Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sædopsamling og computerassisteret sædanalyse i Teleost-modellen japansk Medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Denne artikel beskriver to hurtige og effektive metoder til opsamling af sæd fra den lille model fisk medaka (Oryzias latipes), samt en protokol til pålidelig vurdering af sædkvalitet ved hjælp af computerassisteret sædanalyse (CASA).

Abstract

Japansk medaka (Oryzias latipes) er en teleostfisk og en ny hvirveldyrsmodel til økotoksikologi, udviklings-, genetik- og fysiologiforskning. Medaka bruges også i vid udstrækning til at undersøge hvirveldyrs reproduktion, hvilket er en væsentlig biologisk funktion, da det tillader en art at fortsætte. Sædkvalitet er en vigtig indikator for mandlig fertilitet og dermed reproduktionssucces. Teknikker til ekstraktion af sæd og sædanalyse er veldokumenterede for mange arter, herunder teleostfisk. Indsamling af sæd er relativt enkel i større fisk, men kan være mere kompliceret i små modelfisk, da de producerer mindre sæd og er mere sarte. Denne artikel beskriver derfor to metoder til sædopsamling i den lille modelfisk, japansk medaka: testikler dissektion og abdominal massage. Dette papir viser, at begge tilgange er mulige for medaka og viser, at mavemassage kan udføres gentagne gange, da fisken hurtigt kommer sig efter proceduren. Denne artikel beskriver også en protokol for computerassisteret sædanalyse i medaka for objektivt at vurdere flere vigtige indikatorer for medaka sædkvalitet (motilitet, progressivitet, varighed af motilitet, relativ koncentration). Disse procedurer, der er specificeret til denne nyttige lille teleostmodel, vil i høj grad forbedre forståelsen af de miljømæssige, fysiologiske og genetiske faktorer, der påvirker fertiliteten hos hvirveldyrmænd.

Introduction

Japansk medaka er en lille, æglæggende ferskvandsteleostfisk hjemmehørende i Østasien. Medaka er blevet et fremragende hvirveldyrmodelsystem til økotoksikologi, udviklingsgenetik, genomik og evolutionær biologi og fysiologistudier 1,2. I lighed med de populære zebrafisk er de relativt lette at opdrætte og meget resistente over for mange almindelige fiskesygdomme 1,2. Der er flere fordele ved at bruge medaka som model, herunder en kort generationstid, gennemsigtige embryoner 1,2 og et sekventeret genom3. I modsætning til zebrafisk har medaka et kønsbestemmende gen 4 samt en høj temperatur (fra4-40 ° C) og saltholdighed (euryhaline arter) tolerance5. Også mange genetiske og anatomiske værktøjer samt protokoller 6,7,8,9,10,11,12 er blevet udviklet i medaka for at lette studiet af dets biologi.

Reproduktion er en væsentlig fysiologisk funktion, da den tillader en art at fortsætte. Reproduktion af hvirveldyr kræver et utal af præcist orkestrerede begivenheder, herunder produktion af oocytter hos kvinder og produktion af sæd hos mænd. Sperm er unikke celler, der produceres gennem den komplekse proces med spermatogenese, hvor der er en række kontrolpunkter på plads for at garantere levering af et produkt af høj kvalitet13. Gametkvalitet er blevet et fokus i akvakultur- og fiskebestandsundersøgelser på grund af dens indvirkning på befrugtningssucces og larveoverlevelse. Sædkvalitet er derfor en vigtig indikator for mandlig fertilitet hos hvirveldyr.

Tre nyttige faktorer til vurdering af fisk sædkvalitet er bevægelighed, progressivitet, og lang levetid. Procent motilitet og progressiv motilitet er almindelige indikatorer for sædkvalitet, da progressiv bevægelse er nødvendig for og korrelerer stærkt med befrugtningssucces14,15. Bevægelsesvarighed er også en vigtig indikator hos fisk, da sædceller forbliver fuldt bevægelige i mindre end 2 minutter hos de fleste teleostarter, og sædens bane generelt er mindre lineær end hos pattedyr15. Imidlertid var mange undersøgelser, der vurderede sædmotilitet i fortiden, afhængige af subjektive eller semikvantitative metoder til analyse af sæd15,16. For eksempel er sædmotilitet i medaka tidligere blevet estimeret visuelt under et mikroskop17. Det er også blevet estimeret ved at registrere sædbevægelse og bruge billeddannelsessoftware til at flette rammer og måle svømmebane og hastighed18,19,20. Sådanne tilgange mangler ofte robusthed, hvilket giver forskellige resultater alt efter den person, der udfører analysen15,21.

Computerassisteret sædanalyse (CASA) blev oprindeligt udviklet til pattedyr. CASA er en hurtig kvantitativ metode til at vurdere sædkvalitet ved at registrere og måle hastighed og bane på en automatiseret måde15. I fisk er det blevet brugt i forskellige arter til at overvåge virkningerne af flere vandforurenende stoffer på sædkvaliteten, til at identificere interessante forfædre til at forbedre yngelbestanden, til at forbedre effektiviteten af kryopræservering og opbevaring og til at optimere betingelserne for befrugtning15. Derfor er det et kraftfuldt værktøj til pålidelig vurdering af sædkvalitet hos forskellige hvirveldyrarter. På grund af den vigtige mangfoldighed i reproduktive strategier mellem fisk adskiller sæd fra teleostfisk sig imidlertid fra pattedyr og fra en fiskeart til en anden. Teleostfisk, der primært befrugter æg eksternt ved at frigive kønsceller i vand, har stærkt koncentreret sæd, der er relativt enkle i struktur uden akrosom, i modsætning til pattedyr, der befrugter internt og derfor ikke behøver at kompensere for fortynding i vand, men skal modstå mere tyktflydende væsker14. Derudover bevæger sæd fra de fleste fisk sig hurtigt, men er fuldt bevægelige i mindre end 2 minutter efter aktivering, selvom der er flere undtagelser15,22. Fordi motiliteten kan falde hurtigt hos de fleste fisk, skal der udvises ekstrem forsigtighed med tidspunktet for analyse efter aktivering, når man bestemmer en sædanalyseprotokol for fisk.

Reproduktion er et af de områder inden for biologi, hvor teleosts og medaka er blevet brugt i vid udstrækning som modelorganismer. Faktisk viser medaka-mænd interessant reproduktiv og social adfærd, såsom mage, der bevogter23,24. Derudover findes der flere transgene linjer til at studere den neuroendokrine kontrol af reproduktion i denne art25,26,27. Sædprøvetagning, en procedure, der er relativt enkel i større fisk, kan være mere kompliceret i små modelfisk, da de producerer mindre sæd og er mere sarte. Af denne grund er de fleste undersøgelser, der involverer sædprøvetagning i medaka-ekstraktmilt (fiskesæd) ved knusning dissekeret testikler 17,28,29,30. Et par undersøgelser bruger også en modificeret mavemassage til at udtrykke milten direkte til aktiverende medium18,19,20; Men med denne metode er det svært at visualisere mængden og farven på milt ekstraheret. I zebrafisk bruges abdominal massage almindeligvis til at udtrykke milt, som straks opsamles i et kapillarrør31,32,33. Denne metode muliggør estimering af mængden af milt samt observation af ejakulatfarve, som er en hurtig og enkel indikator for sædkvalitet32,33. Derfor mangler der en klar og velbeskrevet protokol for sædopsamling og analyse for medaka.

Denne artikel beskriver derfor to metoder til sædopsamling i den lille model fisk japansk medaka: testikler dissektion og abdominal massage med kapillarrør. Det viser, at begge tilgange er mulige for medaka og viser, at mavemassage kan udføres gentagne gange, da fisken hurtigt kommer sig efter proceduren. Det beskriver også en protokol for computerassisteret sædanalyse i medaka for pålideligt at måle flere vigtige indikatorer for medaka sædkvalitet (motilitet, progressivitet, lang levetid og relativ sædkoncentration). Disse procedurer, der er specificeret til denne nyttige lille teleostmodel, vil i høj grad forbedre forståelsen af de miljømæssige, fysiologiske og genetiske faktorer, der påvirker fertiliteten hos hvirveldyrmænd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg og håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne om forsøgsdyrs velfærd ved Norges Biovidenskabelige Universitet (NMBU). Forsøgene blev udført ved hjælp af voksen (6-9 måneder gammel) mandlig japansk medaka (Hd-rR-stamme) opdrættet ved NMBU (Ås, Norge). Metoderne blev også kort testet i 9 måneder gammel mandlig japansk medaka (CAB-stamme) opdrættet ved National Research Institute for Agriculture, Food and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrig).

1. Forberedelse af instrument og opløsning

  1. Forbered bedøvelsesmiddelopløsning (0,6% Tricaine).
    1. Der fortyndes 0,6 g Tricaine (MS-222) i 100 ml 10x fosfatbuffersaltvand (PBS).
    2. Aliquot 2 ml af bedøvelsesstamopløsningen i 50 2 ml plastrør og opbevares ved -20 °C, indtil det anvendes til anæstesi eller eutanasi.
  2. Forbered genvindingsvand (0,9% natriumchlorid [NaCl] opløsning).
    1. Tilsæt 27 g NaCl i 3 liter akvariumvand.
    2. Opløsningen opbevares ved stuetemperatur (RT) indtil brug.
  3. Juster aktiveringsmediet om nødvendigt (Hanks afbalancerede saltopløsning [HBSS]).
    BEMÆRK: HBSS kan købes kommercielt eller fremstilles i laboratoriet (Materialetabel).
    1. Mål hbss'ens pH ved hjælp af en pH-meter. Juster om nødvendigt pH ved hjælp af saltsyre eller natriumhydroxid, så den endelige pH er 7,1-7,3.
    2. Mål HBSS's osmolalitet ved hjælp af et osmometer til fremtidig rapportering.
      BEMÆRK: Sortimentet på det kommercielle produkt er 266-294 mOsmol / kg; i den nuværende undersøgelse var osmolaliteten 287 mOsmol/kg. Det kan fortyndes med destilleret vand for at reducere osmolaliteten, hvis det ønskes, men dette er ikke nødvendigt, da der ikke er stor forskel på aktiveringen af medaka-sæd i 150-300 mOsmol/kg HBSS.
    3. Opbevar opløsningen hos RT indtil brug.
  4. Forbered holdesvampen.
    1. Skær en blød svamp, så den sidder tæt i en petriskål.
    2. Skær en lige linje i midten af svampen, der er lang nok til at modtage fisken (3-4 cm) og ca. 1 cm dyb (figur 1A). Denne spalte i svampen holder fiskens ventrale side op for at udsætte cloaca.

2. Indsamling af sæd

BEMÆRK: Sædopsamling kan opnås ved to forskellige metoder: abdominal massage eller testikler dissektion.

  1. Sædopsamling ved mavemassage
    1. Forbered 0,03% bedøvelsesopløsning ved fortynding af et rør Tricaine-lager (0,6%) i 38 ml akvariumvand i en 100 ml glasbeholder.
    2. Instrumenterne forberedes, herunder glatte tang og en 10 μL engangskalibreret glasmikropipette og aspiratorrørssamling (figur 1A). Fugt holdesvampen, der er fremstillet i trin 1.4, med bedøvelsesopløsningen.
    3. Rør med 36 μL af den aktiverende opløsning klargøres til øjeblikkelig analyse. Forvarm aktiveringsopløsningen i et vandbad eller inkubator, der er indstillet til 27 °C i mindst 5 min.
      BEMÆRK: Selvom prøver kan analyseres fra individuelle fisk, kan individuel variation reduceres ved at samle prøver fra flere hanner i samme aktiveringsopløsning. Ved pooling af prøver fra flere fisk skal du bruge 36 μL aktiveringsopløsning pr. Fisk. Denne fortynding skal muligvis justeres afhængigt af belastningen eller opdrætsbetingelserne for den anvendte medaka, da disse faktorer kan påvirke sædkoncentrationen og volumenet. CASA-programmet vil indikere, om koncentrationen er for høj til at identificere sædceller.
    4. Anæstetik fisken ved at lægge den i bedøvelsesopløsning i 30-90 s.
      BEMÆRK: Anæstesivarigheden skal tilpasses, da den varierer alt efter fiskens størrelse. For at sikre, at fisken er fuldt bedøvet, skal du forsigtigt klemme den kaudale peduncle med tang. Hvis fisken ikke reagerer, kan massagen startes.
    5. Tag fisken ud af bedøvelsesopløsningen og brug et papirhåndklæde eller tør forsigtigt for at tørre fiskens mave. Placer fisken i truget på den fugtige svamp ventrale side opad, så dens gæller udsættes for bedøvelsesopløsningen i svampen (figur 1B).
    6. Hvis området omkring cloaca er vådt, skal du forsigtigt tørre undersiden af fisken med en engangsserviet.
    7. Anbring fisken i holdesvampen under et dissekerende mikroskop, og anbring mikropipetten med et aspiratorrør fastgjort mod fiskens cloaca (figur 1C).
    8. Massér fiskens mave ved forsigtigt at klemme med stump ende glatte tang i en rostral til kaudal bevægelse, mens du samtidig suger for at samle den udstødte milt i pipetten (figur 1D).
    9. Slip fisken fra svampen i genopretningsvandet. Lad dem komme sig i opløsningen i mindst 15 minutter, før de returneres til akvariesystemet.
    10. Overfør milten til et forberedt rør med forvarmet aktiveringsopløsning og pipette op og ned flere gange ved at suge og blæse på aspiratorrørets samling.
    11. Homogeniser den fortyndede sæd forsigtigt ved at svirpe rørene før analyse.
      BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater skal du analysere prøver straks (f.eks. 5 s) efter aktivering. I medaka kan analysen om nødvendigt forsinkes, da sædceller forbliver bevægelige i flere timer, men tiden skal forblive konsistent mellem prøverne, da bevægeligheden falder med tiden.
  2. Sædopsamling ved testikler dissektion
    1. Forbered 0,08% eutanasiopløsning ved at fortynde to rør Tricaine-lager (0,6%) i 26 ml akvariumvand i en 100 ml glasbeholder.
    2. Forbered dissektionsværktøjer, herunder stump og fin tang og små dissekerende sakse (figur 1E).
    3. Der fremstilles et rør til hver prøve med 120 μL aktiverende opløsning til øjeblikkelig analyse. Forvarm aktiveringsopløsningen i et vandbad eller inkubator, der er indstillet til 27 °C i mindst 5 min.
      BEMÆRK: Selvom prøver kan analyseres fra individuelle fisk, kan individuel variation reduceres ved at samle prøver fra flere hanner i samme aktiveringsopløsning. Til pooling af prøver fra flere fisk skal du bruge 120 μL aktiveringsopløsning pr. Fisk. Denne fortynding skal muligvis justeres afhængigt af belastningen eller opdrætsbetingelserne for den anvendte medaka, da disse faktorer kan påvirke sædkoncentrationen og volumenet. CASA-programmet vil indikere, om koncentrationen er for høj til at identificere sædceller.
    4. Afliv fisken ved at putte den i 0,08% bedøvelsesopløsningen i 30-90 s.
      BEMÆRK: Varigheden afhænger af fiskens størrelse. For at sikre, at fisken aflives, skal du vente på, at operculumbevægelser ophører. Fisken bør ikke reagere på berøring af tang.
    5. Fjern fisken fra eutanasiopløsningen og tør forsigtigt fisken med et papirhåndklæde eller tør forsigtigt.
      BEMÆRK: På dette trin kan fisken vejes for senere at beregne det gonadosomatiske indeks (GSI, gonadal vægt / kropsvægt).
    6. Placer fisken under et dissekerende mikroskop med venstre sideside opad (figur 1F).
    7. Brug en lille dissekerende saks til at skære en klap dorsalt fra cloaca og derefter over ribbenene til gællerne for at udsætte de indre organer (figur 1G).
    8. Find testiklerne, skær fastgørelsen i begge ender med fine tang, og fjern testiklerne (figur 1H).
      BEMÆRK: For at beregne GSI kan testiklerne vejes på dette trin. Arbejd hurtigt for at undgå tørring af vævet.
    9. Overfør testiklerne til et forberedt rør med den forvarmede aktiveringsopløsning.
    10. Brug tang til at knuse testiklerne flere gange mod siden af røret for at frigive sædcellerne. Sædfrigivelse kan normalt visualiseres og vil gøre opløsningen lidt overskyet.
    11. Homogeniser den fortyndede sæd forsigtigt ved at svirpe rørene før analyse.
      BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater skal du analysere prøver straks (f.eks. 5 s) efter aktivering. I medaka kan analysen om nødvendigt forsinkes, da sædceller forbliver bevægelige i flere timer, men tiden skal forblive konsistent mellem prøverne, da bevægeligheden falder med tiden.

Figure 1
Figur 1: Miltopsamling ved abdominal massage (A-D) og testikeldissektion (E-H). (A) Instrumenter til abdominal massage: holdesvamp, stump glat tang og 10 μL engangskalibreret glasmikropipette med aspiratorrørsamling; B) Fiskens placering i holdesvampen med gæller udsat for bedøvelse i svampen og cloaca opad. (C) Placering af stump glat tang på maven og mikropipette mod cloaca; (D) Milt i mikropipette efter blid massage og sugning. (E) Instrumenter til dissektion af testikler: stump tang, fine tang og små dissekerende sakse; (F) Fiskens position til dissektion af testikler (G) lateralt syn på indre organer; (H) Fjern testiklerne ved at skære fastgørelsen i begge ender med fine tang. Skalastang: 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Sædanalyse med CASA-system

  1. CASA-systemet (SCA Evolution) skal opsættes i henhold til manualen med et mikroskop ved hjælp af et grønt filter og 10x mål med fasekontrast.
  2. Der forberedes engangs 20 μm tællekammerglidninger ved forvarmning på en varmeplade eller i en inkubator, der er indstillet til 27 °C i mindst 5 min.
  3. Åbn sædanalysesoftwaren, og vælg bevægelighedsmodulet.
  4. Indstil konfigurationen for medaka som vist i figur 2B.
  5. Anbring et forvarmet engangs 20 μm tællekammerglas under mikroskopet på et opvarmet trin indstillet til 27 °C.
  6. Pipetter prøven ind i kammeret på glideren, indtil den fylder kammeret uden overfyldning. Tør forsigtigt overskydende prøver væk fra indgangen til kammeret med en bomuldsspids eller tør forsigtigt for at forhindre flydende celler.
  7. Vælg Analysér for at se på prøven under mikroskopet.
    BEMÆRK: Hvis mikroskopikonet er rødt, skal mikroskopbelysningen justeres, så programmet kan spore sæd nøjagtigt. Juster mikroskopets lysstyrke, så sædens halebevægelse ses tydeligt. Ikonet skal være blåt.
  8. Sørg for, at mikroskopet er fokuseret, og vælg Analysér igen for at registrere sædcellerne i marken. Flyt sliden, så der er et nyt område af prøven i rammen, og gentag for at optage for 3-5 forskellige synsfelter. Undgå felter med luftbobler, cellemasser eller artefakter.
  9. Vælg Resultater for at få vist resultaterne.
    BEMÆRK: Hvis felterne på resultatsiden er angivet med rødt, skal du følge systemets anvisninger for at slette de felter, der varierer for meget i koncentration eller bevægelighed.
  10. Dobbeltklik på et felt for at se resultaterne for det enkelte felt eller for manuelt at kontrollere, om der er forkert mærket eller ikke-sporet spermatozo. Højreklik på individuelle spermatozoer for om nødvendigt at ommærke bevægeligheden (figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Skærmbillede af SCA Evolution-software . (A) Sædsporingsresultater for et felt. Se feltdata på højre side og dobbeltklik spermatozoer for at se individuelle data; (B) Resultatoversigt for alle felter med konfigurationsmenuen åben. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Type data opnået
Spermmotilitetsanalyse fra SCA Evolution-softwaren giver data om motilitet (procentdel af bevægelig og immotil sæd) samt progressivitet (procentdel af progressiv og ikke-progressiv sæd) og hastighed (procentdel af hurtig, medium og langsomt bevægende sæd). Det kombinerer også progressivitet og hastighed (hurtig progressiv, medium progressiv, ikke-progressiv). Disse etiketter er baseret på målinger (figur 3A) og beregninger (fig. 3B) af spermatozoons bevægelse, som leveres af programmet (supplerende tabel 1). For medaka blev følgende tærskler tilpasset fra de anbefalede zebrafiskparametre baseret på tidligere litteratur 19,34,35 og fordelingen af medaka-data fra18 individer. Motilitet er baseret på krøllet hastighed (VCL) med ubevægelig < 10 μm/s ≤ langsom < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < hurtig. Sædceller betragtes som progressive, hvis rethedsindekset (STR) er > 68%.

SCA Evolution beregner også koncentrationen af sædceller, hvis der gives prøvens volumen og fortyndingen. Mens abdominal massagemetoden er nyttig til at visualisere farvningen og bekræfte tilstedeværelsen af milten, er det opsamlede volumen for lille til at blive målt nøjagtigt. Hvis miltvolumenet forbedres ved opdrætsforhold eller ved hjælp af en anden stamme og kan måles, kan programmet bruges til at beregne koncentrationen. Imidlertid kan relativ koncentration også beregnes for at sammenligne fisk eller behandlingsgrupper for prøver taget ved testikeldissektion, så længe hele testiklerne dissekeres og fortyndes i samme væskevolumen.

Figure 3
Figur 3: Analyse af spermatozoon bevægelse. (A) Data registreret af CASA-systemet inkluderer krøllet hastighed (VCL, hastighed beregnet ved hjælp af afstanden langs den faktiske bane), gennemsnitlig banehastighed (VAP, hastighed beregnet ved hjælp af afstanden til den gennemsnitlige bane), lige linjehastighed (VSL, hastighed beregnet ved hjælp af afstanden mellem sædsporets start og slutning) amplitude af lateral hovedforskydning (ALH, størrelsen af lateral forskydning af et sædhoved omkring dets gennemsnitlige vej), slagkrydsfrekvens (BCF, hastighed, hvormed den krøllede sti krydser den gennemsnitlige sti); (B) Beregnede værdier fra CASA-systemet inkluderer rethedsindeks (STR, linearitet af den gennemsnitlige sti), linearitetsindeks (LIN, linearitet af den krøllede sti) og wobble (WOB, svingning af den faktiske sti omkring den gennemsnitlige sti). Klik her for at se en større version af denne figur.

Evaluering af sædmotilitet: Forskellige aktiveringsløsninger
Overraskende nok var sædprøver ved både abdominal massage og testikeldissektion immotile i akvariumvand (16 mOsmol / kg) (figur 4A) og i akvariumvand justeret med NaCl-opløsning til 34 mOsmol / kg. Der var heller ingen bevægelighed i deioniseret vand (-1 mOsmol/kg) eller deioniseret vand justeret til 23 mOsmol/kg. Sædceller var bevægelige i HBSS (287 mOsmol/kg) (figur 4B) såvel som i HBSS fortyndet med deioniseret vand til 36 mOsmol/kg og 113 mOsmol/kg, selv om den procentvise bevægelighed var signifikant reduceret ved 36 mOsmol/kg (figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Motilitet ved osmolalitet af aktiverende opløsning. Sædprøver udtaget ved testikeldissektion i (A) akvariumvand (16 mOsmol/kg) og (B) ujusteret HBSS (287 mOsmol/kg). Gule cirkler mærker immotile sædceller og farvede linjer angiver sædbevægelse: rød (hurtig progressiv), grøn (medium progressiv), blå (ikke-progressiv). Skalastang: 100 μm. (C)Sædmotilitet aktiveret med HBSS ved 36, 113 og 287 mOsmol/kg H2O. For 36 og 113 er n = 4 med to fisk samlet pr. prøve. For 287, n = 9 med to fisk samlet pr. Prøve. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en ANOVA med Tukey post-hoc test, og signifikante forskelle er angivet med forskellige bogstaver. Dataene er repræsenteret som middel ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøveudtagningsmetoder: Abdominal massage versus testikler dissektion
Sædprøver udtaget ved testikeldissektion er signifikant mere bevægelige sammenlignet med abdominale massageprøver fra den samme fisk (figur 5A). Af den bevægelige sæd er en højere procentdel også progressiv og medium eller hurtig. I sædceller udtaget ved abdominal massage er mere bevægelige sædceller langsomme og ikke-progressive (figur 5B-C). Der kan dog opnås forskellige resultater ved anvendelse af en anden stamme af medaka (CAB) eller alternative opdrætsbetingelser (supplerende tabel 2).

Figure 5
Figur 5: Abdominal massage versus testikler dissektion. Procentdel af (A) immotile og bevægelige sædceller udtaget ved abdominal massage eller testikler dissektion. Procentdel af bevægelig sæd, der er (B) ikke-progressiv og progressiv sæd, og (C) langsom, medium og hurtig bevægelse. Alle sædprøver blev aktiveret i HBSS (287 mOsmol/kgH2O). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en Mann-Whitney U-test, og signifikante forskelle er angivet med stjerner. Dataene er repræsenteret som middel ± SEM, n = 9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Motilitetsvarighed i henhold til opbevaringsforhold
Sædprøver udtaget ved testiklerdissektion og opretholdt ved 27 ° C havde en 50% reduktion i motilitet i de første 30 minutter efter aktivering. Efter 2,5 timer var mindre end 5% af sædcellerne bevægelige. Ved opbevaring ved 4 °C blev bevægeligheden kun reduceret med 14 % i de første 30 minutter, og det tog 5 timer at se en reduktion på 50 % i forhold til den oprindelige bevægelighed. Is havde en lignende udvidende effekt, men var mindre effektiv med en 26% motilitetsreduktion i de første 30 minutter (figur 6A). Progressiviteten faldt også 52 % i de første 30 minutter på is sammenlignet med 65 % ved 27 °C og 33 % ved 4 °C (figur 6B). Både på is og ved 4 °C bevægede nogle sædceller (<3 %) sig stadig 42 timer efter aktivering.

Figure 6
Figur 6: Sædens levetid i henhold til opbevaringstilstand. Procent (A) bevægelighed og (B) progressivitet over tid for prøver aktiveret med HBSS (287 mOsmol/kgH2O) og opbevaret ved 27 °C, 4 °C eller på is. Datapunkterne er gennemsnitlige ± SEM, n = ≥4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Betydningen af miljø- og boligforholdene
Hanner, der var sammen med hunner, blev udtaget ved testikeldissektion om morgenen, før de fik mulighed for at gyde (før lyset blev tændt) eller efter at lysene blev tændt, og hunnerne i tanken havde æg. Der var ingen signifikant forskel i sædmotilitet. Der blev også udtaget prøver af mænd uden hunner i en måned, og selv om der var en tendens til højere bevægelighed, var forskellen heller ikke signifikant (figur 7).

Men da CAB stamme medaka blev opdrættet i en anden facilitet med hanner adskilt fra hunner i mindst en måned, var fisken større og 5-7 μL milt blev indsamlet ved abdominal massage. Prøver indsamlet fra fem fisk ved mavemassage havde en bevægelighed på 68,34%, når de aktiveres med 300 mOsmol/kg HBSS. Når den blev holdt under de samme forhold, men med kvinder, var mængden af indsamlet milt ca. 2 μL, og den gennemsnitlige bevægelighed var 46,2% fra tre mænd (supplerende tabel 2).

Figure 7
Figur 7. Effekt af miljøforhold på sædmotilitet. Procent bevægelighed af sædceller udtaget før (n = 5) og efter (n = 4) gydning fra mænd, der var co-housed med hunner, og sæd fra hanner, der var anbragt uden hunner (n = 6). Alle prøverne blev udtaget ved testikeldissektion og aktiveret med HBSS (287 mOsmol/kgH2O). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af t-tests, og forskellene var ikke signifikante. Dataene vises som middel ± SEM med cirkler, der repræsenterer individuelle fisk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Beregning af gennemsnitshastighed og bevægelse for sædprøver udtaget ved abdominal massage og testikeldissektion (n = 9). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: Sædanalysedata fra CAB-stamme (også kaldet Carbio) medaka opdrættet på INRAE i Rennes, Frankrig. Alle prøverne blev aktiveret i 300 mOsmol/kg HBSS. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Osmolalitet er en vigtig faktor i aktiveringen af fiskesæd36,37. Generelt er sædceller immotile i testiklerne og bliver bevægelige i medier, der er hyperosmotiske i forhold til sædvæske til marine fisk og hypo-osmotiske i forhold til sædvæske til ferskvandsfisk37. I lighed med blod er sædplasma i ferskvandsfisk typisk lavere end for havfisk (ca. 300 mOsmol/kg sammenlignet med 400 mOsmol/kg)22,37. Således aktiveres fiskesæd normalt ved kontakt med det vand, de lever i, og dette vand tjener som det bedste og mest biologiske aktiveringsmedium til sædanalyse. Medaka sæd udtaget ved abdominal massage og testikler dissektion var imidlertid ikke bevægelige i akvariumvand (figur 4A) i Hd-rR eller CAB stamme medaka rejst i to forskellige laboratorier. Derudover var bevægeligheden højere i 287 mOsmol/kg HBSS end i 36 mOsmol/kg HBSS (figur 4C), hvilket er usædvanligt for en ferskvandsfisk.

De fleste tidligere undersøgelser, der involverede sædanalyse i medaka, brugte HBSS 28,29,38 eller Yamamoto-opløsning 18,19 som aktiverende medium til medaka-sæd uden at diskutere osmolalitet. Mens HBSS er et godt aktiverende medium til medaka sæd, kan variation i osmolalitet påvirke motiliteten. Det er derfor vigtigt for sædanalyseundersøgelser at afsløre osmolaliteten af deres aktiverende opløsning til sammenligning mellem eksperimenter. En undersøgelse, der undersøgte den ideelle osmolalitet af aktiverende medium, viste, at medaka-sæd er bevægelig i deioniseret vand (25 mOsmol / kg) og HBSS med osmolalitetsværdier < 686 mOsmol / kg, med den højeste bevægelighed mellem 25 og 227 mOsmol / kg17. I den nuværende undersøgelse var sædceller imidlertid heller ikke bevægelige i deioniseret vand. Som en euryhaline fisk er medaka meget tilpasningsdygtige til forskellige miljøer og kan endda leve og reproducere i saltvand39, så det er muligt, at forskellige opdrætsforhold er ansvarlige for denne uoverensstemmelse. Interessant nok har ingen andre undersøgelser rapporteret at teste medaka sædmotilitet i akvariumvand (eller lignende, såsom alderen ledningsvand), selvom det er standard sædaktiveringsmedium til ferskvandsfisk.

En mulig forklaring på denne atypiske sædaktivering i medaka er interaktion med æggestokkene. Mens fiskesæd normalt aktiveres i det omgivende vand, øger eller forlænger ovarievæsken varigheden af sædmotilitet hos mange arter40,41. Selvom medaka eksternt befrugter ferskvandsfisk, sætter deres gydeadfærd, som omfatter finindpakning og dirren, dem meget tættere på end udsendte gyder23. Da osmolaliteten af ovarievæske i ferskvandsfisk (ca. 300 mOsmol / kg) er tæt på HBSS40, er det muligt, at væske frigivet af kvinden aktiverer sædcellerne, ikke akvarievandet. Da osmolaliteten af sæd- og ovarieplasma er ens, er det muligt, at den ioniske sammensætning af medaka ovarievæske spiller en vigtig rolle40,42. Rollen som ovarievæske og ioner i aktivering af medaka sæd berettiger yderligere undersøgelse.

I tidligere undersøgelser er medaka sæd kun blevet indsamlet ved at knuse dissekerede testikler 17,28,29,30 eller ved abdominal massage for at udtrykke milten direkte til aktiverende medium 18,19,20; Ingen undersøgelser har rapporteret data med sæd indsamlet ved abdominal massage i et kapillarrør, selv om det er en almindelig praksis i zebrafisk og andre teleost fisk33,43,44. Denne metode er også mulig i medaka. Milt visualiseres let i kapillarrøret, og selvom volumenet er for lille til at blive målt nøjagtigt, muliggør denne metode bekræftelse af vellykket indsamling og analyse af farve som en hurtig indikator for kvalitet32. Undgåelse af fækal forurening er også lettere ved opsamling i et kapillarrør sammenlignet med i medium. Selvom sædprøver indsamlet ved testikeldissektion har bedre bevægelighed i medaka end prøver indsamlet ved mavemassage (figur 5) og derfor er at foretrække til forsøg, hvor fisken kan ofres, er mavemassage en minimalt invasiv procedure, der ikke kræver eutanasi og kan gentages i samme fisk. Derfor er det nyttigt for eksperimenter, der følger den samme fisk over tid. Prøver indsamlet med abdominal massage indeholder også kun modne celler frigivet med sædplasma44, mens prøver fra testikler dissektion kan omfatte umodne sædceller og andet affald. CASA-systemet diskonterer runde celler og snavs, der er større end det maksimale areal, men hvis denne parameter er indstillet for højt, kan bevægelighedsresultaterne blive påvirket.

På grund af den lave mængde sæd indsamlet med abdominal massage teknik i disse medaka, var det umuligt at måle sædvolumen i kapillæren nøjagtigt og dermed beregne sædkoncentrationer ved hjælp af regelmæssige tilgange. For prøver taget ved testikeldissektion kan der imidlertid beregnes en relativ koncentration baseret på sædkoncentration givet af CASA-systemet for at sammenligne mellem individer eller behandlingsgrupper ved at holde mængden af aktiveringsmedium konsistent og veje testiklerne. Udover kvalitetsanalyse er relativ koncentration også nyttig til bestemmelse af optimale prøvefortyndinger til kryopræservering. Hvis volumenet opsamlet ved abdominal massage forbedres ved opdrætsforhold eller ved hjælp af en anden stamme, kan volumenet beregnes ved at måle højden af milt i kapillarrøret og indtastes i programmet for at beregne koncentrationen. I disse tilfælde, hvor der kan opnås flere mikroliter, kan motiliteten være højere ved abdominal massage end testikeldissektion (supplerende tabel 2). Når der indsamles lave mængder, er prøverne mere tilbøjelige til forurening, hvilket kan påvirke bevægeligheden, selvom disse virkninger ser ud til at være konsistente, når mængderne er ens, så der kan stadig foretages sammenligninger mellem behandlingsgrupper. Der bør dog ikke foretages sammenligninger mellem prøver, der varierer meget i volumen eller farve af milt.

Det lave volumen af milt opnået fra medaka ved hjælp af abdominal massage kan være en begrænsning for eksperimenter, der kræver et stort volumen milt. I sådanne tilfælde kan testikeldissektion være at foretrække, som vist i en undersøgelse, der indsamlede milt fra zebrafisk og grøn sværdhale ved både dissektion og massage, men kun ved dissektion i medaka på grund af lavt volumen30. Testikler dissektion er typisk bedre til sammenligninger med andre arter af samme grund. Det begrænsede volumen ved mavemassage sammenlignet med andre fisk af samme størrelse kan skyldes mindre testikler (1,9 ± 0,6 mg i medaka sammenlignet med 7,0 ± 2,5 mg i zebrafisk 45) og mindre produceret sæd (2,0 ± 0,4 x 10 6 sædceller / mg testikler i medaka sammenlignet med 7,7 ± 2,0 x 106 sædceller / mg testikler i zebrafisk 46), eller til andre ukendte biologiske faktorer, der begrænser teknikken, som foreslået i klækkeriopdrættet afrikansk havkat47. Forskellen kan være fysiologisk, alt efter belastning eller miljøforhold, eller anatomisk, da medaka-testikler i modsætning til zebrafisk smeltes sammen og placeres mere medialt og derfor kan være sværere at få adgang til ved mavemassage, selvom der også er andre fisk med smeltede testikler.

For nogle arter, såsom zebrafisk, er det bedst at prøve sæd, før fisken har en chance for at gyde om morgenen48 eller at isolere hanner i individuelle tanke natten før for at forhindre gydning32. Med Hd-rR-medaka fra denne undersøgelse havde miljøforhold såsom prøvetagningstidspunkt (før eller efter gydning) og opstaldningsforhold (med eller uden hunner i 1 måned) ingen signifikant effekt på sædmotiliteten (figur 7). Det er muligt, at en større prøvestørrelse eller isolering af mænd fra kvinder i længere tid kan give højere sædmængde og / eller bevægelighed. I CAB stamme medaka fra en anden facilitet blev der set en lignende tendens med bedre sædkvalitet og volumen fra hanner, der var anbragt alene sammenlignet med hanner, der var anbragt hos hunner (for få fisk blev testet til at drage statistiske konklusioner). Det var også muligt med disse fisk at indsamle relativt store mængder milt ved abdominal massage (supplerende tabel 2), selvom meget små mængder milt blev opnået ved hjælp af Hd-rR stamme medaka, og andre har også rapporteret små mængder ved samme teknik i CAB stamme medaka30. Om disse forskelle skyldes stammen (som er en kommerciel stamme snarere end indavlet) eller på grund af opdrætsforskelle (der er mange mellem faciliteter), er imidlertid uklart. I disse fisk kunne der indsamles flere mikroliter milt, hvilket begrænser forurening og forbedrer kvaliteten. Men for eksperimenter, hvor det er vigtigt at leve sammen begge køn, synes det ikke nødvendigt at adskille dem for at give resultater. Det synes heller ikke nødvendigt at tage prøver af hanner ad gangen før gydning.

Selvom der kræves yderligere undersøgelser for at bestemme nøjagtigt, hvordan medaka-sædceller adskiller sig alt efter befolknings- og miljøfaktorer, bør belastnings- og opdrætsforholdene ikke desto mindre tages i betragtning ved udformningen af den eksperimentelle opsætning, og forsigtighed bør anvendes til sammenligning mellem populationer, der producerer forskellige mængder sædceller. Hvis der opnås større mængder milt, skal fortyndingen af aktiveringsopløsningen justeres (f.eks. 1:60, selv om den foretrukne koncentration kan variere med CASA-systemet). Tilsvarende, hvis de dissekerede testikler er meget større end typisk (2 mg) på grund af belastnings- eller opdrætsforholdene, skal fortyndingen øges, så CASA-programmet nøjagtigt kan mærke alle sædceller.

Metoder til sædanalyse varierer meget for medaka og er ofte subjektive, hvilket gør resultaterne vanskelige at sammenligne mellem undersøgelser. En undersøgelse, der sammenlignede subjektive og objektive metoder, der anvendes af teknikere med varierende ekspertiseniveauer, viste, at meget erfarne teknikere kan estimere fiskesædmotilitet inden for 10 procentpoint af dataene fra et CASA-motilitetsprogram, mens teknikere med medium og lav erfaring overvurderer CASA-motilitetsværdierne med amplituder op til 30 procentpoint21 . Imidlertid kan manglende standardisering for de parametre, der bestemmer motilitet i medaka, også forårsage variation mellem dem, der bruger mere objektive metoder. For eksempel havde en undersøgelse, der registrerede sæd med 33 billeder i sekundet (fps), analyserede 30 rammer og betragtede sæd, der bevægede sig hurtigere end 2 μm / s bevægelig, en gennemsnitlig hastighed på ca. 60 μm / s og bevægelighed på ca. 70% for deres kontrolfisk18. En anden undersøgelse, der brugte den samme protokol, havde en gennemsnitlig hastighed på 40 μm / s for kontrolsæd og en procent bevægelighed over 80% 19. En anden gruppe, der analyserede 200 rammer ved 47 fps, havde en gennemsnitlig VCL over 100 um / s for kontrolfisk, men en gennemsnitlig bevægelighed under 50%. De afslørede ikke, hvilke parametre der bestemte bevægelighed. Så i denne protokol bruges computerassisteret sædanalysesoftware til at analysere sæd objektivt, hurtigt og pålideligt baseret på et sæt parametre, der er tilpasset egenskaberne ved medaka sæd. Da det er afgørende, at motilitetsparametre er konsistente for sammenligninger på tværs af laboratorier, er den komplette konfiguration, der bruges i denne undersøgelse, tilgængelig (figur 2B), så denne protokol kan replikeres pålideligt i et andet laboratorium af forskellige forskere.

Teleostfisk viser en bred mangfoldighed af sædegenskaber, så selvom denne protokol oprindeligt blev testet ved hjælp af de anbefalede zebrafiskparametre til SCA Evolution-softwaren, var det tydeligt, at parametrene skulle justeres for medaka-sæd med lavere hastighed og større levetid. Så zebrafiskparametre blev tilpasset medaka ved hjælp af litteratur fra medaka og andre arter, der rapporterede lignende sædegenskaber 19,34,35 og valgte de tærskler, der bedst passer til fordelingen af 17,580 analyserede sædspor fra18 individer. Motilitet er baseret på krøllet hastighed (VCL) med ubevægelig < 10 μm/s ≤ langsom < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < hurtig. Sædceller betragtes som progressive, hvis straightness index (STR) er > 68%. Tærsklen, der definerer bevægelighed, blev holdt på 10 μm / s i stedet for 2 μm / s, som brugt i noget litteratur18,19, da mange sædceller, der manglede flagellarbevægelse, blev forkert mærket som bevægelige med denne indstilling. Andre fiskearter med sædhoveder af samme størrelse (~ 2 μm) brugte også 10 μm / s til at definere bevægelig sæd35,43. Det maksimale areal blev reduceret fra zebrafiskindstillingen på 90 μm 2 til 20 μm2, så stort cellulært affald fra testikeldissektion ville blive ignoreret.

Varigheden af motilitet ser ud til at være afhængig af mængden af ATP, der er lagret før aktivering, da flagellar bevægelse kræver et hurtigt forbrug af energi. Sandsynligvis på grund af denne hurtige udmattelse er der en sammenhæng mellem sæd med høj initial hastighed og en kortere varighed af motilitet49. Mens et osmotisk chok typisk er nødvendigt for at aktivere fiskesæd, kan det også føre til membranskader i bevægelighedsperioden, hvilket også kan påvirke levetiden. Denne effekt er mere kritisk hos ferskvandsart49, hvilket kan forklare, hvorfor marine sædceller er i stand til længere bevægelighedsvarighed (ca. 550 s i gennemsnit sammenlignet med ca. 150 s for ferskvandsarter), på trods af at de udviser en lignende gennemsnitshastighed og bevægelighed som ferskvandssæd 14,22. Motilitetsvarighed længere end 30 min er ikke almindelig, men det er blevet rapporteret i flere marine arter 22,49. På trods af at det er en ferskvandsfisk, passer resultaterne med medaka til profilen af sædceller, der har en lavere hastighed og længere varighed fra marine arter. Dette kan være relateret til aktiveringen i medium svarende til sædplasma - uden et osmotisk chok lider medaka sæd sandsynligvis ikke membranskader svarende til andre ferskvandsfisk.

En ikke-aktiverende løsning og meget hurtig, konsekvent timet analyse efter aktivering er ofte nødvendig til analyse af sædceller, der kun er bevægelige i minutter. Medaka-sædmotilitet varer dog naturligt flere timer, og højere bevægelighed kan bevares ved opbevaring ved 4 °C eller på is (figur 6). For eksperimenter, hvor øjeblikkelig analyse ikke er mulig, kan protokollen således ændres, så testikler for eksempel opbevares i aktiverende opløsning på is i en time, så længe indsamlingstiden registreres, så analysen kan forblive konsistent. For optimale resultater er øjeblikkelig analyse dog stadig den bedste løsning. Mens motiliteten stadig falder, fordi den er gradvis, påvirkes resultaterne mindre af mindre forskelle i analysetidspunktet efter aktivering. Alligevel er det vigtigt at rapportere både opbevaringstemperaturen for prøver og analysetidspunktet efter aktivering, så data kan sammenlignes og gengives.

Det er også typisk meget vigtigt hos fisk at undgå forurening af milt med urin under prøveudtagning, da dette kan ændre osmolaliteten og for tidligt aktivere sædcellerne16,50. Dette er dog mindre bekymrende i medaka (på grund af den længere varighed af bevægelighed) og med denne protokol, da prøven straks placeres i aktiveringsmedium. Lave mængder milt er tilbøjelige til urinforurening, så der kan forventes en vis misfarvning med abdominal massage fra medaka, når der indkøbes lave mængder. Men hvis dette er konsistent i befolkningen, kan der stadig foretages sammenligninger mellem behandlingsgrupper. Forsigtighed bør anvendes til sammenligning af populationer af medaka, der varierer i volumen eller farve af milt.

Da sædanalyseresultater er meget afhængige af de anvendte metoder, er detaljerede og pålidelige metoder, der let kan gentages i forskellige laboratorier, gavnlige. Det er også vigtigt for papirer at afsløre detaljer om deres metoder for at muliggøre repeterbarhed. Da medaka i stigende grad anvendes som en model for reproduktionsforskning, mangler informationen om vurdering af sædkvalitet. De to forskellige metoder, der er beskrevet i dette papir til sædprøvetagning, kan være gavnlige for forskellige eksperimenter. Testesdissektion giver typisk sæd med højere bevægelighed og giver mulighed for relative koncentrationsberegninger, mens abdominal massage kan udføres gentagne gange på den samme fisk og er en mere ren, biologisk repræsentation af en gydebegivenhed. Dette manuskript giver derfor parametrene for CASA, som er en pålidelig, objektiv teknik, der giver rigelige data om sædbevægelse, herunder bevægelighed, progressivitet, hastighed og andre kinematiske parametre. Disse protokoller vil således være nyttige til en række undersøgelser i medaka, herunder toksikologi, økologi, reproduktion og fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er finansieret af det norske universitet for biovidenskab og det amerikanske Fulbright-program. Forfatterne vil gerne takke Anthony Peltier og Lourdes Carreon G Tan på NMBU for vedligeholdelse af fiskefaciliteter og Guillaume Gourmelin fra ISC LPGP ved INRAE (Frankrig) for at give fisk og laboratorieplads til yderligere at teste disse metoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

Biologi udgave 188 gonader sæd milt testikler medaka fisk reproduktion casa
Sædopsamling og computerassisteret sædanalyse i Teleost-modellen japansk Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter