة برعاية التجارب في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة (NMBU). أجريت التجارب باستخدام الذكور البالغين (6-9 أشهر) medaka اليابانية (سلالة Hd-rR) التي أثيرت في NMBU (Ås ، النرويج). كما تم اختبار الطرق لفترة وجيزة على ذكور الميداكا اليابانية البالغة من العمر 9 أشهر (سلالة CAB) التي أثيرت في المعهد الوطني لبحوث الزراعة والأغذية والبيئة (INRAE ، رين ، فرنسا).

1. إعداد الصك والحل

  1. تحضير محلول مخزون مخدر (0.6٪ تريكايين).
    1. تمييع 0.6 غرام من Tricaine (MS-222) في 100 مل من 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
    2. يقسم 2 مل من محلول مخزون التخدير في 50 أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يتم استخدامه للتخدير أو القتل الرحيم.
  2. تحضير ماء الاسترداد (محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪).
    1. أضف 27 جم من كلوريد الصوديوم إلى 3 لتر من ماء الحوض.
    2. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
  3. اضبط وسيط التنشيط إذا لزم الأمر (محلول الملح المتوازن من هانك [HBSS]).
    ملاحظة: يمكن شراء HBSS تجاريا أو صنعه في المختبر (جدول المواد).
    1. قم بقياس الرقم الهيدروجيني ل HBSS باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. اضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر ، باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم ، وبالتالي فإن الرقم الهيدروجيني النهائي هو 7.1-7.3.
    2. قم بقياس أسمولية HBSS باستخدام مقياس الأسمومتر لإعداد التقارير المستقبلية.
      ملاحظة: النطاق على المنتج التجاري هو 266-294 mOsmol / kg. في الدراسة الحالية ، كانت الأسمولية 287 mOsmol / kg. يمكن تخفيفه بالماء المقطر لتقليل الأسمولية إذا رغبت في ذلك ، ولكن هذا ليس ضروريا حيث لا يوجد فرق كبير في تنشيط الحيوانات المنوية medaka في 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. قم بتخزين المحلول في RT حتى الاستخدام.
  4. تحضير الاسفنجة عقد.
    1. قطع اسفنجة ناعمة لتناسب بشكل مريح في طبق بتري.
    2. قطع خط مستقيم في منتصف الإسفنجة يكون طويلا بما يكفي لاستقبال الأسماك (3-4 سم) وعمقها حوالي 1 سم (الشكل 1 أ). هذا الشق في الإسفنجة سيثبت الجانب البطني للسمكة لأعلى لفضح العباءة.

2. جمع الحيوانات المنوية

ملاحظة: يمكن جمع الحيوانات المنوية بطريقتين مختلفتين: تدليك البطن أو تشريح الخصيتين.

  1. جمع الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن
    1. تحضير محلول مخدر بنسبة 0.03٪ عن طريق تخفيف أنبوب واحد من مخزون Tricaine (0.6٪) في 38 مل من ماء الحوض في وعاء زجاجي سعة 100 مل.
    2. قم بإعداد الأدوات ، بما في ذلك الملقط الأملس ذو النهاية الحادة ومجموعة ماصة زجاجية معايرة سعة 10 ميكرولتر ومجموعة أنبوب شفاط (الشكل 1 أ). بلل الإسفنجة المعدة في الخطوة 1.4 بمحلول التخدير.
    3. تحضير الأنابيب مع 36 ميكرولتر من محلول التنشيط للتحليل الفوري. سخن محلول التنشيط في حمام مائي أو حاضنة مضبوطة على 27 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تحليل العينات من الأسماك الفردية ، إلا أنه يمكن تقليل التباين الفردي عن طريق تجميع عينات من عدة ذكور في نفس محلول التنشيط. عند تجميع عينات من أسماك متعددة ، استخدم 36 ميكرولتر من محلول التنشيط لكل سمكة. قد يحتاج هذا التخفيف إلى التعديل اعتمادا على الإجهاد أو ظروف تربية medaka المستخدمة لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر على تركيز الحيوانات المنوية وحجمها. سيشير برنامج CASA إلى ما إذا كان التركيز مرتفعا جدا لتحديد الحيوانات المنوية.
    4. تخدير الأسماك عن طريق وضعها في محلول مخدر لمدة 30-90 ثانية.
      ملاحظة: يجب تكييف مدة التخدير لأنها تختلف حسب حجم السمكة. للتأكد من تخدير الأسماك بالكامل ، قم بقرص السويقة الذيلية برفق بالملقط. إذا لم تتفاعل الأسماك ، يمكن بدء التدليك.
    5. أخرج السمك من محلول التخدير واستخدم منشفة ورقية أو امسحها برفق لتجفيف بطن السمكة. ضع السمكة في حوض الإسفنج الرطب الذي يمسك الجانب البطني لأعلى بحيث تتعرض خياشيمها لمحلول التخدير في الإسفنجة (الشكل 1 ب).
    6. إذا كانت المنطقة المحيطة بالعباءة مبللة ، جفف الجانب السفلي من السمكة برفق بمسح منديل يمكن التخلص منه.
    7. ضع السمكة في الإسفنجة القابضة تحت مجهر تشريح وضع الماصة الدقيقة مع أنبوب شفاط متصل بعباءة السمكة (الشكل 1 ج).
    8. قم بتدليك بطن السمكة عن طريق الضغط برفق باستخدام ملقط ناعم ذو نهاية حادة في حركة منضدية إلى ذيلية أثناء المص في نفس الوقت لجمع الذوبان المطرود في الماصة (الشكل 1 د).
    9. حرر السمك من الإسفنج في ماء الاسترداد. اسمح لهم بالتعافي في المحلول لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إعادتهم إلى نظام الحوض.
    10. انقل الذوبان إلى أنبوب مجهز بمحلول تنشيط مسخن مسبقا وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات عن طريق المص والنفخ على مجموعة أنبوب الشفاط.
    11. قم بتجانس الحيوانات المنوية المخففة برفق عن طريق تحريك الأنابيب قبل التحليل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتحليل العينات على الفور (على سبيل المثال، 5 ثوان) بعد التنشيط. في medaka ، قد يتأخر التحليل ، إذا لزم الأمر ، حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة لعدة ساعات ، ولكن يجب أن يظل الوقت ثابتا بين العينات حيث تقل الحركة بمرور الوقت.
  2. جمع الحيوانات المنوية عن طريق تشريح الخصيتين
    1. تحضير محلول القتل الرحيم بنسبة 0.08٪ عن طريق تخفيف أنبوبين من مخزون Tricaine (0.6٪) في 26 مل من ماء الحوض في وعاء زجاجي سعة 100 مل.
    2. قم بإعداد أدوات التشريح ، بما في ذلك الملقط الحاد والناعم ومقص التشريح الصغير (الشكل 1E).
    3. قم بإعداد أنبوب لكل عينة مع 120 ميكرولتر من محلول التنشيط للتحليل الفوري. سخن محلول التنشيط في حمام مائي أو حاضنة مضبوطة على 27 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تحليل العينات من الأسماك الفردية ، إلا أنه يمكن تقليل التباين الفردي عن طريق تجميع عينات من عدة ذكور في نفس محلول التنشيط. لتجميع العينات من أسماك متعددة ، استخدم 120 ميكرولتر من محلول التنشيط لكل سمكة. قد يحتاج هذا التخفيف إلى التعديل اعتمادا على الإجهاد أو ظروف تربية medaka المستخدمة لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر على تركيز الحيوانات المنوية وحجمها. سيشير برنامج CASA إلى ما إذا كان التركيز مرتفعا جدا لتحديد الحيوانات المنوية.
    4. القتل الرحيم للأسماك عن طريق وضعها في محلول مخدر 0.08 ٪ لمدة 30-90 ثانية.
      ملاحظة: المدة تعتمد على حجم السمكة. للتأكد من أن الأسماك يتم القتل الرحيم ، انتظر حتى تتوقف حركات operculum. يجب ألا تتفاعل الأسماك مع لمسة الملقط.
    5. أخرج السمك من محلول القتل الرحيم وجفف السمك برفق بمنشفة ورقية أو امسحه برفق.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن وزن الأسماك لحساب مؤشر الغدد التناسلية لاحقا (GSI ، وزن الغدد التناسلية / وزن الجسم).
    6. ضع السمكة تحت مجهر تشريح بحيث يكون جانبها الجانبي الأيسر متجها لأعلى (الشكل 1F).
    7. باستخدام مقص تشريح صغير ، قم بقطع رفرف ظهريا من العباءة ، ثم عبر الأضلاع إلى الخياشيم لفضح الأعضاء الداخلية (الشكل 1G).
    8. حدد موقع الخصيتين ، واقطع المرفق من كلا الطرفين بالملقط الدقيق ، وقم بإزالة الخصيتين (الشكل 1H).
      ملاحظة: لحساب GSI ، يمكن وزن الخصيتين في هذه الخطوة. العمل بسرعة لتجنب تجفيف الأنسجة.
    9. انقل الخصيتين إلى أنبوب معد بمحلول التنشيط المسخن مسبقا.
    10. استخدم الملقط لسحق الخصيتين عدة مرات على جانب الأنبوب لإطلاق الحيوانات المنوية. يمكن عادة تصور إطلاق الحيوانات المنوية وسيجعل المحلول غائما قليلا.
    11. قم بتجانس الحيوانات المنوية المخففة برفق عن طريق تحريك الأنابيب قبل التحليل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتحليل العينات على الفور (على سبيل المثال، 5 ثوان) بعد التنشيط. في medaka ، قد يتأخر التحليل ، إذا لزم الأمر ، حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة لعدة ساعات ، ولكن يجب أن يظل الوقت ثابتا بين العينات حيث تقل الحركة بمرور الوقت.

Figure 1
الشكل 1: جمع Milt عن طريق تدليك البطن (A-D) وتشريح الخصيتين (E-H). (أ) أدوات لتدليك البطن: إمساك الإسفنج ، والملقط الناعم الحاد ، و 10 ميكرولتر من الزجاج القابل للضبط micropipette مع مجموعة أنبوب الشافطة ؛ (ب) وضع الأسماك في الإسفنجة القابضة ، مع تعرض الخياشيم للتخدير في الإسفنجة والعباءة متجهة لأعلى ؛ (ج) وضع ملقط أملس غير حاد على البطن وميكروبيت ضد عباءة ؛ (د) يذوب في ميكروبيبيت بعد التدليك اللطيف والمص. (ه) أدوات تشريح الخصيتين: ملقط غير حاد، ملقط دقيق، ومقص تشريح صغير؛ (و) موضع الأسماك لتشريح الخصيتين؛ (ز) الرؤية الجانبية للأعضاء الداخلية؛ (ح) إزالة الخصيتين عن طريق قطع الملحق من كلا الطرفين بالملقط الدقيق. شريط المقياس: 2 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحليل الحيوانات المنوية مع نظام CASA

  1. يجب إعداد نظام CASA (SCA Evolution) وفقا للدليل باستخدام مجهر باستخدام مرشح أخضر وهدف 10x مع تباين الطور.
  2. قم بإعداد شرائح غرفة العد التي يمكن التخلص منها 20 ميكرومتر عن طريق التسخين المسبق على لوحة تسخين أو في حاضنة مضبوطة على 27 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
  3. افتح برنامج تحليل الحيوانات المنوية وحدد وحدة الحركة.
  4. اضبط تكوين medaka كما هو موضح في الشكل 2B.
  5. ضع شريحة غرفة عد يمكن التخلص منها مسبقا 20 ميكرومتر تحت المجهر على مرحلة ساخنة مضبوطة على 27 درجة مئوية.
  6. ماصة العينة في الحجرة على الشريحة حتى تملأ الغرفة دون ملء زائد. امسح العينات الزائدة بعناية من مدخل الغرفة بطرف قطني أو امسحها برفق لمنع الخلايا العائمة.
  7. حدد تحليل لإلقاء نظرة على العينة تحت المجهر.
    ملاحظة: إذا كان رمز المجهر أحمر ، فيجب ضبط إضاءة المجهر حتى يتمكن البرنامج من تتبع الحيوانات المنوية بدقة. اضبط سطوع المجهر ، بحيث تظهر حركة ذيل الحيوانات المنوية بوضوح. يجب أن يكون الرمز أزرق.
  8. تأكد من تركيز المجهر وحدد تحليل مرة أخرى لتسجيل الحيوانات المنوية في الحقل. حرك الشريحة بحيث تكون منطقة جديدة من العينة في الإطار وكرر لالتقاط 3-5 مجالات عرض مختلفة. تجنب الحقول التي تحتوي على فقاعات هواء أو كتل خلايا أو قطع أثرية.
  9. حدد النتائج لعرض النتائج .
    ملاحظة: إذا كانت الحقول الموجودة في صفحة النتائج محددة باللون الأحمر، فاتبع مطالبات النظام بحذف الحقول التي تختلف كثيرا في التركيز أو الحركة.
  10. انقر نقرا مزدوجا فوق حقل لعرض نتائج الحقل الفردي أو للتحقق يدويا من أي منوية تم تسميتها بشكل خاطئ أو غير متعقبة. انقر بزر الماوس الأيمن على الحيوانات المنوية الفردية لإعادة تسمية الحركة ، إذا لزم الأمر (الشكل 2 أ).

Figure 2
الشكل 2: لقطة شاشة لبرنامج SCA Evolution . (أ) نتائج تتبع الحيوانات المنوية لحقل واحد. عرض البيانات الميدانية على الجانب الأيمن والنقر نقرا مزدوجا فوق الحيوانات المنوية لعرض البيانات الفردية ؛ (ب) ملخص النتائج لجميع الحقول مع فتح قائمة التكوين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نوع البيانات التي تم الحصول عليها
يوفر تحليل حركة الحيوانات المنوية من برنامج SCA Evolution بيانات عن الحركة (النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة وغير المتحركة) ، بالإضافة إلى التقدمية (النسبة المئوية للحيوانات المنوية التقدمية وغير التقدمية) ، والسرعة (النسبة المئوية للحيوانات المنوية السريعة والمتوسطة وبطيئة الحركة). كما أنه يجمع بين التقدمية والسرعة (تقدمي سريع ، تقدمي متوسط ، غير تقدمي). تستند هذه الملصقات إلى القياسات (الشكل 3 أ) والحسابات (الشكل3 ب) لحركة الحيوانات المنوية ، والتي يوفرها البرنامج (الجدول التكميلي 1). بالنسبة ل medaka ، تم تكييف العتبات التالية من معلمات الزرد الموصى بها بناء على الأدبيات السابقة 19،34،35 وتوزيع بيانات medaka من18 فردا. تعتمد الحركة على السرعة المنحنية (VCL) مع < غير متحرك 10 ميكرومتر / ثانية ≤ بطيئة < 20 ميكرومتر / ثانية ≤ متوسطة ≤ 40 ميكرومتر / ثانية < سريع. تعتبر الحيوانات المنوية تقدمية إذا كان مؤشر الاستقامة (STR) > 68٪.

يحسب SCA Evolution أيضا تركيز الحيوانات المنوية إذا تم توفير حجم العينة والتخفيف. في حين أن طريقة تدليك البطن مفيدة لتصور التلوين وتأكيد وجود الميل ، فإن الحجم الذي تم جمعه صغير جدا بحيث لا يمكن قياسه بدقة. إذا تم تحسين حجم الذوبان عن طريق ظروف التربية أو باستخدام سلالة مختلفة ويمكن قياسه ، فيمكن استخدام البرنامج لحساب التركيز. ومع ذلك ، يمكن أيضا حساب التركيز النسبي لمقارنة الأسماك أو مجموعات المعالجة للعينات المأخوذة عن طريق تشريح الخصيتين ، طالما يتم تشريح الخصية بأكملها وتخفيفها بنفس الحجم من السائل.

Figure 3
الشكل 3: تحليل حركة الحيوانات المنوية. (أ) تتضمن البيانات المسجلة بواسطة نظام CASA السرعة المنحنية (VCL ، السرعة المحسوبة باستخدام المسافة على طول المسار الفعلي) ، متوسط سرعة المسار (VAP ، السرعة المحسوبة باستخدام مسافة المسار المتوسط) ، سرعة الخط المستقيم (VSL ، السرعة المحسوبة باستخدام المسافة بين بداية ونهاية مسار الحيوانات المنوية) ، سعة إزاحة الرأس الجانبي (ALH ، حجم الإزاحة الجانبية لرأس الحيوانات المنوية حول مسارها المتوسط) ، وتردد الضرب المتقاطع (BCF ، المعدل الذي يعبر فيه المسار المنحني المسار المتوسط) ؛ (ب) تشمل القيم المحسوبة من نظام CASA مؤشر الاستقامة (STR ، خطية المسار المتوسط) ، ومؤشر الخطية (LIN ، خطية المسار المنحني) ، والتمايل (WOB ، تذبذب المسار الفعلي حول المسار المتوسط). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تقييم حركة الحيوانات المنوية: حلول تنشيط مختلفة
والمثير للدهشة أن الحيوانات المنوية التي تم أخذ عينات منها عن طريق كل من تدليك البطن وتشريح الخصيتين كانت غير متحركة في ماء الحوض (16 مللي أوسمول / كجم) (الشكل 4 أ) وفي ماء الحوض المعدل بمحلول كلوريد الصوديوم إلى 34 مللي أوسمول / كجم. كما لم تكن هناك حركة في الماء منزوع الأيونات (-1 ملي أوسمول/كغ)، أو ماء منزوع الأيونات معدل إلى 23 ملي أوسمول/كغ. كانت الحيوانات المنوية متحركة في HBSS (287 mOsmol / kg) (الشكل 4B) ، وكذلك في HBSS المخفف بالماء منزوع الأيونات إلى 36 mOsmol / kg و 113 mOsmol / kg ، على الرغم من انخفاض النسبة المئوية للحركة بشكل كبير عند 36 mOsmol / kg (الشكل 4C).

Figure 4
الشكل 4: الحركة بواسطة الأسمولية لتنشيط المحلول. عينات من الحيوانات المنوية عن طريق تشريح الخصيتين في (أ) ماء الحوض (16 مللي أوسمول / كجم) و (ب) HBSS غير المعدل (287 مللي أوسمول / كجم). الدوائر الصفراء تسمية الحيوانات المنوية غير المتحركة والخطوط الملونة تشير إلى حركة الحيوانات المنوية: الأحمر (التدريجي السريع) ، الأخضر (التدريجي المتوسط) ، الأزرق (غير التقدمي). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (C) تنشيط حركة الحيوانات المنوية باستخدام HBSS عند 36 و 113 و 287 mOsmol / kg H2O. بالنسبة ل 36 و 113 ، n = 4 مع سمكتين مجمعتين لكل عينة. بالنسبة ل 287 ، ن = 9 مع سمكتين مجمعتين لكل عينة. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار ANOVA مع اختبار Tukey البعدي ويشار إلى الاختلافات ذات الدلالة المعنوية بأحرف مختلفة. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طرق أخذ العينات: تدليك البطن مقابل تشريح الخصيتين
الحيوانات المنوية التي تم أخذ عينات منها عن طريق تشريح الخصيتين أكثر حركة بشكل ملحوظ مقارنة بعينات تدليك البطن من نفس السمكة (الشكل 5 أ). من الحيوانات المنوية المتحركة ، تكون نسبة أعلى أيضا تقدمية ومتوسطة أو سريعة الحركة. في عينات الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن ، تكون الحيوانات المنوية الأكثر حركة بطيئة الحركة وغير تقدمية (الشكل 5B-C). ومع ذلك ، يمكن الحصول على نتائج مختلفة باستخدام سلالة مختلفة من medaka (CAB) أو ظروف تربية بديلة (الجدول التكميلي 2).

Figure 5
الشكل 5: تدليك البطن مقابل تشريح الخصيتين. النسبة المئوية ل (أ) الحيوانات المنوية غير المتحركة والمتحركة التي تم أخذ عينات منها عن طريق تدليك البطن أو تشريح الخصيتين. النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة التي هي (ب) الحيوانات المنوية غير التقدمية والتقدمية، (ج) الحيوانات المنوية البطيئة والمتوسطة وسريعة الحركة. تم تنشيط جميع عينات الحيوانات المنوية في HBSS (287 mOsmol / kg H2O). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار Mann-Whitney U ويشار إلى الاختلافات ذات الدلالة المنطقية بواسطة العلامات النجمية. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM ، n = 9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مدة الحركة وفقا لحالة التخزين
كان لدى الحيوانات المنوية التي تم أخذ عينات منها عن طريق تشريح الخصيتين والحفاظ عليها عند 27 درجة مئوية انخفاضا بنسبة 50٪ في الحركة في أول 30 دقيقة بعد التنشيط. بعد 2.5 ساعة ، كان أقل من 5 ٪ من الحيوانات المنوية متحركة. عند تخزينها عند 4 درجات مئوية ، تم تقليل الحركة بنسبة 14٪ فقط في أول 30 دقيقة ، واستغرق الأمر 5 ساعات لرؤية انخفاض بنسبة 50٪ عن الحركة الأولية. كان للجليد تأثير تمديد مماثل ، لكنه كان أقل فعالية ، مع انخفاض الحركة بنسبة 26٪ في أول 30 دقيقة (الشكل 6 أ). كما انخفضت التقدمية بنسبة 52٪ في أول 30 دقيقة على الجليد ، مقارنة ب 65٪ عند 27 درجة مئوية و 33٪ عند 4 درجات مئوية (الشكل 6 ب). على الجليد وعند 4 درجات مئوية ، كانت بعض الحيوانات المنوية (<3٪) لا تزال تتحرك بعد 42 ساعة من التنشيط.

Figure 6
الشكل 6: طول عمر الحيوانات المنوية حسب حالة التخزين. النسبة المئوية (أ) الحركة و (ب) التقدمية بمرور الوقت للعينات التي يتم تنشيطها باستخدام HBSS (287 mOsmol / kg H2O) وتخزينها عند 27 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية أو على الجليد. نقاط البيانات هي متوسط ± SEM ، n = ≥4. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أهمية الظروف البيئية والسكنية
تم أخذ عينات من الذكور الذين يسكنون مع الإناث عن طريق تشريح الخصيتين في الصباح قبل أن تتاح لهم فرصة التفريخ (قبل تشغيل الأنوار) أو بعد تشغيل الأنوار والإناث في الخزان لديها بيض. لم يكن هناك فرق كبير في حركة الحيوانات المنوية. كما تم أخذ عينات من الذكور الذين تم إيواؤهم بدون إناث لمدة شهر ، وبينما كان هناك اتجاه لحركة أعلى ، لم يكن الفرق كبيرا أيضا (الشكل 7).

ومع ذلك ، عندما تم تربية سلالة CAB medaka في منشأة مختلفة مع فصل الذكور عن الإناث لمدة شهر واحد على الأقل ، كانت الأسماك أكبر وتم جمع 5-7 ميكرولتر من الميلت عن طريق تدليك البطن. العينات التي تم جمعها من خمس أسماك عن طريق تدليك البطن كانت حركتها 68.34٪ عند تنشيطها مع 300 mOsmol / kg HBSS. عند الاحتفاظ بها في نفس الظروف ولكن مع الإناث ، كان حجم الذوبان الذي تم جمعه حوالي 2 ميكرولتر ، وكان متوسط الحركة 46.2٪ من ثلاثة ذكور (الجدول التكميلي 2).

Figure 7
الشكل 7. تأثير الظروف البيئية على حركة الحيوانات المنوية. النسبة المئوية لحركة الحيوانات المنوية التي تم أخذ عينات منها قبل (ن = 5) وبعد (ن = 4) من التفريخ من الذكور التي كانت موجودة مع الإناث ، والحيوانات المنوية من الذكور التي تم إيواؤها بدون إناث (ن = 6). تم أخذ عينات من جميع العينات عن طريق تشريح الخصيتين وتفعيلها باستخدام HBSS (287 mOsmol / kg H2O). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبارات t ولم تكن الاختلافات كبيرة. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM مع دوائر تمثل الأسماك الفردية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: متوسط السرعة وحسابات الحركة للحيوانات المنوية التي تم أخذ عينات منها عن طريق تدليك البطن وتشريح الخصيتين (ن = 9). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: بيانات تحليل الحيوانات المنوية من سلالة CAB (وتسمى أيضا Carbio) medaka التي تمت تربيتها في INRAE في رين ، فرنسا. تم تنشيط جميع العينات في 300 mOsmol / kg HBSS. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسمولية هي عامل مهم في تنشيط الحيوانات المنوية للأسماك36,37. بشكل عام ، تكون الحيوانات المنوية غير متحركة في الخصيتين وتصبح متحركة في الوسائط التي تكون مفرطة التناضح بالنسبة للسائل المنوي للأسماك البحرية ، وناقصة التناضح بالنسبة للسائل المنوي لأسماك المياه العذبة37. وعلى غرار الدم، عادة ما تكون البلازما المنوية في أسماك المياه العذبة أقل من تلك الموجودة في الأسماك البحرية (حوالي 300 ملي أوسمول/كغ مقارنة ب 400 ملي أوسمول/كغ)22,37. وبالتالي ، عادة ما يتم تنشيط الحيوانات المنوية للأسماك عند ملامستها للمياه التي تعيش فيها ، وهذا الماء بمثابة أفضل وسيلة تنشيط بيولوجية لتحليل الحيوانات المنوية. ومع ذلك ، فإن الحيوانات المنوية medaka التي تم أخذ عينات منها عن طريق تدليك البطن وتشريح الخصيتين لم تكن متحركة في ماء الحوض (الشكل 4A) في Hd-rR أو سلالة CAB medaka التي أثيرت في مختبرين مختلفين. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الحركة أعلى في 287 mOsmol / kg HBSS مقارنة ب 36 mOsmol / kg HBSS (الشكل 4C) ، وهو أمر غير معتاد بالنسبة لأسماك المياه العذبة.

استخدمت معظم الدراسات السابقة التي تضمنت تحليل الحيوانات المنوية في medaka HBSS 28،29،38 أو محلول Yamamoto18،19 كوسائط تنشيط للحيوانات المنوية medaka دون مناقشة الأسمولية. في حين أن HBSS هو وسيلة تنشيط جيدة للحيوانات المنوية medaka ، فإن الاختلاف في الأسمولية يمكن أن يؤثر على الحركة. لذلك ، من الضروري أن تكشف دراسات تحليل الحيوانات المنوية عن أسمولية محلولها المنشط للمقارنة بين التجارب. وجدت إحدى الدراسات التي تبحث في الأسمولية المثالية للوسط المنشط أن الحيوانات المنوية medaka متحركة في الماء منزوع الأيونات (25 mOsmol / kg) و HBSS بقيم أسمولية < 686 mOsmol / kg ، مع أعلى حركة بين 25 و 227 mOsmol / kg17. ومع ذلك ، في الدراسة الحالية ، لم تكن الحيوانات المنوية متحركة في الماء منزوع الأيونات أيضا. كأسماك euryhaline ، medaka قابلة للتكيف للغاية مع البيئات المختلفة ويمكنها حتى العيش والتكاثر في المياه المالحة39 ، لذلك من الممكن أن تكون ظروف التربية المختلفة مسؤولة عن هذا التناقض. ومن المثير للاهتمام ، أنه لم تبلغ أي دراسات أخرى عن اختبار حركة الحيوانات المنوية medaka في مياه الحوض (أو ما شابه ذلك ، مثل ماء الصنبور القديم) ، على الرغم من أنها وسيلة تنشيط الحيوانات المنوية القياسية لأسماك المياه العذبة.

أحد التفسيرات المحتملة لهذا التنشيط غير النمطي للحيوانات المنوية في medaka هو التفاعل مع سائل المبيض. بينما يتم تنشيط الحيوانات المنوية للأسماك عادة في المياه المحيطة ، فإن سائل المبيض يزيد أو يطيل مدة حركة الحيوانات المنوية في العديد من الأنواع40,41. على الرغم من أن medaka تقوم بتخصيب أسماك المياه العذبة خارجيا ، إلا أن سلوك التفريخ ، والذي يتضمن لف الزعانف والارتعاش ، يضعها على مقربة من تفريخ البث23. نظرا لأن أسمولية سائل المبيض في أسماك المياه العذبة (حوالي 300 مللي أسمول / كجم) قريبة من HBSS40 ، فمن الممكن أن ينشط السائل الذي تطلقه الأنثى الحيوانات المنوية ، وليس ماء الحوض. نظرا لأن أسمولية البلازما المنوية والمبيض متشابهة ، فمن الممكن أن يلعب التركيب الأيوني لسائل المبيض medaka دورا مهما40,42. دور سائل المبيض والأيونات في تنشيط الحيوانات المنوية medaka يستدعي المزيد من التحقيق.

في الدراسات السابقة ، تم جمع الحيوانات المنوية medaka فقط عن طريق سحق الخصيتين تشريح17،28،29،30 أو عن طريق تدليك البطن للتعبير عن الذوبان مباشرة في وسط التنشيط18،19،20. لم تبلغ أي دراسات عن بيانات مع الحيوانات المنوية التي تم جمعها عن طريق تدليك البطن في أنبوب شعري ، على الرغم من أنها ممارسة شائعة في أسماك الزرد وغيرها من أسماك teleost33،43،44. هذه الطريقة ممكنة في ميداكا أيضا. يمكن تصور Milt بسهولة في الأنبوب الشعري ، وعلى الرغم من أن الحجم صغير جدا بحيث لا يمكن قياسه بدقة ، إلا أن هذه الطريقة تتيح تأكيد الجمع الناجح وتحليل اللون كمؤشر سريع للجودة32. تجنب التلوث البرازي أسهل أيضا مع التجميع في أنبوب شعري مقارنة بالوسط. على الرغم من أن عينات الحيوانات المنوية التي تم جمعها عن طريق تشريح الخصيتين لها حركة أفضل في medaka من العينات التي تم جمعها عن طريق تدليك البطن (الشكل 5) وبالتالي فهي مفضلة للتجارب التي يمكن فيها التضحية بالأسماك ، فإن تدليك البطن هو إجراء طفيف التوغل لا يتطلب القتل الرحيم ويمكن تكراره في نفس السمكة. لذلك ، من المفيد للتجارب التي تتبع نفس السمكة بمرور الوقت. أيضا ، تحتوي العينات التي تم جمعها بتدليك البطن فقط على خلايا ناضجة تم إطلاقها باستخدام البلازما المنوية44 ، في حين أن العينات المأخوذة من تشريح الخصيتين قد تشمل خلايا الحيوانات المنوية غير الناضجة وغيرها من الحطام. يقوم نظام CASA بخصم الخلايا المستديرة والحطام الأكبر من المساحة القصوى ، ولكن إذا تم تعيين هذه المعلمة عالية جدا ، فقد تتأثر نتائج الحركة.

نظرا لانخفاض كمية الحيوانات المنوية التي تم جمعها باستخدام تقنية تدليك البطن في هذه الميداكا ، كان من المستحيل قياس حجم الحيوانات المنوية بدقة في الشعيرات الدموية وبالتالي حساب تركيزات الحيوانات المنوية باستخدام طرق منتظمة. ومع ذلك ، بالنسبة للعينات المأخوذة عن طريق تشريح الخصيتين ، من خلال الحفاظ على حجم وسط التنشيط متسقا ووزن الخصيتين ، يمكن حساب التركيز النسبي بناء على تركيز الحيوانات المنوية الذي يقدمه نظام CASA للمقارنة بين الأفراد أو مجموعات العلاج. إلى جانب تحليل الجودة ، يعد التركيز النسبي مفيدا أيضا لتحديد التخفيفات المثلى للعينة للحفظ بالتبريد. إذا تم تحسين الحجم الذي تم جمعه عن طريق تدليك البطن عن طريق ظروف التربية أو باستخدام سلالة مختلفة ، يمكن حساب الحجم عن طريق قياس ارتفاع الذوبان في الأنبوب الشعري وإدخاله في البرنامج لحساب التركيز. في هذه الحالات ، التي يمكن فيها الحصول على عدة ميكرولتر ، قد تكون الحركة أعلى عن طريق تدليك البطن من تشريح الخصيتين (الجدول التكميلي 2). عندما يتم جمع كميات منخفضة ، تكون العينات أكثر عرضة للتلوث ، مما قد يؤثر على الحركة ، على الرغم من أن هذه التأثيرات تبدو متسقة عندما تكون الأحجام متشابهة ، لذلك لا يزال من الممكن إجراء مقارنات بين مجموعات العلاج. ومع ذلك ، لا ينبغي إجراء مقارنات بين العينات التي تختلف اختلافا كبيرا في حجم أو تلوين الميل.

قد يكون الحجم المنخفض من الذوبان الذي تم الحصول عليه من medaka باستخدام تدليك البطن قيدا على التجارب التي تتطلب كمية كبيرة من الميل. في مثل هذه الحالات ، قد يكون تشريح الخصيتين هو الأفضل ، كما هو موضح في دراسة جمعت الذوبان من الزرد وذيل السيف الأخضر عن طريق التشريح والتدليك ، ولكن فقط عن طريق التشريح في medaka بسبب انخفاض حجم30. عادة ما يكون تشريح الخصيتين أفضل للمقارنات مع الأنواع الأخرى لنفس السبب. قد يكون الحجم المحدود عن طريق تدليك البطن مقارنة بالأسماك الأخرى ذات الحجم المماثل بسبب الخصيتين الأصغر (1.9 ± 0.6 مجم في ميداكا مقارنة ب 7.0 ± 2.5 مجم في الزرد 45) وإنتاج منوية أقل (2.0 ± 0.4 × 10 6 خلايا منوية / خصيتين مجم في ميداكا مقارنة ب 7.7 ± 2.0 × 106 خلايا منوية / خصيتين مجم في الزرد46) ، أو إلى عوامل بيولوجية أخرى غير معروفة تحد من هذه التقنية ، كما هو مقترح في سمك السلور الأفريقي الذي يتم تربيته في المفرخات47. يمكن أن يكون الاختلاف فسيولوجيا ، وفقا للسلالة أو الظروف البيئية ، أو تشريحيا ، على عكس الزرد ، تنصهر خصيتا medaka وتقعان بشكل وسطي ، وبالتالي قد يكون من الصعب الوصول إليها عن طريق تدليك البطن ، على الرغم من وجود أسماك أخرى ذات خصيتين منصهرتين أيضا.

بالنسبة لبعض الأنواع ، مثل الزرد ، من الأفضل أخذ عينات من الحيوانات المنوية قبل أن تتاح للأسماك فرصة التفريخ في الصباح48 أو عزل الذكور في خزانات فردية في الليلة السابقة لمنع التفريخ32. مع Hd-rR medaka من هذه الدراسة ، لم يكن للظروف البيئية مثل توقيت أخذ العينات (قبل أو بعد التفريخ) وظروف السكن (مع أو بدون إناث لمدة شهر واحد) تأثير كبير على حركة الحيوانات المنوية (الشكل 7). من الممكن أن يؤدي حجم العينة الأكبر أو عزل الذكور عن الإناث لفترة أطول من الوقت إلى زيادة كمية الحيوانات المنوية و / أو حركتها. في سلالة CAB medaka من منشأة أخرى ، لوحظ اتجاه مماثل مع جودة وحجم أفضل للحيوانات المنوية من الذكور التي تم إيواؤها بمفردها مقارنة بالذكور التي تم إيواؤها مع الإناث (تم اختبار عدد قليل جدا من الأسماك لاستخلاص استنتاجات إحصائية). كان من الممكن أيضا مع هذه الأسماك جمع كميات كبيرة نسبيا من الذوبان عن طريق تدليك البطن (الجدول التكميلي 2) ، على الرغم من أنه تم الحصول على كميات صغيرة جدا من الذوبان باستخدام سلالة Hd-rR medaka ، وأبلغ آخرون عن كميات صغيرة أيضا بنفس التقنية في سلالة CAB medaka30. ومع ذلك ، ما إذا كانت هذه الاختلافات ناتجة عن الإجهاد (وهي سلالة تجارية وليست متولدة) أو بسبب اختلافات التربية (هناك العديد بين المرافق) ، لا يزال غير واضح. في هذه الأسماك ، يمكن جمع عدة ميكرولترات من الذوبان ، مما يحد من التلوث ويحسن الجودة. ولكن بالنسبة للتجارب التي من المهم فيها التعايش بين الجنسين ، لا يبدو من الضروري فصلهما لتحقيق نتائج. كما أنه لا يبدو من الضروري أخذ عينات من الذكور في وقت واحد قبل التفريخ.

على الرغم من الحاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد كيفية اختلاف الحيوانات المنوية medaka بالضبط وفقا للعوامل السكانية والبيئية ، إلا أنه يجب أخذ ظروف الإجهاد والتربية في الاعتبار عند تصميم الإعداد التجريبي ، ويجب توخي الحذر عند المقارنة بين المجموعات التي تنتج كميات مختلفة من الحيوانات المنوية. إذا تم الحصول على كميات أكبر من الذوبان ، فيجب تعديل تخفيف محلول التنشيط (على سبيل المثال ، 1:60 ، على الرغم من أن التركيز المفضل قد يختلف مع نظام CASA). وبالمثل ، إذا كانت الخصيتين المشرحتين أكبر بكثير من المعتاد (2 ملغ) بسبب الإجهاد أو ظروف التربية ، فستحتاج إلى زيادة التخفيف حتى يتمكن برنامج CASA من تسمية جميع خلايا الحيوانات المنوية بدقة.

تختلف طرق تحليل الحيوانات المنوية بشكل كبير بالنسبة للميداكا وغالبا ما تكون ذاتية ، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج بين الدراسات. وجدت دراسة تقارن بين الأساليب الذاتية والموضوعية المستخدمة من قبل الفنيين ذوي المستويات المختلفة من الخبرة أن الفنيين ذوي الخبرة العالية يمكنهم تقدير حركة الحيوانات المنوية للأسماك في حدود 10 نقاط مئوية من البيانات المقدمة من برنامج حركة CASA ، بينما يبالغ الفنيون ذوو الخبرة المتوسطة والمنخفضة في تقدير قيم حركة CASA بسعات تصل إلى 30 نقطة مئوية21 . ومع ذلك ، فإن عدم وجود توحيد للمعلمات التي تحدد الحركة في medaka يمكن أن يسبب أيضا تباينا بين أولئك الذين يستخدمون طرقا أكثر موضوعية. على سبيل المثال ، إحدى الدراسات التي سجلت الحيوانات المنوية بمعدل 33 إطارا في الثانية (fps) ، وحللت 30 إطارا ، واعتبرت أن الحيوانات المنوية تتحرك أسرع من 2 ميكرومتر / ثانية متحركة كان متوسط سرعتها حوالي 60 ميكرومتر / ثانية وحركة حوالي 70٪ للأسماكالضابطة 18. دراسة أخرى باستخدام نفس البروتوكول كان متوسط سرعة 40 ميكرومتر / ثانية للتحكم في الحيوانات المنوية وحركة مئوية تزيد عن 80٪ 19. مجموعة أخرى ، قامت بتحليل 200 إطار بمعدل 47 إطارا في الثانية ، كان لديها متوسط VCL يزيد عن 100 ميكرومتر / ثانية للأسماك الضابطة ، ولكن متوسط الحركة أقل من 50٪. لم يكشفوا عن المعلمات التي تحدد الحركة. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم استخدام برنامج تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر لتحليل الحيوانات المنوية بشكل موضوعي وسريع وموثوق بناء على مجموعة من المعلمات التي تم تخصيصها لخصائص الحيوانات المنوية medaka. نظرا لأنه من الأهمية بمكان أن تكون معلمات الحركة متسقة للمقارنات عبر المختبرات ، فإن التكوين الكامل المستخدم في هذه الدراسة متاح (الشكل 2 ب) ، لذلك يمكن تكرار هذا البروتوكول بشكل موثوق في مختبر مختلف بواسطة باحثين مختلفين.

تظهر أسماك Teleost تنوعا كبيرا في خصائص الحيوانات المنوية ، لذلك على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم اختباره في البداية باستخدام معلمات الزرد الموصى بها لبرنامج SCA Evolution ، كان من الواضح أن المعلمات ستحتاج إلى تعديل للحيوانات المنوية medaka ذات السرعة المنخفضة وطول العمر. لذلك ، تم تكييف معلمات الزرد مع medaka باستخدام الأدبيات من medaka والأنواع الأخرى التي أبلغت عن خصائص الحيوانات المنوية المماثلة 19،34،35 واختارت العتبات التي تناسب توزيع 17،580 مسارا للحيوانات المنوية تم تحليلها من18 فردا. تعتمد الحركة على السرعة المنحنية (VCL) مع < غير متحرك 10 ميكرومتر / ثانية ≤ بطيئة < 20 ميكرومتر / ثانية ≤ متوسطة ≤ 40 ميكرومتر / ثانية < سريع. تعتبر الحيوانات المنوية تقدمية إذا كان مؤشر الاستقامة (STR) > 68٪. تم الاحتفاظ بالعتبة التي تحدد الحركة عند 10 ميكرومتر / ثانية بدلا من 2 ميكرومتر / ثانية ، كما هو مستخدم في بعض الأدبيات18،19 ، حيث تم تسمية العديد من الحيوانات المنوية التي تفتقر إلى حركة السوط بشكل خاطئ على أنها متحركة مع هذا الإعداد. كما استخدمت أنواع الأسماك الأخرى ذات رؤوس الحيوانات المنوية ذات الحجم المماثل (~ 2 ميكرومتر) 10 ميكرومتر / ثانية لتحديد الحيوانات المنوية المتحركة35،43. تم تقليل المساحة القصوى من إعداد الزرد من 90 ميكرومتر 2 إلى 20 ميكرومتر2 بحيث يتم تجاهل الحطام الخلوي الكبير من تشريح الخصيتين.

يبدو أن مدة الحركة تعتمد على كمية ATP المخزنة قبل التنشيط ، حيث تتطلب الحركة السوطية استهلاكا سريعا للطاقة. على الأرجح بسبب هذا الإرهاق السريع ، هناك علاقة بين الحيوانات المنوية ذات السرعة الأولية العالية ومدة الحركة الأقصر49. في حين أن الصدمة التناضحية مطلوبة عادة لتنشيط الحيوانات المنوية للأسماك ، إلا أنها يمكن أن تؤدي أيضا إلى تلف الغشاء خلال فترة الحركة ، والتي يمكن أن تؤثر أيضا على طول العمر. هذا التأثير أكثر أهمية في أنواع المياه العذبة49 ، وهو ما قد يفسر سبب قدرة الحيوانات المنوية البحرية على مدة حركة أطول (حوالي 550 ثانية في المتوسط مقارنة بحوالي 150 ثانية لأنواع المياه العذبة) ، على الرغم من إظهار متوسط سرعة وحركة مماثلة للحيوانات المنوية في المياه العذبة14,22. مدة الحركة التي تزيد عن 30 دقيقة ليست شائعة ، ولكن تم الإبلاغ عنها في العديد من الأنواع البحرية22,49. على الرغم من كونها سمكة مياه عذبة ، إلا أن النتائج مع medaka تناسب ملف الحيوانات المنوية التي لها سرعة أقل ومدة أطول من الأنواع البحرية. قد يكون هذا مرتبطا بالتنشيط في وسط مشابه للبلازما المنوية - بدون صدمة تناضحية ، من المحتمل ألا تعاني الحيوانات المنوية medaka من تلف غشائي مشابه لأسماك المياه العذبة الأخرى.

غالبا ما يكون الحل غير المنشط والتحليل السريع جدا والمحدد بوقت ثابت بعد التنشيط ضروريا لتحليل الحيوانات المنوية التي تكون متحركة لدقائق فقط. ومع ذلك ، فإن حركة الحيوانات المنوية medaka تدوم بشكل طبيعي عدة ساعات ويمكن الحفاظ على حركة أعلى عن طريق التخزين عند 4 درجات مئوية أو على الجليد (الشكل 6). وبالتالي ، بالنسبة للتجارب التي لا يمكن فيها التحليل الفوري ، يمكن تعديل البروتوكول بحيث ، على سبيل المثال ، يتم تخزين الخصيتين في محلول تنشيط على الجليد لمدة ساعة ، طالما تم تسجيل وقت الجمع بحيث يمكن أن يظل التحليل متسقا. ومع ذلك ، للحصول على أفضل النتائج ، لا يزال التحليل الفوري هو الخيار الأفضل. في حين أن الحركة لا تزال تنخفض ، لأنها تدريجية ، فإن النتائج أقل تأثرا بالاختلافات الطفيفة في وقت التحليل بعد التنشيط. ومع ذلك ، من المهم الإبلاغ عن كل من درجة حرارة تخزين العينات ووقت التحليل بعد التنشيط حتى يمكن مقارنة البيانات وإعادة إنتاجها.

كما أنه من المهم جدا في الأسماك تجنب تلوث الذوبان بالبول أثناء أخذ العينات ، لأن هذا يمكن أن يغير الأسمولية وينشط الحيوانات المنويةقبل الأوان 16,50. ومع ذلك ، فإن هذا أقل إثارة للقلق في medaka (بسبب مدة الحركة الأطول) ومع هذا البروتوكول ، حيث يتم وضع العينة في وسط التنشيط على الفور. الكميات المنخفضة من الميلت عرضة لتلوث البول ، لذلك قد يكون من المتوقع حدوث بعض تغير اللون مع تدليك البطن من medaka عند شراء كميات منخفضة. ومع ذلك ، إذا كان هذا ثابتا في السكان ، فلا يزال من الممكن إجراء مقارنات بين مجموعات العلاج. يجب توخي الحذر عند مقارنة مجموعات medaka التي تختلف في حجم أو لون الميلت.

نظرا لأن نتائج تحليل الحيوانات المنوية تعتمد بشكل كبير على الطرق المستخدمة ، فإن الطرق التفصيلية والموثوقة التي يمكن تكرارها بسهولة في المختبرات المختلفة مفيدة. من الضروري أيضا أن تكشف الأوراق عن تفاصيل حول أساليبها لتمكين التكرار. مع استخدام medaka بشكل متزايد كنموذج لأبحاث الإنجاب ، فإن مجموعة المعلومات المتعلقة بتقييم جودة الحيوانات المنوية غير متوفرة. قد تكون الطريقتان المتميزتان الموصوفتان في هذه الورقة لأخذ عينات الحيوانات المنوية مفيدة لتجارب مختلفة. عادة ما ينتج عن تشريح الخصيتين منوية أعلى حركية ويسمح بحسابات التركيز النسبي ، بينما يمكن إجراء تدليك البطن بشكل متكرر على نفس السمكة وهو تمثيل بيولوجي أكثر نقاء لحدث التفريخ. لذلك ، توفر هذه المخطوطة معلمات CASA ، وهي تقنية موثوقة وموضوعية توفر بيانات وافرة حول حركة الحيوانات المنوية ، بما في ذلك الحركة والتقدم والسرعة والمعلمات الحركية الأخرى. وبالتالي ستكون هذه البروتوكولات مفيدة لمجموعة متنوعة من الدراسات في medaka ، بما في ذلك علم السموم والبيئة والتكاثر وعلم وظائف الأعضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل الجامعة النرويجية لعلوم الحياة وبرنامج فولبرايت الأمريكي. يود المؤلفون أن يشكروا أنتوني بلتيير ولورد كاريون جي تان في NMBU على صيانة مرافق الأسماك وغيوم جورميلين من ISC LPGP في INRAE (فرنسا) لتوفير الأسماك ومساحة المختبر لمزيد من اختبار هذه الأساليب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

علم الأحياء، العدد 188، الغدد التناسلية، الحيوانات المنوية، الميلت، الخصية، ميداكا، الأسماك، التكاثر، كازا
جمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في نموذج Teleost اليابانية Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter