Summary
本文介绍了两种从小型模式鱼青鳉鱼（Oryzias latipes）收集精子的快速有效方法，以及使用计算机辅助精子分析（CASA）可靠地评估精子质量的方案。
Abstract
日本青鳉鱼（Oryzias latipes）是一种硬骨鱼类，也是用于生态毒理学、发育、遗传学和生理学研究的新兴脊椎动物模型。青鳉鱼还广泛用于研究脊椎动物的繁殖，这是一项基本的生物学功能，因为它允许物种永存。精子质量是男性生育能力的重要指标，因此也是生殖成功的重要指标。提取精子和精子分析的技术在许多物种（包括硬骨鱼）中都有很好的记录。收集精子在较大的鱼中相对简单，但在小型模型鱼中可能更复杂，因为它们产生的精子更少并且更脆弱。因此，本文介绍了日本青鳉鱼小型模型鱼的两种精子收集方法：睾丸解剖和腹部按摩。本文表明这两种方法对青鳉鱼都是可行的，并表明随着鱼从手术中快速恢复，腹部按摩可以重复进行多次。本文还描述了一种在青鳉鱼中进行计算机辅助精子分析的协议，以客观地评估青鳉鱼精子质量的几个重要指标（活力、渐进性、运动持续时间、相对浓度）。这些程序，为这个有用的小型硬骨模型指定，将大大增强对影响脊椎动物雄性生育能力的环境，生理和遗传因素的理解。
Introduction
日本青鳉鱼是一种产卵的小型淡水硬骨鱼，原产于东亚。青鳉鱼已成为生态毒理学，发育遗传学，基因组学以及进化生物学和生理学研究的优秀脊椎动物模型系统1，2。与流行的斑马鱼类似，它们相对容易繁殖，并且对许多常见的鱼类疾病具有很强的抵抗力1，2。使用青鳉鱼作为模型有几个优点，包括生成时间短、透明胚胎1，2 和测序基因组3。与斑马鱼不同，青鳉鱼具有性别决定基因4以及高温（4-40°C）和盐度（欧盐碱物种）耐受性5。此外，青鳉鱼还开发了许多遗传和解剖学工具，以及协议6，7，8，9，10，11，12，以促进其生物学研究。
繁殖是一项基本的生理功能，因为它允许物种永存。脊椎动物的繁殖需要无数精确协调的事件，包括雌性卵母细胞的产生和雄性精子的产生。精子是独特的细胞，通过复杂的精子发生过程产生，其中有许多检查点来保证高质量产品的交付13。配子质量因其对受精成功率和幼虫存活的影响而成为水产养殖和鱼类种群研究的重点。因此，精子质量是脊椎动物雄性生育能力的重要指标。
评估鱼精子质量的三个有用因素是活力、渐进性和寿命。活力百分比和渐进运动是精子质量的常见指标，因为渐进运动是受精成功的必要条件，并且与受精成功密切相关14，15。运动的持续时间也是鱼类的一个重要指标，因为在大多数硬骨动物中，精子保持完全活动的时间不到2分钟，并且精子的轨迹通常不如哺乳动物线性15。然而，过去许多评估精子活力的研究依赖于分析精子的主观或半定量方法15，16。例如，青鳉鱼的精子活力过去曾在显微镜下目视估计17。通过记录精子运动和使用成像软件合并帧并测量游泳路径和速度18，19，20，也进行了估计。这种方法通常缺乏稳健性，根据执行分析的人提供不同的结果15，21。
计算机辅助精子分析（CASA）最初是为哺乳动物开发的。CASA是一种快速定量的方法，通过以自动方式记录和测量速度和轨迹来评估精子质量15。在鱼类中，它已被用于不同的物种，以监测几种水污染物对精子质量的影响，用于识别有趣的祖细胞以改善亲鱼，提高冷冻保存和储存的效率，并优化受精条件15。因此，它是可靠评估不同脊椎动物物种精子质量的有力工具。然而，由于鱼类之间繁殖策略的重要多样性，硬骨鱼的精子与哺乳动物的精子以及不同鱼类的精子不同。硬骨鱼主要通过将配子释放到水中来使卵子受精，精子高度浓缩，结构相对简单，没有顶体，不像哺乳动物在内部受精，因此不必补偿水中的稀释，但必须承受更粘稠的流体14。此外，大多数鱼的精子移动迅速，但在激活后不到 2 分钟即可完全活动，尽管有几个例外15，22。由于大多数鱼类的运动能力会迅速下降，因此在确定鱼类的精子分析方案时，应格外小心地考虑激活后的分析时间。
繁殖是生物学领域之一，其中硬骨和青鳉鱼被广泛用作模式生物。事实上，青鳉鱼雄性表现出有趣的生殖和社会行为，例如配偶守卫23，24。此外，存在几种转基因品系来研究该物种繁殖的神经内分泌控制25，26，27。精子采样是大型鱼类相对简单的程序，但在小型模型鱼中可能更复杂，因为它们产生的精子更少并且更脆弱。出于这个原因，大多数涉及青鳉鱼精子采样的研究通过粉碎解剖的睾丸17，28，29，30来提取milt（鱼精液）。一些研究还使用改良的腹部按摩将喷雾直接表达到活化培养基18，19，20中;然而，使用这种方法很难可视化提取的小米的数量和颜色。在斑马鱼中，腹部按摩通常用于表达milt，其立即收集在毛细管31，32，33中。该方法可以估计精子的体积，以及观察射精的颜色，这是精子质量的快速而简单的指标32，33。因此，青鳉鱼缺乏清晰且描述良好的精子收集和分析方案。
因此，本文介绍了日本青鳉鱼小模式鱼的两种精子采集方法：睾丸解剖和毛细管腹部按摩。它表明这两种方法对青鳉鱼都是可行的，并且表明随着鱼从手术中快速恢复，腹部按摩可以重复进行多次。它还描述了一种用于青鳉鱼计算机辅助精子分析的协议，以可靠地测量青鳉鱼精子质量的几个重要指标（活力、渐进性、寿命和相对精子浓度）。这些程序，为这个有用的小型硬骨模型指定，将大大增强对影响脊椎动物雄性生育能力的环境，生理和遗传因素的理解。
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Protocol
所有实验和动物处理均按照挪威生命科学大学（NMBU）关于实验动物福利的建议进行。实验使用在NMBU（挪威Ås）饲养的成年（6-9个月大）雄性日本青鳉鱼（Hd-rR菌株）进行。这些方法还在国家农业，食品和环境研究所（INRAE，法国雷恩）饲养的9个月大的雄性日本青鳉鱼（CAB菌株）中进行了简短测试。
1. 仪器和溶液制备
- 准备麻醉储备溶液（0.6%三卡因）。
- 在 100 mL 的 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 0.6 g 三卡因 （MS-222）。
- 将2mL麻醉储备溶液分装到50 2mL塑料管中，并储存在-20°C直至用于麻醉或安乐死。
- 准备回收水（0.9%氯化钠[NaCl]溶液）。
- 将 27 克氯化钠加入 3 升水族箱水中。
- 将溶液储存在室温（RT）下直至使用。
- 如有必要，调整活化剂（汉克平衡盐溶液[HBSS]）。
注意：HBSS可以商业购买或在实验室制造（材料表）。- 使用pH计测量HBSS的pH值。必要时使用盐酸或氢氧化钠调节pH值，因此最终pH值为7.1-7.3。
- 使用渗透压计测量HBSS的渗透压，以便将来报告。
注意：商业产品的范围为 266-294 mOsmol/kg;在目前的研究中，渗透压浓度为287 mOsmol/kg。如果需要，可以用蒸馏水稀释以降低渗透压，但这不是必需的，因为在150-300mOsmol / kg HBSS中青鳉鱼精子的活化没有太大差异。 - 将溶液储存在室温下直至使用。
- 准备保温海绵。
- 切一块柔软的海绵，使其紧贴在培养皿中。
- 在海绵中间切一条直线，该直线足够长以接收鱼（3-4厘米），深约1厘米（图1A）。海绵上的这个缝隙将保持鱼腹侧向上以暴露泄殖腔。
2. 精子采集
注意：精子收集可以通过两种不同的方法实现：腹部按摩或睾丸解剖。
- 通过腹部按摩收集精子
- 通过将一管三卡因原液 （0.6%） 稀释在 100 mL 玻璃容器中的 38 mL 水族箱水中来制备 0.03% 麻醉液。
- 准备仪器，包括钝端光滑镊子和10μL一次性校准玻璃微量移液器和吸气管组件（图1A）。用麻醉液润湿在步骤1.4中制备的保持海绵。
- 用 36 μL 活化溶液制备试管，以便立即分析。在设置为27°C的水浴或培养箱中预热活化溶液至少5分钟。
注意：虽然可以从单个鱼中分析样品，但可以通过在同一活化溶液中汇集来自多个雄性的样品来减少个体差异。合并来自多条鱼的样品时，每条鱼使用 36 μL 活化溶液。这种稀释可能需要根据所用青鳉鱼的菌株或饲养条件进行调整，因为这些因素会影响精子浓度和体积。CASA程序将指示浓度是否过高而无法识别精子。 - 通过将鱼放入麻醉溶液中30-90秒来麻醉鱼。
注意：麻醉持续时间必须调整，因为它根据鱼的大小而变化。为确保鱼完全麻醉，请用镊子轻轻捏住尾柄。如果鱼没有反应，可以开始按摩。 - 将鱼从麻醉液中取出，用纸巾或轻轻擦干鱼的腹部。将鱼放在潮湿的保持海绵腹侧朝上的槽中，使其鳃暴露于海绵中的麻醉溶液中（图1B）。
- 如果泄殖腔周围的区域是湿的，请用一次性纸巾擦干鱼的底部。
- 将鱼放在解剖显微镜下的保持海绵中，并将微量移液管与吸引器管连接到鱼的泄殖腔上（图1C）。
- 按摩鱼的腹部，用钝端光滑的镊子轻轻挤压，同时吸吮以将排出的小米收集到移液管中（图1D）。
- 将鱼从海绵中释放到回收水中。让它们在溶液中恢复至少15分钟，然后再将它们返回到水族箱系统。
- 将小米转移到装有预热活化溶液的准备好的管中，并通过吸气管组件吸气和吹气上下移液数次。
- 在分析前，通过轻弹试管轻轻地匀浆稀释的精子。
注意：为获得最佳结果，请在激活后立即（例如5秒）分析样品。在青鳉鱼中，如有必要，分析可能会延迟，因为精子会保持运动数小时，但随着运动性随时间而降低，样品之间的时间应保持一致。
- 通过睾丸解剖收集精子
- 通过将两管三卡因原液 （0.6%） 稀释在 100 mL 玻璃容器中的 26 mL 水族箱水中来制备 0.08% 安乐死溶液。
- 准备解剖工具，包括钝钝和细镊子和小解剖剪刀（图1E）。
- 用 120 μL 活化溶液为每个样品准备一个试管，以便立即分析。在设置为27°C的水浴或培养箱中预热活化溶液至少5分钟。
注意：虽然可以从单个鱼中分析样品，但可以通过在同一活化溶液中汇集来自多个雄性的样品来减少个体差异。要混合来自多条鱼的样品，每条鱼使用 120 μL 活化溶液。这种稀释可能需要根据所用青鳉鱼的菌株或饲养条件进行调整，因为这些因素会影响精子浓度和体积。CASA程序将指示浓度是否过高而无法识别精子。 - 通过将鱼放入0.08%麻醉液中30-90秒来对鱼实施安乐死。
注意：持续时间取决于鱼的大小。为了确保鱼被安乐死，请等待盖膜运动停止。鱼不应该对镊子的触摸做出反应。 - 从安乐死溶液中取出鱼，用纸巾轻轻擦干鱼或轻轻擦拭。
注意：在此步骤中，可以对鱼进行称重，以稍后计算性腺体指数（GSI，性腺重量/体重）。 - 将鱼放在解剖显微镜下，其左侧朝上（图1F）。
- 使用小解剖剪刀，从泄殖腔背侧切一个皮瓣，然后穿过肋骨到鳃以暴露内脏（图1G）。
- 找到睾丸，用细镊子切开两端的附件，然后取出睾丸（图1H）。
注意：要计算GSI，可以在此步骤中称量睾丸。快速工作以避免组织干燥。 - 将睾丸转移到装有预热活化溶液的准备好的管中。
- 用镊子将睾丸压在管子的侧面几次以释放精子。精子释放通常可以可视化，并且会使解决方案略微浑浊。
- 在分析前，通过轻弹试管轻轻地匀浆稀释的精子。
注意：为获得最佳结果，请在激活后立即（例如5秒）分析样品。在青鳉鱼中，如有必要，分析可能会延迟，因为精子会保持运动数小时，但随着运动性随时间而降低，样品之间的时间应保持一致。
图1：通过腹部按摩（A-D）和睾丸夹层（E-H）收集的。 （A） 腹部按摩器械：握住海绵、钝光滑镊子和带吸气管组件的 10 μL 一次性校准玻璃微量移液器;（B）鱼在保持海绵中的位置，鳃暴露在海绵中的麻醉下，泄殖腔朝上;（C）腹部钝性光滑镊子和微量移液器对泄殖腔的位置;（D）轻轻按摩和吸吮后用微量移液器涂抹。（五）睾丸清扫器具：钝钳、细镊、小解剖剪刀;（六）鱼解剖睾丸的位置;（G） 内脏的侧视图;（H）用细镊子切割两端的附件来去除睾丸。比例尺：2毫米。 请点击此处查看此图的大图。
3. 使用CASA系统进行精子分析
- CASA系统（SCA演化）应根据手册使用显微镜进行设置，使用绿色滤光片和带相差的10倍物镜。
- 通过在加热板上或在设置为27°C的培养箱中预热至少5分钟来制备一次性20μm计数室载玻片。
- 打开精子分析软件并选择运动模块。
- 设置青鳉鱼的配置，如图 2B 所示。
- 将预热的一次性20μm计数室载玻片放在显微镜下设置为27°C的加热载物台上。
- 将样品移液到载玻片上的腔室中，直到它充满腔室而不会过度填充。用棉签小心地擦去腔室入口处多余的样品，或轻轻擦拭以防止细胞漂浮。
- 选择 “分析” 以在显微镜下观察样品。
注意：如果显微镜图标为红色，则需要调整显微镜照明以使程序准确跟踪精子。调整显微镜的亮度，以便清楚地看到精子的尾巴运动。图标应为蓝色。 - 确保显微镜聚焦，然后再次选择 分析 以记录田野中的精子。移动幻灯片，使样本的新区域位于框架中，然后重复以捕获 3-5 个不同的视野。避免有气泡、细胞团或伪影的磁场。
- 选择“结果”以查看 结果 。
注意：如果结果页面上的字段以红色突出显示，请按照系统的提示删除浓度或运动性差异太大的字段。 - 双击字段以查看单个字段的结果，或手动检查是否有任何错误标记或未跟踪的精子。如有必要，右键单击单个精子以重新标记运动性（图2A）。
图 2：SCA 演进软件截图。 （A）一个领域的精子跟踪结果。右侧查看田间数据，双击精子查看单个数据;（B） 打开配置菜单的所有字段的结果摘要。请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
获得的数据类型
SCA Evolution软件的精子活力分析提供了有关运动性（活动和非活动精子的百分比）以及渐进性（进行性和非进行性精子的百分比）和速度（快速，中等和缓慢移动精子的百分比）的数据。它还结合了渐进性和速度（快速渐进，中等渐进，非渐进）。这些标签基于程序提供的精子运动的测量（图3A）和计算（图3B）（补充表1）。对于青鳉鱼，以下阈值是根据基于先前文献19，34，35的推荐斑马鱼参数和来自18个个体的青鳉鱼数据分布改编的。运动性基于曲线速度（VCL），不动<10μm/s≤慢速<20μm/s≤中等≤40μm/s<快速。如果直线指数 （STR） > 68%，则认为精子是渐进的。
SCA Evolution还会计算精子的浓度（如果提供样品的体积和稀释度）。虽然腹部按摩方法有助于可视化颜色并确认小米的存在，但收集的体积太小而无法准确测量。如果通过饲养条件或使用不同的菌株可以测量磨孔量，则可以使用该程序来计算浓度。然而，只要解剖整个睾丸并在相同体积的液体中稀释，也可以计算相对浓度以比较睾丸解剖采集的样品的鱼或治疗组。
图3：精子运动分析。 （A）CASA系统记录的数据包括曲线速度（VCL，使用沿实际路径的距离计算的速度），平均路径速度（VAP，使用平均路径的距离计算的速度），直线速度（VSL，使用精子轨迹的起点和终点之间的距离计算的速度）， 侧头位移的幅度（ALH，精子头围绕其平均路径的横向位移幅度），搏动交叉频率（BCF，曲线路径穿过平均路径的速率）;（B）CASA系统的计算值包括直线度指数（STR，平均路径的线性度），线性指数（LIN，曲线路径的线性度）和摆动（WOB，实际路径围绕平均路径的振荡）。 请点击此处查看此图的大图。
精子活力评估：不同的激活解决方案
令人惊讶的是，通过腹部按摩和睾丸解剖采样的精子在水族箱水（16 mOsmol/kg）（图4A）和用NaCl溶液调节至34 mOsmol/kg的水族箱水中是不动的。在去离子水（-1 mOsmol/kg）或调整为23 mOsmol/kg的去离子水中也没有运动性。精子在HBSS中运动（287mOsmol / kg）（图4B），以及用去离子水稀释至36mOsmol / kg和113 mOsmol / kg的HBSS，尽管在36mOsmol / kg时运动百分比显着降低（图4C）。
图4：活化溶液渗透压的运动。 通过睾丸解剖（A）水族箱水（16 mOsmol / kg）和（B）未调整的HBSS（287 mOsmol / kg）采样的精子。黄色圆圈标记不动精子，彩色线条表示精子运动：红色（快速进展），绿色（中等进展），蓝色（非进展）。比例尺：100 μm。 （C）用HBSS在36、113和287 mOsmol/kg H2O下激活精子活力。对于 36 和 113，n = 4，每个样本汇集两条鱼。对于 287，n = 9，每个样本汇集两条鱼。使用方差分析与Tukey事后检验进行统计分析，显着差异由不同的字母表示。数据表示为± SEM 平均值。 请点击此处查看此图的大图。
采样方法：腹部按摩与睾丸清扫
与来自同一条鱼的腹部按摩样本相比，通过睾丸解剖采样的精子明显更具活动性（图5A）。在活动精子中，较高比例也是渐进的，中等或快速移动。在通过腹部按摩采样的精子中，更多的活动精子移动缓慢且不进行（图5B-C）。然而，使用不同的青鳉鱼（CAB）菌株或替代饲养条件可以获得不同的结果（补充表2）。
图5：腹部按摩与睾丸夹层。 通过腹部按摩或睾丸解剖采样的（A）不动和活动精子的百分比。（B）非进行性和渐进性精子，以及（C）缓慢，中等和快速移动的运动精子的百分比。所有精子样本均在HBSS中激活（287 mOsmol / kg H2O）。使用曼-惠特尼U检验进行统计分析，显著差异用星号表示。数据表示为± SEM 的平均值，n = 9。 请点击此处查看此图的大图。
根据储存条件的运动持续时间
通过睾丸解剖采样并保持在27°C的精子在激活后的前30分钟内运动性降低50%。2.5小时后，不到5%的精子是可动的。当储存在4°C时，运动性在前30分钟内仅降低14%，并且需要5小时才能看到比初始运动性降低50%。冰具有类似的延伸效果，但效果较差，在前30分钟内运动性降低26%（图6A）。在冰上的前30分钟内，渐进性也下降了52%，而在27°C时为65%，在4°C时为33%（图6B）。在冰上和4°C下，一些精子（<3%）在激活后42小时仍在移动。
图6：根据储存条件的精子寿命。用HBSS活化并储存在27°C、4°C或冰上的样品随时间变化的百分比（A）运动性和（B）递进性。数据点是 SEM ±平均值，n = ≥4。请点击此处查看此图的大图。
环境和住房条件的重要性
与雌性共同饲养的雄性在早上有机会产卵之前（在灯打开之前）或在灯打开并且水箱中的雌性有卵之前通过睾丸解剖取样。精子活力没有显着差异。还对一个月没有雌性的雄性进行了采样，虽然有较高的运动趋势，但差异也不显著（图7）。
然而，当CAB菌株青鳉鱼在不同的设施中饲养时，雄性与雌性分开至少一个月，鱼更大，并通过腹部按摩收集5-7μL的小米。通过腹部按摩从五条鱼身上采集的样品在用300 mOsmol/kg HBSS激活时运动率为68.34%。当在相同条件下但与雌性保持时，收集的小米体积约为2μL，来自三个雄性的平均运动率为46.2%（补充表2）。
图7.环境条件对精子活力的影响。 在（n = 5）和之后（n = 4）从与雌性共同饲养的雄性产卵之前（n = 4）采样的精子运动百分比，以及来自没有雌性（n = 6）的雄性精子的百分比。所有样品均通过睾丸解剖取样，并用HBSS活化（287 mOsmol/kg H2O）。使用 t检验进行统计分析，差异不显著。数据显示为SEM平均值±圆圈表示单个鱼。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：腹部按摩和睾丸解剖采样精子的平均速度和运动计算（n = 9）。请点击此处下载此文件。
补充表2：来自法国雷恩INRAE饲养的CAB菌株（也称为Carbio）青鳉鱼的精子分析数据。 所有样品均在300 mOsmol/kg HBSS中活化。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
渗透压是鱼精子活化的重要因素36，37。一般来说，精子在睾丸中是不动的，并且在相对于海洋鱼类的具有高渗性的介质中变得活跃，对于淡水鱼而言，相对于具有低渗透性37。与血液类似，淡水鱼的精浆通常低于海洋鱼类（约300 mOsmol/kg，而400 mOsmol/kg）22，37。因此，鱼精子通常在与它们生活的水接触时被激活，这种水是精子分析的最佳和最生物活化介质。然而，通过腹部按摩和睾丸解剖采样的青鳉鱼精子在两个不同实验室饲养的Hd-rR或CAB菌株青鳉鱼的水族箱水中（图4A）中不运动。此外，287 mOsmol/kg HBSS的运动性高于36 mOsmol/kg HBSS（图4C），这对于淡水鱼来说是不寻常的。
以前大多数涉及青鳉鱼精子分析的研究都使用HBSS 28，29，38或Yamamoto 溶液18，19作为青鳉鱼精子的活化培养基，而不讨论渗透压。虽然HBSS是青鳉鱼精子的良好活化培养基，但渗透压的变化会影响运动。因此，精子分析研究必须披露其活化溶液的渗透压，以便在实验之间进行比较。一项调查活化培养基理想渗透压的研究发现，青鳉鱼精子在去离子水（25 mOsmol/kg）和HBSS中运动，渗透压值<686 mOsmol/kg，最高运动性在25至227 mOsmol/kg之间17。然而，在目前的研究中，精子在去离子水中也不能运动。青鳉鱼作为一种鳉鱼，对不同环境的适应性很强，甚至可以在咸水中生活繁殖39，因此不同的饲养条件可能是造成这种差异的原因。有趣的是，没有其他研究报告在水族馆水（或类似水，如陈年自来水）中测试青鳉鱼的精子活力，尽管它是淡水鱼的标准精子活化培养基。
青鳉鱼中这种非典型精子激活的一种可能的解释是与卵巢液的相互作用。虽然鱼精子通常在周围的水中被激活，但卵巢液在许多物种中增加或延长精子活力的持续时间40，41。虽然青鳉鱼在外部施肥淡水鱼，但它们的产卵行为，包括鳍包裹和颤抖，使它们比广播产卵者更接近23。由于淡水鱼卵巢液的渗透压（约300 mOsmol/kg）接近HBSS40，因此雌性释放的液体可能会激活精子，而不是水族箱水。由于精浆和卵巢血浆的渗透压相似，因此青鳉鱼卵巢液的离子组成可能起重要作用40，42。卵巢液和离子在激活青鳉鱼精子中的作用值得进一步研究。
在以前的研究中，青鳉鱼精子仅通过挤压解剖的睾丸17，28，29，30或通过腹部按摩将精子直接表达到激活培养基18，19，20中;没有研究报告通过腹部按摩将精子收集到毛细管中的数据，尽管这是斑马鱼和其他硬骨鱼类的常见做法33，43，44。这种方法在青鳉鱼中也是可行的。在毛细管中很容易看到 Milt，尽管体积太小而无法准确测量，但这种方法可以确认成功收集和分析颜色作为质量的快速指标32。与培养基相比，在毛细管中收集也更容易避免粪便污染。虽然通过睾丸解剖收集的精子样本在青鳉鱼中比通过腹部按摩收集的样本具有更好的运动性（图5），因此对于可能牺牲鱼的实验更可取，但腹部按摩是一种微创手术，不需要安乐死，可以在同一条鱼身上重复。因此，它对于随时间跟踪同一条鱼的实验很有用。此外，通过腹部按摩收集的样本仅包含用精浆释放的成熟细胞44，而睾丸解剖的样本可能包括未成熟的精子细胞和其他碎片。CASA系统对大于最大面积的圆形细胞和碎片进行折扣，但如果此参数设置得太高，运动结果可能会受到影响。
由于在这些青鳉鱼中用腹部按摩技术收集的精子量很少，因此不可能准确测量毛细血管中的精子量，从而使用常规方法计算精子浓度。但是，对于睾丸解剖采集的样本，通过保持活化培养基的体积一致并称量睾丸，可以根据CASA系统给出的精子浓度计算相对浓度，以比较个体或治疗组。除质量分析外，相对浓度还可用于确定冷冻保存的最佳样品稀释度。如果通过饲养条件或使用不同的菌株改善通过腹部按摩收集的体积，则可以通过测量毛细管中milt的高度来计算体积，并输入程序以计算浓度。在这些可以获得几微升的情况下，腹部按摩的运动性可能高于睾丸解剖（补充表2）。当收集少量时，样品更容易受到污染，这可能会影响运动性，尽管当体积相似时，这些影响似乎是一致的，因此仍然可以在处理组之间进行比较。但是，不应在体积或颜色差异很大的样品之间进行比较。
使用腹部按摩从青鳉鱼中获得的少量小米可能是需要大量小米的实验的限制。在这种情况下，睾丸解剖可能更可取，如一项研究所示，该研究通过解剖和按摩从斑马鱼和绿色剑尾中收集小米，但由于体积低，只能通过青鳉鱼的解剖30。出于同样的原因，睾丸解剖通常更适合与其他物种进行比较。与其他类似大小的鱼相比，腹部按摩的体积有限可能是由于睾丸较小（青鳉鱼为1.9±0.6毫克，而斑马鱼45为7.0±2.5毫克）和产生的精子较少（青鳉鱼为2.0±0.4 x 106 精子细胞/毫克睾丸，而斑马鱼为7.7 ± 2.0 x 106 精子细胞/ mg 睾丸46）， 或其他限制该技术的未知生物因素，如孵化场养殖的非洲鲶鱼47所示。根据应变或环境条件，差异可能是生理上的，也可能是解剖学上的，因为与斑马鱼不同，青鳉鱼睾丸融合并位于更内侧，因此可能更难通过腹部按摩进入，尽管还有其他鱼也有融合睾丸。
对于某些物种，例如斑马鱼，最好在鱼有机会在早上产卵之前取样精子48 ，或者在前一天晚上将雄性隔离在单独的水箱中以防止产卵32。使用本研究的Hd-rR青鳉鱼，采样时间（产卵前或产卵后）和住房条件（有或没有雌性1个月）等环境条件对精子活力没有显着影响（图7）。较大的样本量或将男性与女性隔离更长时间可能会产生更高的精子数量和/或活力。在来自另一个设施的CAB菌株青鳉鱼中，与与雌性饲养的雄性相比，单独饲养的雄性精子质量和体积更好（测试的鱼太少，无法得出统计结论）。这些鱼也可以通过腹部按摩收集相对大量的米特（补充表2），尽管使用Hd-rR菌株青鳉鱼获得了非常少量的米特，而其他人也报告了在CAB菌株青鳉鱼30中通过相同技术获得的小体积。然而，这些差异是由于品系（这是商业品系而不是近交）还是由于饲养差异（设施之间有很多），仍不清楚。在这些鱼中，可以收集几微升的小米，从而限制污染并提高质量。但是，对于两性同居很重要的实验，似乎没有必要将它们分开以产生结果。似乎也没有必要在产卵前一次对雄性进行采样。
尽管需要进一步的研究来确定青鳉鱼精子根据种群和环境因素的确切差异，但在设计实验装置时仍应考虑菌株和饲养条件，并且在比较产生不同数量精子的种群之间时应谨慎。如果获得较大体积的密尔，则应调整活化溶液的稀释度（例如，1：60，尽管优选浓度可能因CASA系统而异）。同样，如果由于应变或饲养条件，解剖的睾丸比典型睾丸（2毫克）大得多，则需要增加稀释度，以便CASA程序可以准确地标记所有精子细胞。
青鳉鱼的精子分析方法差异很大，而且通常是主观的，使得研究结果难以在研究之间进行比较。一项比较具有不同专业知识水平的技术人员使用的主观和客观方法的研究发现，经验丰富的技术人员可以在CASA运动计划提供的数据的10个百分点内估计鱼精子活力，而中低经验技术人员高估CASA运动值，振幅高达30个百分点21.然而，决定青鳉运动性的参数缺乏标准化也可能导致使用更客观方法的参数之间的差异。例如，一项研究以每秒33帧（fps）的速度记录精子，分析了30帧，并认为精子的移动速度超过2μm / s，其对照鱼的平均速度约为60μm / s，运动速度约为70%18。另一项使用相同方案的研究显示，对照精子的平均速度为40μm/s，运动百分比超过80%19。另一组以47 fps的速度分析200帧，对照鱼的平均VCL超过100 um / s，但平均运动性低于50%。他们没有透露哪些参数决定了运动性。因此，在该协议中，计算机辅助精子分析软件用于根据一组针对青鳉鱼精子特征定制的参数客观、快速、可靠地分析精子。由于运动参数对于跨实验室的比较保持一致至关重要，因此可以使用本研究中使用的完整配置（图2B），因此该协议可以由不同的研究人员在不同的实验室中可靠地复制。
硬骨鱼表现出广泛的精子特征多样性，因此尽管该协议最初是使用SCA Evolution软件推荐的斑马鱼参数进行测试的，但很明显，这些参数需要针对低速度，长寿的青鳉鱼精子进行调整。因此，斑马鱼参数使用来自青鳉鱼和其他物种的文献来适应青鳉鱼，这些文献报告了相似的精子特征19，34，35，并选择了最适合来自18个体的17，580个分析精子轨迹分布的阈值。运动性基于曲线速度（VCL），不动<10μm/s≤慢速<20μm/s≤中等≤40μm/s<快速。如果直线指数（STR）>68%，则认为精子是渐进的。定义运动性的阈值保持在10μm / s，而不是一些文献中使用的2μm /s18，19，因为许多缺乏鞭毛运动的精子被错误地标记为这种设置的运动。其他具有相似大小的精子头（~2μm）的鱼类也使用10μm / s来定义活动精子35，43。最大面积从斑马鱼设置的90μm 2减少到20μm2，因此睾丸解剖中的大细胞碎片将被忽略。
运动持续时间似乎取决于激活前储存的ATP量，因为鞭毛运动需要快速消耗能量。可能是由于这种快速耗尽，高初始速度精子与较短的运动持续时间之间存在相关性49。虽然通常需要渗透休克来激活鱼精子，但它也可能导致运动期间的膜损伤，这也会影响寿命。这种效应在淡水物种中更为关键49，这可以解释为什么海洋精子能够具有更长的运动持续时间（平均约550秒，而淡水物种约为150秒），尽管表现出与淡水精子相似的平均速度和运动能力14，22。运动持续时间超过30分钟并不常见，但在几种海洋物种中已有报道22，49。尽管青鳉鱼是一种淡水鱼，但青鳉鱼的结果符合精子的概况，这些精子的速度较低，持续时间较长。这可能与培养基中的活化有关，类似于精浆 - 没有渗透休克，青鳉鱼精子可能不会遭受类似于其他淡水鱼的膜损伤。
对于分析仅活动几分钟的精子，通常需要非活化溶液和活化后非常快速、一致的定时分析。然而，青鳉鱼精子活力自然持续数小时，并且可以通过在4°C或冰上储存来保持更高的活力（图6）。因此，对于无法立即分析的实验，可以修改方案，例如，只要记录收集时间，就可以将睾丸储存在冰上的活化溶液中一小时，以便分析保持一致。但是，为了获得最佳结果，即时分析仍然是最佳选择。虽然运动性仍然会降低，因为它是渐进的，但激活后分析时间的微小差异对结果的影响较小。尽管如此，报告样品的储存温度和激活后的分析时间仍然很重要，以便可以比较和复制数据。
在鱼类中，在采样时避免尿液污染通常也非常重要，因为这会改变渗透压并过早激活精子16，50。然而，这在青鳉鱼（由于运动持续时间较长）和该方案中不太重要，因为样品立即被置于活化培养基中。少量的乳汁容易被尿液污染，因此当摄入少量的青鳉鱼腹部按摩时，可能会有一些变色。但是，如果这在人群中是一致的，那么仍然可以在治疗组之间进行比较。在比较青鳉鱼的体积或颜色变化时应谨慎使用。
由于精子分析结果非常依赖于所使用的方法，因此可以在不同实验室中轻松重复的详细可靠的方法是有益的。对于论文来说，披露有关其方法的细节以实现可重复性也很重要。随着青鳉鱼越来越多地被用作生殖研究的模型，缺乏有关精子质量评估的信息。本文中描述的两种不同的精子采样方法可能对不同的实验有益。睾丸解剖通常产生更高的精子运动性，并允许相对浓度计算，而腹部按摩可以在同一条鱼上重复进行，并且是产卵事件的更纯净的生物学表现。因此，这份手稿提供了CASA的参数，CASA是一种可靠、客观的技术，提供了关于精子运动的大量数据，包括运动性、渐进性、速度和其他运动学参数。因此，这些协议将有助于青鳉鱼的各种研究，包括毒理学、生态学、生殖和生理学。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由挪威生命科学大学和美国富布赖特计划资助。作者要感谢NMBU的Anthony Peltier和Lourdes Carreon G Tan负责鱼类设施维护，以及INRAE（法国）ISC LPGP的Guillaume Gourmelin提供鱼类和实验室空间来进一步测试这些方法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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